DE2749989A1

DE2749989A1 - Verfahren zum zuechten von verankerungsabhaengigen zellen in einer mikrotraegerkultur

Info

Publication number: DE2749989A1
Application number: DE19772749989
Authority: DE
Inventors: David W Levine; William G Prof Thilly; Daniel I C Prof Wang; Jason S Wong
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1976-11-11
Filing date: 1977-11-08
Publication date: 1978-05-18
Also published as: SE417108C; BR7707551A; NL177926B; AU508398B2; CH615947A5; DE2749989B2; NL7712202A; IN147612B; ZA776251B; JPS5362889A; FI60407C; AU3049177A; FI60407B; FR2370792B1; JPS5699789A; SE7712700L; CA1063050A; DE2749989C3; BE860721A; GB1535150A

Description

Beschreibung ά f ΗΌΌΌ&

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Biologie und insbesondere das Gebiet der Zellenbiologie.

Das Wachsenlassen von Säugetierzellen ist sowohl im Laborais auch im Industriemaßstab wichtig. Im Labormaßstab ist oft der begrenzenden Faktor für eine Zellen- oder Virenuntersuchung die Menge des Rohmaterials, die für die Untersuchung zur Verfügung steht. In industriellem Maßstabe werden große Anstrengungen unternommen, um Pharmazeutika auf der Grundlage von Säugetierzellprodukten zu entwickeln. Es handelt sich dabei hauptsächlich um Impfstoffe für menschliche oder tierische Viren, jedoch auch um menschliche Wachstumshormone sowie andere Körperhormone sowie Biochemikalien für medizinische Anwendungszwecke.

Einige Säugetierzelltypen wurden für ein Wachstum in Suspensionskulturen adaptiert. Beispiele für derartige Zelltypen sind HeLa (menschlich), BHK (Babyhamsternieren) sowie L-Zellen (Mäuse). Derartige Zellen weisen im allgemeinen nicht normal genetische Komplemente auf, d. h. zu viele oder zu wenige Chromosomen oder abnormale Chromosomen. Oft erzeugen diese Zellen einen Tumor nach einer Einspritzung in ein Tier der entsprechenden Spezies.

Andere Säugetierzelltypen konnten bisher noch nicht für ein Züchten in einer Suspensionskultur adaptiert werden. Sie wachsen nur, wenn sie mit einer geeigneten Oberfläche verknüpft werden. Derartige Zellentypen werden im allgemeinen als "verankerungsabhängig" bezeichnet. Erwähnt seien 3T3-Mäusefibroblasten, Mäusemarkknochen, Epithelzellen, von Mäusen übertragene Leukämievirus-erzeugende Stämme von Mäusefibroblasten, primäre und sekundäre Hühnerfibroblasten, WI-38-Menschenfibroblastzellen sowie normale menschliche Embryolungenfibroblastzellen (HEL299, ATCC # CCL137). Einige verankerungsabhängige Zellen wurden gezüchtet, die Tumore verursachen, es konnten jedoch auch andere gezüchtet werden, die keinen Tumor bedingen. Auch können einige veran-

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kerungsabhängige Zellen, wie WI-38 und HEL299, gezüchtet werden, die genetisch normal sind.

Beträchtliche Fortschritte sind bei der Säugetierzellenvermehrung in großtechnischem Maßstäbe unter Einsatz von Vorrichtungen erzielt worden, in denen Suspensionskulturen gezüchtet werden können. Bezüglich der großtechnischen Vermehrung von verankerungsabhängigen Säugetierzellen hält sich jedoch der Fortschritt in sehr engen Grenzen. Bisher bekannte Methoden zum großtechnischen Vermehren von verankerungsabhängigen Zellen basieren auf einer linearen Ausdehnung in kleinem Maßstäbe durchgeführter Verfahren. In Zellkulturanlagen wird eine große Anzahl von chargenweise betriebenen Reaktoren, die niedrige Ausbeuten, bedingen>- verwendet, und zwar in Form von Schalen, Flaschen, in Drehung-versetzten Schläuchen und Flaschen. Es handelt sich dabei jeweils um eine diskrete Einheit oder ein isoliertes chargenweise betriebenes Reaktionsgefäß, wobei jeweils getrennte Kontrollen erforderlich sind. Diese Kontrollen sind jedoch aufgrund wirtschaftlicher Überlegungen sehr primitiv. Veränderungen der Nährmittel wurden durch eine Veränderung des Mediums korrigiert, was eine Maßnahme bedeutet, die zwei Stufen erfordert, und zwar eine Entfernung des Mediums und einen Zusatz des Mediums. Da in einer Anlage mäßiger Größe Hunderte derartiger chargenweise betriebener Reaktionsgefäße eingesetzt werden, erfordert eine einfache Veränderung des Mediums Hunderte von Maßnahmen, die alle genau sowie unter exakt sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen. Eine Vielstufenmaßnahme, wie eine Zellenübertragung oder -ernte trägt weiter zur Verschärfung dieses Problems bei. Daher sind die Kosten einer derartigen Anlage, der Raumbedarf sowie der Personalaufwand erheblich.

Es gibt auch noch andere Methoden zur linearen Ausweitung von in kleinen Chargen betriebenen Kulturen, die bekanntgeworden sind. Beispielsweise werden in der Literatur als Alternativen Plastikbeutel, aufeinandergestapelte Platten, Spiralfilme, Glaskugelvermehrungseinrichtungen, künstliche Kapillaren sowie

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Mikroträger beschrieben. Von diesen Möglichkeiten bieten die Mikroträgersysteme bestimmte einzigartige Vorteile. Beispielsweise kann eine erhebliche Zunahme des erzielbaren Verhältnisses von Wachstumsoberfläche zu Gefäßvolumen (S/V) unter Einsatz von Mikroträgern gegenüber sowohl herkömmlichen als auch in neuerer Zeit entwickelten Methoden erzielt werden. Eine Erhöhung des erzielbaren S/V-Verhältnisses ermöglicht die Konstruktion einer Vermehrungseinrichtung, die aus einer homogenen einzigen Einheit oder einer quasi homogenen Einheit besteht und chargenweise oder halbchargenweise unter Erzielung hochvolumiger Durchsätze betrieben werden kann. Ein einziges mit einem Rührer versehenes Gefäß mit einer einfachen Steuerung für den pH- und pO_-Wert stellt eine homogene Umgebung für eine große Anzahl von Zellen dar, so daß die Notwendigkeit der Verwendung teurer Inkubatoren, die einen erheblichen Raumbedarf bedingen, entfällt. Ferner wird die Gesamtzahl der Operationen, die pro Zelleneinheit erforderlich ist, drastisch herabgesetzt. Daher scheinen Mikroträger bezüglich der Kapitalinvestition, des Raumbedarfs sowie des Personalbedarfs bei der Herstellung von verankerungsabhängigen Zellen im Gegensatz zu den herkömmlichen Erzeugungsmethoden wirtschaftliche Vorteile zu bieten.

Mikroträger bieten ferner den Vorteil einer kontinuierlichen Verfahrensweise, da die Zellen in einer gesteuerten Umgebung wachsen. Daher bieten Mikroträger eine Möglichkeit, verankerungsabhängige Säugetierzellen unter festeingestellten Umgebungsbedingungen zu züchten, die zur Erzielung eines konstanten und optimalen Zellenwachstums gesteuert werden können.

Eines der bisher bekanntgewordenen vielversprechenden Mikroträgersysteme wird von van Wezel beschrieben und sieht die Verwendung von Diäthylaminoäthyl (DEAE)-substituierten Dextrankügelchen in einem mit einem Rührer versehenen Tank vor (A. L. van Wezel, "Growth of Cell Strains and Primary Cells on Microcarriers in Homogeneous Culture", Nature 216:64 (1967); D. van Hemert, D. G. Kilburn and A. L. van Wezel "Homogeneous

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Cultivation of Animal Cells for the Production of Virus and Virus Products", Biotechnol. Bioeng. 11:875 (1969) und A. L. van Wezel, "Microcarrier Cultures of Animal Cells", Tissue Culture, Methods and Applications, P. F. Kruse und M. K. Patterson, Academic Press, New York, S. 372 (1973). Diese Kügelchen werden von der Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, New Jersey, unter dem Warenzeichen DEAE-Sephadex A50 (Ionenaustauschersystem) in den Handel gebracht. Chemisch werden diese Kügelchen aus einer vernetzten Dextranmatrix mit Diäthylaminoäthylgruppen gebildet, die kovalent mit den Dextranketten verknüpft sind. Die im Handel erhältichen DEAE-Sephadex A50-Kügelchen besitzen eine Teilchengröße von 40 bis 120 μ und eine angenommene positive Ladungskapazität von ungefähr 5,4 mÄq/ g des trockenen vernetzten Dextrans (wobei das Gewicht der verknüpften DEAE-Anteile unberücksichtigt ist). Andere Anionenaustauscherharze, wie DEAE-Sephadex A25, QAE-Sephadex A50 sowie QAE-Sephadex A25, sollen ebenfalls, wie von van Wezel angegeben wird, das Zellwachstum unterstützen.

Das von van Wezel vorgeschlagene System kombiniert viele Oberflächen mit beweglichen Oberflächen und gestattet innovative Zellmanipulationen, wobei darüber hinaus eine Übertragung in den technischen Maßstab möglich ist und Umgebungssteuerungen durchführbar sind. Trotz dieser Fähigkeiten werden diese Methoden noch nicht in merklichem Ausmaße ausgewertet, da Schwierigkeiten bei der Zellenerzeugung infolge bestimmter nachteiliger Effekte festgestellt werden,die durch die Kügelchen verursacht werden. Von diesen Nachteilen seien ein anfängliches Absterben von Zellen innerhalb eines hohen Prozentsatzes des Zellinokulums sowie ein unzureichendes Zellenwachstum sogar im Falle von solchen Zellen erwähnt, die verknüpft sind. Die Gründe für diese nachteiligen Effekte sind noch nicht restlos aufgeklärt, es wird jedoch vermutet, daß sie auf eine Toxizität der Kügelchen oder auf eine Nährmitteladsorption zurückgehen (s. van Wezel, A. L. (1967), Nature 216:64-65; A. L. van Wezel (1973), Tissue Culture, Methods and Applications; P. R. Kruse und M. R. Patterson, S. 372 - 377, Academic Press, New York; P. van Hemert, D. G. Kilburn und A. L. van Wezel

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(1969), Biotechnol. Bioeng. 11:875 - 885, C. Horng und W. McLimans (1975), Biotechnol. Bioeng. 17: 713 - 732.

Es könnte sein, daß die nachteiligen Wirkungen dieser im Handel erhältlichen Ionenaustauscherharze auf ihre Herstellungsmethode zurückgehen. Einige dieser Produktionsmethoden für Polyhydroxymaterialien werden beispielsweise in den US-PS 3 277 025, 3 275 576, 3 042 667 und 3 208 994 beschrieben. Unabhängig von dem Grund sind die derzeit im Handel erhältlichen Materialien einfach für ein gutes Zellenwachstum einer erheblichen Vielzahl von Zelltypen nicht zufriedenstellend.

Eine Lösung zur Beseitigung der nachteiligen Wirkungen, die dann festgestellt werden, wenn man im Handel erhältliche Mikroträger für ein 'Zellenwachstum verwenden will, wird in der US-PS 4 036 693 beschrieben. Diese US-PS beschreibt ein Verfahren zur Behandlung dieser im Handel erhältlichen Ionenaustauscherharze mit makroretikularen Polyanionen, wie Carboxymethylcellulose. Diese Methode hat sich zwar als erfolgreich erwiesen, es wäre jedoch noch vorteilhafter, wenn die Kügelchen von Anfang an so hergestellt werden können, daß sie Eigenschaften besitzen, die für ein ausgezeichnetes Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen geeignet sind.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die Ladungskapazität von Mikroträgern eingestellt und/oder innerhalb eines bestimmten Bereiches gesteuert werden muß, damit ein gutes Wachstum einer Vielzahl von verankerungsabhängigen Zelltypen bei vernünftigen Mikroträgerkonzentrationen erzielt werden kann. Unter Berücksichtigung dieser Erkenntnis wurden Mikroträgerkügelchen mit gesteuerten Ladungskapazitäten erzeugt. Unter Einsatz dieser Kügelchen ist ein gutes Wachstum einer Vielzahl von verankerungsabhängigen Zellen möglich. Unter Verwendung dieser Mikroträgersysteme gezüchtete Zellen können gehärtet oder zur Herstellung von Tier- oder Pflanzenviren, Impfstoffen, Hormonen, Interferon oder anderen Zellwachstumsnebenprodukten verwendet werden.

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Ein Beispiel für die verbesserten Hikroträger sind solche Mikroträger, die unter Verwendung von Polymeren mit daran sitzenden Hydroxygruppen erzeugt worden sind, beispielsweise vernetzte Dextrankügelchen. Diese Kügelchen können mit einer wäßrigen Lösung eines tertiären oder quaternären Amins, wie Diäthylaminoäthylchlorid:Chlorid, sowie einem alkalischen Material, wie Natriumhydroxid, behandelt werden. Die spezifische Ladungskapazität der Kügelchen wird durch Veränderung der absoluten Mengen an Dextran, tertiärem Aminsalz und alkalischem Material gesteuert, wobei das Verhältnis dieser Materialien und/oder die Behandlungszeit und -temperatur ebenfalls variiert werden können.

Erfindungsgemäß hergestellte Mikroträger können in Kulturen eingesetzt werden, ohne daß dabei ein hoher Anteil an Zellen anfänglich verlorengeht, wie dies bisher bei der Verwendung von im Handel erhältlichen Mikroträgern festgestellt wurde. Ferner breiten sich gebundene Zellen auf den Kügelchen aus und wachsen zusammen, wobei extrem hohe Zellkonzentrationen in dem Suspensionsmedium erzielt werden. Die Konzentration von Mikroträgern in Suspension ist nicht auf sehr niedrige Gehalte beschränkt, so wie dies im Falle der bisher bekannten Materialien festgestellt wurde. Das Zellenwachstum scheint nur durch Faktoren begrenzt zu werden, die nicht in einem Zusammenhang mit den Mikroträgern stehen. Aufgrund dieser Tatsachen läßt sich eine erhebliche Zunahme der volumetrischen Produktivität von Zellkulturen erzielen. Nunmehr ist es möglich, die Vorteile auszuschöpfen, die bei der Verwendung von Mikroträgern beim Wachstum von Zellen möglich sind, insbesondere beim Züchten von verankerungsabhängigen Zellen.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine graphische Darstellung, welche die Wachstumscharakteristiken normaler diploider menschlicher Embryolungenfibroblastzellen (HEL299) bei einer Mikroträgerkonzen-

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tration von 2 g trockenem vernetzten^ Dextran/Liter sowohl im Falle von im Handel erhältlichen DEAE-behandelten Dextranmikroträgern als auch erfindungsgemäß erzeugten DEAE-behandelten Mikroträgern wiedergibt;

Fig. 2 eine graphische Darstellung, welche die Wachstumscharakteristiken von sowohl normalen diploiden menschlichen Embryolungenfibroblastzellen (HEL299) als auch von sekundären Hühnerembryofibroblasten bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 g trockenem vernetzten! Dextran/Liter unter Verwendung der erfindungsgemäßen verbesserten DEAE-behandelten Mikroträger wiedergibt.

Unter dem Begriff "Mikroträger", "Zellkulturmikroträger" sowie "Zellwachstumsmikroträger" sind kleine diskrete Teilchen zu verstehen, die für eine Zellenverknüpfung und -wachstum geeignet sind. Oft, wenn auch nicht immer, sind Mikroträger poröse Kügelchen, die aus Polymeren gebildet werden. Gewöhnlich verknüpfen sich die Zellen mit den äußeren Oberflächen derartiger Kügelchen und wachsen darauf.

Wie vorstehend erwähnt, wurde nunmehr gefunden, daß das Ausmaß der Ladungskapazität auf den Zellkulturmikroträgern auf einen bestimmten Bereich für ein ausreichendes Zellwachstum bei vernünftigen Mikroträgerkonzentrationen eingestellt und/oder gesteuert werden muß. Geeignete Arbeitsbereiche sowie bevorzugte Bereiche hängen von verschiedenen Faktoren ab, wie den jeweils zu züchtenden Zellen, der Art der Mikroträger, der Konzentration der Mikroträger sowie von anderen Kulturparametern, beispielsweise der Zusammensetzung des Mediums, ab. In allen Fällen liegt jedoch das Ausmaß der Ladungskapazität, das sich als geeignet erwiesen hat, deutlich unter dem Ausmaß, das auf im Handel erhältlichen Anionenaustauscherharzen zu finden ist, wie

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sie bisher für Mikroträgerzellkulturen eingesetzt worden sind. Beispielsweise nimmt man an, daß die DEAE-Sephadex A50-Kügelchen, die von van Wezel vorgeschlagen wurden, eine Ladungskapazität von ungefähr 5,4 mXq/g des trockenen und nichtbehandelten (ohne DEAE) vernetzten Dextrans aufweisen. Im Gegensatz zu dieser relativ hohen Ladungskapazität wurden erfindungsgemäß Mikroträger hergestellt, die sich für ein gutes Zellenwachstum als geeignet erwiesen haben, die eine Ladungskapazität zwischen ungefähr 0,1 und ungefähr 4,5 m&q/g der trockenen nichtbehandelten Mikroträger aufweisen. Unterhalb ungefähr 0,1 itiÄq/g nimmt man an, daß die Zellen sich nur unter Schwierigkeiten mit den Mikroträgem verbinden. Oberhalb ungefähr 4,5 mÄq/g tritt ein Verlust des Ausgangszelleninokulums auf, wobei sogar die überlebenden Zellen nicht gut wachsen, insbesondere bei relativ hohen Mikroträgerkonzentrationen.

Es wurde gefunden, daß zum Wachsen von normalen diploiden menschlichen Fibroblasten auf vernetzten Dextranmikroträgern ein bevorzugter Ladungskapazitätsbereich, der durch die DEAE-Gruppen zur Verfügung gestellt wird, ungefähr 1,0 bis ungefähr 2,8 mÄq/g des trockenen nichtbehandelten vernetzten Dextrans beträgt. Der bevorzugte Bereich kann in Abhängigkeit von den verschiedenen Zelltypen oder Kulturbedingungen schwanken, man nimmt jedoch an, daß die bevorzugten Bereiche für gegebene Bedingungen zwischen 0,1 und 4,5 m&q/g liegen. Die bevorzugten und optimalen Bedingungen können durch Routineexperimente ermittelt werden.

Natürlich gibt es gewisse Schwierigkeiten bei der Bestimmung der Ladungskapazität der Mikroträger, bezogen auf eine Einheitsgewichtsbasis. Beispielsweise liefern zwei Kügelchen, die in jeder Hinsicht identisch sind, mit der Ausnahme, daß sie aus Materialien mit verschiedenen Dichten mit der gleichen Ladungsverteilung darauf hergestellt worden sind, verschiedene Werte für ihre Ladungskapazität pro Gewichtseinheit. In ähnlicher Weise können zwei Kügelchen

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mit identischen Ladungskapazitäten pro Gewichtseinheit verschiedene Ladungsverteilungen aufweisen.

Es ist auch eine andere Definition dadurch möglich, daß der Bereich geeigneter Ladungen bezüglich der Ladungskapazität pro Gewichtseinheit der Mikroträger in ihrer fertigen funktioneilen Form spezifiziert wird. Diese Basis würde verschiedene Faktoren berücksichtigen, beispielsweise das Gewicht an gebundenen DEAE- oder anderen positiv geladenen Gruppen sowie die Hydratisierung der Kügelchen etc., während die bekannte Definition auf trockenem vernetztem Dextran basiert und derartige Faktoren nicht berücksichtigt. In einem wäßrigen Zellenkulturmedium sollte die Dichte der Mikroträger nahe 1,0 g/ccm liegen, so daß die Mikroträger leicht in der Kultur dispergiert werden können. Auf dieser Basis wurde ermittelt, daß der Bereich geeigneter Ladungskapazitäten für Mikroträger gemäß vorliegender Erfindung zwischen ungefähr 0,012 und ungefähr 0,25 mÄq/g beträgt.

Die Bereiche geeigneter Ladungskapazitäten, wie sie vorstehend auf Gewichtsbasis spezifiziert worden sind, gelten unter der Voraussetzung, daß die Mikroträger eine im wesentlichen gleichmäßige Ladungsverteilung über ihre Masse hinweg aufweisen. Ist die Ladungsverteilung ungleichmäßig, dann kann es möglich sein, daß geeignete Mikroträger Ladung skapazitäten außerhalb der angegebenen Bereiche besitzen. Das wichtige Kriterium besteht natürlich darin, daß die Ladungskapazität auf einen Wert eingestellt und/oder gesteuert wird, der dazu ausreicht, ein gutes Zellenwachstum auf den Mikroträgemzu ermöglichen.

Da das Ladungsmuster auf der äußeren Oberfläche wichtig sein kann, ist es außerdem zweckmäßig, daß man in der Lage ist, den geeigneten Ladungskapazitätsbereich im Hinblick auf das wahrscheinliche Oberflächenmuster zu definieren. Dies kann in der Weise geschehen, daß man von der Voraussetzung ausgeht, daß der aktive Teil der Mikroträger nur auf der äußeren Oberfläche der Kügelchen bis zu einer Tiefe von ungefähr 20 A

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liegt. Nimmt man ferner an, daß die geladenen Gruppen in den vorstehend erwähnten Fällen gleichmäßig fiber die Kügelchen verteilt sind, dann können die erwähnten Bereiche in eine Ladungskapazität in dieser äußeren Schale umgewandelt werden. Bedient man sich dieser Annäherung, dann kann der Bereich der Ladungskapazität, der sich als geeignet erwiesen hat, von ungefähr 0,012 m&q/cm³ bis ungefähr 0,25 mXq/cm³ definiert werden. Diese Näherung berücksichtigt Veränderungen des Mikroträgervolumens infolge von verschiedenen Ladungsdichten.

Mikroträger mit der erforderlichen Ladungskapazität können in der Weise hergestellt werden, daß Mikroträger aus Polymeren, die daran sitzende Hydroxylgruppen aufweisen, mit einer wäßrigen Lösung eines alkalischen Materials und eines tertiären oder quaternären Amins behandelt werden. Die Kügelchen können zu Beginn in einem wäßrigen Medium ohne die anderen Bestandteile angequollen oder einfach mit einem wäßrigen Medium, das die erforderliche Base und das Amin enthält, kontaktiert werden. Diese Methode unter Einsatz von alkalischen Materialien zum Katalysieren der Verknüpfung von positiv geladenen Aminogruppen mit den Hydroxyl-enthaltenden Polymeren wird in der US-PS 1 777 970 beschrieben.

Beispiele für geeignete Hydroxyl-enthaltende Polymere sind Polysaccharide, wie Dextran, Dextrin, Stärke, Cellulose, Polyglukose sowie substituierte Derivate dieser Substanzen. Bestimmte synthetische Polymere, wie Polyvinylalkohol sowie hydroxysubstituierte Acrylate oder Methacrylate, beispielsweise Hydroxyäthylmethacrylat, sind ebenfalls geeignet. Dextran, insbesondere vernetztes Dextran in Form von kleinen Kügelchen, ist besonders bevorzugt, da es im Handel erhältlich und relativ billig ist und Mikroträger erzeugt, die ein ausgezeichnetes Zellwachstum fördern.

Jedes alkalische Material kann für die Reaktion eingesetzt werden. Die Alkalimetallhydroxide, wie Natrium- oder Kaliunhydroxid, sind jedoch die bevorzugten alkalischen Substanzen.

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Entweder tertiäre oder quaternäre Amine sind geeignete Quellen für positiv geladene Gruppen, die mit den Hydroxy-enthaltenden Polymeren verknüpft werden können. Besonders bevorzugte Materialien sind die chlor- oder bromsubstituierten tertiären Amine oder Salze davon, wie Diäthylaminoäthylchlorid, Diäthylaminoäthylbromid, Dimethylaminoäthylchlorid, Dimethylaminoäthylbromid, Diäthylaminomethylchlorid, Diäthylaminomethylbromid, Di-(hydroxyäthyl)-aminoäthylchlorid, Di-(hydroxyäthyl)-aminoäthylbromid, Di-(hydroxyäthyl)-aminomethylchlorid, Di(hydroxyäthyl)-aminomethylbromid, ß-Morpholinoäthyläthylchlorid, ß-Morpholinoäthylbromid, ß-Morpholinomethylchlorid, ß-Morpholinomethylbromid sowie Salze davon, beispielsweise die Hydrochloride.

Ein breiter Bereich bezüglich der Reaktionstemperaturen und -zeiten kann eingehalten werden. Vorzugsweise werden die Reaktionen bei Temperaturen zwischen ungefähr 18 und 65°C durchgeführt. Man kann jedoch auch andere Temperaturen einhalten. Die Reaktionskinetik hängt in einem erheblichen Ausmaß natürlich von der Reaktionstemperatur sowie der Reaktantenkonzentration ab. Sowohl die Zeit als auch die Temperatur beeinflussen die erzielte Endaustauscherkapazität.

Der Grund dafür, daß die Ladungskapazität der Mikroträger beim Zellwachstum so kritisch ist, ist bisher noch nicht restlos aufgeklärt. Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, kann man annehmen, daß die Ladungskapazität auf der Oberfläche bestimmte lokale Diskontinuitäten der mittleren Zusammensetzung bedingt, welche den hauptsächlichen steuernden Einfluß auf das Mikroträgerkulturzellenwachstum ausüben. Dies bedeutet jedoch nicht, daß auch andere Möglichkeiten existieren.

Es kann natürlich auch bestimmte Kügelchen geben, die nicht für ein gutes Zellenwachstum geeignet sind, obwohl sie eine Ladungskapazität aufweisen, die in die vorstehend angegebenen Bereiche fällt. Dies kann auf Seitenketten an dem Anteil zu-

rückzuführen sein, der die Ladungskapazität bedingt, welche toxisch sind oder anderweitig in nachteiliger Weise das ZeIlwachstum beeinflussen. Ferner können adsorbierte oder absorbierte nachteilige Verbindungen oder Zubereitungen vorliegen, außerdem können die Porosität der Kügelchen oder andere Gründe ausschlaggebend sein. Sind derartige Kügelchen nicht für ein Zellenwachstum mit Ausnahme des Ausmaßes der Ladungskapazität geeignet, dann werden sie nicht als "Zellenwachstumsmikroträger" betrachtet.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von verbesserten Mikroträgern

Verbesserte Mikroträger können in der folgenden Weise hergestellt werden: Trockene, nichtgeladene und vernetzte Dextrankügelchen werden zur Gewinnung von Teilchen mit einem Durchmesser von ungefähr 75 μπι gesiebt. 1g dieser Fraktion wird zu 10 ml destilliertem Wasser gegeben, worauf die Kügelchen quellen gelassen werden. Eine zufriedenstellende im Handel erhältliche Quelle für trockenes verneteates Dextran ist Sephadex G-50 der Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey.

Eine wäßrige Lösung, die 0,01 Mol Diäthylaminoäthylchlorid: Chlorid, zweimal aus Methylenchlorid umkristallisiert, und 0,015 Mol Natriumhydroxid enthält, wird in einem 10 ml Volumen hergestellt. Die wäßrige Lösung wird dann der Suspension aus gequollenen Dextrankügelchen zugesetzt, die dann kräftig in einem Schüttelwasserbad während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 60⁰C bewegt wird. Nach einer Stunde werden die Kügelchen von der Reaktionsmischung durch Filtration unter Verwendung eines Whatman-Filterpapiers Nr. 595 abgetrennt und mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen.

Nach dieser Methode hergestellte Kügelchen enthalten ungefähr

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2,0 mÄq Ladungskapazität pro Gramm trockenem, nichtbehandeltem vernetztem Dextran. Diese Ladungskapazität kann durch Messen der Anionenaustauscherfähigkeit der Kügelchen in der folgenden Weise ermittelt werden: Die Kugelzubereitungen werden gründlich mit 0,1 η HCl zur Sättigung aller Austauscherstellen mit Cl -Ionen gewaschen. Dann erfolgt ein Spülen mit

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10 η HCl zur Entfernung von nichtgebundenen Chloridionen. Anschließend werden die Kügelchen mit einer 10 %igen (Gewicht/ Gewicht) Natriumsulfatlösung zur Gegenabsättigung der Austauschstellen mit SQ.~ gewaschen. Der Ablauf der Natriumsulfatwäsche wird gesammelt und enthält freigesetzte Chloridionen. Diese Lösung wird mit 1 m Silbernitrat unter Verwendung von verdünntem Kaliumchromat als Indikator titriert.

Nach der Titration werden die Kügelchen gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespült, in PBS suspendiert und im Autoklaven behandelt. Diese Methode liefert hydratisierte Kügelchen mit einem Durchmesser von ungefähr 120 bis 200 μΐη, die ungefähr 2,0 mÄq Ladungskapazität pro g trockenem, nichtbehandeltem und vernetz tem Dextran tragen.

Beispiel 2

Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen mit erfindungsgemäßen Mikroträgern im Gegensatz zu im Handel erhältlichem Ionenaustauscherharz

Alle Zellen v/erden in einem modifizierten Dulbecco-Eagle-Medium gezüchtet. Zum Wachsenlassen von normalen diploiden Fibroblasten wird das Medium mit 10 % Kälberfötusserum ergänzt. Zum Wachsenlassen von primären und sekundären Hühnerfibroblasten wird das Medium mit 1 % Hühnerserum, 1 % Kälberserum und 2 % Tryptosephosphatbrühe (Difco Laboratories, Detroit, MI) ergänzt. Die Ansätze werden auf 100 mm-Kunststoffschalen (Falcon Plastics, Inc., Oxnard, CA) behandelt.

Primäre Hühnerembryofibroblasten werden durch Zerkleinern und anschließendes Trypsinisieran von 10 Tage alten Embryos her-

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gestellt. Sekundäre Hühnerembryofibroblasten werden am ersten Tag des primären Zusammenlaufens durch Trypsinisierung hergestellt. Für in Kunststoffschalen gezüchtete Zellen beträgt die Verdoppelungszeit ungefähr 20 Stunden.

Diploide menschliche Fibroblasten, die auf Embryolungen (HEL299, ATCC #CCL 137) zurückgehen, werden von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, erhalten. Diese Zellen besitzen eine Verdoppelungszeit von 19 Stunden in Kunststoffschalen.

Mikroträgerkultüren werden dadurch initiiert, daß einfach die Zellen und die Kügelchen in einer gerührten Kultur vereinigt werden. 100 ml Kulturvolumina in 250 ml-Glasflaschen (6,5 cm Durchmesser), die mit einem magnetisch angetriebenen, mit Teflon überzogenen Rührstab mit einer Abmessung von 4,5 cm (Wilbur Scientific, Inc., Boston, MA) ausgestattet sind, werden verwendet. Die Rührgeschwindigkeit beträgt ungefähr 90 Upm. Es werden direkte Proben aus den Kulturen entnommen. Die Proben werden mikroskopisch untersucht und photographiert. Die Zellen werden durch Zählen der Keime numeriert, wobei eine Modifizierung der Methode von Sanford et al. (Sanford, K. K., Earle, W. R., Evans, V. J., Waltz, H. K., und Shannon, J. E. (1951) J. Nat. Cancer Inst., 11: 773) wie sie von van Wezel beschrieben wird (van Wezel, A. L. (1973) angewendet wird. Tissue Culture, Methods and Applications. Kruse, P. F. und Patterson, M. R., S. 372 bis 377, Academic Press, New York.

Kügelchen mit daran gebundenen Zellen werden von dem Kulturmedium in der Weise abgetrennt, daß man die Kügelchen bei 1 g während einer Zeitspanne von wenigen Minuten absetzen läßt, und dann die überstehende Flüssigkeit absaugt. Diese Methode erleichtert erheblich den Ersatz des Mediums sowie die Abtrennung von Zellen von den Mikroträgern nach der Trypsinisierung.

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Im Handel erhältliches DEAE Sephadex A-50 wird als Mikroträger für die diploiden menschlichen Fibroblasten verwendet und mit Trägern verglichen, die gemäß Beispiel 1 synthetisiert und titriert worden sind. Im Falle beider Kügelchentypen beträgt die Trägerkonzentration 2 g des trockenen nichtbehandelten und vernetzten Dextrans pro Liter. Die Ladungskapazität von DEAE Sephadex A-50 beträgt 5,4 mÄq/g des trockenen vernetzten Dextrans, während diejenige der frisch synthetisierten Kügelchen zu 2,0 mÄq/g ermittelt wird. Die Ergebnisse gehen aus der Fig. 1 hervor.

Im Falle dieses Zelltyps wird der Verlust an ursprünglichem Inoculum auf A-50 Mikroträgern festgehalten, während die Fibroblasten sich verknüpfen, vermehren und auf den Mikroträgern gemäß vorliegender Erfindung in sechs Tagen die Konfluenz erreichen. Dieses Verhalten stimmt mit dem angegebenen Verhalten dieses Zellentyps auf Standardplatten überein. Wie aus der Fig. 1 ersichtlich ist, beträgt die Endzellendichte, die mit den neuen Mikroträgern bei 2 g des trockenen vernetzten Dextrans/Liter erzielt wird, 1,2 χ 10⁶ Zellen/ml.

Eei Kulturen, welche die neuen Träger enthalten, sind weder ein anfänglicher Zellverlust noch eine Inhibierung bezüglich des Erreichens des Zusammenlaufens festzustellen. Darüber hinaus wachsen die Kulturen, was noch wichtiger ist, normal bei höheren Mikroträgerkonzentratxonen. Beispielsweise zeigt die Fig. 2 wie menschliche Fibroblasten sowie sekundäre Hühnerembryofibroblasten die Sättigungskonzentrationen nahe 4 χ 10 Zellen/ml erreichen, wenn 5 g trokkenes vernetztes Dextran pro Liter im Falle der neuen Träger mit einer Ladungskapazität von 2,0 inAq/g Dextran verwendet werden. Wie ersichtlich, tritt sogar bei dieser relativ hohen Mikroträgerkonzentration kein signifikanter Inokulumverlust auf.

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Sekundäre Hühnerembryofibroblasten werden ebenfalls bei einer Mikroträgerkonzentration von 10 g/l gezüchtet. Unter Einhaltung der vorstehend beschriebenen Bedingungen wird eine Sättigungskonzentration von 6 χ 10 Zellen/ml erzielt. Setzt man dem Medium ein weiteres Prozent Kälberfötusserum zu, dann wird eine Sättigungskonzentration von 8x10 Zellen/ml erzielt. Es wird kein signifikanter Zelleninokulumverlust festgestellt.

Primäre Hühnerembryofibroblasten werden bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 und 10 g/l gezüchtet. Die Wachstumseigenschaften sind ähnlich denjenigen der sekundären Hühnerfibroblasten, obwohl leichte Inokulumverluste und etwas längere Verzögerungszeiten festgestellt werden.

Es wurden ferner Versuche unternommen, sekundäre Hühnerembryofibroblasten unter Bedingungen zu züchten, die den vorstehend eingehaltenen ähnlich sind, mit der Ausnahme, daß die DEAE Sephadex A-50 Mikroträger mit Konzentrationen von 1 und 5 g/l verwendet werden. Es wird kein Zellenwachstum festgestellt und ein signifikanter Inokulumverlust beobachtet.

Beispiel 3 Herstellung von Mikroträgern mit wechselnden Reaktantenmengen

Mikroträgerchargen werden durch Auflösen von Diäthylaminoäthyl-Chlorid:Chlorid und Natriumhydroxid in 20 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Lösung wird dann über trockene Sephadex G-50-Kügelchen gegossen, worauf die Kügelchen auf einen sich hin- und herbewegenden mit Wasser gefüllten Schüttler (Temperatur 60⁰C) gebracht werden. Ein Teil der Kugelchargen wird mit einer Lösung behandelt, die 0,01 Mol des Amins und 0,015 Mol Natriumhydroxid enthält, während eine andere Portion mit einer Lösung behandelt wird, die 0,03 Mol des Amins und 0,045 Mol Natriumhydroxid enthält. Die Reaktionszeit wird zur Erzielung von verschiedenen mXq/g innerhalb einer jeden Charge variiert.

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Diploide menschliche Fibroblasten (HEL299) werden in Suspensionskulturen bei einer Mikroträgerkonzentration von 5,0 g des trockenen nichtbehandelten vernetzten Dextrans pro Liter nach den in Beispiel 2 beschriebenen Methoden gezüchtet, wobei Mikroträger verwendet werden, die wechselnde mÄq/g aufweisen und aus jeder Charge ausgewählt werden. Anschließend wird die Produktivität (10 gezüchtete Zellen/Liter-Stunde) berechnet und in Abhängigkeit von mÄq/g für jede Kugelcharge, die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt worden ist, aufgetragen. Kurven, die unter Verwendung von Werten aus beiden Versuchen aufgetragen werden, besitzen eine ähnliche Form, und zwar im allgemeinen eine Glockenform, die Kurve aus den Chargen, die mit Reaktanten in höheren Konzentrationen behandelt worden sind, weist jedoch einen etwas steileren Anstieg und Abfall auf. Aus jeder Charge werden Träger erhalten, die ein ausgezeichnetes Zellenwachstum bewirken.

Beispiel 4

Herstellung von Mikroträgern unter Einhaltung wechselnder

Verhältnisse Amin/Alkali

Dieses Beispiel erläutert weitere Veränderungen der Ladungskapazität, die durch Veränderung der Verhältnisse DEAE Chlorid: Chlorid/NaOH erzielt werden. Zur Durchführung dieses Beispiels wird die in Beispiel 3 beschriebene Arbeitsweise eingehalten, mit der Ausnahme, daß ein breiter Konzentrationsbereich an Natriumhydroxid verwendet wird, während die Konzentration an Diäthylaminoäthylchlorid:Chlorid bei 0,01 Mol pro 20 ml gehalten wird. Die Konzentrationen an Natriumhydroxid betragen 0,01, 0,011, 0,012, 0,013, 0,014, 0,015, 0,02, 0,03, 0,05, 0,75 und 0,10 Mol pro 20 ml.

Nach 1,25 Stunden bei 60⁰C werden die Werte von inÄg in Abhängigkeit von der Konzentration an Natriumhydroxid aufgetragen. Aus der graphischen Darstellung ersieht man, daß Natriumhydroxidkonzentrationen von weniger als ungefähr 0,01 keine feststellbare Ladungskapazität erzeugen. Die Ladungskapazität

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steigt jedoch schnell mit einer Zunahme der Konzentration an und erreicht ein Maximum von etwa 2,3 mÄq/g des trockenen vernetzten Dextrans bei einer Konzentration von ungefähr 0,014 Mol Natriumhydroxid. Die Ladungskapazität nimmt dann praktisch linear bis auf einen Wert von ungefähr 1,1 mÄq/g bei einer Natriumhydroxidkonzentration von ungefähr 0,10 Mol ab. Eine Veränderung der Reaktionskinetik erfolgt daher, wenn das Verhältnis DEAE-ChIorid:Chlorid zu Natriumhydroxid bei einer konstanten Konzentration von DEAE-Chlorid:Chlorid und vernetztem Dextran variiert wird.

Beispiel 5

Herstellung von menschlichem Interferon in Zellen, die auf

verbesserten Mikroträgern gezüchtet worden sind

Nachfolgend wird die Fähigkeit von auf Mikroträgern gezüchteten Zellen zur Gewinnung von menschlichem Interferon beschrieben. Die für die Herstellung von menschlichem Interferon eingesetzten Zellen sind normale diploide menschliche Vorhautfibroblasten (FS-4). Diese Fibroblasten werden in Mikroträgerkulturen unter Anwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Methode gezüchtet. Gemäß Beispiel 1 hergestellte und titrierte Mikroträger werden in einer Konzentration von 5 g trockenem vernetztet» Dextran/1 verwendet. Das für das Kulturwachstum verwendete Medium besteht aus DMEM, ergänzt mit 10 % Kälberfötusserum.

Nach 8 bis 10 Tagen hört das Wachstum der Kulturen auf. Zu diesem Zeitpunkt wird das Wachstumsmedium entfernt. Die Kulturen werden ein- bis viermal mit 100 ml serumfreien DMEM gewaschen. Die Zellen sind dann für die Interferoninduktion fertig. Diese erfolgt durch Zugabe von 50 ml serumfreien DMEM-Medium, das 50 μg/ml Cyclohexamid sowie wechselnde Mengen Poly I-Poly C-Induktionsmittel enthält, zu den Kulturen. Nach 4 Stunden wird Actinomycin D den Kulturen zur Einstellung einer Endkonzentration von 1 Hg/ml zugesetzt.

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5 Stunden nach dem Einsetzen der Induktion wird das Induktionsmedium dekantiert, worauf die Kulturen drei- bis viermal mit 100 ml warmem serumfreien DMEM gewaschen werden. Die Kulturen werden mit 50 ml DMEM aufgefrischt, das 0,5 % menschliches Plasmaprotein enthält. Die Kulturen werden unter Standardbedingungen während weiterer 18 Stunden bebrütet. Zu diesem Zeitpunkt werden die Kulturen dekantiert, worauf das dekantierte Medium auf seine Interferonaktivität untersucht wird. Die Inteferonaktivität wird in der Weise ermittelt, daß das 50 % Ausmaß des Zellenschutzes von Proben und Standardlösungen von FS-4-Fibroblasten ermittelt wird, die mit Vesicular Stomatitis Viren (VSV), Indiana-Stamm, herausgefordert worden sind. Die Ergebnisse der Interferonerzeugungsversuche sind nachfolgend tabellarisch zusammengefaßt:

Induktionsmitte1- konzentration, μg/ml	Zellenkonzentration rend der Erzeugung, len/ml	χ 10⁶	wäh- ZeI-	Interferon, U/10⁶ Zellen
4	2,0	χ 10⁶		39
5	2,6	χ 10⁶		378
25	2,6	χ 10⁶		886
50	2,0		/^5000

Diese Werte stammen aus jeweils getrennten Versuchen und sollen nicht irgendeine Beziehung zu der Induktionsmittelkonzentration wiedergeben.

Beispiel 6

Wachstum von Zellen auf verbesserten Mikroträgern zur Erzeugung

von Viren

Die Fähigkeit von Mikroträger-gezüchteten Zellen zur Erzeugung eines Virus wird nachfolgend beschrieben. Primäre und sekundäre Huhnerembryofibroblasten werden in einer Mikroträgerkultur nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode gezüchtet, wobei die primären Zellen bei einer Mikroträgerkonzentration von 10 g/l und die sekundären Zellen bei einer Mikroträgerkonzentration

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von 5 g/l gezüchtet werden. Zur Initiierung der Viruserzeugung wird das Wachsturasmedium entfernt, worauf die Kulturen zweimal mit 100 ml serumfreien DMEM gewaschen werden. Die Infizierung der Zellen mit Sindbis-Virus erfolgt in 50 ml DMEM, ergänzt mit 1 % Kälberserum, 2 % Tryptosephosphatbrühe sowie soviel Sindbis-Viren, die einem MOI-Wert von 0,05 (Multiplizität der Infektion) entsprechen.

Das Virus wird 24 Stunden nach der Infektion durch Sammeln der Kulturbrühe, Klären durch geringes Zentrifugieren und Einfrieren der überstehenden Flüssigkeit gehärtet. Die Virusproduktion wird durch Plattenbildung in einem Feld sekundärer Hühnerfibroblasten untersucht. Die Ergebnisse der Infektion dieser Mikroträgerkulturen sind folgende:

Z eilen typ Gesamtkonzentration zur Herstellung PFü/ml PFü/Zelle

(Zellen/ml)

Sekundär 4,0 χ 10⁶ 8,4 χ 10⁹ 2100

Primär 1,4 χ 10⁶ 2,3 χ 10¹⁰ 16000

Primär 6,0 χ 10⁶ 2,6 χ 10¹⁰ 5000

Die Viruserzeugung wird ferner für die folgenden Kombinationen aus Viren und Zellen auf Mikroträgem ermittelt: Polio/Wi-38, Moloney MuLV/Cl-1 Maus und VSV/Hühnerembryofibroblasten.

Beispiel 7

Vergleichswachstum von Zellen in Rollflaschen unter Einsatz von verbesserten Mikroträgern zur Herstellung von Iläuseleukämievirus-Provirus-DNA

Die mit reverser Transcriptase gebildete DNA von Moloney Leukämievirus (M-MuLV) wird nach einer Infektion von JLS-V9-Zellen aus Mäusemarkknochen untersucht.

Eine Methode besteht darin, Zellen in gerollten Flaschen zu züchten. Die Zellen werden in einer Rollflaschenkultur gezüchtet, worauf das Medium entfernt und das Virusinokulum

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in die Flaschen eingeführt wird. Kurz danach werden die Kulturen mit frischem Medium versetzt und 8 bis 16 Stunden später für eine evtl. Reinigung von Virus-DNA extrahiert. Die Kulturen werden mit frischem Puffer gewaschen und die Zellen mit einer Lösung lysiert, die das Detergens Natriumdodecylsulfat enthält. Die abschließende Abkühlung des Lysats sowie die Zugabe von Salz (1 molar) verursacht eine Coprecipitation des Detergenses mit DNA mit hohem Molekulargewicht. Die DNA mit niederem Molekulargewicht, die in der übestehenden Flüssigkeit zurückbleibt, kann entproteinisiert und für eine weitere Analyse konzentriert werden.

Eine aus 50 Rollflaschen bestehende Kultur enthält ungefähr Zellen. Diese werden mit ungefähr 1 1 Virusinokulum (3x10 plattenbildende Einheiten pro ml) infiziert. Dies bedingt eine nominelle Multiplizität der Infektion von 1 bis 3. Die infizierten Zellen ergeben 5 bis 20 Nanogramm virusspezifische DNA.

Eine einfachere Methode wurde unter Verwendung von verbesserten erfindungsgemäßen Mikroträgern entwickelt. Eine Kultur, die 10g Kügelchen in 1 1 Wachstumsmedium enthält, wird ver-

wendet. Nach dem Erreichen der Konfluenz werden die 10 -Zellen auf den Kügelchen in der Weise infiziert, daß man die Kügelchen absitzen läßt und das Medium durch 1 1 Virusinokulum ersetzt. Zur Extraktion werden die Zellen auf den Kügelchen mit Puffer gewaschen und dann in SDS enthaltenden Puffer gegeben. Nach der Coprecipitation der DNA mit hohem Molekulargewicht mit dem Detergens wird der Niederschlag zusammen mit den Kügelchen abzentrifugiert und eine überstehende Flüssigkeit für eine weitere Analyse extrahiert. Die Ausbeute an Virus-DNA ist vergleichbar mit derjenigen, die in einer Rollflaschenkultur erzielt wird, wobei der Arbeitsaufwand 5 bis 10 % des Aufwandes beträgt, der im Falle der Rollflaschenkultur erforderlich ist.

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Beispiel 8

Verbesserte Mikroträgererzeugung mit Dimethylaminoäthyl-Ladungsgruppen.

Ein geeigneter Mikroträger wird in der Weise erzeugt, daß ein anderer Austauscheranteil mit der Dextranmatrix gemäß Beispiel 1 verknüpft wird. Dimethylaminoäthylgruppen (DMAE) werden mit einer Dextranmatrix nach der folgenden Methode verknüpft: 1 g Dextrankügelchen (Pharmacia G-50) mit einem Durchmesser von 50 bis 75 μια im trockenen Zustand werden zu 10 ml destilliertem Wasser gegeben, worauf man die Kügelchen anquellen läßt. Eine wäßrige Lösung, die 0,01 Mol Dime thylaminoäthylchlorid:Chlorid (Sigmal Chemical Co.) und 0,015 Mol Natriumhydroxid enthält, wird mit einem Volumen von 10 ml hergestellt. Diese wäßrige Lösung wird den gequollenen Dextrankügelchen zugesetzt. Die erhaltene Suspension wird dann kräftig während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei 60⁰C bewegt. Nach der Umsetzung wird die Kügelchenmasse wie in Beispiel 1 titriert. Diese Reaktion bindet 1,0 mXq Dimethylaminoäthy1 mit der Dextranmasse. Zur Erzeugung von Mikroträgern mit größerem Substitutionsgrad wird die vorstehend beschriebene Reaktion durchgeführt, worauf die Kugelmasse gründlich mit Wasser gewaschen wird. Nachdem der Wasserüberschuß abfiltriert worden ist, wird die Kügelchenmasse gewogen, um die Menge an Wasser, die von der Kügelchenmasse festgehalten wird, zu bestimmen. Diese Masse wird dann mit der entsprechenden Menge an frischen Reagentien (d. h. DMAE-CL:CL und NaOH) in der Weise versetzt, daß die Endkonzentration an DMAE und NaOH in diesen darauffolgenden Reaktionsmischungen identisch mit der anfangs eingehaltenen ist.

Auf diese Weise wird eine Reihe von Mikroträgern mit 1,0, 2,0, 2,5 und 3,5 m&q DMAE/g nichtumgesetztem Dextran hergestellt. Zellen (HEL299) werden in einer Mikroträgerkultür (5 g/l) mit diesen Mikroträgern nach der Methode gemäß Beispiel 2 gezüchtet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Ta-

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belle zusammengefaßt:

Substitutionsgrad, Zellenausbrei- Nettowachs-

mÄq/q tung tum

1,0

2,0

2,5 + +

3,2 +

Wie erwartet, steht das Zellenwachstum in einer Beziehung zu dem Substitutionsgrad mit ladungstragenden Gruppen. „ Bei einem zu hohen Substitutionsgrad erfolgt kein Zellenwachstum, obwohl eine Verknüpfung und eine Ausbreitung erfolgt. Bei einem zu niedrigen Substitutionsgrad reicht das Haften der Zellen an die Oberfläche nicht aus, um ein ausreichendes Ausbreiten und Wachstum zu ermöglichen.

Beispiel 9

Verbesserte Mikroträger mit positiv geladenen Phosphonium-

gruppen

Verbesserte Mikroträger werden ferner unter Einsatz von Nichtaminaustauschergruppen in der folgenden Weise hergestellt: 1 g trockener Dextrankügelchen werden hergestellt und mit Wasser wie in Beispiel 1 gequollen. Den gequollenen Kügelchen werden 5 ml einer gesättigten wäßrigen Lösung von Triäthyl-(äthylbromid)-phosphonium (TEP)

C₂H₄Br C₂H₅

und 5 ml einer 3 molaren Lösung von Natriumhydroxid zugesetzt, Diese Aufschlämmung wird bei 65°C zur Umsetzung gebracht. Eine Reihe Mikroträger wird mit 1,1, 1,7 und 2,9 mÄq/g hergestellt. Die Mikroträger mit 1,1 mÄq/g werden durch Umsetzung unter den vorstehend angegebenen Bedingungen während einer Zeitspanne von 4 Minuten hergestellt. Der 1,7 mÄq/g-Mikroträger wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde und die 2,9 mÄq/g-Mikroträger aufeinanderfolgend dreimal wie in

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Beispiel 7 umgesetzt. Eine Mikroträgerzellenkultur mit 5 g/l wird für jeden dieser Träger mit einem kontinuierlichen Zellentyp, und zwar JLS-V9, hergestellt, worauf ein Vergleich zu dem Wachstum dieser Zellen an verbesserten DEAE-Mikroträgern durchgeführt wird, die wie in Beispiel 3 hergestellt worden sind. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

DEAE

mSq/g Zellenverknüpfunq und Ausbreitung Nettowachstun 0,9 + +

1.7 + +

3.8 + -

TEP

1,1 + +

1,7 + +

2.9 +

In den Rahmen der Erfindung fallen auch bestimmte Äquivalente zu den angegebenen spezifischen Methoden, Materialien etc. Obwohl hauptsächlich von einer Verwendung der verbesserten Mikroträger für das Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen die Rede war, können diese Träger natürlich auch für das Wachstum von anderen Zelltypen eingesetzt werden.

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Claims

MÜLLER-BORE · DEUFEL · SCHÖN · HBRTBL PATENTANWÄLTE DR. WOLFGANC MOLLER-BORt !PATENTANWALT VON 1927-1975) DR. PAUL DEUFEL. DIPI CHBM. OR. ALFRED SCHÖN. DIPU-CHeM. WKRNER HERTEL. DIPL.-PHYS. M 2522 Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA Verfahren zum Züchten von verankerungsabhängigen Zellen in einer Mikroträgerkultur. Patentansprüche

1. Verfahren zum Züchten von verankerungsabhängigen Zellen in einer Mikroträgerkultur, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroträger verwendet werden, die eine solche Menge an positiv geladenen chemischen Anteilen aufweisen, daß eine Austauscherkapazität innerhalb eines Bereiches verfügbar ist, die ein gutes Zellenwachstum der Zöllen ermöglicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der positiv geladenen chemischen Anteile an den Mikroträgern derartig ist, daß eine Austauscherkapasität zwischen ungefähr 0,1 und ungefähr 4,5 mÄq/g der trockenen

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nichtbehandelten Mikroträger zur Verfügung steht.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroträger aus vernetzten Dextrankügelchen bestehen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die positiv geladenen chemischen Anteile an den vernetzten Dextrankügelchen aus tertiären oder quaternären Amingruppen bestehen.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die positiv geladenen chemischen Anteile an den vernetzten Dextrankügelchen aus Diäthylaminoäthylgruppen bestehen.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an positiv geladenen chemischen Anteilen an den Mikroträgern derart ist, daß eine Austauscherkapazität in der äußeren Schale zwischen ungefähr 0,012 und ungefähr 0,25 itiÄq/ccm zur Verfügung steht.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der positiv geladenen chemischen Anteile an den Mikroträgern derart eingeste Ht ist, daß eine Austauscherkapazität zwischen ungefähr 0,012 und ungefähr 0,2 5 inÄq/g der fertigen Mikroträger zur Verfügung steht.

8. Verfahren zum Züchten von verankerungsabhängigen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß

a. eine Suspension positiv geladener Mikroträger in einem Zellenkulturmedium gebildet wird, deren Ladungskapazität auf einen V7ert eingestellt ist, der ein gutes Wachstum der Zellen fördert,

b. Zellen auf die Suspension der Mikroträger unter Bildung einer Zellenkultur aufgeimpft werden und

c. die Zellenkultur unter Zeilwachstumsbedingungen gehalten wird.

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9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die positiv geladenen Mikroträger eine Ladungskapazität von ungefähr 0,1 bis ungefähr 4,5 m&q/g der trockenen, nichtbehandelten Mikroträger aufweisen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß

die Mikroträger aus vernetzten Dextrankügelchen mit tertiären oder guaternären Amingruppen bestehen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß

die tertiären oder quaternären Amingruppen aus Diäthylaminoäthylgruppen bestehen.

12. Zellkultunnikroträger mit einem Substitutionsgrad mit positiv geladenen chemischen Anteilen, die dazu ausreichen, eine Ladungskapazität zur Verfügung zu stellen, bei welcher ein gutes Zellenwachstum erfolgt.

13. Mikrοträger nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Ladungskapazität ungefähr 0,1 bis ungefähr 4,0 mÄq/g der trockenen nichtbehandelten Mikroträger beträgt.

14. Mikroträger nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die fertigen Mikroträger eine Ladungska 0,012 bis ungefähr 0j25 mÄq/g aufweisen

die fertigen Mikroträger eine Ladungskapazität von ungefähr

15. Mikroträger nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine -Lfedungskapazität in ihrer äußeren Schale von ungefähr 0,012 bis ungefähr 0,25 mfiq/ccm aufweisen.

16. Zellkulturmikroträger, gekennzeichnet durch vernetzte Dextrankügelchen mit einer solchen Menge positiv geladener Gruppen, daß eine Ladungskapazität zwischen ungefähr 0,1 und ungefähr 4,5 m&q/g der trockenen vernetzten Dextrankügelchen vorliegt.

17. Mikroträger nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die positiv geladenen Gruppen aus Diäthylaminoäthylgruppen

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bestehen.

18. Zellkulturmikroträger, gekennzeichnet durch ein Reaktionsprodukt aus vernetzten Dextrankügelchen und einer wäßrigen Lösung eines tertiären oder quaternären Amins und einer Base, wobei die wäßrige Lösung eine solche Menge an Amin und Base in einem solchen Verhältnis aufweist, daß die Mikroträger eine Austauscherkapazität von ungefähr 0,1 bis ungefähr 4,5 mÄq/g des trockenen Dextrans aufweisen.

19. Mikroträger nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das tertiäre oder quaternäre Amin aus Diäthylaminoäthyl besteht.

20. Mikroträger nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Base aus Natriumhydroxid besteht.

21. Verfahren zur Herstellung von verankerungsabhängigen Zeilwachstumsnebenprodukten, dadurch gekennzeichnet, daß

a. eine Suspension positiv geladener Mikroträger mit einer Ladungskapazität gebildet wird, die dazu ausreicht, ein gutes Wachstum verankerungsabhängiger Zellen in einem geeigneten Zellenkulturmedium zu ermöglichen,

b. die Kultur mit verankerungsabhängigen Zellen unter Bildung einer Zellenkultur beimpft wird,

c. die Zellenkultur unter solchen Bedingungen gehalten wird, die für die Erzeugung von Zellenwachstumsnebenprodukten geeignet sind und

d. die Zellenwachstumsnebenprodukte geerntet werden.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroträger eine Ladungskapazität von ungefähr 0,1 bis ungefähr 4,5 mÄq/g der trockenen nichtbehandelten Mikroträger besitzen.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellenwachstumsnebenprodukt aus einem Virus besteht.

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24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellenwachstumsnebenprodukt aus einem Hormon besteht.

25. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellenwachstumsnebenprodukt aus Interferon besteht.

26. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroträger eine Ladungskapazität von ungefähr 0,012 bis ungefähr 0,25 mSq/g der fertigen Mikroträger aufweisen.

27. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroträger eine Ladungskapazität in ihrer äußeren Schale von ungefähr 0,012 bis ungefähr 0,25 mÄq/ccm aufweisen.

28. Verfahren zur Herstellung von Zellkulturmikroträgern, dadurch gekennzeichnet, daß vernetzte Dextrankügelchen in einer wäßrigen Lösung eines tertiären oder quaternären Amins und einer Base solange eingetaucht werden, bis die Kügelchen mit einer ausreichenden Menge Aminanteilen zur Erzeugung einer Ionenaustauscherkapazität von ungefähr 0,1 bis ungefähr 4,5 mÄq/g des trockenen Dextrans substituiert sind.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Amin aus Diäthylaminoäthyl besteht.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzte Base aus Natriumhydroxid besteht.

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