JPH06510421A - 抽出システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抽出システム 本発明は抽出システムに係り、特に、本発明は密閉システム内において核酸の抽 出を行う方法および該方法を実行する抽出システムに係る。

細胞からの核酸の抽出は生化学的作業において重要な手順である。そのような抽 出は通常は膜の化学的または物理的変性およびそれに続く核酸の沈降によって、 またはそれが核酸に対し親和力を有する媒質（ｍｅ　ｄ　ｉ　ｕｍ）と結合する ことを許すことによって達成される。その後、核酸は洗われＡたは清浄化される 。

これら作業は通常は、典型的にピストンピペットおよび微小遠心分離管（ｍｉｃ ｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｔｕｂｅ）を使用して開放取扱チェーン（ｏｐｅｎｈ ａｎｄｌｉｎｇ　ｃｈａｉｎ）において在来的手順を使用して遂行されている。

この開放取扱いにおける欠点は反応液が繰返して露出され、汚染のリスクを増す ことである。

そのような汚染は主として微生物、核酸の断片およびヌクレアーゼを担持してい る空気伝達の粒子から成っている。本発明は密閉取扱チェーン（ｃｌｏｓｅｄｈ ａｎｄｌｉｎｇ　ｃｈａｉｎ）において処理過程の構成要素Ｃｍ胞、化学薬品お よび核酸のための結合媒質）を取扱うことによって核酸の抽出の間の前記タイプ の汚染のリスクを最小限にすることを目的とする。

簡潔に記すると、本発明の原理は、水より濃くて特定の分子、例えば核酸、に対 し親和力を育する媒質（化学的合成物または粒子の懸濁液）であって、遠心分離 または沈降を利用して、代替的に所望の流体物質（例えば洗浄緩衝剤）へ移転さ れ、代替的に所望流体物質の交換時に毛細管内に一時的に蓄えられるシャツトル （ｓｈｕｔｔｌｅ）として役立つものを使用することである。

本発明は次に添付図面に関連してより精密に説明されるであろう。添付図面にお いて、 第１図は本発明による抽出システムの二つの部分の一つを構成する反応バイアル （ｖ　ｉ　ａ　Ｉ）の断面図であり。

第２図は、前出の反応バイアルと嵌合する本発明による抽出システムの第２の部 分を構成する第２の反応バイアルの断面図であり； 第３図は互いに嵌合された抽出システムの概略図である。

本発明による抽出システムは図面において参照符号ｌによって全体として示され ている。前記抽出システムは第１図による反応バイアル２と第２図による反応バ イアル３から構成されており、これら二つは第３図に例示されるようにそれぞれ 底端を上と下に向けてそれらが互いに嵌合されることを可能にする輪郭を育する 。この嵌合は、反応バイアル２が上部末細部分 （ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ　５ｅｃｔ　１ｏｎ）即ち蓋４を備えることと反応バイ アル３が上部末広（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）即ちカラー付き部分８を備えることと によって達成される。上記末細部分と上記末広部分のそれぞれの角度は同じであ り、第３図に示されるごとく二つの反応バイアル２．３が互いに取付けられたと き、密着嵌合へ導き、従って、密閉システムを生じさせる。また、第３図に示さ れるように、反応バイアル２の外径は反応バイアル３のカラー付き部分８の内径 に一致する。

反応バイアル２の蓋４には一つまたはそれより多い（個数は下の毛細管Ｉ２の個 数と一致する）管形のオリフィス５であって選択的に透過性の膜６によって覆わ れるものが位置されている。反応バイアル３は上記オリフィス５と比較するとか なり広いオリフィス９を備えており、このオリフィス９は第３図を参照して上に 説明されたように反応バイアル２の上部分４に来入する機能を育する。

反応バイアル３内には一つまたはそれより多い毛細管１２が長手方向に配置され ている。この毛細管１２は、その上端が反応バイアル３の上部分において精密に カラー付き部分８の下方に位置されている円板の孔１１内に挿入され且つその下 端が反応バイアル３の底にしっかりと結合されていることにより、好ましくは反 応バイアル３の中心に固定されている。

第３図に示されているように、管形のオリフィス５は毛細管１２の上部分のまわ りに緊密に嵌合して円板ＩＯとの接触を確立するように精密に寸法を付与されて いる。

以下において核酸の抽出のために本発明による上記抽出システムを使用する好ま しい方法が説明される。

毛細管１２は水より濃い核酸１３（以下ＤＮＡ−バインダ［ｂｉｎｄｅｒ］　と 称す）に対して親和力を存する媒質を備える。毛細管１２を取囲む反応バイアル ３は微小遠心分離管の形状を育しており、三つの機能を有する。

その一つはその内容物を周囲から隔離する機能であり、それは汚染性物質の抽出 の場合に感染のリスクに加えて汚染のリスクを減少させる。もう一つの機能は遠 心分離の間に毛細管を安定させることであり、第３は遠心分離の間のストップカ ラー（ｓｔｏｐ　ｃｏｌｌａｒ）としての機能である。安定は上に説明されたよ うに水平の円板１０の孔１１によって得られる。ストップカラーとしての機能は 反応バイアル３の上カラー付き部分８によって達成され、その結果として、倒立 する反応バイアル２は、上に説明されたように、カラーの末広壁と接触すること になる。

ここで反応バイアル２Ａとして表される反応バイアル２に膜を変性させる媒質７ （例えば濃塩分含有溶液、リゾチームおよび／またはアルカリ）が提供され、次 いで蓋４の孔５は薄い膜６によって密封される。ここで反応バイアル２Ｂとして 表される他の、図示されない、反応バイアル２に、洗浄緩衝剤（ＤＮＡバインダ をゆすぐ（ｒｉｎｓｅ）ことを目的とする塩分含有溶液であり、ＤＮＡバインダ からＤＮＡを溶離することなしに、ＤＮＡバインダから凝固した蛋白質、細胞断 片およびその他の不純物を除去する）が導入され、且つ、さらにここで２０とし て表されるさらにもう一つの、図示されない、反応バイアル２に蒸留水が導入さ れ、そのあとさらに前記反応バイアル２Ｂおよび２Ｃは薄い膜で密封される。

以上説明された作業はあらかじめ工業的に実行されてもよい。

手動取扱い（ｍａｎｕａｌ　ｈａｎｄｌｉｎｇ）としてまず、注射器、ピペット または測定毛細管を使用してサンプル、例えば血液か反応バイアル２Ａに挿入さ れる。

これは培養され、内容物はヌクレアーゼを変性させるために沸騰させられ、その あと毛細管１２は管形オリフィス５を毛細管１２の上にオリフィスの縁が円板１ ０と接触させられるまで持ってくることによって反応バイアル密閉ユニットは反 応バイアル２Ａの底を微小遠心器内において下方且つ外方に指向して配置され、 それに続いて、各毛細管の内容物（即ち、ＤＮＡバインダ）を反応バイアル２Ａ に移転する短い遠心分離が行われる。反応バイアル２Ａの内容物の、例えば渦巻 運動による、強方な混合の後、ＤＮＡはＤＮＡバインダに結合する。

その後、密閉抽出システムｌは、管のためのスタンド内において、反応バイアル ３の底を下向きにして転回配置されて、結合したＤＮＡと共にＤＮＡバインダ１ ３を毛細管１２内に沈降復帰することを許すか、または微小遠心分離器内におい て反応バイアル３の底を下方且つ外方に指向して、その後、結合したＤＮＡと共 にＤＮＡバインダＩ３が毛細管１２へ戻される短い遠心分離が行われる。

反応バイアル２Ａがその内容物と一緒に処理（ｄｉｓｐｏｓｅ）され、洗浄緩衝 剤を収容している反応バイアル２Ｂか上に説明されたように毛細管１２上に配置 される。このあと、ＤＮＡバインダは結合したＤＮＡと共に、遠心分離を使用し て洗浄緩衝剤を収容している反応バイアル２Ｂ内にそれを移転することによって 、ゆすがれる。反応バイアル２Ｂの内容物は結合したＤＮＡの効果的な洗浄を達 成するために例えば渦巻運動によって混合される。そのあと、ＤＮＡバインダは 結合したＤＮＡと一緒に、反応バイアル２Ａに関して上に説明されたごとき同じ 手順に従って沈降または遠心分離によって毛細管１２へ移転復帰される。そのあ と、反応バイアル２Ｂもその内容物と一緒に処理（ｄｉｓｐｏｓｅ）される。

もしさらにゆすぎが望まれるならば、上記手順が反応バイアル２Ａの置換え（ｒ ｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の時点から反応バイアル２Ｂの処理（ｄ　１ｓｐｏｓ　 ｉｎｇ）まて１回または数回反復される。

もしこれ以上のゆすぎか望まれないならば、反応バイアル２Ｂは溶液中にＤＮＡ を持ち込む水またはその他の媒質を収容する反応バイアル２Ｃと置換えられる。

ＤＮＡバインダは結合したＤＮＡとともに反応バイアル２Ｃ内へ下降するように 遠心分離される。反応バイアル２ｃは振り動かされ、その内部においてＤＮＡは ＤＮＡバインダから分離されて水中で溶解される。ＤＮＡを有しないＤＮＡバイ ンダは、もし好ましいとされるならば、沈降してまたは遠心分離によって固形化 （ｐｅｌｌｅｔｅｄ）されて、選択的に反応バイアル２Ｃの底へ達しまたは毛細 管１２内に戻り、その後それらは結合された反応バイアル３と一緒に処理される 。

いま反応バイアル２Ｃ内で溶解しているＤＮＡは、上に説明された密閉取扱い（ ’ｃ　Ｉ　ｏ　ｓ　ｅ　ｄ　ｈａｎｄｌｉｎｇ）によって、例えばＰＣＲにおい て極めて信頼できる結果を保証するであろう。

好ましくは、反応バイアル２Ｃ内のＤＮＡは、それに対して引用がなされるスウ ェーデン特許願第９１００２７６−０号による分配器を使用して分配される。

国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｑ　１／６８　Ｚ 　７８２３−４８ＧＯＩＮ　１／１０　Ｈ７５１９−２Ｊ１／２８　Ｊ　７５１ ９−２Ｊ Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．密閉システム内で核酸抽出を行う方法において、ａ）核酸含有サンプルが膜 変性媒質（７）を収容している反応容器（２Ａ）に供給され、そしてこれらが培 養するようにされ； ｂ）前記反応容器（２Ａ）の上蓋（４）内に位置されているオリフィス（５）が 一つまたはそれより多い毛細管（１２）の上部分のまわりに緊密に配置され、前 記毛細管が（水より濃い）核酸結合媒質（１３）を収容して反応容器（３）の底 にしっかりと固定され、前記反応容器（２Ａ）および（３）がそれぞれ前記毛細 管（１２）の底から前記反応容器（２Ａ）の底に達する開いた通路を構成する密 閉ユニットを形成し；ｃ）前記密閉ユニットが前記反応容器（２Ａ）の底を下方 へ向け且つ前記反応容器（３）の底を上方に向けて遠心分離され、それにより前 記核酸結合媒質が前記反応容器（２Ａ）内に導入され； ｄ）前記反応容器（２Ａ）の内容物が混合され、それによって前記サンプル中の 核酸が前記核酸バインダ（１３）に結合し； ｅ）前記密閉ユニットが前記反応容器（３）の底を下向きにし且つ前記反応容器 （２Ａ）の底を上向きにして遠心分離され、それにより前記核酸結合媒質が結合 した核酸と共に前記毛細管（１２）内に導入され；ｆ）前記反応容器（２Ａ）が 放棄されて洗浄緩衝剤を有する新反応容器（２Ｂ）と置換えられ且つｃ）および ｅ）による前記遠心分離がそれらの間の混合によって繰返され； ｇ）前記反応容器（２Ｂ）が放棄されて前記核酸を前記核酸結合媒質（１３）か ら分離させる媒質を有する新反応容器（２Ｃ）と置換えられ且つｃ）による前記 遠心分離が繰返され、それにより前記核酸が前記核酸バインダから分離して溶解 されて前記核酸バインダが反応容器（２Ｃ）の底に沈降し； ｈ）前記反応容器（３）および（２Ｃ）が結合を解かれて前記反応容器（２Ｃ） 内の前記核酸がさらなる分析を受けさせられる、 密閉システム内で核酸抽出を行う方法。 ２．請求項１による方法において、沸騰がヌクレアーゼを変性させるため過程ｂ ）の前に行われる方法。 ３．請求項１または２による方法において、結合した核酸の洗浄が、前記反応容 器（２Ｃ）および前記反応容器（３）を有する前記密閉ユニットの最終遠心分離 の前に、洗浄緩衝剤を有する一つまたはそれより多い反応容器（２Ｂ）によって 繰返される方法。 ４．請求項１から３の何れか一つの項による方法において、過程ｇ）における前 記核酸結合媒質が前記反応容器（２Ｃ）内に下降するように遠心分離される方法 。 ５．請求項１から３の何れか一つの項による方法において、過程ｇ）における前 記核酸結合媒質が前記毛細管（１２）内に下降するように遠心分離される方法。 ６．密閉抽出システムにおいて、交換可能な反応容器（２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）およ び一つまたはそれより多い長手方向に配置された毛細管（１２）を内部に有する 反応容器（３）を有し、前記反応容器（２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）および（３）が、そ れぞれ、前記毛細管（１２）の底から前記反応容器（２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）の底に 達する開いた通路を有する密閉システムを形成するため互いに係合するように構 成されている密閉抽出システム。 ７．請求項６による密閉抽出システムにおいて、前記反応容器（２Ａ、２Ｂ、２ Ｃ）と前記反応容器（３）との間の係合が、前記反応容器が上部末細部分即ち蓋 （４）を備え、その傾斜が前記反応容器（３）の上部末広即ちカラー付き部分（ ８）に合致することによって達成され、且つ、前記蓋（４）が一つまたはそれよ り多い管形オリフィス（５）であってその内径が前記毛細管（１２）の外径に合 致するものを備えている密閉抽出システム。 ８．請求項６または７による密閉抽出システムにおいて、前記反応容器（２Ａ、 ２Ｂ、２Ｃ）の前記オリフィス（５）が透過性の膜によって覆われている密閉抽 出システム。 ９．請求項６から８の何れか一つの項による密閉抽出システムにおいて、前記毛 細管（１２）が前記反応容器（３）の中心に配置されていて前記管形のオリフィ ス（５）が前記蓋（４）の中心に配置されている密閉抽出システム。 １０．請求項９による密閉抽出システムにおいて、前記毛細管（１２）の上端が 円板（１０）の孔（１１）内に配置されており、前記円板が前記反応容器（３） の上部分において前記カラー付き部分（８）の直下に配置されており、前記毛細 管の下端が前記反応容器（３）の底に固定配置されている密閉抽出システム。 １１．請求項６から１０の何れか一つの項による密閉抽出システムにおいて、前 記毛細管（１２）が水より濃い核酸結合媒質（１３）を有し、前記反応容器（２ Ａ）が膜変性媒質を有し、前記反応容器（２Ｂ）が洗浄緩衝剤を有し、前記反応 容器（２Ｃ）が前記結合した核酸を前記核酸結合媒質から分離させる媒質を有す る密閉抽出システム。