DE69022121T2

DE69022121T2 - Verfahren zur Herstellung eines Metastaseninhibitorenfaktors.

Info

Publication number: DE69022121T2
Application number: DE69022121T
Authority: DE
Inventors: Kanso Iwaki; Masashi Kurimoto; Ryuichi Motoda
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1989-05-22
Filing date: 1990-05-21
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2010-05-22
Also published as: EP0401997A1; ES2080114T3; JPH02308799A; KR900018379A; EP0401997B1; GR3018004T3; ATE127527T1; CA2017279A1; RU2070046C1; DK0401997T3; DE69022121D1; KR0157227B1; US5126148A; JP2926409B2

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Metastaseninhibitorfaktors (im folgenden als "MIF" abgekürzt), und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von MIF, bei welchem eine errichtete, menschliche, hämopoietische Zelle MIF produzieren gelassen wird und wobei der MIF gewonnen wird.
In Japan steigt die Lebenserwartung bei Geburt von Jahr zu Jahr. Gemäß dem Nippon Tokei Nenkan (Japanisches Statistisches Jahrbuch), 37. Ausgabe, veröffentlicht von der Japan Statistical Association (1987), war die Lebenserwartung bei Geburt im Jahr 1985 für Männer 74,78 Jahre und für Frauen 80,48 Jahre. Die häufigste Todesursache sind maligne Neoplasmen oder Krebs, was etwa 25% der gesamten Todesfälle ausmacht.
Die Behandlung von Krebs wird vorwiegend durch chirurgische Operation, Chemotherapie und Bestrahlung ausgeführt. Diese Therapien können zwar einen Hauptteil eines wachsenden Tumors töten, können jedoch die übrigen Krebszellen im Körper des Patienten dispergieren, wobei seine Metastase beschleunigt wird. Dies kann zu einem viel schwerwiegender metastasierenden Tumor führen und das Leben des Patienten noch mehr verkürzen.
Falls die Metastase des Krebses verhindert wird, wird der Schmerz der Patienten gelindert und kann der Rest ihres Lebens bemerkenswert verlängert werden. Für die Entwicklung einer Methode, welche die Metastase von Krebs wirksam unterdrückt, besteht daher ein großer Bedarf.
Demgemäß zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, ein Verfahren zur Herstellung von MIF zur Verfügung zu stellen, welches in industriellem Maßstab einfach durchführbar ist.
Wir überprüften verschiedenste Metastaseninhibitorsubstanzen, welche einfach in den Handel gebracht werden können, und haben auch ihre industrielle Herstellung studiert.
Als Ergebnis fanden wir, daß Metastaseninhibitor-Substanzen durch Überprüfen ihrer Metastaseninhibitoraktivität mit einer RPMI 4788-Zelle (FERM BP-2429), eine errichtete, menschliche Colonkrebszelle, gescreent werden können. Ferner errichteten wir ein Verfahren zur Herstellung von MIF, bei welchem Verfahren eine errichtete, menschliche, hämopoietische Zelle, die MIF produzieren kann, MIF produzieren gelassen und der MIF gewonnen wird. Auf diese Weise kamen wir zur vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung des Metastaseninhibitorfaktors zur Verfügung, wobei:
eine errichtete, menschliche, hämopoietische Zelle den Faktor produzieren gelassen wird; und
der erhaltene Faktor gewonnen wird, wobei der Metastaseninhibitorfaktor eine Metastaseninhibitoraktivität aufweist, wenn diese mit einer errichteten, menschlichen Colonkrebszelle RPMI 4788 (FERM BP-2429) gemessen wird, jedoch keine Interferonaktivität, Tumornekrosefaktor-aktivität, Interleukin 1-Aktivität und Interleukin 2-Aktivität aufweist, und bei Gelfiltration ein Molekulargewicht von 10.000-450.000 aufweist.
Der Ausdruck "errichtete, menschliche, hämopoietische Zelle" umfäßt jene Zellen, welche zum Beispiel in Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Band 20, Nr. 6, Seiten 616-643 (1975), Catalogue of the Japanese Cancer Research Resources Bank, (1988), und Catalogue of ATCC Cell Lines & Hybridomas, 6. Ausgabe (1988) beschrieben sind.
Errichtete, menschliche, hämopoietische Zellen, welche in die T-Zelle, B-Zelle, non-T non-B- Zelle und myelomonozytische Zelle gruppiert sind, werden zweckmäßigerweise gewählt. Beispielsweise sind menschliche T-Zellen, wie z.B. die CCRF-CEM-Zelle, die HPB-MLT-Zelle, die MOLT-3-Zelle, die MOLT-4-Zelle, die P12/ICH-Zelle und die TALL-1-Zelle, hinsichtlich der Kommerzialisierung von MIF überlegen, da sie eine hohe MIF-Produktionsfähigkeit aufweisen.
Die Proliferationsgeschwindigkeit und die MIF-Produktionsfähigkeit einer solchen menschlichen Zelle können gesteigert werden, indem Gene, welche die MIF-Produktion kodieren, in eine leichter in einer Subkultur züchtbaren, errichteten Zelle eingebracht werden, und zwar beispielsweise mittels einer Zellfusionstechnik, wobei Polyethylenglycol oder Sendai-Virus verwendet wird, oder durch herkömmliche rekombinante Gentechniken unter Verwendung von DNA-Ligase, Restriktionsenzym (Nuklease) und DNA-Polymerase.
Die Proliferationsmethode für eine solche menschliche Zelle wird zweckmäßig gewählt. Beispiele für eine solche Methode umfassen sowohl eine in vitro-Gewebekulturmethode, in welcher eine errichtete, menschliche, hämopoietische Zelle inokuliert und in einem Nährkulturmedium proliferiert wird, als auch ein in vivo-Verfahren, in welchem eine errichtete, menschliche, hämopoietische Zelle zuerst in den Körper eines nicht-menschlichen, warmblütigen Tiers implantiert wird oder in einer Diffusionskammer inokuliert wird, welche außerhalb oder innerhalb des Körpers eines nicht-menschlichen, warmblütigen Tiers vorgesehen wird, worauf sie wachsen gelassen wird, während sie die Nährstoff-Körperflüssigkeit vom Körper des Tiers empfängt.
Zuerst wird die in vitro-Methode erklärt.
Die in vitro-Methode kann mit jedem Nährkulturmedium durchgeführt werden, solange eine errichtete, menschliche, hämopoietische Zelle, wenn sie darin inokuliert ist, proliferativ ist; zum Beispiel das RPMI 1640-Medium und das Eagle'sche Minimalmedium, welche mit Vitaminen, Mineralien, Kohlenwasserstoffen, Aminosäuren und Seren von Säugetieren, falls nötig, ergänzt sein können.
In der Kultur wird eine Monoschichtkultur und eine Suspensionskultur zweckmäßig gewählt.
Die Temperatur wird auf etwa 20-40ºC, vorzugsweise etwa 35-38ºC, festgesetzt, während das Inokulum so gewählt wird, daß ein maximales Zellenwachstum innerhalb etwa 1 Woche nach der Inokulation, zweckmäßigerweise etwa 10&sup4;-10&sup7; hinsichtlich der Zellenzahl/ml Kulturmedium, erreicht wird.
Ein Kulturmedium mit einem solchen Inokulum wird unter diesen Bedingungen für etwa 4-10 Tage inkubiert, während ausreichend Nährstoffe zugeführt und die in das Kulturmedium abgegebenen Metaboliten ausgewaschen oder verdünnt werden, indem es mit einem frischen zu bestimmten Zeitpunkten ersetzt wird.
Im folgenden wird die in vivo-Methode erklärt.
Bei dieser Methode ist eine errichtete, menschliche, hämopoietische Zelle auf einfache Weise proliferativ, während die Nährstoff-Körperflüssigkeit, die vom Körper eines nicht-menschlichen, warmblütigen Tiers geliefert wird, ausgenützt wird, indem die menschliche Zelle zuerst in den Körper des Tiers implantiert wird, und indem alternativ die menschliche Zelle in eine Diffusionskammer gegeben wird, welche Nährstoff-Körperflüssigkeit liefern kann, und indem dann das Tier auf herkömmliche Weise gefüttert wird. Anders als die in vitro-Gewebekulturmethode ergibt die in vivo-Methode eine große Menge MIF, sogar dann, wenn ein teures Serum und Nährkulturmedium außer Acht gelassen oder größtenteils weggelassen werden.
Die Methode, die ein nicht-menschliches, warmblütiges Tier benutzt, erleichtert insbesondere das Aufrechterhalten und die Kontrolle während der Zellenproliferation sowie das Verwirklichen einer in höherem Ausmäß stabilisierten Zellenproliferation und gesteigerten MIF-Produktion pro Zelle, insbesondere 2-10-fach oder viel höher als im Fall eines in vitro-Kultivierens.
Die in vivo-Methode kann bei jedem nicht-menschlichen, warmblütigen Tier vorgenommen werden, solange eine errichtete, menschliche, hämopoietische Zelle darin proliferativ ist; zum Beispiel Vögel, wie Huhn und Taube, und Säugetiere, wie Hund, Katze, Affe, Ziege, Schwein, Kuh, Pferd, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Hamster, Maus und Nacktmaus.
Da die Implantierung einer solchen menschlichen Zelle die Gefahr eines Hervorrufens unerwünschter Immunreaktionen aufweist, ist es zweckmäßig, ein nicht-menschliches, warmblütiges Tier in seinem möglichst jüngsten Stadium zu verwenden, wie z.B. ein Ei, Embryo oder Fötus, und Neugeborene und Tierbabys, um eine solche Immunreaktion so weit wie möglich zu unterdrücken.
Diese Tiere können zum Beispiel mit Röntgen- oder Gammastrahlung, etwa 200-600 rem, oder durch Injektion von Antiserum oder einem immunsuppressiven Mittel, vorbehandelt werden, um die mögliche Immunreaktion vor der Implantierung abzuschwächen.
Da eine Nacktmaus insbesondere eine geringere Immunreaktion aufweist, sogar dann, wenn sie erwachsen ist, kann jegliche errichtete, menschliche hämopoietische Zelle implantiert und ohne eine solche Vorbehandlung leicht vermehrt werden. Dies deshalb, weil die Verwendung einer nackten Maus sehr günstig ist.
Man kann eine stabilisierte Proliferation einer errichteten, menschlichen, hämopoietischen Zelle und/oder eine erhöhte Menge an MIF erhalten, indem die menschliche Zelle in verschiedene nichtmenschliche, warmblütige Tiere sukzessiv implantiert wird; zum Beispiel, indem die menschliche Zelle zuerst in einen Hamster implantiert und vermehrt wird und indem dann die vermehrten menschlichen Zellen in eine Nacktmaus transplantiert werden.
In diesem Fall sind Tiere der gleichen Klasse und des gleichen Stammes verwendbar, sowie jene der gleichen Spezies und der gleichen Art. Errichtete, menschliche, hämopoietische Zellen sind in jede Stelle des Tiers implantierbar, solang sie in der Stelle proliferativ sind, wenn sie implantiert sind; zum Beispiel allantoisch, intravenös, intraperitoneal und subkutan.
Zusätzlich zur direkten Implantation in den Körper eines Tiers ist jede der oben beschriebenen menschlichen Zellen proliferativ, indem sie in den Körper eines Tiers zum Beispiel intraperitoneal, in einer herkömmlichen Diffusionskammer mit einem makroporösen Filter verschiedener Formen und Größen, wie z.B. ein Membranfilter, ein Ultrafilter und eine Hohlfaser, mit einer Porengröße von etwa 10&supmin;&sup7; - 10&supmin;&sup5; m, welche die Penetration von Tierzellen stoppen, aber die Nährstoff-Körperflüssigkeit der menschlichen Zelle zuführen kann.
Falls notwendig, kann eine solche Diffusionskammer zum Beispiel mit einem Tier verbunden oder auf einem Tier angeordnet werden, auf eine Weise, daß sowohl die Nährlösung in der Diffusionskammer als auch die Körperflüssigkeit durch die Diffüsionskammer zirkulieren können. Man kann auf diese Weise ein Proliferieren von menschlichen hämopoietischen Zellen durch eine Kammerwand beobachten, und/oder ist die Diffusionskammer als solche mit einer frischen ersetzbar, um sowohl die Proliferation während der Lebenszeit des Tieres, ohne es zu töten, weiterzuführen, als auch eine viel höhere Zellenproduktion pro Tier zu erreichen.
Da aufgrund des Fehlens eines direkten Kontaktes einer menschlichen Zelle mit einer Tierzelle eine solche Diffusionskammer eine weit weniger wünschenswerte Immunreaktion hervorruft, kann jedes nicht menschliche, warmblütige Tier ohne Vorbehandlung verwendet werden, um eine solche Immunreaktion zu verringern, und die proliferierte menschliche Zelle kann aus der Diffusionskammer auf einfachste Weise gewonnen werden.
Das Füttern des Tiers wird auf herkömmliche Weise ausgeführt, und sogar nach der Implantation ist keine besondere Sorgfalt erforderlich.
Die Zeitspanne, die erforderlich ist, eine vorgeschriebene Proliferation zu erreichen, ist gewöhnlich etwa 1 - 10 Wochen.
Die Anzahl der menschlichen Zellen, die auf diese Weise erhalten werden, ist etwa 10&sup7; - 10¹² Zellen oder mehr pro Tier.
Insbesondere erreicht die Zahl an menschlichen, hämopoietischen Zellen, die mit dem Verfahren unter Verwendung eines nicht menschlichen, warmblütigen Tiers proliferiert werden, bis zu etwa das 10² - 10&sup7;fache oder mehr, was etwa 10 - 10&sup6;fach oder höher ist, als durch Inokulierung und Proliferierung in vitro einer menschlichen hämopoietischen Zelle in einem Nährkulturmedium erhalten wird. Dies ist bei der Herstellung von MIF sehr günstig.
Das Verfahren zur Herstellung von MIF mit der menschlichen hämopoietischen Zelle, die auf diese Weise erhalten wurde, sollte nicht auf ein spezielles beschränkt sein. Die menschliche Zelle wird einem MIF-Induktor im Tier exponiert, in welchem die menschliche Zelle gewachsen ist. Zum Beispiel wird eine menschliche, hämopoietische Zelle, die in Aszites in Suspension proliferiert wurde, oder eine Tumorzelle, die gebildet wurde, zum Beispiel subkutan in vivo direkt einem MIF-Induktor ausgesetzt, um die MIF-Produktion zu induzieren, und der erhaltene MIF wird von Aszites, Serum und/oder Tumor gewonnen und dann gereinigt.
Alternativ wird die proliferierte, menschliche Zelle vom Tier gewonnen und dann in vitro einem MIF-Induktor ausgesetzt. Eine menschliche Zelle beispielsweise, welche aus einer Aszitessuspension gewonnen wurde, oder welche durch Extrahieren und Disaggregieren von Tumormassen erhalten wurde, beispielsweise subkutan gebildet, wird in einem Nährkulturmedium, welches auf etwa 20 - 40ºC gehalten wird, suspendiert, um eine Zelldichte von etwa 10&sup5; - 10&sup8; Zellen/ml zu ergeben, und einem MIF- Induktor ausgesetzt, um die MIF-Produktion zu induzieren. Danach wird der erhaltene MIF gewonnen und gereinigt.
Wenn eine menschliche hämopoietische Zelle in einer Diffusionskammer proliferiert wird, wird die proliferierte menschliche Zelle in einer Diffusionskammer einem MIF-Induktor ausgesetzt, um eine MIF-Produktion zu induzieren, und, alternativ, aus der Diffusionskammer vor der Induktion gewonnen.
Die MIF-Produktion pro Tier kann weiter erhöht werden, indem ein Verfahren angewandt wird, in welchem eine proliferierte menschliche Zelle einem MIF-Induktor im Körper eines Tieres ausgesetzt, von einer oder mehreren bestimmten Stellen des Tiers oder seinem gesamten Körper gewonnen und in vitro einem MIF-Induktor ausgesetzt wird, um die MIF-Produktion zu induzieren; ein anderes Verfahren in welchem eine menschliche Zeile wiederholt einem MIF-Induktor ausgesetzt wird; und/oder ein weiteres Verfahren, in welchem eine Diffusionskammer, welche in den Körper eines Tiers eingebettet oder damit verbunden ist, wird zu bestimmten Zeitabständen mit einer frischen ersetzt.
Was MIF-Induktoren betrifft, so sind Mitogene, wie Phytohämagglutinin, Concanavalin A, Taschenunkrautmitogen, Lipopolysaccharid, Lipid A, Endotoxin, Polysaccharid, Bakterien, Viren, Nucleinsäure und Polynucleiotid zweckmäßig.
Ein solcher MIF-Induktor wird gewöhnlich bei Konzentrationen von etwa 0,001 µg/ml bis 10 mg/ml verwendet. Zwei oder mehrere MIF-Induktoren sind in Kombination frei verwendbar, um MIF zu erhöhen und eine gleichzeitige Produktion eines oder mehrerer anderer Lymphokine zu induzieren.
Der MIF, der auf diese Weise erhalten wird, ktuin durch Reinigung und Abtrennung unter Anwendung eines herkömmlichen Verfahrens, wie zum Beispiel Aussalzen, Diailyse, Filtration, Zentrifugieren, Konzentrieren und Lyophilisieren, auf einfache Weise gewonnen werden. Wenn eine viel weitergehende Reinigung erforderlich ist, werden zum Beispiel Adsorption und Desorption mit Ionenaustausch, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Fraktionierung unter Ausnutzung des isoelektrischen Punktes, Hochleistungsflüssigchromatographie und Elektrophorese in Kombination angewendet. Insbesondere kann man durch die Chromatographie unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers ein MIF der höchsten Reinheit gewinnen.
Das MIF, das auf diese Weise erhalten wurde, kann vorteilhaft in prophylaktischen oder therapeutischen Mitteln für Krankheiten verwendet werden, die auf MIF ansprechen.
Der Ausdruck "Krankheiten, die auf MIF ansprechen" bedeutet solche, welche mit MIF verhindert und/oder behandelt werden konnen, zum Beispiel Viruserkrankungen, wie eine epidemische Konjunktivitis, herpetische Keratitis, Influenza, Masern, Serumhepatitis, und erworbenes Immunmangelsyndrom (AIDS); und nichtvirale Erkrankungen; zum Beispiel maligne Tumore, wie z.B. Colonkarzinom, Lungenkarzinom, Leberkarzinom und Osteosarkom; und Immunopathien, wie z.B. atopische Allergien, Myasthenia gravis, Kollagenose, perniziöse Anämie, Gelenksrheumatismus und systemischer Lupus erythematosus.
Die Form eines solchen Vorbeugungs- und Heilmittels kann gemäß seiner Endverwendung frei gewählt werden, und ist zum Beispiel ein flüssiges Mittel, wie ein Nebel, ein Augenwasser, ein Collutorium und eine Injektion, ein pastenförmiges Arzneimittel, wie eine Salbe und Kataplasma, und feste Mittel, wie Pulver, Granulat, Kapsel oder Tablette.
In das Vorbeugungs- und Heilmittel werden in der Regel von etwa 1-10.000.000 Einheiten MIF/g eingebracht. Falls notwendig, kann es mit einem oder mehreren Lymphokinen und/oder natürlichen oder synthetischen Chemotherapeutika, zum Beispiel α-Interferon, β-Interferon, γ-Interferon, Tumornekrosefaktor, Lymphotoxin, Interleukin 1, Interleukin 2 und B-Zellen-differenzierender Faktor, eingebracht werden, so daß die Wirksamkeit des Mittels in vorteilhafter Weise verstärkt wird.
Natürlich können ein oder mehrere Hilfsstoffe, Verstärker und Stabilisatoren in Kombination verwendet werden.
Das Vorbeugungs- und Heilmittel, das auf diese Weise erhalten wird, ist zum Beispiel in Antivirusmitteln, in Antitumormitteln, in Hilfsmitteln für Antitumor-Chemotherapeutika, in Vorbeugungsmitteln für das Wiederauftreten maligner Tumore, Immunregulatoren, und Heilmitteln für Immunopathien, sowie in Unterdrückungsmittel für die Metastase von Krebs vorteilhaft brauchbar.
Die Aktivität von MIF wurde gemäß der Methode bestimmt, die im Joumal of Cancer Research Clinical Oncology, Band 113, S. 544-549 (1987) von Y. Naomoto et al. berichtet werden, mit einer geringfügigen Modifikation, bei welcher eine Lungenmetastase mit der RPMI 4788-Zelle (FERM BP-2429), einer errichteten, menschlichen Kolonkrebszelle, in Nacktmäusen induziert wird, welchen dann eine flüssige Probe, welche MIF enthält, verabreicht wird, um ihre Metastaseninhibitoraktivität zu bestimmen.
Insbesondere werden BALB/c-Nacktmäuse über die Schwanzvene mit 2 x 10&sup6; RPMI 4788- Zellen in 0,2 ml Salzlösung inokuliert. Ab dem nächsten Tag werden in die Nacktmäuse über die Schwanzvene 0,1 ml Aliquot einer flüssigen, MIF-enthaltenden Probe täglich für 10 Tage iniziert. Am 21. Tag werden die Nacktmäuse getötet und die Knoten auf ihrer Lungenoberfläche werden gefärbt und die Metastasen von RPMI 4788-Zellen gezählt. Als Kontrolle wird Salzlösung verwendet, und 8 Nacktmäuse werden für jene flüssige Probe verwendet. Eintausend Einheiten MIF werden als die Menge MIF definiert, welche die Zahl an Knoten halbiert, vorausgesetzt, daß die Kontrolle 100 oder mehr Knoten unter diesen Bedingungen bildet. α-Interferon, β-Interferon, γ-Interferon, α-Tumornekrosefaktor, β-Tumornekrosefaktor, Interleukin 1 und Interleukin 2 werden von der flüssigen Probe vor ihrer Verwendung entfernt, falls sie etwas von diesen enthält.
Die Hämagluttinierungstiter wurden gemäß der Methode getestet, die von S.E. Salk, The Journal of Immunology, Band 49, S. 87-98 (1944) berichtet wird, und zwar mit einer geringfügigen Modifikation.
Die folgenden Experimente werden die vorliegende Erfindung im Detail erklären.

Experiment

Vergleich von errichteten, menschlichen, hämopoietischen Zellen auf ihre MIF-Produktionsßfähigkeft

Experiment 1

MIF-Produktion von der in vitro proliferierten Zelle

Verschiedenste errichtete, menschliche Zellen wurden im Medium RPMI 1640 (pH 7,2), welches mit 20 Vol./Vol.-% fötalem Kalbserum ergänzt war, bei 37ºC auf herkömmliche Weise kultiviert, mit serumfreiem Medium RPMI 1640 (pH 7,2) gewaschen und in einer frischen Präparation des gleichen Kulturmediums auf eine Zelldichte von etwa 5 x 10&sup6;/ml suspendiert.
Der erhaltenen Zellsuspension wurden 10 µg/ml BCG zugegeben, sie wurde 1 Tag bei 37ºC inkubiert, ferner mit 1 µg/ml Lipopolysaccharid versetzt, bei 37ºC 1 zusätzlichen Tag inkubiert, um die MIF-Produktion zu induzieren, und zentrifugiert. Der Überstand wurde 50fach mit einer Membran, welche ein unteres Molekulargewichtslimit von 6.000 aufwies, konzentriert und dann auf MIF-Aktivität pro ml untersucht.
Die Resultate waren so, wie in der Tabelle I gezeigt ist.
Wie von den Ergebnissen in der Tabelle I klar ersichtlich ist, besitzen errichtete, menschliche hämopoietische Zellen eine MIF-Produktionsfähigkeit. Wir fanden, daß insbesondere T-Zellen in der MIF-Produktionsfähigkeit höher waren. Die HPB-MLT-Zelle (FERM BP-2430), welche eine bemerkenswert hohe MIF-Produktionsfähigkeit besitzen, werden in der Erfindung bevorzugt verwendet. Tabelle I T-Zelle B-Zelle weniger als 20 non-T non-B-Zelle Myelomonozytische Zelle
Anmerkung: Die Werte repräsentieren MIF-Aktivitäten (Einheiten).

Experiment 2

MIF-Produktion von Zellen, welche in vivo proliferiert wurden

Neugeborenen Hamstern wurde ein Antiserum injiziert, welches mit einem herkömmlichen Verfahren von Kaninchen hergestellt wurde, um ihre Immunreaktion zu schwächen, subkutan wurden ihnen verschiedenste, errichtete, menschliche, hämopoietische Zellen implantiert, und sie wurden 3 Wochen auf herkömmliche Weise gefüttert. Die Tumormassen, die sich in den Hamstern subkutan bildeten, wurden extrahiert, zerkleinert, disaggregiert, indem sie in eine Trypsin-enthaltende Salzlösung suspendiert wurden, und gewonnen.
Danach wurde jede Zelle, ähnlich wie in Experiment 1, in eine Suspension gebracht und dann ihre MIF-Aktivität bestimmt. Die Ergebnisse waren so, wie sie in der Tabelle II gezeigt sind. Tabelle II T-Zelle B-Zelle non-T non-B-Zelle Myelomonozytische Zelle
Anmerkung: Die Werte repräsentieren MIF-Aktivitäten (Einheiten).

Experiment 3

Teilweise Reinigung von MIF

HPB-MLT-Zellen, proliferiert mit dem Verfahren in Experiment 2, wurden MIF produzieren gelassen und zentrifügiert, nach dem Verfahren in Experiment 1 mit einer geringfügigen Abwandlung. Dann wurde der Überstand 50fach mit einer Membran, deren untere Molekulargewichtsgrenze 6.000 war, konzentriert, und auf "PBE-94", ein Gelprodukt von Pharmacia LKB Biotechnology, Upsala, Schweden, chromatofokussiert. Die MIF-reichen Fraktionen (pH 5-7) wurden gewonnen und einer Genfiltrationschromatographie unterworfen, wobei "Sephacryl S-200", ein Gelprodukt von Pharmacia LKB Biotechnology, Upsala, Schweden, verwendet wurde, und die neu gebildeten, MIF-reichen Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 10.000-450.000 wurden gewonnen und konzentriert, um eine teilweise gereinigte flüssige Probe zu erhalten, welche etwa 2.800.000 Einheiten MIF/ml enthielt, was einer Aktivitätsgewinnungsausbeute von etwa 60% entspricht.
Das Produkt unterdrückt zusätzlich zur Lungenmetastase der RPMI 4788-Zelle, eine menschliche Colonkrebszelle, die Lebermetastase der Lovo-Zelle (ATCC CCL 229), eine menschliche Colonkrebszelle.
Das Produkt ist bei der Behandlung von Krebspatienten allein oder in Kombination mit einem anderen Lymphokin, Chemotherapeutikum, mit chriurgischer Operation und/oder Bestrahlung vorteilhaft verwendbar.
Einige Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden beschrieben.

Beispiel 1

Eine Ramos-Zelle (ATCC CRL 1596) wurde im Medium von RPMI 1640 (pH 7,2), ergänzt mit 10 Vol./Vol.-% fötalem Kalbserum, inokuliert, bis eine Zelldichte von 5 x 10&sup5; Zellen/ml erhalten wurde.
Danach wurde die Zelle bei 37ºC unter Erneuern des Kulturmediums in bestimmten Intervallen kultiviert, mit einer frischen Präparation des gleichen Kulturmediums gewaschen und im gleichen Kulturmedium suspendiert, um eine Zelldichte von 2 x 10&sup6; Zellen/ml zu erhalten. Der Suspension wurde BCG und Lipopolysaccharid in jeweiligen Mengen von etwa 10µg/ml zugegeben und 2 Tage bei 37ºC inkubiert, um die MIF-Produktion zu induzieren. Ein Zentrifugieren der erhaltenen Kultur ergab einen Überstand, welcher etwa 60 Einheiten MIF/ml enthielt.

Beispiel 2

Neugeborenen Hamstern wurde ein Antiserum injiziert, welches mit einem herkömmlichen Verfahren von Kaninchen hergestellt wurde, um ihre Immunreaktion zu schwächen, subkutan HPB-MLT-Zellen (FERM BP-2430) implantiert, und sie wurden 5 Wochen auf herkömmliche Weise gefüttert. Die Tumormassen, die sich in den Hamstern subkutan bildeten, jeweils etwa 20 g, wurden extrahiert, disaggregiert, indem sie in eine Collagenase-enthaltende Salzlösung suspendiert wurden, und gewonnen.
Die erhaltene Zelle wurde mit Eagle'schem Minimalmedium gewaschen und in einer frischen Präparation des gleichen Mediums verdünnt, bei 37ºC gehalten, bis eine Zelldichte von etwa 2 x 10&sup6; Zellen/ml erhalten wurde, mit 200 µg Phytohämaglutinin/ml und 5 mg Lipid A/ml versetzt, und 2 Tage bei 37ºC inkubiert, um die MIF-Produktion zu induzieren. Die Zentrifugierung der erhaltenen Kultur ergab einen Überstand, welcher etwa 9.400 Einheiten MIF/ml enthielt. Auf diese Weise wurden etwa 16.500.000 Einheiten MIF pro Hamster erhalten.

Beispiel 3

Neugeborenen Ratten wurde intravenös die Zelle MOLT-3 (ATCC CRL 1552) implantiert, und die Ratten wurden 4 Wochen lang auf herkömmliche Weise gefüttert.
Die Tumormassen, die sich subkutan in den Ratten gebildet hatten, jeweils etwa 20 g, wurden extrahiert und auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2 disaggregiert, um eine Zellsuspension zu erhalten, welche dann mit etwa 100 Hämagglutinationstiter Sendai-Virus/ml und etwa 5 µg Lipopolysaccharid/ml versetzt und 2 Tage lang bei 37ºC inkubiert wurde, um die MIF-Produktion zu induzieren.
Die erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, ultrazentrifugiert und zur Entfernung des Virus durch eine Membbrane filtriert, um etwa 4.200 Einheiten MIF pro ml Filtrat zu erhalten. Auf diese Weise wurden etwa 6.900.000 Einheiten MIF pro Ratte erhalten.

Beispiel 4

Die Zelle TALL-1 (JCRB 0086) wurde mit Salzlösung in zylindrischen Plastikdiffusionskammern mit etwa 10 ml, welche ein Membranfilter mit der Porengröße von etwa 0,5 µ aufwiesen, suspendiert und dann in erwachsene Ratten intraperitoneal eingebettet.
Dann wurden die Ratten auf herkömmliche Weise 4 Wochen lang gefüttert, und die Diffusionskammern wurden entfernt.
Die Zellen wurden von den Diffusionskammern gewonnen und auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, um die MIF-Produktion zu induzieren. Die Zentrifugierung der erhaltenen Kultur ergab einen Überstand, welcher etwa 1.600 Einheiten MIF/ml enthielt. Auf diese Weise wurden etwa 1.800.000 Einheiten MIF pro Ratte erhalten.

Beispiel 5

Die Zelle U-937 (ATCC CRL 1593) wurde in embryonierten Eier, welche 5 Tage lang auf 37ºC gehalten worden waren, implantiert und 1 Woche bei 37ºC inkubiert. Dann wurden die Eier aufgebrochen, und die proliferierten Zellen wurden gewonnen. Danach wurden die Zellen auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2 behandelt, um die MIF-Produktion zu induzieren. Die Zentrifugierung der erhaltenen Kultur ergab einen Überstand, welcher etwa 120 Einheiten MIF/ml enthielt. Auf diese Weise wurden etwa 9.000 Einheiten MIF pro 10 embryonierte Eier erhalten.
Wie oben beschrieben, soll die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von MIF unter Verwendung menschlicher, hämopoietischer Zellen zur Verfügung stellen.
Neben einem Unterdrücken der Metastase von Krebs, um die Schmerzen von Patienten zu lindern und ihr Leben zu verlängern, ist MIF bei der Vorbeugung und Heilung von Krankheiten, die auf MIF ansprechen nützlich, zum Beispiel bei Viruskrankheiten, malignen Tumoren und Immunopathien. MIF ist daher in der pharmazeutischen Industrie sehr signifikant.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Metastaseninhibitorfaktor, wobei:

eine errichtete, menschliche, hämopoietische Zelle den Faktor produzieren gelassen wird; und

der erhaltene Faktor gewonnen wird, wobei der Metastaseninhibitorfaktor eine Metastaseninhibitoraktivität aufweist, wenn diese mit einer errichteten, menschlichen Colonkrebszelle RPMI 4788 (FERM BP-2429) gemessen wird, jedoch keine Interferonaktivität, Tumornekrosefaktor-aktivität, Interleukin 1-Aktivität und Interleukin 2-Aktivität aufweist, und bei Gelfiltration ein Molekulargewicht von 10.000-450.000 aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die menschliche, hämopoietische Zelle erhältlich ist durch:

Implantieren einer errichteten menschlichen, hämopoietischen Zelle in den Körper eines nichtmenschlichen, warmblütigen Tiers, und

Füttern des Tieres, während die menschliche, hämopoietische Zelle die Nährstoff-Körperflüssigkeit vom Körper des Tiers für ihre Proliferation empfangen gelassen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das nicht-menschliche, warmblütige Tier ein Vogel oder ein Säugetier ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die menschliche, hämopoietische Zelle erhältlich ist durch:

Inokulieren einer errichteten. menschlichen, hämopoietischen Zelle in eine Diffusionskammer, die innerhalb oder außerhalb des Körpers eines nicht-menschlichen, warmblütigen Tieres vorgesehen ist; und Füttern des Tieres, während die menschliche, hämopoietische Zelle die Nährstoff-Körperflüssigkeit vom Körper des Tiers für ihre Proliferation empfangen gelassen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das nicht-menschliche, warmblütige Tier ein Vogel oder ein Säugetier ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die menschliche, hämopoietische Zelle eine T-Zelle ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die errichtete, menschliche, hämopoietische Zelle aus einer RAMOS-Zelle (ATCC CRL 1596), HPB-MLT-Zelle (FERM BP-2430), MOLT-3-Zelle (ATCC CRL 1552), TALL-1-Zelle (JCRB 0086) und U-937-Zelle (ATCC CPL 1593) gewählt ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches ferner ein Exponieren der errichteten, menschliche, hämopoietischen Zelle an ein Mitogen umfäßt.

9. Metastaseninhibitorfaktor, erhältlich mit einem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.