FI60407C - Saett att odla foerankringsberoende celler i en mikrobaerarkultur - Google Patents

Description

EÄSP*1 [Bl f11, KUULUTUSJULKAISU /λ ι Λη

JgTft LBJ UTLAGG NINGSSKRI FT 604 0 7 φφτΛχ· C Patentti myönnetty 11 01 1982 JS&V7& Patent »eddelat V y X (51) Kv.ik.3/»nt.ci.3 C 12 N 5/00

SUOMI —FINLAND (21) Pit*nttlh*k«rmi« — Ptt«nun*6knlng 77 3 3TT

(22) Hakamltpllvl — Antaknlng«dk| 10.11.77 (23) Alkuptivi—GlhlghMsdag 10.11.77 (41) Tullut (ulkltakai — Bllvic oftoitllg 12.05-78

Patentti- ja rekisterihallitut .... .... .... .....

__. . . . . (44) Nlhaviktlpanon a kuuLJulkalaun pvm.— „

Patent- och registerstyrelsen ' ' Antökan utlagd och utl.*krifcen pubtkarad 30.09· 8l (32)(33)(31) Pyydetty atuolkaut—Begird prkxitet 11.11.76 USA(US) 7^0993 (71) Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Mass., USA(US) (72) David W. Levine, Somerville, Mass., William G. Thilly, Cambridge,

Mass., Daniel I.C. Wang, Belmont, Mass., Jason S. Wong, Toledo,

Ohio, USA(US) (TM Oy Kolster Ab (5*0 Tapa viljellä kiinnittymisestä riippuvaisia soluja mikrokantajavil-jelmässä - Sätt att odla förankringsberoende celler i en mikrobärar-kultur

Keksinnön kohteena on tapa viljellä kiinnittymisestä riippuvaisia soluja mikrokantajaviljelmässä soluviljelmien ja mahdollisesti soluviljelystä saatavien tuotteiden, kuten viruksien, hormoonien tai interferonin valmistamiseksi, jolloin muodostetaan positiivisesti varattujen mikrokantajien ja kiinnittymisestä riippuvaisten solujen suspensio sopivassa viljelyväliaineessa sellaisen mikrokantaj asoluviljelmän aikaansaamiseksi, joka pidetään solujen kasvuolosuhteissa ja joka sen jälkeen mahdollisesti pidetään sellaisissa olosuhteissa, jotka edistävät soluviljelmästä saatavien tuotteiden muodostumista, jotka sitten otetaan talteen.

On tärkeätä, että nisäkässoluja kyetään viljelemään sekä laboratorio-että tehdasmittakaavassa. Laboratoriomittakaavassa on solu- tai virustutkimuksissa rajoittavana tekijänä usein käytettävissä oleva tutkittavan raaka-aineen määrä. Teollisessa mittakaavassa on nähty paljon vaivaa nisäkässolutuotteisiin pohjautuvien farmaseuttisten valmisteiden kehittämiseen. Nämä ovat etupäässä rokotteita ihmisten ja eläinten viruksia vastaan, mutta käsittävät myös ihmisen kasvuhormonin ja muita kehon hormoneja sekä biokemiallisia aineita lääketieteellisiä sovellutuksia varten.

2 60407

Tietyt nisäkässolutyypit ovat soveltuneet viljeltäviksi suspensioviljeliöissä. Esimerkkejä tällaisista solutyypeistä ovat HeLa- (ihmisen), BHK- (hamsterin poikasen munuainen) ja L-solut (hiiri). Tällaisilla soluilla ei yleensä ole epänormaaleja perinnöllisiä komplementtejä, ts. liian paljon tai liian vähän kromosomeja tai epänormaaleja kromosomeja. Usein nämä solut saavat aikaan kasvaimen, kun niitä annetaan ruiskeena ko. lajin eläimelle.

Tähän asti ei muita nisäkässolytyyppejä ole käytetty viljelyyn suspensio-viljelmissä ja ne kasvavat ainoastaan, jos ne saatetaan kiinnittymään sopivalle pinnalle. Tällaisia solutyyppejä kutsutaan yleisesti "kiinnittymisestä riippuvaisiksi" ja niihin kuuluvat 3T3-hiirifibroblastit, hiiren luuytimen epiteelisolut, hiirifibroblastien Muridae-verisyöpäviruksia tuottavat kannat, primaariset ja sekundaariset kananpojan fibroblastit, WI-38 ihmisen fibroblastit ja normaalit ihmisen sikiön keuhkofibroblastit (HEL299» ATCC no. CCL13T)· Joitakin sellaisia kiinnittymisestä riippuvaisia soluja, jotka aiheuttavat kasvaimia on viljelty; toisten viljeltyjen kiinnityksestä riippuvaisten solujen taas on havaittu olevan ei-kasvaimia aiheuttavia. Voidaan myös viljellä tiettyjä kiinnittymisestä riippuvaisia soluja, kuten WI-38 ja HEL-299j jotka ovat perinnöllisesti normaaleja.

Vaikka on tapahtunut huomattavaa edistymistä suuressa mittakaavassa tapahtuvassa nisäkässoluviljelyssä käytettäessä solulinjoja, jotka pystyvät kasvamaan suspensioviljelmässä, on edistys ollut hyvin rajoitettua, mitä tulee kiinnittymisestä riippuvaisten nisäkässolujen viljelyyn suuressa mittakaavassa. Aikaisemmat työskentelymenetelmät, joita on käytetty kiinnittymisestä riippuvaisten solujen viljelyyn suuressa mittakaavassa, perustuvat pienmittakaavaisten menetelmien suoraviivaiseen laajentamiseen. Soluviljelylaitokset käyttävät suurta määrää piensaantoisia panosreaktoreita maljojen, lääkepullojen, pyörivien viljely-putkien ja viljelypullojen muodossa. Jokainen näistä on itsenäinen yksikkö tai eristetty panosreaktori, joka vaatii yksilöllistä ympäristösäätöä. Nämä säädöt ovat kuitenkin taloudellisista syistä johtuen laadultaan hyvin alkeellisia. Ravinteiden muutos korjataan vaihtamalla väliaine, toimenpide, joka vaatii kaksi vaihetta, ts. väliaineen poiston ja väliaineen lisäämisen. Koska ei ole epätavallista, että kohtalaisen kokoisesta laitoksessa samanaikaisesti käsitellään satoja tällaisia panosreaktoreita, vaatii jopa yksi ainoa väliaineen muutos satoja työvaiheita, jolloin kaikki näistä täytyy suorittaa tarkasti ja vaativissa steriileissä olosuhteissa. Jokainen monivaihetyö, kuten solunvaihto tai talteenotto, monimutkaistuttaa vastaavasti ongelmaa. Sen tähden tämäntyyppisessä laitoksessa kustannukset ovat laitteiston, tilan ja ihmeistyövoiman suhteen suuret.

3 60407

On olemassa vaihtoehtoisia menetelmiä, joita on ehdotettu pienten panos-viljelyjen suoraviivaiseksi suurentamiseksi. Tällaisia vaihtoehtoja, joita on selostettu kirjallisuudessa, ovat muovipussit, päällekkäin ladotut maljat, kierukkakalvot, viljely lasihelmillä, keinokapillaarit ja mikrokantajat. Näistä on mikrokantajajärjestelmillä tiettyjä huomattavia ja ainutlaatuisin etuja. Voidaan esimerkiksi huomattavasti parantaa saavutettavissa olevaa viljelypinta-alan ja astian tilavuuden (S/V) välistä suhdetta käyttämällä mikrokantajia, verrattuna sekä tavanomaisiin että viime aikoina kehitettyihin vaihtoehtoisiin menetelmiin. Saavutettavissa olevan suhteen S/V kasvu sallii omana yksikkönä homogeenisen tai näennäishomogeenisen panos- tai puolipanos-lisääntymislaitteen rakentamisen suurta tilavuustuottoa varten. Siten yksi ainoa sekoitettava säiliö, jossa on yksinkertainen palautussyöttösäätö pH:ta ja pC^ta varten, muodostaa homogeenisen ympäristön suurta solumäärää varten, minkä ansiosta kalliiden ja tilaa vaativien ympäristösäädettävien inkubaattoreiden tarve poistuu. Ifyös vaadittavien työvaiheiden kokonaislukumäärä yksikköä kohti tuotettuja soluja vähenee suuresti. Yhteenvetona sanottakoon, että mikrokantajat näyttävät olevan hyvin taloudellisia mitä tulee pääomaan, tilaan ja ihmistyövoimaan valmistettaessa kiinnittymisestä riippuvaisia soluja, verrattuna tavallisiin valmistusmenetelmiin.

Mikrokantajilla on myös se etu, että ympäristö on jatkuva, koska soluja viljellään yhdessä ainoassa valvotussa ympäristössä. Siten mikrokantajia käyttämällä on mahdollista viljellä kiinnittymisestä riippuvaisia nisäkässoluja säädettävissä ympäristöolosuhteissa muuttumattoman, optimaalisen solukasvun aikaansaamiseksi. Eräs nykyään lupaavimmista mikrokantajajärjestelmistä, joka käsittää dietyyliaminoetyyli(DEAE)-substituoituja dekstraanihelmiä sekoituksen-alaisessa säiliössä, on esitetty julkaisussa A.L. van Wezel, "Growth of Cell Strains and Primary Cells on Microcarriers in Homogeneous Culture", Nature 216:6U (1967); D. van Hemert, D.G. Kilbrun ja A.L. van Wezel, "Homogeneous Cultivation of Animal Cells for the Production of Virus and Virus Products", Biotechnol. Bioeng. 11:875 (1969); sekä A.L. van Wezel, "Microcarrier Cultures of Animal Cells Tissue Culture, Methods and Applications, P.F., Academic Press, New York, sivu 372 (1973). Näitä helmiä valmistaa kaupallisesti Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, New Jersey, kauppanimellä DEAE-Sephadex A50, ioninvaihto järjestelmä. Kemiallisesti nämä helmet muodostetaan ristisidotusta dekst-raanimatriisista, jossa on dietyyliaminoetyyliryhmiä kovalenttisesti sidottuina dekstraaniketjuihin. Näiden kaupallisesti saatavien DEAE-Sephadex A50-helmien hiukkaskoko lienee Uo-200 jm ja positiivinen varauskapasiteetti noin 5,^ mekv/g kuivaa, ristisidottua dekstraania (jolloin liittyneiden DEAE-yksiköiden painoa ei 11 60407 ole otettu huomioon). Myös muiden ani on i vai ht oh art s i en, kuten DEAE-Sephadex A25 , QAE-Sephadex A50 ja QAE-Sephadex A25, on esitetty vahvistavan solukasvua.

Van Wezelin ehdottamassa järjestelmässä on yhdistelty moninkertaisia pintoja liikkuvien pintojen kanssa, mikä antaa mahdollisuuden innovatiiviselle manipulaatiolle ja mistä on etuja tuotannon lisäämisen ja ympäristösäädön kannalta. Tästä mahdollisuudesta huolimatta ei näitä ehdotettuja menetelmiä ole merkittävästi käytetty hyväksi, sillä tutkijoilla on ollut vaikeuksia valmistaa soluja, mikä johtuu tietyistä helmien aiheuttamista haitallisista vaikutuksista. Näitä, ovat soluympin prosentuaalisesti suuri solukuolemien määrä ja riittämätön solu-kasvu niilläkin soluilla, jotka kiinnittyvät. Syytä näihin vahingollisiin vaikutuksiin ei täysin ymmärretä; on ehdotettu, että ne voivat johtua helmien myrkyllisyydestä tai ravintoaineadsorptiosta. Ks. van Wezel, A.L. (1967), Nature 216: 6U-65; van Wezel, A.L. (1973), Tissue Culture Methods and Applications, sivu 372-377, Academic Press, New York; van Hemert. P., Kilhurn, D.G. ja van Wezel, A.L. (1969), Biotechnol. Bioeng. 11: 875-885; Horng. C. ja McLimans, W. (1975), Biotechnol. Bioeng. 17: 713-732.

Saattaa olla, että näiden kaupallisesti saatavien ioninvaihtohartsien vahingolliset vaikutukset johtuvat niiden valmistustavasta. Eräitä näistä menetelmistä on kuvattu polyhydroksimateriaalin valmistuksen yhteydessä US-paten-teissa 3 277 025; 3 275 576; 3 Oi+2 667 ja 3 208 99^; olkoonpa syy mikä tahansa, nykyään kaupallisesti saatavat aineet eivät kuitenkaan yksinkertaisesti ole riittäviä lukuisten erilaisten solutyyppien hyvää viljelyä varten.

Erästä ratkaisua näiden vahingollisten vaikeuksien voittamiseksi yritettäessä käyttää kaupallisesti saatavia mikrokantajia solujen kasvattamiseen, on kuvattu Levine'in ai US-patentissa U 036 693. Mainitussa patentissa on ehdotettu menetelmää näiden kaupallisesti saatavien ioninvaihtohartsien käsittelemiseksi makromolekyyli sillä polyanioneilla, kuten karboksimetyyliselluloosalla. Vaikka tämä menetelmä on osoittautunut menestykselliseksi, olisi tietenkin edullisempaa, jos helmet voitaisiin valmistaa niin, että niillä alunperin on ominaisuuksia, jotka on tarkoitettu kiinnittymisestä riippuvaisten solujen menestyksellistä viljelyä varten.

Nyt on keksitty, että mikrokantajien varauskapasiteetti täytyy sovittaa ja/tai säätää tietylle alueelle useiden erilaisten kiinnittymisestä riippuvaisten solutyyppien hyvän kasvun saamiseksi kohtuullisilla mikrokantajapitoisuuksi11a. Tähän havaintoon perustuen on valmistettu mikrokantajahelmiä, joilla on säädetyt varauskapasiteetit ja tällaisia helmiä on käytetty hyvän kasvun saamiseksi lukuisilla kiinnittymisestä riippuvaisilla soluilla. Soluja, jotka on viljelty käyttäen tällaisia mikrokantajajärjestelmiä, voidaan korjata talteen tai käyttää valmistettaessa eläin- tai kasviviruksia, rokotteita, hormoneja, interferonia tai muita soluviljelyn avulla valmistettavia tuotteita.

5 60407

Esimerkkinä parannetuista mikrokantajista ovat sellaiset,jotka on valmistettu käyttäen polymeerejä, joissa on hydroksyyliryhmiä, kuten ristisidottuja dekst-raanihelmiä. Näitä helmiä voidaan käsitellä tertiäärisen tai kvaternäärisen amiinin, kuten dietyyliaminoetyylikloridi:kloridivesiliuoksella ja alkali sella aineella, kuten natriumhydroksidilla. Helmien ominaisvarauskapasiteettia säädetään vaihtelemalla dekstraanin, tertiäärisen amiinisuolan ja aikaiison aineen absoluuttisia määriä, näiden aineiden suhteita ja/tai käsittelyaikaa ja -lämpötilaa.

Mikrokantajia, jotka on valmistettu tämän keksinnön mukaisesti, voidaan käyttää viljelmissä ilman suuria soluhäviöitä, joita tähän asti on esiintynyt kaupallisesti saatavilla mikrokantajilla. Sen lisäksi kiinnittyneet solut levittyvät ja kasvavat yhtyen helmillä, jolloin saavutetaan erittäin suuria solupitoi-suuksia suspensioaineessa. Mikrokantajien pitoisuus suspensiossa ei ole rajoitettu hyvin alhaisille tasoille, niin kuin on ollut tavallista aikaisemmin tunnetuilla aineilla; solukasvua rajoittavat ainoastaan tekijät, jotka eivät näytä olevan mikrokantajiin liittyviä. Tästä seuraa, että soluviljelmien tilavuustuottavuus lisääntyy suuresti. Lyhyesti voidaan sanoa, että potentiaali, joka tarjoutuu mikrokantajien käytöstä soluja viljeltäessä ja erityisesti kiinnittymisestä riippuvaisia soluja viljeltäessä, voidaan nyt käyttää hyväksi.

Kuvio 1 on graafinen esitys, joka kuvaa normaaleja, diploidisia ihmisen sikiökeuhkofibrcblastisolujen (HEL299) kasvuominaisuuksia mikrokantajapitoisuudella 2 g kuivaa, ristisidottua, dekstraania/l sekä kaupallisesti saataville DEAE-käsitellyille dekstraanimikrokantajille sekä DEAE-käsitellyille mikrokantajille, jotka on valmistettu tämän keksinnön mukaisesti; kuvio 2 esittää graafisesti sekä normaalien, diploidisten, ihmisen sikiö-keuhkofibroblastisolujen (HEL299) ja sekundaaristen kananpoikien sikiöfibrobiasti-solujen kasvuominaisuuksia mikrokantajapitoisuudella 5 g kuivaa, ristisidottua dekstraania/l käyttäen tämän keksinnön mukaisia parannettuja DEAE-käsiteltyjä mikrokantajia.

Tässä käytetyillä ilmaisuilla "mikrokantaja" ja "soluviljelymikrokantaja" tarkoitetaan pieniä, vapaita hiukkasia, jotka sopivat solujen kiinnittymiseen ja viljelyyn. Usein, vaikkakaan ei aina, mikrokantajat ovat huokoisia helmiä, jotka on muodostettu polymeereistä. Tavallisesti solut kiinnittyvät ja kasvavat tällaisten helmien ulkopinnalla.

Kuten aikaisemmin on selostettu, on keksitty, että varauskapasiteetin määrä soluviljelymikrokantajilla täytyy sovittaa ja/tai säätää niin, että se on tietyllä alueella sopivan solukasvun aikaansaamiseksi mikrokantajapitoisuuden ollessa kohtuullinen. Sopivat toiminta-alueet ja edulliset alueet vaihtelevat sellaisten tekijöiden kuin viljeltävien solujen, mikrokantajien luonteen, mikrokantajien 6 60407 pitoisuuden ja muiden viljelyparametrien mukaan, väliaineen koostumus mukaanluettuna. Kaikissa tapauksissa on kuitenkin sopivan varauskapasiteetin määrän havaittu olevan merkittävästi alle niiden määrien, joiden uskotaan olevan läsnä kaupallisesti saatavissa anioninveihtohartseissa, joita aikaisemmin on ehdotettu mikrokantajasoluviljelmiä varten. Esimerkiksi DEAE-Sephadex A50-helmien, joita van Wezel ehdotti, varauskapasiteetti lienee noin 5»^ mekv/g kuivaa, käsittelemätöntä (ilman DEAE), ristisidottua dekstraania. Vastakohtana tälle suhteellisen korkealle varauskapasiteetille on valmistettu mikrokantajia ja havaittu niiden olevan sopivia soluviljelyyn tämän keksinnön mukaisesti, jolloin näiden varauskapasiteetti on n. 0,1- n. U,5 mekv/g kuivaa, käsittelemätöntä mikrokantajaa. N. 0,1 mekv/g:n alapuolella otaksutaan, että solujen on vaikea kiinnittyä mikrckantajalle. N. i+,5 mekv/g:n yläpuolella tapahtuu häviöitä, jotka johtuvat alkusoluympistä, eivätkä myöskään eloon jääneet solut kasva hyvin, erityisesti suhteellisen suurilla mikrokantajapitoisuuksilla.

Normaalien, diploidisten ihmisfibroblastien viljelyä varten ristisidotuil]a dekstraari-mikrokantajilla on havaittu, että edullinen alue DEAE-ryhmien antamalle varauskapasiteetille on n. 1,0-2,8 mekv/g kuivaa, käsittelemätöntä, risti-sidottua dekstraania. Vaikka edullinen alue voi vaihdella eri solutyypeillä tai eri viljelyolosuhteiden mukaan, uskotaan, että edulliset alueet kaikissa olosuhteissa tulevat olemaan alueelta 0,1-^,5 mekv/g. Optimiolosuhteet voi alan ammattimies määrittää rutiinikokein.

On tietenkin huomattava, että mikrokantajien varauskapasiteetin määrittelemisessä ainoastaan painoyksikköpohjalta on tiettyjä puutteita. Esimerkiksi kaksi helmeä, jotka ovat samanlaisia kaikissa muissa suhteissa paitsi että ne on muodostettu eri aineista, joilla on erilaiset tiheydet ja sama varauksen jakauma, antaisivat varauskapasiteetille yksikköpainoa kohti eri arvot. Samalla tavalla voi kahdella helmellä, joilla on samat varauskapasiteetit yksikköpainoa kohti, olla täysin erilainen varauksen jakamaa.

Vaihtoehtoinen varauskapasiteetti voidaan määritellä esittämällä sopivien varausten alue ilmaistuna varauskapasiteettina mikrokantajien yksikköpainoa kohti niiden lopullisessa toiminnallisessa muodossa. Tällöin on otettu huomioon sellaiset tekijät kuin liittyneiden DEAE-ryhmien tai muiden positiivisesti varautuneiden ryhmien paino sekä helmien hydratoituminen jne. , kun sitä vastoin aikaisempi määritelmä pohjautuu kuivaan, risti sidottuun dekstraaniin eikä ota tällaisia tekijöitä huomioon. Vesipitoisessa soluviljelyväliaineessa tulee mikrokantajien tiheys valita 1,0 g/ml:ksi, niin että mikrokantajat helposti voidaan dispergoida koko viljelmään. Tähän pohjautuen on määrätty, että mikrokantajien sopivien varauskapasiteettien alue keksinnön mukaisesti tällä tavalla määriteltynä on n. 0,012-0,25 mekv/g.

7 60407

Sopivien varauskapasiteettien painoperustaiset edellä määritellyt rajat ovat voimassa edellyttäen että mikrokantajilla on pääasiallisesti samankaltainen varausjakauma kautta koko massan. Jos varausjakauma on epätasainen, voitaneen käyttää mikrokantajia, joiden varauskapasiteetit ovat mainittujen rajojen ulkopuolelta. Tärkeä kriteeri on tietenkin, että varauskapasiteetti sovitetaan ja/tai säädetään arvoon, joka on riittävä hyvään solukasvuun mikrokantajilla.

Koska ulkopinnan varausjakauma voi olla tärkeä, on toivottavaa, että sopiva varauskapasiteettialue voidaan määritellä todennäköisen pintamainn muodossa. Tämä voidaan tehdä siten, että oletetaan, että mikrokantajien aktiivisen osan muodostaa ainoastaan helmen ulkopinta noin 20 i:n syvyyteen. Jos vielä oletetaan, että varatut ryhmät aikaisemmin mainituissa tapauksissa ovat kauttaaltaan tasaisesti jakautuneet helmissä, voidaan aikaisemmat alueet muuttaa varaus-kapasiteetiksi tässä ulommassa kuoressa. Kun ongelmaa lähestytään tällä tavalla, on varauskapasiteetin edullisen alueen havaittu olevan noin 0,012-0,25 mekv/cm^. Tämä tapa ottaa huomioon mikrokantajatilavuuden muutokset, jotka johtuvat erilaisista varaustiheyksistä.

Mikrokantajia, joilla on vaadittu varauskapasiteetti, voidaan valmistaa käsittelemällä mikrokantajia, jotka on muodostettu hydroksyyliryhmiä sisältävistä polymeereistä, alkalisen aineen vesiliuoksen ja tertiäärisen ja kvaternäärisen amiinin kanssa. Helmien voidaan aluksi antaa paisua vesiväliaineessa ilman muita aineosia, tai ne voidaan yksinkertaisesti saattaa kosketukseen vesiväliaineen kanssa, joka sisältää vaaditun emäksen ja amiinin. Tätä tapaa käyttää alkalista ainetta katalysoimaan positiivisesti varautuneiden aminoryhmien kiinnittymistä hydroksyyliä sisältäville polymeereille on kuvattu US-patentissa 1 777 970.

Esimerkkejä sopivista hydroksyyliryhmiä sisältävistä polymeereistä ovat polysakkaridit, kuten dekstraani, dekstriini, tärkkelys, selluloosa, polyglukoosi ja näiden substituoidut johdannaiset. Tietyt synteettiset polymeerit, kuten polyvinyylialkoholi ja hydroksi-substituoidut akrylaatit tai metakrylaatit, kuten hydroksietyylimetakrylaatti, ovat myös sopivia. Edullinen on dekstraani ja varsinkin ristisidottu dekstraani pienten pallosten tai helmien muodossa, erityisesti siksi, että sitä on kaupallisesti saatavissa, se on suhteellisen halpa ja siitä saadaan mikrokantajia, jotka erinomaisesti avustavat solukasvua.

Jokaista alkalista ainetta voidaan käyttää reaktioon. Alkalimetallihydrok-sidit, kuten natrium- tai kaliumhydroksidi ovat kuitenkin edullisimmat alkaliset aineet.

Tertiääriset tai kvaternääriset amiinit ovat sopivia antamaan positiivisesti varattuja ryhmiä, jotka voidaan liittää hydroksyyliä sisältäviin polymeereihin. Erityisen edullisia aineita ovat kloori- tai bromisubstituoidut tertiääriset amiinit tai niiden suolat, kuten dietyyliaminoetyylikloridi, dietyyliaminoetyyli- 8 60407 bromidi, dimetyyliaminoetyylikloridi, dimetyyliaminoetyylibromidi, dietyyliamino-metyylikloridi, dietyyliaminometyylibromidi, di-(hydroksietyyli)-aminoetyyli-kloridi, di(hydroksietyyli)-aminoetyylibromidi, di-(hydroksietyyli)-aminometyyli-kloridi, di-(hydroksietyyli)-aminometyylibromidi, /6-morfoliinietyylietyyli-kloridi, ^-morfoliinietyylibromidi , ^-morfoliinimetyylikloridi, ^-morfoliini-metyylibromidi ja niiden suolat, esimerkiksi hydrokloridit.

Reaktiolämpötila- ja reaktioaika-alueet voivat olla laajat. On edullista saattaa reaktio tapahtumaan lämpötiloissa noin 18-65°C. Kuitenkin voidaan käyttää myös muita lämpötiloja. Reaktiokinetiikka riippuu luonnollisesti suureksi osaksi reaktiolämpötilasta ja reagoivien aineiden väkevyyksistä. Sekä aika että. lämpötila vaikuttavat lopulliseen anioninvaihtokapasiteettiin.

Syytä siihen, että mikrokantajien varauskapasiteetti on niin ratkaiseva soluviljelyssä, ei täysin tiedetä. Sitoutumatta mihinkään teoriaan, on mahdollista, että pinnan varauskapasiteetti aiheuttaa aineen koostumukseen tiettyjä paikallisia epäsäännöllisyyksiä, jotka ovat tärkeimmät tekijät säädettäessä mikrokantaja-soluviljelmää.

Luonnollisesti voi esiintyä tiettyjä helmiä, jotka eivät ole sopivia hyvää soluviljelyä varten, siitä huolimatta, että niiden varauskapasiteetti on määritellyltä alueelta. Tämä saattaa johtua varauskapasiteetin antavan ryhmän sellaisista sivuketjuista, jotka ovat myrkyllisiä tai muulla tavalla vahingollisia solukasvulle, adsorboitujen tai absorboitujen vahingollisten koostumusten tai yhdisteiden läsnäolosta, tai tämä voi johtua helmien huokoisuudesta tai muista syistä. Jos tällaiset helmet eivät ole sopivia soluviljelyyn muiden ominaisuuksiensa kuin varauskapasiteetin määrää suhteen, ei helmien katsota olevan "soluviljelymikrokantajia".

Keksintöä kuvataan seuraavin esimerkein.

Esimerkki 1

Parannettujen mikrokantajien valmistus

Parannetut mikrokantajat valmistettiin seuraavalla tavalla. Kuivia, varaa-mattomia, ristisidottuja dekstraanihelmiä seulottiin niiden saamiseksi läpimitaltaan noin 75^pm. Yksi gramma tätä jaetta lisättiin 10 ml:aan tislattua vettä ja helmien annettiin paisua. Sopiva kaupallinen kuiva, ristisidottu dekstraani on Sephadex G~50, jota tuottaa Pharmacia Fine Chemicals, Piscatavay, New Jersey.

Muodostettiin tilavuudeltaan 10 ml:n vesiliuos, joka sisälsi 0,01 moolia dietyyliaminoetyylikloridi:kloridia, joka oli kaksi kertaa uudelleenkiteytetty metyleenikloridista, ja 0,015 moolia natriumhydroksidia. Tämä vesiliuos lisättiin sitten paisuneitten dekstraanihelmien suspensioon, minkä jälkeen sitä sekoitettiin voimakkaasti täryvesihauteella 1 tunti 60°C:ssa. 1 tunnin kuluttua helmet erotettiin reaktioseoksesta suodattamalla Whatman-suodatinpaperilla no. 595 ja pestiin 500 ml:lla tislattua vettä.

9 60407 Tällä tavalla valmistettujen helmien varauskapasiteetti oli n. 2,0 mekv/g kuivaa, käsittelemätöntä ristisidottua dekstraania. Tämä varauskapasiteetti voidaan karakterisoida mittaamalla helmien anioninvaihtokapasiteetti seuraavasti:

Helmivalmiste pestään tarkoin 0,1 normaalisella HCl:llä kaikkien ioninv&ihto- - . . -I4 paikkojen kyllästämiseksi Cl -ioneilla. Sen jälkeen ne huuhdotaan 10 -normaalisella HCl:llä sitoutumattomien kloridi-ionien poistamiseksi. Sen jälkeen helmet pestään 10-$:isella (paino/paino) natriumsulfaattiliuoksella vaihtopaikkojen kyllästämiseksi S0^ :llä. Natriumsulfaattipesuneste kootaan ja se sisältää vapautuneita kloridi-ioneja. Tämä liuos titrataan 1 M hopeanitraatilla käyttäen indikaattorina laimennettua kaliumkromaattia.

Titrauksen jälkeen helmet pestään huolellisesti tislatulla vedellä, huuhdotaan fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), suspendoidaan PBS:ään ja käsitellään autoklaavissa. Tällä menetelmällä saadaan hydratoituja helmiä, joiden läpimitta on n. 120-200 jum ja joiden varauskapasiteetti on n. 2,0 mekv/g kuivaa, käsittelemätöntä ristisidottua dekstraania.

Esimerkki 2

Kiinnittymisestä riippuvaisten solujen viljely mikrokantajilla keksinnön mukaisesti verrattuna kaupallisesti saatavaan ioninvaihtohartsiin

Kaikki solut viljeltiin "Dulbecco's Modifield Eagle's Medium"-väliaineessa. Normaalien, diploidisten fibroblastien viljelemiseksi lisättiin väliaineeseen 10 % vasikan sikiöseerumia. Kananpoikien primaaristen ja sekundaaristen fibroblastien viljelemiseksi lisättiin väliaineeseen 1 % kananpoikien seerumia, 1 % vasikan seerumia ja 2 % tryptoosifosfaattilientä (Difco Laboratories Detroit, MI). Perusaineet siivilöitiin 100 mm:n muovimaljoille (Falcon Plastics, Inc., Oxnard, CA).

Kananpoikien primaarista sikiöfibroblastia valmistettiin paloitte]emalia 10 päivän ikäisiä sikiöitä ja käsittelemällä niitä sitten trypsiinillä. Sekundaarista kananpojan sikiöfibroblastia valmistettiin primaarisesta konfluenssista ensimmäisenä päivänä trypsiinillä käsittelemällä. Soluille, jotka oli viljelty muovimaljoissa, oli kahdentumisaika n. 20 tuntia.

Diploidisia, ihmisen fibroblasteja, jotka oli otettu sikiön keuhkosta (HEL2999 ATCC no. CCL 137) saatiin kokoelmasta "American Type Culture Collection", Rockville, MD. Näiden solujen kahdentumisaika oli 19 tuntia muovimaljoissa.

Mikrokantajaviljelyt pantiin alulle yksinkertaisesti saattamalla solut ja helmet yhteen sekoituksenalaisessa viljelmässä. Käytettiin 100 ml:n viljelmä-tilavuuksia 250 ml:n keittopulloissa (halkaisijaltaan 6,5 cm), jotka oli varustettu h ,5 cm:n magneettikäyttöisellä Teflon (D-päällysteisellä sekoitussauvalla (Wilbur Scientific, Inc. Boston, MA). Sekoitusnopeus oli n. 90 r/min. Viljelmistä otettiin heti näytteitä ja näytteet tutkittiin mikroskooppisesti ja valokuvattiin.

,0 60407

Solut laskettiin laskemalla tumat käyttäen Sanford’in et ai modifioitua menetelmää (Sanford, K. K., Earle, W. R. , Evans, V. J., Waltz, H. K. ja Shannon, J. E. (1951) J. Natl Cancer Inst. 11:773·), jonka van Wezel on selostanut (van Wezel, A. L. (1973). Tissue Culture, Methods and Applications, sivu 372-377, Academic Press,

New York).

Helmet kiinnittyneine soluineen erotettiin viljelyväliaineesta antamalla helmien laskeutua 1 g:ssa muutaman minuutin ajan ja sitten imettiin päällä oleva kerros pois. Tämä menettely helpottaa suuresti väliaineen vaihtoa sekä helpottaa solujen erottamista mikrokantajista trypsiinikäsittelyn jälkeen.

Kaupallista DEAE Sephadex A-50 käytettiin mikrokantajana diploidisille ihmisen fibroblasteille ja verrattiin kantajiin, jotka oli valmistettu synteettisesti ja titrattu kuten esimerkissä 1 kuvattiin. Kummallekin helmityypille oli kantajapitoisuus 2 g kuivaa, käsittelemätöntä, ristisidottua dekstraania/l. Varauskapasiteetti DEAE-Sephadex A-50:lle oli 5»^ mekv/g kuivaa, ristisidottua dekstraania, kun se sitä vastoin vasta syntetisoiduille helmille oli 2,0 mekv/g. Tulokset on esitetty kuviossa 1 .

Tälle solutyypille oli alkuperäisen ympin häviöt käytettäessä A-50-mikro-kantajia huomattavat. Fibroblastit taas kiinnittyivät, lisääntyivät ja saavuttivat konfluenssin keksinnön mukaisilla mikrokantajilla 6 vuorokaudessa. Tämä käyttäytyminen on hyvin sopusoinnussa tälle solutyypille esitetyn käyttäytymisen kanssa standardimaljoilla. Kuten kuvio 1 osoittaa oli uusilla mikrokantajilla pitoisuudella 2 g kuivaa, ristisidottua dekstraania/l, aikaansaatu lopullinen solutiheys 1,2 x 10^ solua/ml.

Viljelmissä, jotka sisältävät näitä uusia kantajia, ei esiintynyt alku-soluhäviötä eikä estymistä konfluenssin saavuttamisessa. Vielä tärkeämpää oli, että soluviljelmät kasvoivat normaalisti suuremmilla mikrokantajapitoisuuksilla. Kuviossa 2 esitetään esimerkinomaisesti, että ihmisen fibroblastit ja kananpojan sekundaariset sikiöfibrob]astit saavuttavat kyllästyspitoisuuden lähellä. H χ 10 solua/ml, kun käytetään 5 g kuivaa, ristisidottua dekstraani/l, jolloin uusien kantajien varauskapasiteetti oli 2,0 mekv/g dekstraania. Kuten voidaan nähdä ei esiinny merkittävää ymppihäviötä edes tässä suhteellisen suuressa mikrokantaja-pitoisuudessa.

Sekundaarisia kananpojan sikiöfibroblasteja viljeltiin myös mikrokantaja-pitoisuudessa 10 g/1. Edellä kuvatuissa olosuhteissa aikaansaatiin kyllästymis-väkevyys 6x10^ solua/ml; lisäämällä väliaineeseen vielä 1 ! vasikan sikiö-seerumia aikaansaatiin kyllästymispitoisuus 8 x 10^ solua/ml. Mitään merkittävää soluympin häviötä ei esiintynyt.

Primaarisia kananpojan sikiöfibroblasteja viljeltiin mikrokantajaväkevyy-dessä 5 ja 10 g/1 ja kasvuominaisuudet olivat samanlaisia kuin sekundaarisilla 11 60407 kananpojan fibroblasteilla, vaikka mitättömiä ymppihäviöitä havaittiin ja saatiin jonkin verran pitempiä viipymisaikoja.

Tehtiin myös yrityksiä sekundaaristen kananpojan sikiöfibroblastien viljelemiseksi samoissa olosuhteissa, joita edellä käytettiin, sillä poikkeuksella, että käytettiin DEAE-Sephadex A-50-mikrokantajia pitoisuuksissa 1 ja 5 g/l. Solu-kasvua ei havaittu ja ymppihäviöt olivat huomattavat.

Esimerkki 3

Mikrokantimien valmistus käyttämällä vaihtelevia määriä reaktiokomponentteja

Valmistettiin mikrokantajaeriä liuottamalla dietyyliaminoetyylikloridi. : kloridia ja natriumhydroksidia 20 ml:aan tislattua vettä. Liuos kaadettiin sitten kuiville Sephadex-G-50-helmille, minkä jälkeen helmet pantiin vesitärypöydälle, jota pidettiin 6o°C:ssa. Yhtä helmierää käsiteltiin liuoksella, joka sisälsi 0,01 moolia amiinia ja 0,015 moolia natriumhydroksidia, kun taas toista sarjaa ' käsiteltiin liuoksella, joka sisälsi 0,03 moolia amiinia ja 0,0^5 moolia natriumhydroksidia. Reaktioaikaa vaihdeltiin erilaisten mekv/g-arvojen saamiseksi jokaiselle sarjalle.

Diploidisia ihmisen fibroblasteja (HEL299) viljeltiin suspensioviljelmissä mikrokantajapitoisuuden ollessa 5,0 g kuivaa, käsittelemätöntä, ristisidottua dekstraania/1, jolloin seurattiin esimerkin 2 mukaisia menetelmiä käyttäen jokaisesta erästä valittuja mikrokantajia, joilla oli vaihtelevia mekv/g-arvoja.

g

Sen jälkeen laskettiin tuottavuus (10 viljeltyä solua/1. h) ja merkittiin koordinaatistoon mekv/g:aa vastaan jokaiselle edellisen mukaisesti valmistetulle helmierälle. Käyrillä, jotka oli piirretty käyttäen arvoja, jotka oli saatu kummallekin sarjalle, oli sama muoto, ne olivat pääasiallisesti kellonmuotoisia, mutta niistä eristä piirretyillä käyrillä, jotka oli käsitelty suuremmilla reagoivien aineiden väkevyyksillä, oli jonkin verran jyrkempi nousu ja putous. Jokaisesta erästä valmistettiin kantajia, jotka antoivat erinomaisen solukasvun.

Esimerkki b

Mikrokantajien valmistus vaihtelevin amiini/alkali-suhtein Tämä esimerkki kuvaa varauskapasiteetin muita muutoksia, joita voidaan saada vaihtelemalla DEAE-kloridi:kloridi/NaOH-suhteita. Tässä esimerkissä seurattiin esimerkin 3 mukaisia menetelmiä sillä poikkeuksella, että käytettiin natrium-hydroksidi -väkevyyksiä laajalta alueelta, kun taas dietyyliamino-etyylikloridi: kloridin väkevyys pidettiin 0,01 moolia/20 ml. Natriumhydroksidille käytetyt väkevyydet olivat 0,01; 0,011; 0,012; 0,013; 0,01U; 0,015; 0,02; 0,03; 0,05; 0,75; 0,10 mcolia/2C ml.

Käyrä mekv/g:lle tehtiin 1,25 tunnin kuluttua 60°C:ssa natriumhydroksidin väkevyyttä vastaan. Käyrästä voidaan lukea, että natriumhydroksidi-väkevyydet n. 0,01:n alapuolella eivät anna osoitettavissa olevaa varauskapasiteettia. Varaus- 12 60407 kapasiteetti kasvoi kuitenkin nopeasti väkevyyden kasvaessa ja saavutti maksimin, n. 2,3 mekv/g kuivaa, ristisidottua dekstraania natriumhydroksidin väkevyydellä n. 0,01U- moolia. Varauskapasiteetti laski sitten miltei suoraviivaisesti arvoon n. 1,1 mekv/g natriumhydroksidi-väkevyydessä n. 0,10 moolia. Siten tapahtui reaktiokinetiikan muutos, kun DEAE-kloridi:kloridin suhdetta natriumhydroksidi in vaihdeltiin DEAE-kloridi:kloridin ja ristisidotun dekstraanin väkevyyden pysyessä muuttumattomana.

Esimerkki 5

Ihmisen interferonin valmistus viljelemällä parannetuilla mikrokantaji11a Tässä kuvataan mikrokantajilla viljeltyjen solujen kykyä tuottaa ihmisen interferonia. Solut, joita käytettiin ihmisen interferonin valmistukseen, olivat normaaleja, diploidisia, ihmisen esinahkafihroblasteja FS-U. Niitä viljeltiin mikrokantajaviljelmissä käyttäen esimerkissä 2 kuvattuja menetelmiä. Esimerkin 1 mukaisesti valmistettuja ja titrattuja mikrokantajia käytettiin väkevyydessä 5 g kuivaa, ristisidottua dekstraania/1. Tähän viljelyyn käytetty väliaine oli DMEM (Dulbecco's Minimal Essential Medium), johon oli lisätty 10 % vasikan sikiöseerumia.

8-10 vuorokauden kuluttua viljelmät lakkasivat kasvamasta. Tässä vaiheessa viljelyväliaine poistettiin. Viljelmät pestiin 1-U kertaa 100 ml:lla seerumi-vapaata DMEM. Solut olivat silloin valmiita interferoni-induktioon. Tämä aikaansaatiin lisäämällä viljelmiin 50 ml seerumivapaata DMEM-vällainetta, joka sisälsi 50 ^ig/ml sykloheksamidia ja vaihtelevia määriä poly I.poly C-indusoimisainetta.

tunnin kuluttua viljelmiin lisättiin aktinomysiini D:tä loppuväkevyyden 1 yug/ml aikaansaamiseksi.

5 tunnin kuluttua induktion alkuunpanemisesta induktioväliaine dekantoitiin ja viljelmät pestiin 3~b kertaa 100 ml:11a lämmintä, seerumivapaata DMEM. Viljelmiin lisättiin 50 ml DMEM, joka sisälsi 0,5 % ihmisen plasmaproteiinia. Viljelmiä inkuboitiin standardiolosuhteissa vielä 18 tuntia. Tänä ajankohtana viljelmät dekantoitiin ja dekantoitu väliaine analysoitiin interferoni-aktiivisuuden suhteen. Interferoni-aktiivisuus analysoitiin määrittämällä 50 %:n suojaustaso näytteille ja standardiliuoksille, FS-U fibroblasteille, jotka oli tartutettu Vesicular Stomatitis viruksella (VSV), (Indiana-kannalla). Tulokset interferonin valmistuskokeista esitetään seuraavassa taulukossa.

• i V .

is 60407

Indusoimisaineen Sclupitoisuus valmis- Interferoni väkevyys (jug/ml) tuksen aikana U/10^ solua) (soluja/ml) h 2,0 x ^06 39 5 2,6 x 106 378 25 2,6 x 106 886 50 2,0 x 106 n. 5000

Jokainen näistä arvoista on saatu eri koesuorituksesta eivätkä ne näytä olevan vastaavuussuhteessa indusoimisaineen väkevyyteen.

Esimerkki 6

Solujen viljely -parannetuilla mikrokantajilla tarkoituksena tuottaa viruksia

Seuraavassa kuvataan mikrokantajilla viljeltyjen solujen kykyä tuottaa virusta. Primaarisia ja sekundaarisia kananpojan sikiöfibroblasteja viljeltiin mikrokantajaviljelmässä esimerkissä 2 kuvatun menetelmän mukaisesti, jolloin primaarisia soluja viljeltiin mikrokantajapitoisuudessa 10 g/1 ja sekundaarisia soluja mikrokantajapitoisuudessa 5 g/1. Virustuotannon alkuunpanemiseksi poistettiin viljelyväliaine ja viljelmät pestiin 2 kertaa 100 ml:11a seerumivapaata DMEM. Solujen infektoiminen Sindbis-viruksella tapahtui 50 ml:ssa DMEM, johon oli lisätty 1 % vasikan seerumia, 2 % tryptoosifosfaattilientä ja riittävästi Sindbis-virtausta vastatakseen MOI (multiplicity of infection)-arvoa 0,05·

Virukset korjattiin talteen 2h tuntia inflektoimisen jälkeen kokoamalla viljelyliemi, kirkastamalla se lievällä linkoamisella ja päällä oleva kerros jäähdytettiin. Virustuotantoa tutkittiin plakinmuodostuksella (PF) sekundaaristen kananpojan fibroblastien alueella. Tulokset näiden mikrokantajaviljelmien inflektoi-misesta olivat:

Solutyyppi Kokonai s tuot ant o PFU/ml PFU/solu (soluja/ml) sekundaarinen 1*,0 x 10^ 8,U x 10^ 2000 primaarinen 1 ,U x 10^ 2,3 x 10^ 16000 primaarinen 6,0 x 10^ 2,6 x 10^ 5000

Virustuotanto määrättiin seuraaville virus/soluille mikrokantajayhdistel-millä: Polio/WI-38i Moloney MuLV/Cl-1 hiiri ja VSV/kananpojan sikiöfibroblasti.

Esimerkki 7

Solujen vertaileva viljely pyörivissä pulloissa ja parannetuilla mikro-kantajilla tarkoituksena tuottaa Muridae-leukemiaviruksen proviraalista PNA:ta 1U 60407

Tutkittiin Moleney-verisyöpäviruksen (M-MuLV) käänteis-transkriptaasilla saatua DNA:ta hiiren luuydinsolujen (JLS-Vg)infektoimisen jälkeen.

Metodiikka käsitti solujen viljelyn pyörivissä pulloissa. Soluja kasvatettiin pyörivässä pulloviljelyssä, väliaine poistettiin ja virusymppi lisättiin pulloihin. Heti sen jälkeen viljelmiin lisättiin tuoretta väliainetta ja 8—16 tuntia myöhemmin ne uutettiin virus-DNA:n lopullista puhdistusta varten. Viljelmät pestiin tuoreella puskurilla ja solut lysoitiin liuoksella, joka sisälsi natrium-dodekyylisulfaattia. Sen jälkeen seuraava lysaatin jäähdytys ja suolan lisääminen yksimolaariseksi aiheutti detergentin ja suurmolekyylipainoisen DNA:n yhteissaostumisen.

Pienimolekyylipainoinen DNA, joka jäi jäljelle päällä olevaan kerrokseen, voitiin sitten puhdistaa proteiineista ja väkevöidä jatkoanalyysiä varten, 9 50-pullon pyöriväviljelraä sisälsi n. 10 solua. Nämä solut infektoitiin 6 n. 1 1:11a virusymppiä, pitoisuus 3 X 10u palkkia muodostavaa yksikköä/ml.Tästä oli seurauksena nimellinen MOI 1-3 ja infektoidut solut antoivat 5-20 nanogrammaa virusspesifistä DNA.

Yksinkertaisempi menetelmä kehitettiin käyttäen tämän keksinnön mukaisia parannettuja mikrokantajia. Käytettiin viljelmää, joka sisälsi 10 g helmiä 1 l:ssa o viljelyväliametta. Konfluenssin saavuttamisen jälkeen infektoitiin 10 helmillä oleva solua antamalla helmien upota ja korvaamalla väliaine 1 1:11a virusymppiä. Uuttamista varten pestiin helmillä olevat solut puskurilla ja pantiin sitten natriumdodekyylisulfaattia sisältävään puskuriin. Suurimolekyylipainoisen DN.A:n ja detergentin yhteissaostamisen jälkeen sentrifugoitiin saostuma yhdessä helmien kanssa ja päällä oleva kerros erotettiin jatkoanalyysiä varten. Virus-DNA:n saanto oli verrattavissa siihen, joka saatiin pyörivässä pulloviljelyssä ja käytetty työ oli 5-10 % siitä, jonka pyörivä pulloviljely vaati.

Esimerkki 8

Parannettu mikrokantajien tuottaminen dimetyyliaminoetyylivarausryhmillä

Sopiva mikrokantaja valmistettiin sitomalla toinen vaihtoyksikkö dekstraani-matriisiin, jota käytettiin esimerkissä 1. Dimetyyliaminoetyyliryhmiä (DMAE) sidottiin dekstraanimatriisiin seuraavalla menetelmällä: 1 g kuivia dekstraani-helmiä (Pharmacia G-50), joiden läpimitta oli 50-75 yjm, pantiin 10 ml:aan tislattua vettä ja annettiin helmien paisua. Muodostettiin tilavuudeltaan 10 ml:n vesiliuos, joka sisälsi 0,01 moolia dimetyyliaminoetyyli-kloridi:kloridia (Sigma Chemical Co.) ja 0,015 moolia natriumhydroksidia. Tämä vesiliuos lisättiin paisuneisiin dekstraanihelmiin ja tätä suspensiota sekoitettiin sitten voimakkaasti 1 tunnin ajan 60°C:ssa. Reaktion jälkeen helmimassa titrattiin kuten esimerkissä 1. Tämä reaktio sitoo 1,0 mekv dimetyyliaminoetyyliä dekstraanimassaan. Sellaisten Λ ' 60407 mikrokantajien valmistamiseksi, joilla on suurempi substituutioaste, saatettiin edellä annettu reaktio tapahtumaan ja helmimassa pestiin huolellisesti vedellä. Vesiylimäärä suodatettiin pois ja helmimassa punnittiin vesimäärän määrittämiseksi , joka oli jäänyt helmimassaan. Tähän helmimassaan lisättiin sopiva määrä tuoreita reaktiokomponentteja (ts. DMAE-C1:C1 ja NaOH) niin että DMAErn ja NaOH:in loppu-väkevyys näissä jälkeentulevissa reaktioseoksissa oli yhtä suuri kuin alunperin käytetty.

Tällä tavalla valmistettiin mikrokantajasarja, joka sisälsi 1,0; 2,0; 2.5 ja 3,5 mekv DMAE/g reagoimatonta dekstraania. Soluja (HEL299) viljeltiin mikrokantajaviljelmässä (5 g/l) näillä mikrokantajilla esimerkin 2 menetelmien mukaisesti. Tulokset annetaan seuraavassa taulukossa:

Substituutioaste Solujen' leviäminen Nettosolukasvu (mekv/g) 1,0 2,0 2.5 + + 3,2 +

Odotusten mukaisesti solukasvu riippuu substituutioasteesta varatuilla ryhmillä. Substituutioasteen ollessa liian suuri ei solukasvua esiinny, huolimatta siitä, että kiinnittymistä ja leviämistä tapahtuu. Liian alhaisella substituutio-asteella ei solujen kiinnittyminen pintaan ole riittävä salliakseen oikean leviämisen ja kasvun.

Esimerkki 9

Parannettuja mikrokantajia, joissa on positiivisesti varattuja fosfonium- ryhmiä

Parannettuja mikrokantajia valmistettiin myös käyttäen ei-amiini-vaihto-ryhmiä seuraavasti: 1 g kuivia dekstraanihelmiä valmistettiin ja paisutettiin vedellä kuten esimerkissä 1. Paisuneisiin helmiin lisättiin 5 ml kyllästettyä trietyyli-(etyyli-bromidi)-fosfoniumin (TEP), C2H5 C2H5

P

/ \ C2Hl,Br C2E5 16 60407 vesiliuosta ja lisättiin 5 ml natriumhydroksidin 3-molaarista liuosta. Tämän lietteen annettiin reagoida 65°C:ssa. Valmistettiin mikrokantajasarja pitoisuudeltaan 1,1; 1,7 ja 2,9 mekv/g. Mikrokantajat, joiden pitoisuus oli 1,1 mekv/g, valmistettiin reaktiolla edellä annetuissa olosuhteissa k minuutissa. 1,7 mekv/g:n mikrokantajat saivat reagoida 1 tunnin ajan ja 2,9 mekv/g:n mikrokantajat saivat reagoida kolme kertaa peräkkäin kuten esimerkissä 7 on kuvattu. Jokaiselle näistä kantajista tehtiin 5 g/l:n mikrokantajasoluviljelmä jatkuvalla solutyypillä JLS-V9 ja verrattiin tämän solun kasvuun parannetuilla DEAE-mikrokantajilla, jotka oli valmistettu esimerkin 3 mukaisesti. Tulokset annetaan seuraavassa taulukossa.

DEAE

mekv/g Solujen kiinnittyminen Nettosolukasvu ja leviäminen_ 0,9 + + 1 ,7 + + 3.8 +

TEP

1,1 + + 1 ,7 + + 2.9 +

Claims (7)

17 60407

1. Tapa viljellä kiinnittymisestä riippuvaisia soluja mikrokantajaviljel-mässä soluviljelmien ja mahdollisesti soluviljelystä saatavien tuotteiden, kuten viruksien tai interferonin valmistamiseksi, jolloin muodostetaan positiivisesti varattujen mikrokantajien ja kiinnittymisestä riippuvaisten solujen suspensio sopivassa viljelväliaineessa sellaisen mikrokantajasoluviljelmän aikaansaamiseksi, joka pidetään solujen kasvuolosuhteissa ja joka sen jälkeen mahdollisesti pidetään sellaisissa olosuhteissa, jotka edistävät soluviljelmästä saatavien tuotteiden muodostumista, jotka sitten otetaan talteen, tunnettu siitä, että positiivisesti varattuja mikrokantajia, joiden anioninvaihtokapasiteetti on 0,1-1+,5 mekv/g kuivia, käsittelemättömiä mikrokantajia, käytetään suspension muodostamiseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen tapa, tunnettu siitä, että käytetään mikrokantajia, jotka koostuvat ristisidotuista dekstraanihelmistä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen tapa, t u n e t t u siitä, että mikrokantajat koostuvat ristisidotuista dekstraanihelmistä, joissa on tertiääri-siä tai kvaternäärisiä aminoryhmiä. U. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen tapa, tunnettu siitä, että mikrokantajat koostuvat ristisidotuista dekstraanihelmistä, joissa on dietyyli-aminoetyy1iryhmiä.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen tapa, tunnettu siitä, että mikrokantajat koostuvat ristisidotuista dekstraanihelmistä joissa on fosfoniumryhmiä.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen tapa, tunnettu siitä, että käytetään positiivisesti varattuja mikrokantajia, joiden anioninvaihtokapasiteetti on 1-2,8 mekv/g kuivaa, käsittelemätöntä dekstraania.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen tapa, tunnettu siitä, että käytetään positiivisesti varattuja mikrokantajia, joiden keskimääräinen halkaisija on 120-200 pm.