SE460906B - Cellkulturmikrobaerare - Google Patents

Description

I 4âxgcrigagséeroende" och inbegriper 3T3-musfibroblaster, musbe-nmärgs- epitelceller; Muridae-1eukemivirusalstrande arter av musfibroblas- ter, primära och_sekundära kycklingfibroblaster; WI-38 humana fibroblastceller; och normala humana embryolungfibroblastceller (HEL299, ATCC nr CCL137). Vissa förankringsberoende celler har od- lats vilka förorsakar tumörer,men andra har odlats och befunnits vara icke-tumöralstrande. även vissa förankringsberoende celler, såsom WI-38 och HEL-299, kan odlas vilka är genetiskt normala.

Ehuru avsevärda framsteg har gjorts i fråga om däggdjurscell- odling i stor skala med användning av cellinjer som är kapabla att- växa i suspensionskultur, har framstegen varit mycket begränsade i fråga om 'odling av förankringsberoende däggdjursceller i stor skala.

Tidigare arbetstekniker som använts för odling av förankringsbe- roende celler i stor skala var baserade på linjär expansion av processer i liten skala. Cellkulturanläggningar utnyttjade ett stort antal satsreaktorer med lågt utbyte,i form av skålar, medi- cinflaskor, roterande odlingsrör och odlingsflaskor. Var och en av dessa var en fristående enhet eller isolerad satsreaktor som er- fordrade individuella omgivningskontroller. Dessa kontroller var emellertid av en synnerligen primitiv typ beroende på ekonomiska skäl. Förändring av näringsämnen korrigerades genom en ändring avme- diet, en operation som erfordrar två steg, dvs avlägsning av medium och tillsättning av medium. Eftersom det inte var ovanligt att en anläggning av måttlig storlek samtidigt opererade 100-tals av dessa satsreaktorer erfordrade t o m en enda ändring av mediet 100-tals operationer, varvid alla dessa måste utföras noggrant, och under fordrande sterila betingelser. Varje flBrSfiê9S°P@fati0n, SåS0m cellöverföring enar sköraning sammansatta problemet 1 enlighet därmed. Sålunda var kostnaden för utrustning, utrymme och människo- kraft stor för denna typ av anläggning.

Det finns alternativa metoder som har föreslagits för linjär uppförstoring från små satskulturer. Bland sådana alternativ som har rapporterats i litteraturen finns plastpåsar, staplade skålar, spiralfilmer, odling på glaspärlor, artificiella kapillärer och mikrobärare. Bland dessa erbjuder mikrobärarsystem vissa framstå- ende och unika fördelar. Exempelvis kan stora förbättringar av det uppnåeliga förhållandet mellan odlingsyta och kärlvolym (S/V) er- hållas med användning av mikrobärare,jämfört med både traditionella och nyligen utvecklade alternativa tekniker. Ökningen av det upp- nåeliga förhållandet S/V medger konstruering av en singelenhets 460 906 *homogen eller kvasihomogen sats- eller semisats-propagator för _ hög volumetrisk produktivitet. Sålunda utgör en enda omrörd behål- ilare med enkel returmatníngskontroll för pH och p02 en homogen omgivning för ett stort antal celler, varigenom nödvändigheten av dyra och utrymmeskrävande inkubatorer med kontrollerad omgivning elimineras. Även totala antalet erforderliga operationer per enhet av producerade celler minskas drastiskt. Sammanfattningsvis verkar mikrobärare erbjuda god ekonomi i fråga om kapital, utrymme och människokraft vid framställning av förankringsberoende celler, 1 förhållande till gängse produktionsmetoder.

Mikrobärare erbjuder också fördelen av kontinuerlig omgivning eftersom cellerna odlas i en kontrollerad omgivning. Sålunda er- bjuder mikrobärare möjligheten att odla förankringsberoende dägg- djursceller under en serie av omgivningsbetingelser som kan regleras för att åstadkomma konstant, optimal celltillväxt. Ett av de för närva- rande mest lovande mikrobärarsystemen har rapporterats av van Wezel och innebär användning av dietylaminoetyl (DEAE)-substituerade dextranpärlor i en omrörd tank. A. L. van wezel, 'Growth of Cell Strains and Primary Cells on Microcarriers in Homogeneous Culture“, Nature 216:64 (l967); D. van Hemert, D. G. Kilburn och A. L. van Wezel, "Homogeneous Cultivation of Animal Cells for the Production of Virus and Virus 2roducts', Biotechnol. Bioeng. ll:87S (l969); och A. L. van Wezel, ”Microcarrier Cultures of Animal Cells", Tissue Culture, Methods and Applications, P. F. Kruse och M. K.

Patterson, eds., Academic Press, New York, sid 372 (1973). Dessa pärlor framställs kommersiellt av Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, New Jersey, under handelsnamnet DEAE-Sephadex A50, ett jonbytarsystem. Kemiskt bildas dessa pärlor av en tvärbunden dextranmatris som har dietylaminoetylgrupper kovalent bundna till dextrankedjorna. De kommersiellt tillgängliga DEAE-Sephadex A50- pärlorna tros ha en partikelstorlek av 40-200 u och positiv ladd- ningskapacitet av cirka 5,4 mekv/g av torr, tvärbunden dextran (varvid anslutna DEAE-enheters vikt förbisetts). Andra anjonbytar- hartser, såsom DEAE-Sephadex A25, QAE-Sephadex A50 och QAE-Sephadex A25,angavs av van Wezel även understödja celltillväxt.

Det av van Wezel föreslagna systemet kombinerar multipla ytor med rörliga ytor och utgör en möjlighet till nyskapande cellulära manipulationer samt erbjuderfördelar vid uppskalning och omgivf ningskontroller. Trots denna möjlighet har dessa föreslagna tek- niker inte betydelsefullt exploaterats, ty forskare har stött 460 906 på svårigheter vid cellproduktion beroende på vissa skadliga effek- ter som förorsakats av pärlorna. Bland dessa är inledande celldöd bland en hög procentsats av cellinokulumet och inadekvat celltillväxt även för de celler som fastnar- Anledningen till dessa skadliga effekter förstås icke helt och hållet, ehuru det har föreslagits att de kan bero på pärlornas toxicitet eller näringsämnesadsorp- tion. Se van Wezel, A. L. (1967), Nature 216: 64-65; van Wezel, A. L. (1973), Tissue Culture Methods and Applications. Kruse, P. R. och Patterson, M. R. (eds.), sid 372-377, Academic Press, New York; van Hemert, P., Kilburn, D. G., och van Wezel, A. L. (1969), _ Biotechnol. Bioeng. ll: 875-885; Horng, C. och McLimans, W. (1975), Biotechnol. Bioeng. 17: 713-732.

Det kan hända att dessa kommersiellt tillgängliga jonbytar- hartsers skadliga effekter beror på deras framställningssätt. Vissa rial i patent såsom: US-patenten 3 277 025; 3 275 576; 3 042 667 och 3 208 994; alla av Flodin et al. Vad som än är anledningen är emellertid de för närvarande kommersiellt tillgängliga materialen helt enkelt inte tillräckliga för god cellodling av en mångfald olika celltyper.

En lösning att övervinna vissa av de skadliga effekterna vid försök att använda sådana kommersiellt tillgängliga mikrobärare för celltillväxt har beskrivits i US patentet 4 036 693 av Levine et al. I nämnda patent har föreslagits en metod för behandling av dessa kommersiellt tillgängliga jonbytarhartser med makromolekylära polyanjoner, såsom karboximetylcellulosa. Ehuru denna metod har visat sig vara framgångsrik skulle det naturligtvis vara fördel- aktigare om pärlorna kunde tillverkas så att de initialt har egen- skaper som avsetts för framstående odling av förankringsberoende celler. ' Man har nu funnit att mirkobärarnas laddningskapacitet måste justeras och/eller kontrolleras inom ett visst omrâde för att resultera i god tillväxt av en mångfald olika förankringsberoende celltyper vid rimliga mikrobärarkoncentrationer. Baserat på denna upptäckt har mikrobärarpärlor framställts med kontrollerade ladd- ningskapaciteter,och sådana pärlor har använts till att erhålla god tillväxt av en mångfald förankringsberoende celler. Celler som odlats med användning av sådana mikrobärarsystem kan skördas eller användas vid framställning av djur- eller växtvirus, vacciner, hor- moner, interferon eller andra cellodlingsbiprodukter.- ' Ett exempel pâ de förbättrade mikrobärarna är dåâß ställts med användning av polymerer med utskjutande hydroxylgrup- ' per, såsom tvärbundna dextranpärlor. Dessa pärlor kan behandlas med en vattenlösning av en tertiär eller kvarternär amin, såsom dietylaminoetylklorid:klorid, och ett alkaliskt material, såsom natriumhydroxid. Pärlornas specifika laddningskapacitet kontrol- leras genom att variera den absoluta mängden av dextran, tertiär aminsalt och alkaliskt material, dessa materials förhållanden och/eller behandlingens tid och temperatur.

Mikrobärare som framställts enligt föreliggande uppfinning kan användas i odlingar utan den höga initiala cellförlusten som hitintills erfarits med komersiellt tillgängliga mikrobärare.

Därtill sprider sig och växer de fästade cellerna till sammanflöde på pärlorna varvid extremt höga cellkoncentrationer nås i suspen- sionsmediet. Koncentrationen av mikrobärare i suspension är inte begränsad till mycket låga nivåer,såsom var brukligt med de tidi- gare kända materialen, och celltillväxt uppträder,varvid den endast begränsas av faktorer som inte verkar att vara förknippade med mirkobärarna. Härav följer att stora ökningar av den voluetriska produktiviteten av cellkulterar kan erhållas. I korthet kan sägas att den potentiella möjligheten,som erbjuds med användning av mik- robärare vid odling av celler, och speciellt förankringsberoende celler, nu kan realiseras.

Fig l är en grafisk framställning som visar normala, diploida, humana embryolungfibroblastcellers (HEL299) tillväxtkaraktäristikor vid en mikrobärarkoncentration av 2 g torr, tvärbunden dextran/liter för både kommersiellt tillgängliga DEAE-behandlade dextranmikro- bärare och DEAE-behandlade mikrobärare som framställts enligt före- liggande uppfinning; fig 2 visar grafiskt både normala, diploida, humana embryolungfibroblastcellers (HEL299) och sekundära kyckling- embryofibroblasters tillväxtkaraktäristikor vid en mirkobärarkon- centration av S g torr, tvärbunden dextran/liter med användning av, förbättrade DEAE-behandlade mikrobärare enligt föreliggande upp- finning.

Såsom uttrycken "mikrobärare", 'cellkulturmikrobärareP och "cellodlingsmikrobärare“ används här avses små, fristående partik- lar lämpliga för cellförankring och -odling. Ofta, ehuru inte all- tid, är mikrobärare porösa pärlor som bildats av polymerer. Vanli- gen fastnar och växer celler på sådana pärlors yttre ytor.

Såsom tidigare beskrivits har man funnit att mängden av ladd- 4ç>lpn 906 gskapacitet på cellkulturmikrobärare måste justeras och/eller kontrolleras så att den är inom ett visst område för adekvat cell- É tillväxt vid rimliga mikrobärarkoncentrationer. Lämpliga arbets- É områden och föredragna områden varierar med sådana faktorer som § de specifika celler som skall odlas, mikrobärarnas natur, mikrobä- E rarnas koncentration och andra kulturparametrar inbegripet mediets sammansättning. I samtliga fall är emellertid mängden av laddnings- kapacitet,som befunnits vara lämpligfsignifikant under de mängder som tros vara närvarande på kommersiellt tillgängliga anjonbytar- hartser,som tidigare föreslagits för mikrobärarcellkulturer. Exem- pelvis tror man att DEAE-Sephadex A50 pärlorna, som föreslagits av van Wetzel, har en laddningskapacitet av cirka 5,4 mekv/g av torr, obehandlad (utan DEAE), tvärbunden dextran. I motsats till denna relativt höga laddningskapacitet har mikrobärare framställts och befunnits lämpliga för god cellodling enligt föreliggande upp- finning, vilka har mellan cirka 0,1 och cirka 4,5 mekv/g av torra, obehandlade mikrobärare. Under cirka 0,1 mekv/g tror man att cel- ler skulle ha svårt att fastna på mikrobärarna. över cirka 4,5 mekv/g sker förluster beroende på initialcellinokulum,och ej heller de - *"< överlevande cellerna växer bra, särskilt vid relativt höga mikro- bärarkoncentrationer. M För odling av normala, diploida humanfibroblaster på tvärbund- na dextranmikrobärare har man funnit att ett föredraget omrâde för den av DEAE-grupper försedda laddningskapaciteten är från cirka 1,0 till 2,8 mekv/g av torr, obehandlad, tvärbunden dextran. Ehuru det föredragna området kan variera med olika celltyper eller kul- turbetingelser tror man att de föredragna områdena för varje given serie av betingelser komer att vara inom området 0,1 - 4,5 mekv/g.

De föredragna och optimala betingelserna kan bestämas av en fack- man på omrâdet för varje~serieaw'betingelser genom rutinexperimen- tering.

Man bör naturligtvis inse att det finns vissa brister vid försök att definiera mikrobärarnas laddningskapacitet enbart 'på en enhetsviktbas. Exempelvis skulle två pärlor som är identiska på varje annat sätt än att de är bildade från olika material med olika densiteter och med samma laddning fördelad därpå leda till olika värden för deras laddningskapacitet per enhetsvikt. På sama sätt kan två pärlor med identiska laddningskapaciteter per enhets- vikt ha helt olika laddningsfördelning därpå.

En alternativ definition kan göras genom att specificera om- 7 . _ _ 4sg eos rådet av lämpliga laddningar utryckt som laddningskapaci et per enhetsvikt av mikrobärare i deras slutliga funktionella form. Denna basis skulle ta i beaktande sådana faktorer som vikten av anslutna DEAE eller andra positivt laddade grupper, samt hydratisering av pärlorna, etc, då däremot den tidigare definitionen är baserad på torr, tvärbunden dextran och inte beaktar sådana faktorer. I ett vattenhaltigt cellkulturmedium bör tätheten av mikrobärare väljas till 1,0 g/ml så att mikrobärarna lätt kan dispergeras i hela kul- turen. Baserat på detta har det bestämts att området av lämliga laddningskapaciteter för mikrobärare enligt uppfinningen definie-I rat på detta sätt är från cirka 0,012 till cirka 0,25 mekv/g._ Områdena för tidigare specificerade lämpliga laddningskapaci- teter på en viktbasis gäller förutsatt att mikrobärarna har en väsentligen likformig laddningsfördelning överallt i sin huvudmassa.

Om laddningsfördelningen är ojämn är det möjligt att ha lämpliga mikrobärare med laddningskapaciteter utanför nämnda områden. Det viktiga kriteriet är naturligtvis att laddningskapaciteten juste- ras till och/eller kontrolleras vid ett värde som är tillräckligt för att medge god celltillväxt på mikrobärarna. A Eftersom det kan vara laddningsmönstret på yttre ytan som är viktig är det även önskvärt att man kan: definiera det lämpliga laddningskapacitetomrâdet i form av troligt ytmönster. Detta kan göras genom att man antar att mikrobärarnas aktiva del utgörs en- dast av pärlans yttre yta till ett djup av cirka 20 Å. Om man även antar att de laddade grupperna i de tidigare nämnda fallen är jämt fördelade överallt i pärlorna kan de tidigare områdena omvandlas till en laddningskapacitet i detta yttre skal. När problement nal- kas på detta sätt har det lämpliga området för laddningskapaciteten befunnits vara från cirka 0,012 mekv/cm3 till cirka 0,25 mekv/cm3.

Detta sätt tar i beaktande förändringarna av mikrobärarvolymen be- roende på olika laddningstätheter.

Mikrobärare med den erfordrade laddningskapaciteten kan fram- ställas genom behandling av mikrobärare,som bildats från polymerer innehållande utskjutande hydroxylgrupper,med en vattenlösning av ett alkaliskt material och en tertiär eller kvarternär amin. Pär- lorna kan inledningsvis få svälla i ett vattenmedium utan de övriga beståndsdelarna, eller de kan helt enkelt bringas i beröring med ' ett vattenmedium innehållande den erfordrade basen och aminen..“.

Denna metod att använda alkaliskt material för att katalysera för- ankringen av positivt laddade aminogrupper på-hydroxylinnehållande 46 po ymereé har beskrivits i Hartmann, US-patentet nr l 777 970.

Exempel på lämpliga hydroxylinnehâllande polymerer inbegriper polysackarider såsom dextran, dextrin, stärkelse, cellulosa, poly- glukos och substituerade derivat därav. Vissa syntetiska polymerer såsom polyvinylalkohol och hydroxisubstituerade akrylater eller metakrylater, såsom hydroxietylmetakrylat, är även lämpliga. Dextran, ochspeciellttvärbunden dextran i form av små kulor eller pärlor föredrages, särskilt för att den är kommersiellt tillgänglig, rela- tivt billig och åstadkommer mikróbärare som stödjer utmärkt cell- tillväxt. ' Varje material som är alkaliskt kan användas för reaktionen.

Alkalimetallhydroxiderna, såsom natrium- eller kaliumhydroxid, är emellertid de föredragna alkaliska substanserna.

Antingen tertiära eller kvarternära aminer är lämpliga källor för positivt laddade grupper som kan kopplas till de hydroxylinne- hållande polymererna. Särskilt föredragna material är klor- eller bromsubstituerade tertiära aminer eller salter därav, såsom dietylaminoetylklorid, dietylaminoetylbromid, dimetylaminoetyl- klorid, dimetylaminoetylbromid, dietylaminometylklorid, dietyl- aminometylbromid, di-{hydroxietyl)-amincetylklorid, di-(hydroxi- etyl)-aminoetylbromid, di-(hydroxietyl)-aminometylklorid, di- -(hydroxietyl)-aminometylbromid, B-morfolinoetyletylklorid, B-morfolinoetylbromid, 5-morfolinometylklorid, B-morfolinometyl- bromid och salter därav, exempelvis hydrokloriderna.

Ett brett område av reaktionstemperaturer och tider kan an- vändas. Det föredrages att utföra reaktionerna vid temperaturer av cirka mellan l8°C och 6S°C. Andra temperaturer kan emellertid an- vändas. Reaktionskinetiken beror naturligtvis till stor del på reaktionstemperaturen och reaktanternas koncentrationer. Både tiden och temperaturen påverkar den erhållna slutliga utbyteskapaciteten.

Anledningen till att mikrobärarnas laddningskapacitet är så kritisk vid cellodling förstås inte helt och hållet. Ehuru man inte skam vara bunden :in denna teori är det möjng: att iaaaningskapa- citeten på ytan förorsakar vissa lokala oregelbundenheter av mediets sammansättning,viIka är de viktigaste faktorerna vid kontrollering av mikrobärarkulturcellodling. Det oaktat_avses inte detta utesluta andra möjligheter. ' Det kan naturligtvis finnas vissa pärlor som inte kommer att vara lämpliga för god cellodling trots att de har en laddningskapa- citet inom en av de specificerade områdena. Detta kan bero på sido- 9 kedjor på den enhet somförserladdningskapaciteten,vï4fÄ0är9¿l§iska eller på annat sätt skadliga för celltillväxt, närvaron av adsor- berande eller absorberande skadliga kompositioner eller föreningar eller detta kan bero på pärlans porositet eller andra orsaker. Om sådana pärlor inte är lämpliga för cellodling med undantag för mängden av laddningskapacitet anses pärlorna inte vara 'cellodlings- mikrobärare'.

Uppfinningen illustreras ytterligare med följande exempel.

EXEMPEL l FRAMSTÄLLNING AV FÖRBÄTTRADE MIKROBÄRARE Förbättrade mikrobärare kan framställas på följande sätt.

Torra, oladdade, tvärbundna dextranpärlor siktades för att erhålla de med en diameter av cirka 75 Pm. Ett gram av denna fraktion sattes till 10 ml destillerat vatten och pärlorna fick svälla. En adekvat kommersiell källa av torr, tvärbunden dextran är Sephadex-G-50 från Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey.

En vattenlösning innehållande 0,01 mol dietylaminoetylkloridz- klorid, två gånger omkristalliserad ur metylenklorid, och 0,015 mol natriumhydroxid bildades i en 10 ml volym. Denna vattenlösning sat- tes sedan till suspensionen av svällda dextranpärlor, varefter den omrördes kraftigt i ett skakande vattenbad i l h vid 60°C. Efter l h separerades pärlorna från reaktionsblandningen genom filtrering på Whatman filtrerpapper nr 595 och tvättades med 500 ml destil- lerat vatten. ' Pärlor som framställts på detta sätt har cirka 2,0 mekv ladd- ningskapacitet per gram av torr, obehandlad tvärbunden dextran.

Denna laddningskapacitet kan karaktäriseras genom mätning av pär- lornas anjonbytarkapacitet enligt följande. Pärlpreparaten tvättas noggrant med 0,1 normal H01 för att mätta alla utbytesställen med Cl'-joner. Därpå sköljs de med 10-4 normal H01 för att avlägsna obundna kloridjoner. Sedan tvättas pärlorna med en l0 % (vikt/viktï natriumsulfatlösning för att mätta utbytesställena med S04=. Natrium- sulfattvättningens effluent uppsamlas och innehåller frigjorda kloridjoner, Denna lösning titreras med l M silvernitrat med an- vändning av utspätt kalinmkromat såsom.indikator.

Efter titreringen tvättas pärlorna noggrant med destillerat vatten, sköljs med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), suspenderas i PBS och autoklaveras. Detta förfarande ger hydratiserade pärlor med en diameter av cirka 120-200 Fm, vilka har en laddningskapaci- tet av cirka 2,0 mekv/g av torr, obehandlad tvärbunden dextran. 4 ßßnægß É ODLING AV FÖRANKRINGSBEROENDE CELLER MED MIKROBÄRARE ENLIGT UPP- FINNINGEN I JÄMFÖRELSE MED KOMMERSIELLT 'ÉILLGÄNGLIGT JONBYTARHARTS Alla celler odlades i Dulbecco's Modified Eagle's Medium.

För odling av normala, diploida fibroblaster utökades mediet till % med fetalt kalvserum. För odling av primära och sekundära kycklingfibroblaster utökades mediet med 1 % kycklingserum, 1 % kalvserum och 2 3 tryptosfosfatbuljong (Difco Laboratories, Detroit, MI). Grundsubstanser passerades på 100 mm plastskâlar (Falcon Plastics, Inc., Oxnard, CA).

Primära kycklingembryofibroblaster preparerades genom sönder- hackning och därpå följande trypsinbehandling av 10 dygn gamla embryon. Sekundära kycklingembryofibroblaster framställdes på första dagen av primär confluens genom trypsinbehandling. För celler som odlats i plastskålar var fördubblingstiden cirka 20 h.

Diploida, humana-fibroblaster härstammande från embryonal lunga (HEL299, ATCC nr CCL 137) erhölls från the American Type Culture Collection, Rockville, MD. Dessa celler hade en fördubb- lingstid av 19 h i plastskålar.

Mikrobärarkulturer påbörjades helt enkelt genom att celler och pärlor sammanfördes i omrörd kultur. 100 ml kulturvolymer i 250 ml glaskolvar (6,5 cm i diameter) utrustade med en 4,5 cm magnetisktdriven Teflogàbelagd omrörarstav (wilbur Scientific, Inc., Boston, MA) användes. Omröringshastigheten var cirka 90 r/v. Det togs direkt prover på kulturerna och proverna undersöktes mikro- skopiskt samt fotograferades. Cellerna räknades genom att kärnor räknades med användning av den modifierade metoden enligt Sanford et al. (Sanford, K. K., Earle, W. R., Evans, V. J., Waltz, H. K., och Shannon, J. E. (1951) J. Natl Cancer Inst. 11: 773.) som be- skrivits av van Wezel (van Wezel, A. L. (1973). Tissue Culture, Methods and Applications. Kruse, P. F. och Patterson, M. R. (eds.), sid 372-377, Academic Press, New York).

Pärlor med fästade celler separerades från kulturmediet genom att pärlorna tilläts sjunka vid 1 g under några minuter och sedan aspireradesdetömerliggandeskiktet Detta förfarande underlättar mycket utbyte av mediet samt underlättar separationen av celler från mikrobärare efter trypsinbehandling.

Kommersiell DEAE Sephadex A-S0 användes som mikrobärare för de diploida humana fibroblasterna och jämfördes med bärare som syntetiserats och titrerats såsm beskrivits i exempel 1. För båda ll « 460 906 pärltyperna var bärarkoncentrationen 2 g av torr, obehandlad, tvärbunden dextran per liter. Laddningskapaciteten för.DEAE Sephadex A-50 var 5,4 mekv/g av torr, tvärbunden dextran, då däremot den för de nyligen syntetiserade pärlorna var 2,0 mekv/g. Resultaten visas i fig l.

För denna celltyp var förlusten av ursprungligt inokulum på A-50 mikrobärare utpräglad, medan fibroblasterna fastnade, proli- fererade och nådde confluens på mikrobärarna enligt uppfinningen på 6 dygn. Detta beteende överensstämmer väl med det rapporterade beteendetfördenna celltyp på standardskålar. Såsom fig 1 visar - var den slutliga celltätheten som åstadkoms med de nya mikrobärarna vid 2 g torr, tvärbunden dextran/liter 1,2 x 106 celler/ml.

--- ~ ~Xulturer innehållande de nya barerna uppvisade varken initial cellförlust eller någon hämning vid uppnående av confluens. Ännu viktigare var att cellkulturerna växte normalt vid högre mikrobä-, rarkoncentrationer. I fig 2 visas exempelvis att humana fibroblaster och sekundära kycklingembryofibroblaster när mättnadskoncentratio- ner nära 4 x 106 celler/ml när 5 g torr, tvärbunden dextran/liter användes, varvid de nya bärarna hade en laddningskapacitet av 2,0 mekv/g dextran. Såsom kan ses förekom det inte någon signifi- kant förlust av inokulum ens vid denna relativt höga mikrobärar- koncentration.

Sekundära kycklingembryofibroblaster odlades även vid mikro- bärarkoncentration av 10 g/liter. Under de ovan beskrivna betingel- serna âstadkoms en mättnadskoncentration av_6 x 106 celler/ml; vid utökning av mediet med ytterligare l % fetalt kalvserum åstad- koms en mättnadskoncentration av 8 x 106 celler/ml. Det förekom inte någon signifikant förlust av cellinokulum.

Primära kycklingembryofibroblaster odlades vid en mikrobärar- koncentration av S och 10 g/liter' och tillväxtkaraktäristikorna var lika de för de sekundära kycklingfibroblasterna, ehuru obetyd- liga inokulumförluster noterades och något längre retardationstider erhölls. _ Försök gjordes också att odla sekundära kycklingembryofibro- blaster under samma betingelser som användes ovan med undantag för att DEAE-Sephadex A-50 mikrobärare vid koncentrationer av l och g/liter användes. Ingen celltillväxt registrerades och signifi- kant inokulumförlust uppträdde. 12 . 2 *láåmäåš FRAMSTÄLLNING AV MIKROBÄRARE MED VARIERANDE MÄNGDER REAKTANTER Satser av mikrobärare framställdes genom upplösning av dietylaminoetylklorid:klorid och natriumhydroxid vid 20 ml destil- lerat vatten. Lösningen hälldes sedan över torra Sephadex G-50 pärlor, varefter pärlorna placerades på ett vattenskakbord som hölls vid 60°C. En serie av pärlsatser behandlades med en lösning innehållande0,0lmnl av aminen och 0,015 mol av natriumhydroxid, då däremot en annan serie av satser behandlades med en lösning innehållande 0,03 mol av aminen och 0,045 mol natriumhydroxid.

Reaktionstiden varierades för att åstadkomma olika mekv/g inom varje sats.

Diploida humana fibroblaster (HEL299) odlades i suspensions- kulturer vid en mikrobärarkoncentration av 5,0 g torr, obehandlad _ tvärbunden dextran per liter, varvid förfarandena enligt exempel 2 å »följdes med användning av mikrobärare med varierande mekv/g valda från varje sats. Därpå beräknades produktiviteten (106 celler odlade/liter.h) och plottades emot mekv/g för varje sats av pärlor framställda såsom ovan. Kurvor plottade med användning av data som I erhållits för_båda serierna hade samma form, de hade huvudsakligen en klockform, men kurvan från satserna som behandlats med högre koncentrationen av reaktanter hade något brantare stigning och fall.

Från varje sats framstäüdesbärare som gav utmärkt celltillväxt.

EXEMPEL 4 FRAMSTÄLLNINGAV MIKROBÄRARE VID VARIERANDE FÖRHÅLLANDEN AV MHN/- ALKALI Detta exempel illustrerar ytterligare förändringar av ladd- ningskapaciteten,vilka kan erhållas genom att variera förhållandena DEAE-kloridzklorid/NaOH. I detta exempel följdes förfarandena en- ligt exempel 3 med undantag för att ett vidsträckt område av natrium- hydroxidkoncentrationer användes medan koncentrationen av dietyl- aminoetylkloridzklorid hölls vid 0,01 mol per 20 ml. De koncentra- tioner som användes för natriumhydroxid var 0,01; 0,011; 0,012; 0,013; 0,014; 0,015; 0,02; 0,03; 0,05; 0,75; 0,10 mol per 20 ml.

En kurva uppgjordes av mekv/g efter 1,25 h vid 60°C emot koncentrationen av natriumhydroxid. Av kurvan kunde utläsas att natriumhydroxidkoncentrationer under cirka 0,01 gav ingen påvisbar laddningskapacitet. Laddningskapaciteten steg emellertid snabbt med ökande koncentration och nådde ett maximum av cirka 2,3 mekv/g torr, tvärbunden dextran vid en koncentration-av cirka 0,014 mol 13 I natriumhydroxid. Laddningskapaciteten sjönk sedan näsâšàpi gêåó linjärt samband till ett värde av cirka 1,1 mekv/g vid en natrium- hydroxidkoncentration av cirka 0,10 mol. Sålunda sker en förändring av reaktionskinetiken när förhållandet av DEAE-klorid:k1orid till natriumhydroxid varieras vid en konstant koncentration av DEAE- kloridzklorid och tvärbunden dextran.

EXEMEL S HUMANT INTERFERON FRAMSTÄLLT I CELLER ODLADE PÅ FÖRBÄTTRADE MIKRO- BÄRARB Mikrobärarodlade cellers förmåga att alstra humant interferon' beskrives här. De celler som användes för framställning av humant! interferon var normala, diploida, humana förhudsfibroblaster, FS-4. Dessa fibroblaster odlades i mikrobärarkulturer med använd- ning av de förfaranden som beskrivits i exempel 2. Mikröbärare framställda och titrerade enligt exempel l användes vid en koncen- tration av S g torr, tvärbunden dextran/liter. Det för kulturodling ianvändamediet var DMEM utökat med lO.% fetalt kalvserum.

Efter 8-till 10 dygn upphörde kulturerna att växa. Vid detta skede avlägsnades odlingsmediet. Kulturerna tvättades l-4 ggr med 100 ml serumfritt DMEM. Cellerna var då klara för interferoninduk- tion. Detta åstadkoms genom att man satte till kulturerna 50 ml serumfritt DMEM-medium som innehöll 50 pg/ml cyklohexamid, och varierande mängder av poly I. poly C inducerare. Efter 4 h sattes Actinomycin D till kulturerna för att åstadkomma en slutlig koncen- traion av l pg/ml. _ 5 h efter påbörjad induktion dekanterades induktionsmediet och kulturerna tvättades 3-4 ggr med 100 ml varmt, serumfritt DMBM.

Kulturerna påfylldes med 50 ml DMEM som innehöll 0,5 % humant plasmaprotein.i Kulturerna inkuberades under standardbetingelser i ytterligare 18 h. Vid denna tidpunkt dekanterades kulturerna och det dekanterade mediet analyserades i fråga om interferonaktivitet.

Interferonaktiviteten analyserades genom att 50 % nivån av cell- protektion bestämdes för prover och standardlösningar, för FS-4 fibroblaster som smittats med Vesicular Stomatitis Virus (VSV), Indiana-stammen).'Resultaten från interferonframställningskörningarna presenteras nedan i tabellform. ' 14 460 906 Koncentration av Cellkoncentration under Interferon inducerare framställningen (U/106 celler) (pg/ml) (celler/ml) 4 2,o x 1ø6 39 2,6 x 106 378 zs 2,6 X 106 sas so 2,0 X 1o6 -sooo Vart och ett av dessa data är från en separat körning och de ' avses inte visa någon korrelation till koncentrationen av induce- rare.

EXBMPEL 6 g ODLING AV CELLBR PÅ FÖRBÄTTRADE MIKROBÄRARE FÖR ÄNDAMÅLET ATT PRODUCERA VIRUS Mikrobärarodlade cellers förmåga att producera ett virus be- skrivs nedan. Primära och sekundära kycklingembryofibroblaster odlades i mikrobärarkultur enligt det i exempel 2 beskrivna förfa- randet, varvid de primära cellerna odlades vid 10 g/liter och de sekundära vid 5 g/liter mikrobärarkoncentration. För att initiera virusproduktion avlägsnades odlingsmediet och kulturerna tvättades 2 ggr med 100 ml av serumfritt DMEM. Infektion av dellerna med Sindbis-virus skedde 1 50 ml DMEM utökat med l % kalvserum, 2 % tryptosfosfatbuljong och tillräckligt med Sinbis-virus för att mot- svara en MOI (mångfald av infektion) av 0,05.

Viruset skördades 24 h efter infektion genom att kulturbuljongen uppsamlades, gjordes klar vid låg centrifugering och det överlig- gande skiktetzfrystes. Virusproduktionen analyserades genom plaque- bildning (PF) i ettområdeausekundära kycklingfibroblaster. Resul- taten från infektering av dessa mikrobärarkulturer var: Total koncentration för produktion Celltyp (celler/ml) (PFU/ml) PFU/cell Sekundär 4,0 x 106 8,4 x 109 2 000 Primär ' 1,4 x 106 . 2,3 x 1o1° 16 ooo primär 6,0 x 105 2,6 x 1o1° s ooo Virusproduktion fastställdes för följande virus/cell på mikro- bärarkombinationerna: Polio/WI-38; Moloney MuLV/Cl-1 mus och VSV/- " kycklingembryofibroblaster.

EEMPEL _, 460 906 JÄMTÖRANDE ODLING AV CELLER I ROTERKOLVAR OCH MED FÖRBÄTTRADE MIKRO- BÄRARE FÖR AVSIKTEN ATT PRODUCERA MURIDAE-LEUKEMIVIRUS PROVIRALT DNA _Det omvänt-transkriberade DNA av Moloney leukemivirus (M-MuLV) efter infektion av JLS-V9-celler, en musbenmärgslinje, studerades.

Tekniken innefattade odling av celler i roterkolvar. Celler odlades i roterkolvskultur, mediet avlägsnades, och virusinukulum infördes i kolvarna. Strax därefter fick kulturerna färskt medium och 8-16 h senare extraherades de för slutlig rening av viralt DNA.

Kulturerna tvättades med färsk buffert och cellen lyserades med en lösning som innehöll detergenten natriumdodekylsulfat. Därpå följande kylning av lysatet och tillsättning av salt till en molar orsakade samutfällning av detergenten och DNA av hög molekylvikt.

DNA av låg molekylvikt som kvarstod i det överliggande skiktet kun- de sedan avproteiniseras och koncentreras för vidare analys.

En S0-roterkolvkultur som innehöll cirka 109 celler. Dessa infekterades med cirka l liter av viral inokulumtitrering vid 3 x 106 plaque-bildningsenheter per ml. Detta resulterade i en nomi- nefl mångfald av infektion av 1-3 och de infekterade cellerna gav -20 nanogram av virusspecifikt DNA.

Ett enklare förfarande utvecklades med användning av förbättrade mikrobärare enligt föreliggande uppfinning. En kultur som innehöll g av pärlor i l liter av odlingsmedium användes. Vid uppnådd confluens infekterades 109 celler på pärlorna genom att pärlorna fick sjunka ned och mediet ersattes med l liter av virusinokulum.

För extraktion tvättades cellerna på pärlorna med buffert och place- rades sedan i den SDS-innehållande bufferten. Efter samutfällning av DNA med hög molekylvikt och detergenten centrifugerades fällningen tillsammans med pärlorna och det överliggandeskiktetavskiljdes för vidare analys. Utbytet av viralt DNA var jämförbart med det som erhölls i roterkolvskulturen och det medförda arbetet var 5fl0 Q av det som erfordradesavroterkolvskulturen.

EEE-il. , , .

FÖRBÄTTRAD MIKROBÄRARPRODUKTION MED DIMETYLAMINOETYLLADDNINGSGRUPPER En lämplig mikrobärare framställdes genom att en alternerande utbytesenhetbandstilldendextranmatris som användes i exempel l.

Dimetylaminoetylgrupper (DMAE) bands till en dextranmatris genom följande förfarande: l g torra dextranpärlor (Pharmacia G-50) med en diameter av 50-75 Fm sattes till 10 ml destillerat vatten och V pärlorna fick svälla. Vattenlösningen,som innehöll 0,01 mol dimetyl- 16 4šHQno2¿§§¿k1orid:klorid (Sigma Chemical Co.) och 0,015 mol natrium- hydroxid,bildades i en 10 ml volym. Denna vattenlösning sattes till de svällda dextranpärlorna,och denna suspension omrördes sedan kraf tigt under 1 h vid 60°C. Efter reaktionen titrerades pärlmassan så- som i exempel 1. Denna reaktion binder 1,0 mekv av dimetylamino- etyl till dextranmassan. För att framställa mikrobärare med högre gradav Qistiündon utfördes ovan angivna reaktion och pärlmassan tvättades omsorgsfullt med vatten. Överskottet vatten frånfiltre- rades och pärlmassan vägdes för att bestämma mängden vatten som kvarhâllits av pärlmassan. Till denna pärlmassa sattes den lämpliga mängden av färska reaktanter (dvs DMAE-Cl:Cl, och NaOH) så att den slutliga koncentrationen av DMAE och Na0H i dessa efterföljande reaktionsblandningar var identisk med de som ursprungligen användes.

På detta sätt framställdes en serie mikrobärare vid 1,0; 2,0; 2,5 och 3,5 mekv DMAE/g oreagerad dextran. Celler (HEL 299) odlades i mikrobärarkultur (5 g/liter) med dessa mikrobärare enligt förfa- randena i exempel 2. Resultaten ges nedan i tabellform: Grad av substitution (mekv/g) \ce11spr1an1ng netto tillväxt 1 ,o - - 2 .o - - 2 , 5 + + 3, 2 + - Såsom väntat är celltillväxt förknippad med graden av substi- tution med laddningsbärande grupper. Vid en för hög grad av sub- stitution uppträder ingen celltillväxt, trots att förankring och spridning sker. vid en för låg grad av substitution är inte adhe- sion av celler till ytan tillräcklig för att medge riktig sprid- ning och tillväxt. ammar. 9 _ FÖRBÄTTRADE MIKROBÄRARE MED POSITIVT LADDADE FOSFONIUMGRUPPEÉ Förbättrade mikrobärare framställdes även med användning av non-amin utbytesgrupper enligt följande. l g av torra dextranpärlor framställdes och svälldes med_vatten såsom i exempel 1. Till de svällda pärlorna sattes 5 ml av en mättad vattenlösning av trietyl- C K C H \P/ 25 ,/ \\ C2H4Br CZHS -(etyl-bromid)-fosfonium (TEPÉ, , och S ml av en 17 460 '906 3 molar lösning av natriumhydroxid. Denna uppslamning fick reagera vid 65°C. En serie av mikrobärare framställdes vid 1,1; 1,7 och 2,9 mekv/g. Mikrobärarna vid 1,1 mekv/g framställdes genom reaktion 'vid de ovan angivna betingelserna i 4 min. 1,7 mekv/g mikrobärare fick reagera i l h och 2,9 mekv/g mikrobärare fick reagera 3 ggr i följd såsom beskrivits i exempel 7. En mikrobärarcellkultur vid g/liter upprättades för var och en dessa bärare med en kontinu- erlig celltyp, JLS-V9 och jämfördes med denna cells tillväxt på förbättrade DEAB-mikrobärare som framställts såsom i exempel 3.

Resultaten ges nedan i tabellform.

DEAE mekv/g Cellförankring och -spridning Netto tillväxt 0,9 + + 1,7 + + 3'8 + _ TEP 1,1 + + 1,7 + + 2,9 + - Det inses av fackmännen på omrâdet att det finns vissa ekvi- valenter till de specifika teknikerna, materialen, etc som beskri- vits här och dessa anses vara en del denna uppfinning och avses in- gâideefterföljande patentkravens skyddsomfång. Ehuru största delen av denna beskrivning har begränsats till användningen av förbättrade mikrobärare för odling av förankringsberoende celler kan de natur- ligtvis även användas för odling av andra celltyper.

Claims (7)

18 . 460 906 PATENTKRAV

1. Cellkulturmikrobärare k ä n n e t e c k n a d e av att mikrobärarna har en grad av substitution därpå med positivt laddade grupper som är tillräcklig för att ge en anjonbytarkapacitet av 0,1-4,5 mekv/g av torra, obehandlade mikrobärare, vid vilken god celltíllväxt uppträder.

2. Cellkulturmikrobärare enligt patentkravet l, k ä n n e - t e c k n a d e av att mikrobärarna består av tvärbundna dextran- pärlor.

3. Cellkulturmikrobärare enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n - n e t e c k n a d e av att de positivt laddade grupperna utgörs av tertiära eller kvaternära aminogrupper.

4. Cellkulturmikrobärare enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a d e av att de positivt laddade grup- perna utgörs av dietylaminoetylgrupper.

5. Cellkulturmikrobärare enligt patentkravet l eller 2, k ä n - n e t e c k n a d e av att de positivt laddade grupperna utgörs av fosfoniumgrupper.

6. Cellkulturmikrobärare enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a d e av att de har en anjonbytarkapa- citet av l-2,8 mekv/g av torr, obehandlad, tvärbunden dextran.

7. Cellkulturmikrobärare enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a d e av att de positivt laddade mik- robärarna har en genomsnittlig diameter av 120-200 um.