SE503729C2 - Extraktionssystem - Google Patents

Description

503 729 2 Fig. 1 är en tvärsektionsvy av ett reaktionskärl som utgör den ena delen av ett extraktionssystem enligt föreliggande upp- finning; Fig. 2 är en tvärsektionsvy av ett till det första reaktionskär- let passande andra reaktionskärl som utgör den andra delen av extraktionssystemet enligt föreliggande uppfinning; och Fig. 3 är en schematisk vy av extraktionssystemet i ihopmonterat tillstànd.

Extraktionssystemet enligt föreliggande uppfinning betecknas allmäntmedrànvisningssiffran1 ifigurerna.Extraktionssystemet innefattar ett reaktionskärl 2 enligt Fig. 1 och ett reaktion- skärl 3 enligt Fig. 2, vilka är utformade för komma till ingrepp med varandra såsom visas i Fig. 3. Ingreppet åstadkoms genom att reaktionskärlet 2 är försett med ett övre konvergerande parti eller lock 4 och reaktionskärlet 3 är försett med ett övre divergerande eller utkragat parti 8. Lutningen på respektive konvergerande och divergerande partier är densamma så att en tät anliggning och därmed ett slutet system uppstår när de två reaktionskärlen 2, 3 är ihopmonterade på det i Fig. 3 visade sättet. Ur Fig. 3 framgår också att reaktionskärlets 2 ytterdia- meter överenstämmer med innerdiametern av reaktionskärlets 3 utkragade parti 8.

I reaktionskärlets 2 lock 4 finns en rörformig öppning 5 som valfritt kan vara täckt av ett permeabelt membran 6. Reaktion- skärlet: 3 är försett med en betydligt större öppning 9 än öppningen 5, vilken öppning 9 är avsedd att mottaga det övre partiet 4 av reaktionskärlet 2 såsom förklarats ovan, se Fig. 3.

Inuti reaktionskärlet 3 är en kapillär 12 anordnad. Kapillären 12 är centrerad i reaktionskärlet 3 genom att dess övre ände är anbringad i en borrning ll i en platta 10, som är anordnad i reaktionskärlets 3 övre parti just under det utkragade området UI j» (;~l \ J I\J \0 3 8, och dess undre ände är fast anbringad i reaktionskärlets 3 botten.

Ur Fig. 3 framgår att den rörformiga öppningen 5 är dimensionerad för att exakt passa över kapillärens 12 övre ände och för att komma till anliggning mot plattan 10.

Nedan beskrivs ett föredraget sätt att använda extraktionssyste- met enligt uppfinningen för nukleinsyraextraktion Kapillären 12 fylls med ett nukleinsyrabindande medium 13 (nedan kallat DNA-bindare), vilket är tyngre än vatten. Det omkring kapillären 12 anordnade reaktionskärlet 3 är utformat som ett mikrocentrifugrör och har tre funktioner. Dels har det funktionen att isolera innehållet från omgivningen, vilket minskar både kontaminationsrisken och smittospridningsrisken ifall smittsamt material extraheras, dels funktionen att stabilisera kapillären vid centrifugering samt dels funktionen att utgöra stoppkrage vid centrifugering. Stabiliteten åstadkoms genom borrningen ll i den horisontella plattan 10 såsom beskrivits ovan. Stoppkragefunktio- nen åstadkoms genom det övre utkragade partiet 8 av reaktionskär- let 3, så att ett upp och nedvänt reaktionskärl 2 kan komma till anliggning mot kragens snedställda väggar enligt ovanstående beskrivning.

Till ett reaktionskärl 2, här kallat reaktionskärl 2A, sätts ett membrandenaturerande medium 7 (t ex stark saltlösning, lysozym och/eller alkali), varefter borrningen 5 i locket 4 försluts med ett tunt membran 6. Till ett annat, ej visat, reaktionskärl 2, här kallat reaktionskärl 28 sätts tvättbuffert (en saltlösning avsedd att skölja bort proteinkoagulat, cellrester och andra föroreningar från DNA-bindaren utan att bundet DNA lossnar), och till ett ytterligare, ej visat, reaktionskärl 2, här kallat reaktionskärl 2C, tillsätts destillerat vatten, varefter även reaktionskärlen 2B och 2C försluts med ett tunt membran. De moment som hittills beskrivits kan utföras industriellt i förväg. 4 Den manuella hanteringen börjar med att provet , t ex blod, med hjälp av en kanyl, pipett eller mätkapillär sätts till reak- tionskärl 2A. Detta inkuberas och innehållet kokas eventuellt upp för att denaturera nukleaser, varefter kapillären 12 monteras ihop med reaktionskärlet 2 genom att den rörformiga öppningen 5 förs över kapillären 12 tills dess ytterkant kommer till anliggning mot plattan 10. Reaktionskärl 2A och reaktionskärl 3 bildar då en sluten enhet (se Fig. 3), vilken placeras med reaktionskärlets 2A botten nedåt/utåt i en mikrocentrifug, varefter en kort centrifugering utförs, vilken överför ka- pillärens innehåll (dvs DNA-bindare) till reaktionskärl 2A. Efter kraftig blandning, t ex genom vortexning, av reaktionskärlets A innehåll, binder DNA till DNA-bindaren.

Därefter vänds det slutna extraktionssystemet 1 och placeras med reaktionskärlets 3 botten nedåt, endera i provrörsställ, varvid DNA-bindaren 13 med bundet DNA tillåts sedimentera tillbaka in i kapillären 12, eller i mikrocentrifug med botten av reaktion- skärlet 3 riktad nedåt/utåt, varefter en kort centrifugering återför DNA-bindaren 13 med bundet DNA till kapillären 12.

Reaktionskärlet 2A med innehåll kasseras och reaktionskärl 2B innehållande tvättbuffert monteras på kapillären 12 såsom beskrivits ovan. Därefter sker avsköljning av DNA-bindaren med bundet DNA genom att detta centrifugeras ned i reaktionskärl 25 innehållande tvättbuffert. Innehållet i:reaktionskärl 28 blandas, t ex genom vortexning, för effektiv tvätt av bundet DNA. Därefter återförs DNA-bindaren med bundet DNA till kapillären 12 medelst sedimentation eller centrifugering enligt samma procedur som beskrivits ovan för reaktionskärl 2A. Därefter kasseras även reaktionskärl 2B med innehåll. Önskas ytterligare sköljning upprepas proceduren en eller flera gånger från och med ersättandet av reaktionskärl 2A till och med kasserandet av reaktionskärl 2B.

I) I c \J~| f729 5 Om inga ytterligare sköljningar önskas ersätts reaktionskärl 28 med reaktionskärl 2C innehållande vatten eller annat medium som får DNA att ga i lösning. DNA-bindaren med bundet DNA centrifuge- ras ned i reaktionskärl 2C, vilket omskakas, varvid DNA släpper från DNA-bindaren och gár i lösning i vattnet. DNA-bindaren utan DNA kan, om sà önskas, få sedimentera eller pelleteras ned med centrifugering, valfritt till botten av reaktionskärl 2C eller áter till kapillären 12, vilken därefter kasseras jämte till- hörande reaktionskärl 3.

DNA som nu finns i lösning i reaktionskärlet 2C, ger pga den slutna hanteringen.enligt ovan upphov till mycket säkra resultat, t ex vid PCR.

Företrädesvis doseras DNA i reaktionskärlet 2C med hjälp av en doseringsanordning som beskrivs i sökandens samtidigt med denna ingivna ansökan.

Claims (10)

(J-l :Ii ~\1 ro \o PATENTKRAV

1. Sätt att utföra nukleinsyraextraktion i ett slutet system, k ä n n e t e c k n a t av att a) nukleinsyra-innehållande prov tillsätts till ett reaktionskärl (2A) innehållande membrandenaturerande medium (7) och att dessa får inkubera; b) att en i locket (4) av reaktionskärlet (2A) befintlig öppning (5) anbringas över det övre partiet av en kapillär (12), som innehåller nukleinsyrabindande.medium (13) (tyngre än vatten) och är fast centrerad i ett reaktionskärl (3) och tätt säkrad mot reaktionskärlets (3) botten, varvid reaktionskärlen (ZA) resp. (3) bildar en sluten enhet innefattande en öppen passage från kapillärens (12) botten till reaktionskärlets (ZA) botten; c) att den slutna enheten centrifugeras med reaktionskärlets (ZA) botten nedåt, varvid det nukleinsyrabindande mediet förs in i reaktionskärl (2A); d) att innehållet i reaktionskärl (ZA) blandas, varvid nukleinsyra i provet binder till nukleinsyrabindaren (13): e) att den slutna enheten centrifugeras med reaktionskärlets (3) botten nedåt, varvid nukleinsyrabindande medium med bunden nukleinsyra förs in i kapillären (l2); f) att reaktionskärl (2A) kastas och ersätts med ett nytt reaktionskärl (28) innehållande tvättbuffert och att centrifuge- ringarna enligt c) och e) upprepas med blandning däremellan; g) att reaktionskärl (2B) kastas och ersätts med ett nytt reaktionskärl (2C) innehållande medium som får nukleinsyran att släppa ifrån det nukleinsyrabindande mediet (13) och att centrifugeringen enligt c) upprepas, varvid nukleinsyra släpper från nukleinsyra-bindaren och går i lösning och nukleinsyrabinda- ren sedimenterar till botten av reaktionskärl (2C); och h) att reaktionskärl (3) och (2C) tas isär och att nuklein- syran i reaktionskärl (2C) utsätts för vidare analys.

2. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att kokning utförs före steg b) för denaturering av nukleaser. S5 729 (fl 7

3. Sätt enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av att tvättning av bunden nukleinsyra upprepas med en eller flera reaktionskärl (28) innehållande tvättbuffert före den slutliga centrifugeringen av den slutna enheten bestående av reaktionskärl (2C) och reaktionskärl (3).

4. Sätt enligt krav 1, 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a t av att det nukleinsyrabindande mediet i steg g) centrifugeras ned i reaktionskärl (2C).

5. Sätt enligt krav 1, 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a t av att det nukleinsyrabindande mediet i steg g) centrifugeras ned i kapillären (12).

6. Slutet extraktionssystem, k ä n n e t e c k n a t av att det innefattar dels utbytbara reaktionskärl (2A, 2B, 2C) och dels ett reaktionskärl (3) innehållande en däri centrerad kapillär (12), vilka reaktionskärl (2A, 28, 2C) resp (3) är utformade för komma till ingrepp med varandra under bildande av ett slutet system innefattande en öppen passage fràn kapillärens (12) botten till reaktionskärlets (2A, 2B, 2C) botten.

7. Slutet extraktionssystem enligt krav 6, k ä n n e t e c k - n a t av att ingreppet mellan reaktionskärl (2A, 28, 2C) och reaktionskärl (3) ástadkoms genom att reaktionskärl (2A, 2B, 2C) är försett med ett övre konvergerande parti eller lock (4), vars lutning är anpassat till ett övre divergerande eller utkragat parti (8) pà reaktionskärl (3), och att locket (4) är försett med en rörformig öppning (5) vars innerdiameter är anpassad till kapillärens (12) ytterdiameter.

8. Slutet extraktionssystem enligt krav 7, k ä n n e t e c k - n a t av att reaktionskärlets (2A, 2B, 2C) öppning (5) är täckt av ett permeabelt membran (6).

9. Slutet extraktionssystem enligt krav 6, 7 eller 8, k ä n n e t e c k n a t av att kapillären (12) är centrerad 505 729 a i reaktionskarlet (3) genom att dess övre ände är anbringad i en borrning (ll) i en platta (10), som är anordnad i reaktionskär- lets (3) övre parti just under det utkragade området (8), och dess undre ände är fast anbringad i reaktionskärlets (3) botten.

10. Slutet extraktionssystem enligt något eller några av kraven 6-9, k ä n n e t e c k n a t av att kapillären (12) innehåller nukleinsyrabindande medium (13), som är tyngre än vatten, och att reaktionskärl (2A) innehåller membrandenaturerande medium, att reaktionskärl (28) innehåller tvättbuffert,cxfl1att reaktionskärl (2C) innehåller medium som får den bundna nukleinsyran att släppa från det nukleinsyrabindande mediet.