WO1998032877A1 - Verfahren und vorrichtung zur reinigung von nukleinsäuren - Google Patents

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WO1998032877A1
WO1998032877A1 PCT/EP1998/000408 EP9800408W WO9832877A1 WO 1998032877 A1 WO1998032877 A1 WO 1998032877A1 EP 9800408 W EP9800408 W EP 9800408W WO 9832877 A1 WO9832877 A1 WO 9832877A1
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nucleic acid
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Thomas Walter
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    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5082—Test tubes per se

Definitions

  • the invention relates to a method for isolating nucleic acids from a sample and a device suitable therefor.
  • the release from the biological sample material is always necessary.
  • the nucleic acid must be protected against degradation by nucleases from the biological material or the environment and degradation by chemical reaction conditions (Fe ++ / DTT or ß-mercaptoethanol; NaOH; heat).
  • chemical reaction conditions Fe ++ / DTT or ß-mercaptoethanol; NaOH; heat.
  • the greatest demands are placed on the contamination-free nature of the biological sample and the nucleic acid isolated from it. In particular, an entry from the environment, by laboratory personnel and cross-contamination of the samples with one another must be prevented.
  • the nucleic acid should be in a buffered, aqueous, salt-free solution.
  • PCR generally uses very small amounts of analyte (pg / ng range)
  • special questions require the processing of a larger amount of sample.
  • the nucleic acid from 10 - 20 ml be isolated from a blood sample. After homogenization of the sample, an aliquot of the isolated RNA can then be examined for expression of a tumor-associated gene.
  • a modified method uses a concentrated salt solution after the lysis of the sample material to precipitate proteins and other accompanying substances.
  • the nucleic acids in the supernatant are then precipitated by ethanol and collected by centrifugation. After the nucleic acids have been dissolved, they can be used for the amplification.
  • the object of the present invention was therefore to provide a simple method for isolating nucleic acids from larger sample volumes.
  • the invention therefore relates to a method for isolating nucleic acids from a sample by taking the sample into a first vessel through an opening, closing the opening of the first vessel with a closure element which contains a nucleic acid-binding, liquid-permeable material and which faces the opening on its side
  • Side means for attaching the element to the first vessel and on the other side of the material includes means for attaching the element to a second vessel, and transferring the sample through the material into the vessel attached on the other side.
  • the invention also relates to a device for carrying out this method.
  • a method for isolating nucleic acids is understood to mean a method in which nucleic acids of a sample are separated from other sample components. This is done by binding the nucleic acids to a nucleic acid binding material. After binding, the liquid can be separated from the material with the nucleic acids. For the isolation of particularly pure nucleic acids, any adhering substances can be removed by washing the material with a liquid. If desired, the nucleic acids can be detached from the nucleic acid-binding material. The binding or detachment of the nucleic acids from the material takes place under conditions which depend on the material used.
  • Nucleic acid binding materials are known to the person skilled in the art.
  • the material can be both particulate and fibrous.
  • the material consists of particles, it has proven to be advantageous to immobilize these particles, e.g. B. by insertion between liquid-permeable platelets, for. B. woven or non-woven from fibrous Material such as cellulose or plastics that have such tight pores that the particles are held between the platelets.
  • the nucleic acid binding material is a fibrous material, e.g. B. in the form of fabrics or nonwovens themselves. Suitable materials are, for. B. from methods for the isolation of nucleic acids using centrifuge tubes or multiple devices in strip format known.
  • the nucleic acid binding material must have the property that the sample liquid without additional force or with force, e.g. B. by exerting pressure or negative pressure through the material.
  • the nucleic acids in the present method are not bound by filtration of the nucleic acids from the sample, but rather by a method in which the affinity of nucleic acids for surfaces is exploited, it is possible to use a relatively large-pore material. This facilitates the flow through even relatively viscous sample liquids.
  • the liquid-permeable material is able to bind nucleic acids, but to allow the surrounding liquid and other constituents, such as proteins, etc., to pass through.
  • the nucleic acids can be bound in a sequence-specific manner by capture probes attached to the surface of the material.
  • the capture probes have a base sequence that can bind to a complementary base sequence in the nucleic acids to be isolated under hybridization conditions.
  • sequence-specific materials allows the selective isolation of nucleic acids of a certain sequence.
  • a method for binding nucleic acids to peptide nucleic acids on the surface of solids is described, for example, in WO 95/14708.
  • the liquid-permeable material has a glass-containing surface.
  • the ability to bind nucleic acids has long been known for particulate and fibrous materials. For example, DE-A-19512369 describes the use of glass nonwovens for the isolation of nucleic acids.
  • nucleic acids are to be understood as meaning nucleic acids of any origin, e.g. B. nucleic acids of viroid, viral, bacterial or cellular origin. If the nucleic acids in the sample are not freely accessible, they are preferably made available with appropriate reagents. This includes both changes in pHs (alkaline), heat, repetition of extreme temperature changes (freeze / thaw), change in the physiological growth conditions (osmotic pressure), exposure to detergents, chaotropic salts or enzymes (e.g. proteases and lipases). Specimen material from which nucleic acids can be released are, in particular, cell-containing media, cell smears and tissue sections. The nucleic acids can be both RNA and DNA.
  • Suitable vessels are in particular plastic vessels.
  • Such vessels are made of polystyrene, polyethylene or luran, for example. These have the advantage of being easy to manufacture in the multi-injection molding process with simultaneous high mechanical stability under the conditions of the insulation process according to the invention.
  • this vessel has a volume which contains the entire sample and possibly other reagents, e.g. B. to facilitate the binding of the nucleic acids to the nucleic acid binding material allowed.
  • the volume is preferably between 1 and 100 ml, preferably between 5 and 50 ml.
  • This vessel preferably has an essentially cylindrical basic shape which is closed on one side. On the other side of the vessel there is an opening that is suitable for receiving the sample.
  • this vessel preferably has means for fastening the vessel to a closure element in the region near the opening. This means can be, for example, an outside or inside screw thread.
  • the vessel preferably has a further opening (for example as a pressure compensation opening).
  • Another essential element of the invention is a closure element which contains the nucleic acid-binding, liquid-permeable material.
  • the nucleic acid-binding material is arranged in the closure element such that sample liquid passing from the first vessel into the second vessel must pass through the nucleic acid-binding material.
  • the nucleic acids are bound to the material.
  • the closure element therefore connects the opening of the first vessel to the opening of a second vessel, the nucleic acid-binding material being introduced between these openings.
  • the closure element On one side of the nucleic acid binding material, the closure element has means for fastening the element on the first vessel. These means depend on the geometry of the first vessel in the area of the opening. If the first vessel has a thread, for example, the middle of the closure element is a matching counter thread. On the side of the closure element facing away from the opening of the first vessel, this means has means for fastening the closure element to a second vessel. It has proven to be advantageous to provide a screw closure here as well.
  • the second vessel can be similar in shape and material to the first vessel. In particular, however, the second vessel should be able to hold at least the volume of the sample liquid.
  • the second vessel is preferably the same size as the first vessel or has a volume which is so much larger than that of the first vessel that it can also take up washing liquids in addition to the sample liquid.
  • the closure element can be made of the same material as the vessels, here the use of injection-moldable plastics is particularly preferred because this allows the introduction of the liquid-permeable material during the manufacture of the closure element.
  • the material especially in the case of glass fiber nonwovens, can be firmly poured into the closure element during the injection molding process. However, it is also possible to introduce the material later and to fasten it in the closure element, e.g. B. by gluing or welding.
  • the closure element may include other advantageous elements, e.g. B. a neck for applying negative pressure.
  • This attachment piece is preferably located on the side of the closure element facing the second vessel.
  • the closure element can also contain a pressure compensation connection. This is preferably located in the part of the closure element facing the first vessel or on the side facing away from the intake manifold. It is preferably designed in such a way that under normal conditions no sample liquid can escape through it into the environment. It can e.g. B. is an opening closed with a dense fleece in the area just next to the nucleic acid binding material. Furthermore, the closure element still contain internals, which ensure the controlled and even flow through the nucleic acid binding material. This includes, in particular, a distribution of the liquid flow over the entire available area of the material and the collection of the liquid flow as it enters the second vessel, thereby preventing the liquid from splashing and possible loss through the suction nozzle.
  • a system which is already very suitable for carrying out the method according to the invention is based on the components of the commercially available Steriflip TM vacuum filtration system from Millipore, but a glass fiber fleece is used instead of the sterile filtration membrane.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention based on this device is described below. 5 to 30 ml of whole blood are pipetted into the first tube. In a first step, the cells should be lysed and disrupted. For this purpose, the necessary reagents, e.g. B. a chaotropic salt and / or protease added.
  • the first vessel is preferably tightly closed and mixed with a lid. The cover is then removed and the closure element according to the invention is screwed on.
  • the second vessel is already attached to the closure element or it is then attached to the closure element on the side of the nucleic acid-binding material facing away from the opening of the first vessel.
  • the sample liquid is then caused to pass through the nucleic acid binding material. This can be done on the one hand by tipping over the assembled device (first vessel, closure element, second vessel) or also in a supportive manner by additional application of negative pressure when connecting piece of the closure element.
  • the sample liquid passes through the nucleic acid binding material, the now accessible nucleic acids present in the sample are bound to the nucleic acid binding material, while other sample components pass together with the liquid into the second vessel. Air can penetrate into the first vessel from the outside through the second nozzle, and thus compensate for the negative pressure which has arisen in the first vessel.
  • the isolated nucleic acids are now in the closure element, bound to the liquid-permeable material. They can now be further processed in any way. Since certain liquid amounts of the sample usually still adhere to the liquid-permeable material even after air has been sucked through, it is preferred to wash off these adhering residues.
  • the first vessel can be separated from the first closure element, e.g. B. unscrewed, and the washing liquid to the material to which the nucleic acids are bound, z. B. be dropped. If a larger amount of washing liquid is to be used, it is possible to attach a filler neck to the closure element using the means for attaching the first vessel. The washing liquid can be sucked through the material by applying negative pressure into the second vessel.
  • the second vessel can be removed from the closure element and replaced by a fresh, third vessel.
  • the third vessel can be attached to the closure element using the means for attaching the second vessel. Then, preferably on the side to which the first vessel was attached, an elution liquid is added and, if desired, sucked through the material into the third vessel under reduced pressure.
  • the elution liquid is such that the binding of the nucleic acids to the liquid-permeable material is released. It is now possible to dissolve the nucleic acids in very small volumes of elution liquid.
  • the third vessel can therefore also have a smaller volume than the second and the first vessel.
  • the device according to the invention is also suitable for converting nucleic acids from a larger volume to a smaller volume.
  • FIG. 1A shows a closure element (1) which has both a first screw thread (2) and a second screw thread (7).
  • a pressure compensation connection (8) which is sealed with a dense fleece that is air-permeable but liquid-impermeable.
  • On the side of the second screw thread there is an exhaust port for negative pressure (3) and a splash guard (5).
  • the nucleic acid binding material is located between the screw threads (4)
  • FIG. 1B shows a first vessel (10) with a counter thread for the screw thread (2) (11) and a sample liquid (12) containing nucleic acid.
  • the closure element (1) is screwed onto the first vessel containing the sample liquid in such a way that the suction nozzle (3) is removed from the sample liquid by the Material (4) is separated.
  • the second vessel (20) with a counter thread for the screw thread (7) (21) is indicated.
  • FIG. 1D shows the assembled device in a state in which negative pressure has already been applied and part of the sample liquid has passed through the nucleic acid-binding material (4).
  • the liquid (22) that has passed collects in the second vessel (20). It can be seen that the device was turned over after screwing on the second vessel (see FIG. IC) (FIG. 1D).
  • the invention also relates to a device for isolating nucleic acids from a sample containing a first vessel with an opening capable of receiving the sample and a closure element with a nucleic acid-binding liquid-permeable material, the closure element on a side facing away from the first vessel, means for fastening the element on a second vessel.
  • the connection of the first vessel to the closure element should be so tight that no liquid and no gas can penetrate inwards between the closure element and the first vessel.
  • the invention also relates to the use of a device with a first and a second vessel and a closure element for firmly connecting these vessels, which contains a nucleic acid-binding material, to avoid contamination during sample preparation for nucleic acid detection.
  • the nucleic acids eluted from the liquid-permeable material after isolation can namely advantageously be used for the detection of one or more of these nucleic acids from the sample.
  • Appropriate detection methods are known to the person skilled in the art. In particular, they include the amplification of the isolated nucleic acids and their detection using labeled nucleic acid probes.
  • the described method allows the simple isolation of nucleic acids from larger sample volumes (> 10 ml) with a reduced risk of contamination of the sample, the operator and the workplace.
  • the arrangement of the sample vessels and the filtration unit prevents the spread of aerosols.
  • the lysis and further processing the sample can be conveniently staggered in time and space without the need to change vessels (e.g. decentralized sampling and lysis / stabilization).
  • Fig. 1 serves as an illustration.
  • the vessel is cooled, briefly centrifuged (Heraeus Sepatech Varifuge 3.0R), opened and 5 ml of i-propanol are added and mixed well.
  • the filtration unit carries a further 50 ml sample vessel, which can be placed under negative pressure via a connection which is located on the filtration unit.
  • a sample vessel can be found, for example, in the Steriflip TM Filter Unit (Millipore, Cat. No. SCGP 005 25).
  • the assembled unit is now oriented (e.g. rotated) so that the lysed sample material is in the upper container, and vacuum is applied (e.g. water jet vacuum).
  • the vacuum line is usually protected against contamination by an appropriate filter (e.g. Millipore Cat. No. SLFG 050 10).
  • the fleece can also be dried by sucking in sterile air. Now the tube with the passage is removed and replaced with a fresh, sterile tube. 1-2 ml of an elution buffer preheated to 70 ° C. (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) are applied to the fleece and sucked through with a vacuum. In order to obtain an optimal yield, the unit is finally centrifuged at approx. 8000 xg. The isolated nucleic acid is in the eluate and contains both DNA and RNA and is now suitable for use in PCR or RT-PCR.

Abstract

Eine Vorrichtung zum Isolieren von Nukleinsäuren, die den Austrag von Kontaminationen bei Nukleinsäureisolierungsverfahren reduziert, aufgebaut aus zwei Gefäßen, die über ein Verschlußelement verbunden sind, in welchem ein Material zur Bindung der Nukleinsäuren eingebracht ist. Die Nukleisäuren können beispielsweise durch Kippen der Vorrichtung an das Material gebunden werden.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Reinigung von Nukleinsäuren
Gegenstand der Erfindung sind ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe und eine hierfür geeignete Vorrichtung.
Mit der Einführung der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und nachfolgender alternativer Amplifikationssysteme für Nukleinsäuren ist die Verwendung dieses genetischen Materials als Untersuchungsmaterial für diagnostische Tests möglich geworden. Dadurch sind vor allem bei der Diagnose von Erbkrankheiten, der Prädisposition für gewisse Erkrankungen und von Infektionskrankheiten neue Analysemöglichkeiten, die u. a. eine frühere Erkennung des Zustandes erlauben, gegeben.
Um das genetische Material in eine geeignete Form für die enzymatische Amplifikation zu überführen, ist immer die Freisetzung aus dem biologischen Probenmaterial erforderlich. Weiterhin muß die Nukleinsäure vor Degradation durch Nukleasen aus dem biologischen Material oder der Umgebung und Abbau durch chemische Reaktionsbedingungen (Fe++/DTT oder ß-Mercaptoethanol; NaOH; Hitze) geschützt werden. Die größten Anforderungen werden an die Kontaminationsfreiheit der biologischen Probe und der daraus isolierten Nukleinsäure gestellt. Hier muß insbesondere ein Eintrag aus der Umgebung, durch Laborpersonal und eine Kreuzkontamination der Proben untereinander verhindert werden. Die Nukleinsäure sollte für die Amplifikation in einer gepufferten, wässerigen, möglichst salzfreien Lösung vorliegen.
Während die PCR grundsätzlich sehr geringe Analytmengen verwendet (pg-/ng Bereich), erfordern spezielle Fragestellungen die Aufarbeitung einer größeren Probenmenge. Um etwa zirkulierende Tumorzellen mit einer Sensitivität von einer Tumorzelle in einem Hintergrund von 107 -108 normalen Zellen zu identifizieren, muß z. B. die Nukleinsäure aus 10 - 20 ml einer Blutprobe isoliert werden. So kann dann nach Homogenisierung der Probe ein Aliquot der isolierten RNA auf Expression eines tumorassoziierten Gens untersucht werden.
Neben den klassischen Methoden der Nukleinsäure-Isolierung mittels enzymatischer, mechanischer oder chemischer Lyse des Probenmaterials, nachfolgender Extraktion der Proteine und Lipide durch Phenol und Phenol/CHCl3 und Präzipitation der Nukleinsäure aus der wässerigen Phase mittels Ethanol oder i-Propanol (Sambrook J., Fritsch E.F. und T. Maniatis Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989, 2nd Edition, 9.16 - 9.23; Ausubel F. M. et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987, 2.1.1 - 2.4.5) wurden in den letzten Jahren einige kommerzielle Kits speziell für die PCR-Proben- vorbereitung entwickelt, welche die Eigenschaft von Nukleinsäuren nutzen, unter chaotropen Salzbedingungen an Glasoberflächen zu binden, die seit Ende der siebziger Jahre bekannt ist (Vogelstein B. et al., Proc. Natl. Acad. Sei: USA, 76, pp 615-619 (1979)). Andere Inhaltstoffe biologischen Materials, wie Proteine, Lipide oder Salze, werden nicht gebunden und daher abgetrennt. Zentrifugationsgefäße mit eingelegten Glasvliesen für Probenvolumina bis 200 μl, oder Silikagel-Suspensionen, die einen Batchprozeß erlauben, sind bekannt. Weiterhin sind Mehrfachvorrichtungen im Streifen- und 96-well-Mikrotiterplatten-Format mit in den Boden eingelassenen Glasvliesen bekannt, die sowohl mit Hilfe einer darunter angebrachten Vakuumkammer als auch durch Zentrifugation betrieben werden können. Bei diesen Verfahren besteht größte Kontaminationsgefahr, da sowohl bei der Vakuumabsaugung als auch bei der Zentrifugation alle Gefäße über den Luftraum in Kontakt sind und Kontamination über Aerosole erfolgen kann.
Ein modifiziertes Verfahren (Miller et al., Nucl. Acids Res. 16: 1215) verwendet nach der Lyse des Probenmaterials eine konzentrierte Salzlösung zur Ausfällung von Proteinen und anderen Begleitstoffen. Die im Überstand befindlichen Nukleinsäuren werden dann durch Ethanol ausgefällt und durch Zentrifugation gesammelt. Nach Lösen der Nukleinsäuren sind sie für die Amplifikation einsetzbar.
Die gegenwärtigen Lösungsmöglichkeiten sind entweder in der Größe des zu bearbeitenden Volumens limitiert oder sind zeitaufwendiger oder benötigen einen zusätzlichen Schritt zur Präzipitation der Nukleinsäuren. Ein mehrfaches Auftragen ist zeitaufwendig und erhöht die Gefahr der Kontamination und Verwechslung. Batch- Verfahren sind grundsätzlich upscalebar, bergen aber auch dann die Gefahr der Kontamination.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein einfaches Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus größeren Probenvolumina bereitzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe durch Aufnahme der Probe in ein erstes Gefäß durch eine Öffnung, Verschluß der Öffnung des ersten Gefäßes mit einem Verschlußelement, welches ein nukleinsäurenbindendes, flüssigkeitsdurchlässiges Material enthält und welches auf seiner der Öffnung zugewandten Seite Mittel zur Befestigung des Elements auf dem ersten Gefäß und auf der anderen Seite des Materials Mittel zur Befestigung des Elements an einem zweiten Gefäß enthält, und Transfer der Probe durch das Material in das auf der anderen Seite angebrachte Gefäß. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
In Figur 1 sind die Bestandteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie die einzelnen Phasen des erfindungsgemäßen Verfahrens schematisch und beispielhaft dargestellt.
Unter einem Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren wird ein Verfahren verstanden, bei dem Nukleinsäuren einer Probe von anderen Probenbestandteilen getrennt werden. Dies geschieht durch Bindung der Nukleinsäuren an ein nukleinsäurebindendes Material. Nach der Bindung kann die Flüssigkeit von dem Material mit den Nukleinsäuren getrennt werden. Für die Isolierung besonders reiner Nukleinsäuren können eventuell noch anhaftende Stoffe durch Waschen des Materials mit einer Flüssigkeit entfernt werden. Die Nukleinsäuren können, falls gewünscht, von dem nukleinsäurebindenden Material wieder abgelöst werden. Die Bindung bzw. Loslösung der Nukleinsäuren von dem Material geschieht unter Bedingungen, die von dem verwendeten Material abhängen.
Nukleinsäurebindende Materialien sind dem Fachmann bekannt. Das Material kann sowohl partikulär als auch fasrig sein. Für den Fall, daß das Material aus Partikeln besteht, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, diese Partikel zu immobilisieren, z. B. durch Einbringen zwischen flüssigkeitsdurchlässigen Plättchen, z. B. Geweben oder Vliesen aus fasrigem Material wie Zellulose oder Kunststoffen, die so enge Poren haben, daß die Partikel zwischen den Plättchen festgehalten werden. Bevorzugt handelt es sich bei dem nukleinsäurebindenden Material jedoch um ein fasriges Material, z. B. in Form von Geweben oder Vliesen, selbst. Geeignete Materialien sind z. B. aus Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren mit Hilfe von Zentrifügationsröhrchen oder Mehrfachvorrichtungen im Streifenformat bekannt. Das nukleinsäurebindende Material muß die Eigenschaft haben, daß die Probenflüssigkeit ohne zusätzliche Krafteinwirkung oder mit Krafteinwirkung, z. B. durch Ausübung von Druck oder Unterdruck, durch das Material durchtreten kann. Da jedoch die Bindung der Nukleinsäuren im vorliegenden Verfahren nicht durch Filtration der Nukleinsäuren aus der Probe geschieht, sondern durch ein Verfahren, bei dem die Affinität von Nukleinsäuren zu Oberflächen ausgenutzt wird, ist es möglich, ein relativ grobporiges Material einzusetzen. Dies erleichtert die Durchströmung auch relativ dickflüssiger Probenflüssigkeiten.
Das flüssigkeitsdurchlässige Material ist in der Lage, Nukleinsäuren zu binden, die umgebende Flüssigkeit sowie darin gelöste weitere Bestandteile, wie Proteine etc., jedoch durchzulassen. In einer ersten Möglichkeit können die Nukleinsäuren sequenzspezifisch durch auf der Oberfläche des Materials angebrachte Fangsonden gebunden werden. Die Fangsonden weisen eine Basensequenz auf, die unter Hybridisierungsbedingungen an eine komplementäre Basensequenz in den zu isolierenden Nukleinsäuren binden kann. Die Verwendung sequenzspezifischer Materialien erlaubt die selektive Isolierung von Nukleinsäuren einer bestimmten Sequenz. Ein Verfahren zur Bindung von Nukleinsäuren an Peptid- nukleinsäuren auf der Oberfläche von Feststoffen ist beispielsweise in WO 95/14708 beschrieben. In einem bevorzugten Fall weist das flüssigkeitsdurchlässige Material eine glas- haltige Oberfläche auf. Die Eigenschaft, Nukleinsäuren binden zu können, ist für partikuläre und fasrige Materialien schon seit langem bekannt. So ist beispielsweise in DE-A- 19512369 die Verwendung von Glasvliesen zur Isolierung von Nukleinsäuren beschrieben.
Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der Erfindung Nukleinsäuren jeglichen Ursprungs zu verstehen, z. B. Nukleinsäuren viroiden, viralen, bakteriellen oder zellulären Ursprungs. Sofern die Nukleinsäuren in der Probe nicht frei zugänglich sind, werden sie bevorzugt mit entsprechenden Reagenzien verfügbar gemacht. Hierzu gehören sowohl Veränderungen des pHs (alkalisch), Hitze, Wiederholung extremer Temperaturveränderungen (einfrieren/auftauen), Veränderung der physiologischen Wachstumsbedingungen (osmotischer Druck), Einwirkung von Detergenzien, chaotropen Salzen oder Enzymen (z. B. Proteasen und Lipasen). Probenmaterial, aus dem so Nukleinsäuren freigesetzt werden können, sind insbesondere zellhaltige Medien, Zellabstriche und Gewebeschnitte. Bei den Nukleinsäuren kann es sich sowohl um RNA als auch DNA handeln.
Geeignete Gefäße sind insbesondere Kunststoffgefäße. Solche Gefäße sind beispielsweise aus Polystyrol, Polyethylen oder Luran. Diese haben den Vorteil der leichten Herstellbarkeit im Mehrspritzgußverfahren bei gleichzeitiger hoher mechanischer Stabilität unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Isolierungsverfahrens.
Zunächst wird die Probe in ein erstes Gefäß aufgenommen. Hierfür weist dieses Gefäß ein Volumen auf, welches die Aufnahme der gesamten Probe und gegebenenfalls weiterer Reagenzien, z. B. zur Erleichterung der Bindung der Nukleinsäuren an das nukleinsäurebindende Material, erlaubt. Das Volumen beträgt bevorzugt zwischen 1 und 100 ml, bevorzugt zwischen 5 und 50 ml. Dieses Gefäß hat bevorzugt eine im wesentlichen zylindrische Grundform, die auf einer Seite verschlossen ist. Auf der anderen Seite des Gefäßes befindet sich eine Öffnung, die zur Aufnahme der Probe geeignet ist. Des weiteren hat dieses Gefäß bevorzugt im Bereich nahe der Öffnung Mittel zur Befestigung des Gefäßes an ein Verschlußelement. Bei diesem Mittel kann es sich beispielsweise um ein außen- oder innenseitiges Schraubgewinde handeln. Bevorzugt weist das Gefäß eine weitere Öffnung (z. B. als Druckausgleichsöffnung ) auf. Nach Aufnahme der Probe in das erste Gefäß ist die Probe zwar im erten Gefäß enthalten, steht jedoch nicht mit dem nukleinsäurebindenden Material in Kontakt.
Ein weiteres wesentliches Element der Erfindung ist ein Verschlußelement, welches das nukleinsäurebindende, flüssigkeitsdurchlässige Material enthält. Das nukleinsäurebindende Material ist so im Verschlußelement angeordnet, daß aus dem ersten Gefäß in das zweite Gefäß übertretende Probenflüssigkeit durch das nukleinsäurebindende Material hindurchtreten muß. Hierbei werden die Nukleinsäuren an dem Material gebunden. Das Verschlußelement verbindet daher die Öffnung des ersten Gefäßes mit der Öffnung eines zweiten Gefäßes, wobei zwischen diesen Öffnungen das nukleinsäurebindende Material eingebracht ist. Auf einer Seite des nukleinsäurebindenden Materials weist das Verschlußelement Mittel zur Befestigung des Elements auf dem ersten Gefäß auf. Diese Mittel richten sich nach der Geometrie des ersten Gefäßes im Bereich der Öffnung. Weist das erste Gefäß beispielsweise ein Gewinde auf, so ist das Mittel des Verschlußelements ein dazu passendes Gegengewinde. Auf der der Öffnung des ersten Gefäßes abgewandten Seite des Verschlußelements weist dieses Mittel zur Befestigung des Verschlußelements an ein zweites Gefäß auf. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, auch hier einen Schraubverschluß vorzusehen.
Das zweite Gefäß kann sowohl von seiner Gestalt als auch dem Material her dem ersten Gefäß ähneln. Insbesondere sollte jedoch das zweite Gefäß mindestens das Volumen der Probenflüssigkeit aufnehmen können. Bevorzugt ist das zweite Gefäß gleich groß wie das erste Gefäß oder es hat ein Volumen, welches so viel größer ist als das des ersten Gefäßes, daß es zusätzlich zu der Probenflüssigkeit auch noch Waschflüssigkeiten mit aufnehmen kann.
Das Verschlußelement kann aus demselben Material hergestellt sein wie die Gefäße, hier ist die Verwendung von spritzgußfähigen Kunststoffen besonders bevorzugt, weil dies die Einbringung des flüssigkeitsdurchlässigen Materials während der Herstellung des Verschlußelementes erlaubt. Das Material kann, insbesondere bei Glasfaservliesen, schon während des Spritzgußverfahrens fest in das Verschlußelement eingegossen werden. Es ist jedoch auch möglich, das Material erst später einzubringen und in dem Verschlußelement zu befestigen, z. B. durch Verkleben oder Verschweißen.
Das Verschlußelement kann weitere vorteilhafte Elemente beinhalten, z. B. einen Ansatzstutzen zum Anlegen von Unterdruck. Dieser Ansatzstutzen befindet sich bevorzugt auf der dem zweiten Gefäß zugewandten Seite des Verschlußelements.
Femer kann das Verschlußelement einen Druckausgleichsstutzen enthalten. Dieser befindet sich bevorzugt in dem dem ersten Gefäß zugewandten Teil des Verschlußelementes bzw. der dem Ansaugstutzen abgewandten Seite. Es ist bevorzugt so gestaltet, daß unter normalen Bedingungen keine Probenflüssigkeit durch ihn in die Umgebung austreten kann. Es kann sich z. B. um eine mit einem dichten Vlies verschlossene Öffnung im Bereich knapp neben dem nukleinsäurebindenden Material handeln. Ferner kann das Verschlußelement noch Einbauten enthalten, die die kontrollierte und gleichmäßige Durchströmung des nukleinsäurebindenden Materials gewährleisten. Hierzu gehört insbesondere eine Verteilung des Flüssigkeitsstroms über die gesamte verfügbare Fläche des Materials sowie die Sammlung des Flüssigkeitsstroms beim Eintritt in das zweite Gefäß, wodurch ein Verspritzen der Flüssigkeit und ein eventueller Verlust durch den Ansaugstutzen verhindert wird.
Ein für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereits gut geeignetes System basiert auf den Komponenten des käuflich erhältlichen Steriflip™ Vakuumfiltrationssystems der Firma Millipore, wobei jedoch anstelle der Sterilfiltrationsmembran ein Glasfaservlies verwendet wird. Im Folgenden wird eine auf dieser Vorrichtung beruhende bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben. 5 bis 30 ml Vollblut werden in das erste Gefäß einpipettiert. In einem ersten Schritt sollen die Zellen lysiert und aufgeschlossen werden. Hierzu werden der Probenflüssigkeit die erforderlichen Reagenzien, z. B. ein chaotropes Salz oder/und Protease, zugesetzt. Das erste Gefäß wird bevorzugt mit einem Deckel fest verschlossen und gemischt. Danach wird der Deckel entfernt und das erfindungsgemäße Verschlußelement aufgeschraubt. Entweder ist das zweite Gefäß bereits am Verschlußelement befestigt oder es wird anschließend auf das Verschlußelement auf der der Öffnung des ersten Gefäßes abgewandten Seite des nukleinsäurebindenden Materials befestigt. Anschließend wird die Probenflüssigkeit zum Durchtritt durch das nukleinsäurebindende Material veranlaßt. Dies kann einerseits bereits durch Umkippen der zusammengebauten Vorrichtung (erstes Gefäß, Verschlußelement, zweites Gefäß) oder aber auch unterstützend durch zusätzliches Anlegen von Unterdruck beim Ansatzstutzen des Verschlußelements geschehen. Während die Probenflüssigkeit durch das nukleinsäurebindende Material durchtritt, werden die in der Probe vorhandenen, nun zugänglichen Nukleinsäuren an das nukleinsäurebindende Material gebunden, während andere Probenbestandteile zusammen mit der Flüssigkeit in das zweite Gefäß übertreten. Durch den zweiten Stutzen kann Luft von außen in das erste Gefäß eindringen, und somit den im ersten Gefäß entstandenen Unterdruck ausgleichen. Die isolierten Nukleinsäuren befinden sich nun im Verschlußelement, an das flüssigkeitsdurchlässige Material gebunden. Sie können nun auf beliebige Art weiterbearbeitet werden. Da üblicherweise dem flüssigkeitsdurchlässigen Material selbst nach Durchsaugen von Luft noch gewisse Flüssigkeitsmengen der Probe anhaften, ist es bevorzugt, diese anhaftenden Reste abzuwaschen. Hierzu kann beispielsweise das erste Gefäß vom ersten Verschlußelement getrennt, z. B. abgeschraubt, und die Waschflüssigkeit auf das Material, an das die Nukleinsäuren gebunden sind, aufgegeben, z. B. aufgetropft werden. Soll eine größere Menge an Waschflüssigkeit benutzt werden, ist es möglich, einen Einfüllstutzen mit Hilfe des Mittels zur Befestigung des ersten Gefäßes am Verschlußelement zu befestigen. Die Waschflüssigkeit kann durch Anlegen von Unterdruck in das zweite Gefäß durch das Material durchgesaugt werden. Sollen die Nukleinsäuren wieder von dem flüssigkeitsdurchlässigen Material losgelöst werden, kann das zweite Gefäß vom Verschlußelement entfernt und durch ein frisches, drittes Gefäß ersetzt werden. Das dritte Gefäß kann mit Hilfe der Mittel zur Befestigung des zweiten Gefäßes am Verschlußelement befestigt werden. Danach wird, bevorzugt auf der Seite, an der das erste Gefäß befestigt war, eine Elutionsflüssigkeit aufgegeben und gewünschtenfalls mit Unterdruck durch das Material in das dritte Gefäß gesaugt. Die Elutionsflüssigkeit ist so geartet, daß die Bindung der Nukleinsäuren an das flüssigkeitsdurchlässige Material aufgehoben wird. Es ist nun möglich, die Nukleinsäuren in sehr kleinen Volumina an Elutionsflüssigkeit zu lösen. Daher kann auch das dritte Gefäß ein geringeres Volumen aufweisen als das zweite und das erste Gefäß. Somit ist die erfindungsgemäße Vorrichtung neben der Isolierung der Nukleinsäuren auch zur Überführung von Nukleinsäuren aus einem größeren Volumen in ein kleineres Volumen geeignet.
In Figur 1A ist ein Verschlußelement (1) gezeigt, welches sowohl ein erstes Schraubgewinde (2) als auch zweites Schraubgewinde (7) aufweist. Auf der Seite des Schraubgewindes (2) ist auch ein Druckausgleichsstutzen (8) vorgesehen, der mit einem dichten Vlies luftdurchlässig jedoch flüssigkeitsundurchlässig verschlossen ist. Auf Seiten des zweiten Schraubgewindes befindet sich ein Ausaugstutzen für Unterdruck (3) sowie ein Spritzschutz (5). Zwischen den Schraubgewinden befindet sich das nukleinsäurebindende Material (4)
In Figur 1B ist ein erstes Gefäß (10) mit einem Gegengewinde für das Schraubgewinde (2) (11) sowie einer nukleinsäurehaltigen Probenflüssigkeit (12) gezeigt.
In Figur IC ist das Verschlußelement (1) auf das die Probenflüssigkeit enthaltende erste Gefäß so aufgeschraubt, daß der Ansaugstutzen (3) von der Probenflüssigkeit durch das Material (4) getrennt ist. Das zweite Gefäß (20) mit einem Gegengewinde für das Schraubgewinde (7) (21) ist angedeutet.
In Figur 1D ist die zusammengebaute Vorrichtung in einem Zustand gezeigt, bei dem bereits Unterdruck angelegt wurde und ein Teil der Probenflüssigkeit durch das nukleinsäurebindende Material (4) durchgetreten ist. Die durchgetretende Flüssigkeit (22) sammelt sich im zweiten Gefäß (20). Es ist zu erkennen, daß die Vorrichtung nach Aufschrauben des zweiten Gefäßes (siehe Figur IC) umgedreht wurde (Figur 1D).
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe enthaltend ein erstes zur Aufnahme der Probe befähigtes Gefäß mit einer Öffnung und ein Verschlußelement mit einem nukleinsäurebindenden flüssigkeitsdurchlässigen Material, wobei das Verschlußelement auf einer dem ersten Gefäß abgewandten Seite Mittel zur Befestigung des Elements an einem zweiten Gefäß aufweist. Die Verbindung des ersten Gefäßes mit dem Verschlußelement soll so fest sein, daß zwischen dem Verschlußelement und dem ersten Gefäß keine Flüssigkeit nach außen und kein Gas nach innen dringen kann.
Außerdem Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer Vorrichtung mit einem ersten und einem zweiten Gefäß und einem Verschlußelement zur festen Verbindung dieser Gefäße, welches ein nukleinsäurebindendes Material enthält, zur Vermeidung von Kontaminationen bei Probenvorbereitungen für Nukleinsäurenachweise. Die von dem flüssigkeits- durchlässigen Material nach der Isolierung eluierten Nukleinsäuren können nämlich in vorteilhafter Weise zum Nachweis einzelner oder mehrerer dieser Nukleinsäuren aus der Probe verwendet werden. Entsprechende Nachweisverfahren sind dem Fachmann bekannt. Sie beinhalten insbesondere die Amplifikation der isolierten Nukleinsäuren und deren Nachweis unter Verwendung markierter Nukleinsäuresonden.
Die beschriebene Methode erlaubt die einfache Isolierung von Nukleinsäuren aus größeren Probenvolumina (> 10 ml) bei vermindertem Kontaminationsrisiko der Probe, des Bearbeiters und des Arbeitsplatzes. Die Ausbreitung von Aerosolen wird durch die Anordnung der Probengefäße und der Filtrationseinheit verhindert. Die Lyse und die weitere Aufarbeitung der Probe kann bequem zeitlich und räumlich versetzt erfolgen, ohne daß ein Gefäßwechsel erforderlich ist (z. B. dezentrale Probenentnahme und Lyse/Stabilisierung).
Das folgende Beispiel soll die vorliegende Erfindung näher erläutern.
Beispiel
AπvBeispiel einer Nukleinsäureanalyse aus 20 ml Vollblut, z. B. Nachweis von Transloka- tion 9:22 bei Leukämien oder Prostata-Membran-Antigen (PMA) auf Basis der tumorassoziierten Genexpression durch reverse Trankriptase-PCR (RT-PCR) soll die vorliegende Erfindung beschrieben werden. Zur Illustration dient die Abb. 1.
Alle Arbeiten werden unter den üblichen Laborbedingungen für die Handhabung potentiell pathogenen Humanmaterials durchgeführt. 10 ml Vollblut werden mit 10 ml Lyse-Puffer (6 M Guanidinium-HCl, 10 mM Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, 20 % Triton X-100 (v/v), pH 4.4 (25 °C), in einem 50 ml-Polypropylen-Gefäß (Millipore SC50 TB1 00) versetzt. Es werden 2 ml einer Proteinase K-Lösung (20 mg/ml, Boehringer Mannheim, Kat. No. 1000 144) zugesetzt, das Gefäß verschlossen und sofort gut auf einem Vortex-Mischer gemischt. Anschließend wird für 10 Minuten bei 70 °C inkubiert. Das Gefäß wird abgekühlt, kurz anzentrifügiert (Heraeus Sepatech Varifüge 3.0R), geöffnet und 5 ml i-Propanol zugegeben und gut gemischt. Eine Filtrationseinheit, Steriflip™ (Milllipore), welche anstelle der Millipore Express™ Membran 2 Lagen Glasvlies (z. B. Gelman S80100 A/E Glassfaser, S80352 A/F Glassfaser, S80348 A C Glassfaser, S80038 Extra dick Glassfaser, geklebt oder verschweißt) enthält, wird auf das Deckelgewinde aufgeschraubt.
Die Filtrationseinheit trägt am Auslauf der dem ersten Gefäß abgewandten Seite des Glasvlieses ein weiteres 50 ml-Probengefäß, welches über einen Anschluß, der an der Filtrationseinheit sitzt, unter Unterdruck gesetzt werden kann. Ein solches Probengefäß kann beispielsweise der Steriflip™ Filter Unit (Millipore, Kat. No. SCGP 005 25) entnommen werden. Die zusammengesetzte Einheit wird nun so orientiert (z. B. gedreht), daß sich das lysierte Probenmaterial im oberen Behälter befindet, und Vakuum angelegt (z B. Wasserstrahlvakuum). Die Vakuumlinie wird üblicherweise durch einen entsprechenden Filter (z. B. Millipore Kat. No. SLFG 050 10) vor Kontamination geschützt. Beim Passieren der Probe durch das Glasvlies werden Nukleinsäuren an die Glasvliesoberfläche gebunden, während der überwiegende Teil der Proteine, Lipide und anderen Bestandteile des Probenmaterials das Vlies durchlaufen (Durchlauf). Nun wird das obere (erste) Gefäß entfernt und durch einen Zylinder ersetzt (z. B. Millipore Steriflipfünneltop Kat. No. SC05 FLO 25). Bei angelegtem Vakuum werden nun 2 x 10 ml eines Waschpuffers (20 ml NaCl, 2 mM Tris-HCl, 80 % Ethanol (v/v), pH 7,5 (25 °C), durch das Glasvlies gesaugt. Zum Schluß wird der Zylinder durch einen Deckel ersetzt und die Einheit zentrifügiert, um restlichen Waschpuffer aus dem Glasvlies zu entfernen. Alternativ kann das Vlies auch durch Durchsaugen steriler Luft getrocknet werden. Nun wird das Gefäß mit dem Durchlauf entfernt und gegen ein frisches, steriles Gefäß ersetzt. Auf das Vlies werden 1 - 2 ml eines auf 70 °C vorgewärmten Elu- tionspuffers (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) aufgetragen und mit Vakuum durchgesaugt. Um eine optimale Ausbeute zu erhalten, wird die Einheit abschließend bei ca. 8000 x g zentrifügiert. Die isolierte Nukleinsäure befindet sich im Eluat und enthält sowohl DNA als auch RNA und ist nun für die Verwendung in der PCR oder RT-PCR geeignet.
Bezugszeichenliste
1 Verschlußelement
2 erstes Schraubgewinde
3 Ansaugstutzen für Unterdruck
4 nukleinsäurebindendes Material (Vlies)
5 Spritzschutz
6 Anschlag für Schraubgewinde
7 zweites Schraubgewinde
8 Druckausgleichsstutzen
10 erstes Gefäß
11 Gegengewinde für 2
12 nukleinsäurehahige Probenflüssigkeit
20 zweites Gefäß
21 Gegengewinde für 7
22 durchgetretene Flüssigkeit

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe durch
a) Aufnahme der Probe in ein erstes Gefäß durch eine Öffnung,
b) Verschluß der Öffnung des ersten Gefäßes mit einem Verschlußelement, welches ein nukleinsäurebindendes, flüssigkeitsdurchlässiges Material enthält und welches auf seiner der Öffnung zugewandten Seite Mittel zur Befestigung des Elements auf dem ersten Gefäß und auf der anderen Seite des Materials Mittel zur Befestigung des Elements an einem zweiten Gefäß enthält, und
c) Transfer der Probe durch das Material in das auf der anderen Seite angebrachte Gefäß.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren nach Aufnahme der Probe in das erste Gefäß durch Lyse aus Zellen freigesetzt werden.
3. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt
d) Elution der Nukleinsäuren aus dem nukleinsäurebindenden Material.
4. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe im ersten Gefäß vor Transfer der Probe durch das Material durch Drehen des Gefäßes mit dem Material in Kontakt gebracht wird.
5. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Transfer der Probe durch Anlegen eines Unterdrucks in dem zweiten Gefäß bewirkt wird.
6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Gefäß ein Volumen von mehr als 5 ml aufweist.
7. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das nukleinsäurebindende Material ein Glasvlies oder eine Membran ist, welche Metalloxide, Metallmischoxide, Silicagel, Aluminiumoxid, Zeolithe, Titanoxid oder Zirkonoxid in Form von Fasern oder Partikeln enthält.
8. Vorrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe, enthaltend ein erstes zur Aufnahme der Probe befähigtes Gefäß mit einer Öffnung und ein Verschlußelement mit einem nukleinsäurebindenden flüssigkeitsdurchlässigen Material, wobei das Verschlußelement auf einer dem ersten Gefäß abgewandten Seite Mittel zur Befestigung des Elements an einem zweiten Gefäß aufweist.
9. Vorrichtung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung ein zweites Gefäß enthält.
10. Verwendung einer Vorrichtung mit einem ersten und einem zweiten Gefäß und einer festen Verbindung zwischen diesen Gefäßen, die ein nukleinsäurebindendes Material enthält, zur Vermeidung von Kontaminationen bei Probenvorbereitungen für Nukleinsäurenachweisen.
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US09/355,365 US6720417B1 (en) 1997-01-28 1998-01-26 Method and device for refining nucleic acids
AU62132/98A AU6213298A (en) 1997-01-28 1998-01-26 Method and device for refining nucleic acids
US10/786,835 US20040166524A1 (en) 1997-01-28 2004-02-25 Method and device for purifying nucleic acids

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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002522092A (ja) * 1998-08-12 2002-07-23 アンティゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 血液を採取するための容器
JP2002537781A (ja) * 1999-02-26 2002-11-12 モザイク テクノロジーズ 固定化捕捉プローブを有する生化学的精製装置およびその使用
WO2003019131A2 (de) * 2001-08-29 2003-03-06 Hexal Pharma Gmbh Verfahren und vorrichtung zur vorbereitung einer biologischen urprobe für die bestimmung zumindest einer darin enthaltenen komponente
JP2003516156A (ja) * 1999-12-10 2003-05-13 アルファヘリックス・アクチボラゲット サンプルおよび試薬を取り扱う方法およびデバイス
JP2003524782A (ja) * 2000-02-15 2003-08-19 アンティゲン ビオテヒ ゲーエムベーハー 核酸の分析のための容器
US6720417B1 (en) * 1997-01-28 2004-04-13 Roche Diagnostics Gmbh Method and device for refining nucleic acids
JP2008245649A (ja) * 1997-10-23 2008-10-16 Qiagen Gmbh 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段
EP2055385A1 (de) 2007-10-31 2009-05-06 Roche Diagnostics GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Reinigung von Nukleinsäuren
US7897378B2 (en) 2004-03-18 2011-03-01 Roche Molecular Systems, Inc. Method and device for purifying nucleic acids

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004080357A1 (es) 2003-03-14 2004-09-23 Ferreyro Irigoyen Roque Humber Dispositivo hidraulico de inyección de cemento oseo en la vertebroplastiá percutánea
US8066713B2 (en) 2003-03-31 2011-11-29 Depuy Spine, Inc. Remotely-activated vertebroplasty injection device
US7267950B2 (en) * 2003-05-01 2007-09-11 Veridex, Lcc Rapid extraction of RNA from cells and tissues
US8415407B2 (en) 2004-03-21 2013-04-09 Depuy Spine, Inc. Methods, materials, and apparatus for treating bone and other tissue
US8579908B2 (en) 2003-09-26 2013-11-12 DePuy Synthes Products, LLC. Device for delivering viscous material
CA2575699C (en) 2004-07-30 2014-07-08 Disc-O-Tech Medical Technologies Ltd. Methods, materials and apparatus for treating bone and other tissue
DE102004058828B4 (de) * 2004-10-28 2010-08-19 Progen Biotechnik Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur parallelen Aufbereitung von Biopolymeren
US20060166223A1 (en) * 2005-01-26 2006-07-27 Reed Michael W DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces
US9381024B2 (en) 2005-07-31 2016-07-05 DePuy Synthes Products, Inc. Marked tools
US9918767B2 (en) 2005-08-01 2018-03-20 DePuy Synthes Products, Inc. Temperature control system
US8360629B2 (en) 2005-11-22 2013-01-29 Depuy Spine, Inc. Mixing apparatus having central and planetary mixing elements
US7608399B2 (en) * 2006-06-26 2009-10-27 Blood Cell Storage, Inc. Device and method for extraction and analysis of nucleic acids from biological samples
US8163535B2 (en) * 2006-06-26 2012-04-24 Blood Cell Storage, Inc. Devices and processes for nucleic acid extraction
KR100805449B1 (ko) 2006-08-18 2008-02-20 배정훈 비석분말을 분자체로 이용하여 아가로스겔에서 dna를정제하는 방법
WO2008032322A2 (en) 2006-09-14 2008-03-20 Depuy Spine, Inc. Bone cement and methods of use thereof
CA2747850C (en) * 2006-10-19 2013-05-14 Depuy Spine, Inc. Fluid delivery system
WO2008075501A1 (ja) 2006-12-19 2008-06-26 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. 回転式抽出容器、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、及び自動核酸抽出装置
JP2010537797A (ja) * 2007-05-23 2010-12-09 ニプロ インク 真空濾過システム中の泡の制御のための方法及び装置
ATE548095T1 (de) * 2007-07-26 2012-03-15 Roush Life Sciences Llc Verfahren und vorrichtung zur abstützung einer vakuumfiltrationsvorrichtung
WO2009014768A1 (en) * 2007-07-26 2009-01-29 Nypro Inc. Method and apparatus for filtrate storage handling
US20090048438A1 (en) * 2007-08-13 2009-02-19 Taigen Bioscience Corporation. Method for washing a column and method for extracting membrane-bound target molecules
AU2009313556A1 (en) * 2008-11-04 2010-05-14 Blood Cell Storage, Inc. Nucleic acid extraction on curved glass surfaces
WO2012159063A2 (en) 2011-05-19 2012-11-22 Blood Cell Strorage, Inc. Gravity flow fluidic device for nucleic acid extraction
WO2014190249A1 (en) * 2013-05-24 2014-11-27 Occam Biolabs, Inc. System and method for collecting a sample of nucleic acid
RU2020124757A (ru) 2014-11-21 2021-06-30 Оккам Байолэбс, Инк. Система и способ сбора образца нуклеиновой кислоты
WO2019023440A1 (en) * 2017-07-27 2019-01-31 Biomerieux, Inc. INSULATION TUBE

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991007648A1 (en) * 1989-11-08 1991-05-30 Fmc Corporation Combined centrifuge tube and porous selection means for separation and recovery of biological materials
WO1995006652A1 (en) * 1993-08-30 1995-03-09 Promega Corporation Nucleic acid purification compositions and methods
US5438128A (en) * 1992-02-07 1995-08-01 Millipore Corporation Method for rapid purifiction of nucleic acids using layered ion-exchange membranes
WO1995027546A1 (en) * 1994-04-08 1995-10-19 Amicon, Inc. Method and apparatus for isolation and purification of biologically active complexes
WO1996006850A1 (en) * 1994-08-29 1996-03-07 Akzo Nobel N.V. Device for use in the isolation of a biological material such as nucleic acid
DE19512369A1 (de) * 1995-04-01 1996-10-02 Boehringer Mannheim Gmbh Vorrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren
EP0734768A1 (de) * 1995-04-01 1996-10-02 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur Bindung eines biologischen Materials
WO1997021484A1 (en) * 1995-12-08 1997-06-19 Orbital Biosciences, L.L.C. Microconcentrator device

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19702907A1 (de) * 1997-01-28 1998-07-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Reinigung von Nukleinsäuren
DE19725190A1 (de) * 1997-06-14 1998-12-17 Innova Gmbh Vorrichtungen mit integrierten Elektroden aus elektrisch leitfähigen Kunststoffen
CA2304017C (en) * 1997-09-17 2007-05-01 Gentra Systems, Inc. Apparatuses and methods for isolating nucleic acid

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991007648A1 (en) * 1989-11-08 1991-05-30 Fmc Corporation Combined centrifuge tube and porous selection means for separation and recovery of biological materials
US5438128A (en) * 1992-02-07 1995-08-01 Millipore Corporation Method for rapid purifiction of nucleic acids using layered ion-exchange membranes
WO1995006652A1 (en) * 1993-08-30 1995-03-09 Promega Corporation Nucleic acid purification compositions and methods
WO1995027546A1 (en) * 1994-04-08 1995-10-19 Amicon, Inc. Method and apparatus for isolation and purification of biologically active complexes
WO1996006850A1 (en) * 1994-08-29 1996-03-07 Akzo Nobel N.V. Device for use in the isolation of a biological material such as nucleic acid
DE19512369A1 (de) * 1995-04-01 1996-10-02 Boehringer Mannheim Gmbh Vorrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren
EP0734768A1 (de) * 1995-04-01 1996-10-02 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur Bindung eines biologischen Materials
WO1997021484A1 (en) * 1995-12-08 1997-06-19 Orbital Biosciences, L.L.C. Microconcentrator device

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6720417B1 (en) * 1997-01-28 2004-04-13 Roche Diagnostics Gmbh Method and device for refining nucleic acids
JP2008245649A (ja) * 1997-10-23 2008-10-16 Qiagen Gmbh 表面における核酸の単離及び精製のための方法並びに手段
USRE43389E1 (en) 1998-08-12 2012-05-15 Preanalytix Gmbh Vessel for blood sampling
JP2002522092A (ja) * 1998-08-12 2002-07-23 アンティゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 血液を採取するための容器
JP2002537781A (ja) * 1999-02-26 2002-11-12 モザイク テクノロジーズ 固定化捕捉プローブを有する生化学的精製装置およびその使用
JP2003516156A (ja) * 1999-12-10 2003-05-13 アルファヘリックス・アクチボラゲット サンプルおよび試薬を取り扱う方法およびデバイス
US7282371B2 (en) 2000-02-15 2007-10-16 Preanalytix Gmbh Container for nucleic acid analysis
CN100341625C (zh) * 2000-02-15 2007-10-10 普里阿勒蒂克斯有限公司 用于核酸分析的容器
JP2003524782A (ja) * 2000-02-15 2003-08-19 アンティゲン ビオテヒ ゲーエムベーハー 核酸の分析のための容器
WO2003019131A3 (de) * 2001-08-29 2003-11-27 Hexal Pharma Gmbh Verfahren und vorrichtung zur vorbereitung einer biologischen urprobe für die bestimmung zumindest einer darin enthaltenen komponente
US7456024B2 (en) 2001-08-29 2008-11-25 Hexal Pharma Gmbh Method and device for preparing a sample of biological origin in order to determine at least one constituent contained therein
WO2003019131A2 (de) * 2001-08-29 2003-03-06 Hexal Pharma Gmbh Verfahren und vorrichtung zur vorbereitung einer biologischen urprobe für die bestimmung zumindest einer darin enthaltenen komponente
US7897378B2 (en) 2004-03-18 2011-03-01 Roche Molecular Systems, Inc. Method and device for purifying nucleic acids
US8158349B2 (en) 2004-03-18 2012-04-17 Roche Molecular Systems, Inc. Method and device for purifying nucleic acids
US8927261B2 (en) 2004-03-18 2015-01-06 Roche Molecular Systems, Inc. Method and device for purifying nucleic acids
EP2055385A1 (de) 2007-10-31 2009-05-06 Roche Diagnostics GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Reinigung von Nukleinsäuren
US8951780B2 (en) 2007-10-31 2015-02-10 Roche Molecular Systems, Inc. Method and device for purifying nucleic acids

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