JPH01137969A - 浮遊増殖性細胞の培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は浮遊増殖性細胞の培養法に関するものである。

［従来の技術］ 一般に細胞の培養においては、培養対象細胞が浮遊増殖
性細胞、すなわち液体培地中に細胞自体が浮遊した状態
で増殖が可能な細胞である場合には、その栄養源である
液体培地中に浮遊させることにより培地と接触させるこ
とが必要である。

而して目的とする細胞の培養を高い効率で実行するため
には、培養対象細胞を常に新しい培地と接触させること
が肝要であり、そのためには浮遊増殖性細胞（以下単に
「細胞」ということがある）を液体培地中に高い分散度
で分散せしめることが必要である。

［発明が解決しようとする問題点コ 従来において、細胞を常に新しい液体培地に接触させる
ための方法としては、液体培地中に細胞を加えた系を回
転翼によって撹拌する方法が一般的であるが、この方法
は液体培地と細胞とより成る混合系に剪断力を加える方
法であるため、回転翼との衝突により或いは大きな剪断
力の作用により培養中の細胞が損傷されることを回避す
ることができず、従って培養効率が低く、細胞の種類に
よってはこの方法を用いることができない場合もあると
いう欠点を有する。また、この方法による大量培養のた
めの大容量の細胞培養装置の場合には、撹拌のために大
型の撹拌機が必要となり、従って必然的に剪断力も大き
くなるために培養効率がさらに低下するようになるとい
う欠点をも有する。このような欠点を解消するために種
々の方策が研究されており、上記欠点を本質的に解決す
る細胞培養法として、特開昭６０−２３２０８８号公報
や特開昭６１６６７０号公報に記載されるような培養容
器を回転させる培養法が提案されている。

この培養法は高い効率で浮遊増殖性細胞を培養すること
ができるが、汎用性を一層高めるためにさらに培養効率
の向−ヒが望まれている。

本発明は、さらに高められた培養効率を有する浮遊増殖
性細胞の培養法を提供するものである。

［問題点を解決するめたの手段］ すなわち本発明は、液体培地、粒子および浮遊増殖性細
胞より成る混合系を実質的に充満するように充填した培
養容器を実質上水平な軸の周りに自転するよう回転せし
めて、当該混合系を前記培養容器と共に定常的に回転せ
しめることを特徴とする浮遊増殖性細胞の培養法を提供
するものである。

本発明において使用することのできる培養容器としては
、例えば、特開昭６０−２３２０８８号公報および特開
昭６２−６６７０号公報に記載の培養容器を好適に用い
ることができる。

以下、図面によって本発明を具体的に説明する。

第１図は本発明に用いる培養装置の一例を示す概略図で
あり、この第１図の例においては、容器部１と回転駆動
部２とにより装置が構成されている。

容器部１は容器３と筒状の内容器４とにより構成され、
容器３においては実質的に水平な方向に伸び、内容器４
を容器３の側壁に回転可能に軸支するための一方の回転
軸３１および他方の回転軸３２とが設けられている。こ
の例においては、他方の回転軸３２はその軸内部が中空
であって、液体培地を内容器４内に循環（矢印で示す方
向）させるだめの通路を形成しており、この他方の回転
軸３２は容器３の外部から内容器４内に挿通された状態
で配設され、その一方の端部開口３３は内容器４内に連
通している。容器３の外部においては、他方の回転軸３
２は屈曲して上方に伸び、その他方の端部開口３４が容
器３の上部から当該容器３の内部に充填された液体培地
５内に埋没された状態に配置され、これにより液体培地
５を循環するための培地循環管３５が構成されている。

３６はポンプであり、このポンプ３６により必要に応じ
て容器３の上部の液体培地が培地循環管３５を通って内
容器４内に循環される。

内容器４は、細胞および担体に対し不透過性で液体培地
透過性の網または膜４１により構成された筒壁４２と、
この筒壁４２の両端部を塞ぐよう設けた側板４３および
４４と、これら側板４３および４４を連結して前記筒壁
４２を保持する連結板（図示せず）により構成されてい
る。また、必要に応じて前記ポンプ３６により容器３の
上部の液体培地を培地循環管３５を通して内容器４内に
循環させるようにしてもよい。

前記網または膜４１の孔のサイズは培養対象細胞の大き
さなどを勘案して選定され、−概に想定することはでき
ないが、例えば、通常０．１〜１０μｍ１好ましくは３
〜５μｍである。前記網または膜４１を構成する材質は
、細胞の培養に支障をきたさないものであれば特に限定
されるものではないが、例えば、ナイロンおよびテフロ
ン（商品名）などを用いることができる。

回転駆動部２は、この例においては、モーター２１と、
このモーター２１により回転される回転磁石体２２とに
より構成され、回転磁石体２２はモーター２１に軸支さ
れ、その回転軸が水平となるよう位置された保持板２３
と、この保持板２３に固定された磁石２４とにより構成
されている。

内容器４の一方の側板４３には磁石４５が固定して設け
られ、この磁石４５に対向するよう回転磁石体２２が配
置され、モーター２１により回転磁石体２２を回転させ
ることより、磁石２４と磁石４５との間の磁力により内
容器４を回転軸３１および３２の周りに自転するよう回
転させることができる。

内容器４の回転軸３１および３２は実質上水平に配置さ
れ、そのようにすることにより内容器４内において液体
培地中の細胞を均一に分散させることができる。ここに
おいて回転軸３１および３２が実質上水平であるとは、
回転軸３１および３２の傾きが例えば水平に対して最大
的１５度程度までの範囲内である場合であり、好ましく
は水平に対して５度以内、より好ましくは３度以内の傾
きであるが、いずれの場合においても内容器４は完全に
液体培地内に浸漬されるものとする。

６１は容器３の上部に設けた送気管であり、この送気管
６１により容器３の上部空間には細胞の場合、例えば濃
度が５％の炭酸ガスを含む空気を供給し、これにより液
体培地５の溶存酸素量を細胞に適した一定の状態に保つ
ことができる。さらに、液体培地供給管６３より一定の
割合で液体培地を供給すると同時に、液体培地排出管６
４より同一割合で液体培地を排することもできる。６２
は排気管、６５はｐＨセンサー、６６はＤＯセンサーで
ある。

第２図は本発明に用いる培養装置の他の例を示すもので
あり、この図の例においては、底板７０と有底筒状の容
器本体７１とにより培養容器が構成されている。すなわ
ち、容器本体７１は底板７０に固定して設けた押え機構
７２によって底板７０にＯリング７３を介して押圧され
、その内部空間が培養領域とされる。底板７０は回転ス
リーブ７５に固定され、回転スリーブ７５はドライベア
リング７６を介して、スタンド７７によって保持された
外套部材７８に回転自在にかつ水平方向に保持されてい
る。底板７０は中央に開口を有し、この開口は、液体は
通過するが粒子および細胞を通過させないメツシュ８０
により塞がれており、このメツシュ８０を貫通する内導
管８１がメツシュに固定されている。この内導管８１は
その先端に開口を有し、回転スリーブ７５内番通って伸
び、その後端は連結シール部９０において外部よりの供
給管９１に連通ずるようにこれに回転自在に連結されて
いる。回転スリーブ７５の内周には外導管８２が内導管
８１に対して二重管構造となるよう固定され、その先端
は底板７０の開口に連通するよう連結されており、その
後端は連結シール部９０において回転自在であって、し
かも外部に伸びる排出管９２と連通されている。１００
は回転スリーブ７５に固定した被動歯車であり、モータ
（図示せず）によって駆動される駆動歯車１０１と噛合
している。

以上の如き構成においては、駆動歯車１０１が駆動され
ることによって回転スリーブ７５が回転し、これによっ
て底板７０と容器本体７１とにより構成される培養容器
が水平な軸の周りに回転され、同時に内導管８１および
外導管８２も共に回転する。

而してこの装置においては、供給管９１が内導管８１に
連通し、外導管８２が排出管９２に連通しているので、
これらにより培養容器を回転させて細胞の分散を図りな
がら、当該培養容器内に新たな液体培地を供給すること
、および対応する量の使用されて栄養分の失われた古い
液体培地を外部に排出することができる。

本発明の培養法によって培養することのできる浮遊増殖
性細胞としては、例えばリンパ球、リンパ芽球、マクロ
ファージ、末梢血単球、末梢血単核球、ロイケミアＴ細
胞、ナマルア株（ヒトバーキットリンパ肺由来Ｂ細胞型
リンパ芽球様細胞）、ジャーカット株（Ｔ細胞型リンパ
芽球様細胞）、バーキットクンパ腫細胞、急性リンパ芽
球性白血病細胞、骨髄腫細胞、トランスフオームＴリン
パ球、Ｂ細胞−１細胞（ヒト白血病由来）、トランスフ
オームＢ細胞、ヒトリンパ球Ｍｏ細胞、ＮＫ（Ｎａｔｕ
ｒａｌ　Ｋ１１ｌｅｒ）細胞、抗プラスミノーゲンアク
チベーターモノクローナル抗体産生細胞、ＬＡＫ細胞（
Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｋ１１ｌ
ｅｒ　Ｃｅ１ｌ）、ＴＩＬ細胞　（Ｔｕｍｏｒ　　Ｉｎ
ｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ　　Ｌｙ［ｌ１ｐｈｏｋｉｎｅ　
　）　　、ＣＴＬ細胞（Ｃｙｔｏｘｏｔｉｃ　Ｔ　Ｌｙ
ｍｐｈｏｋｉｎｅ）などを挙げることができる。

また本発明の適用における液体培地も特に限定されるも
のではなく、ミニマルーエッセンシャル培地（ｍｉｎｉ
ｍａｌ　−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　：汎用
細胞培養用基礎培地）やダルベツコ変法イーグル培地、
ＰＲＭＩ　　１６４０培地などを例示することができ、
液体培地の比重としては、１．００〜１．０５のものが
一般的である。

これらの液体培地には必要に応じ、例えば１〜３０容量
％の子牛血清または牛胎児血清、ならびに１００〜１０
０ＯＩＵ／ａｔｅのインターロイキン２などの生理活性
物質を添加することができる。

なお液体培地には、酸素および炭酸ガスを溶存させるこ
とが必要である。なお培養時の液体培地の温度は通常３
０〜４０℃であり、好ましくは３７℃である。

さらに浮遊増殖性細胞を培養する場合に用いる粒子も特
に制限があるものではなく、液体培地に不溶であればよ
く、例えばガラスなどの無機材料、ポリスチレンなどの
合成高分子、タン白質や多糖類などの天然高分子により
表面が形成された粒子を挙げることができ、市販品とし
ては［サイトデイ、 ックス」　（ファルマシア社製）、しバイロンロン」（
日本インターメッド社製）、「スーパービーズ」（大日
本製薬製）などを挙げることができる。また粒子は磁性
を有するものである場合、これによって磁石を用いて粒
子の捕集、移動、処理、その他の取扱いを簡便に、かつ
迅速に行うことが可能となる。磁性を有する粒子として
は、磁性体粉を高分子材料により結着して成るもの、磁
性を有するコアを高分子材料により被覆して成るものが
あり、磁性体の具体例としては、鉄、コバルト、ニッケ
ル、これらの合金、低炭素鋼、ケイ素鋼、γ−酸化鉄、
フェライト、マグネタイト、その他を挙げることができ
る。粒子の比重は、液体培地の粘性および比重などによ
っても異なるが、一般的に０．８〜１．２ｇ／ｃｎｔ、
好ましくは０．８５〜１．１５ｇ／ｃｕｔの範囲内のも
のとされるが、液体培地の比重、通常１．０１ｇ／ｃｎ
ｔとは異なることが好ましい。また粒子の粒径は、通常
２０〜５００μｍ１好ましくは８０〜３００μｍが好ま
しく、形状は球形が望ましいが、顆粒状、円筒状などで
あってもよく、不定形のものであっても差支えない。ま
た混合系における粒子の密度は液体培地１献当り、通常
１０３〜１０６個、好ましくは１０４〜１０５個である
。液体培地１ｍＡ当りの浮遊増殖性細胞の播種量は、一
般的には１０４〜１０６個である。

なお上記条件などにおいて、細胞は液体培地よりも比重
が小さくてもよく、液体培地より比重が小さい細胞は、
重力によらず浮力によって比重が大きい細胞の場合と同
様に液体培地中において運動し、均一に分散するように
なる。

本発明において、培養容器内には、液体培地、粒子およ
び細胞の混合系が空間が存在しないように充満状態に充
填されていることが望ましく、これによって当該混合系
を確実に培養容器と共に回転させることが容易となり、
空間が存在するときにもそれが僅かであればその空間が
存在することによる液体培地における撹乱は、培養容器
内の混合系の上部部分の僅かな領域に限定されるので、
事実上本発明による効果を無効とするものではない。し
かし培養容器内の空間の割合が多くなると、混合系を撹
乱することなく培養容器と共に回転させることができず
、本発明の目的を達成することができない。このために
本発明においては、培養容器内における混合系の充填割
合が８０容量％以上の場合を実質的な充満状態とし、充
填割合は好ましくは９０容量％以上であり、特に好まし
くは９８容量％以上である。

本発明において、培養容器の自転における回転速度は、
細胞の大きさおよび比重、粒子の大きさおよび比重、液
体培地の粘度、培養容器の形状および大きさなどによっ
て一概に規定することができないが、通常は５〜５０　
ｒ、ｐ、ｍ、、好ましくは１０〜３０　ｒ、ｐ、ｍ、程
度となるように回転速度を調整する。

［実　施　例］ 以下に本発明の実施例を示す。

実施例１ 培養細胞　：　腫瘍白血病細胞であるロイケミアＴ細胞
（Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　）液体培地　：　
酸素および炭酸ガスを溶存し、１容量％牛脂児血清を含
むｒＰＲＭ Ｉ　　１６４０Ｊ 粒　　子　＝　「バイオシロン」　（ポリスチレン、粒
径１６０〜３００μｍ１日本イ ンターメッド社製） 第１図に示す培養装置のナイロンメツシュよりなる容量
３００−の内容器４に、乾燥重量で０゜６ｇの粒子を挿
入口３３を介して入れて液体培地を満し、これに９×１
０４個／ｄになるよう培養細胞を播種し、空気が入らな
いように密閉した後、温度３７℃の環境下、８日間に亘
り、回転数１５ｒ、ｐ、ｍ、で培養容器を回転させて培
養を行った。なお、この培養装置の容器３の容量は６０
０ｍｊ２であった。

結果を第３図にａとして示す。

比較例１ 粒子を使用しない以外は、実施例１と同様にして培養を
行った。

結果を第３図にｂとして示す。

実施例２ 培養細胞を抗組織プラスミノーゲンアクチベーター（抗
ＴＰＡ）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとし、
その播種量を２×１０４個／ｄとした以外は、実施例１
と同様にして培養を行った。

結果を第４図にａとして示す。

比較例２ 粒子を使用しない以外は、実験例と同様にして培養を行
った。

結果を第４図にｂとして示す。

実施例３ 培養細胞　：　末梢血リンパ球 液体培地　：　酸素および炭酸ガスを溶存し、１容量％
の牛胎児血清および２００ ＩＵ／ｍｌ！のγ−インターロイキン ２を含むｒＰＲＭＩ　　１６４０Ｊ 粒　　子　：　「バイオロシロン」　（ポリスチレン、
粒径１６０〜３００μｍ１日 本インターメッド社製） 第２図に示す培養装置の内容積６００ｄの培養容器７１
に、乾燥重量で０．１ｇの粒子を挿入口８１を介して入
れて液体培地を満し、これに１×１０６個／献になるよ
う培養細胞を播種し、空気が入らないように密閉した後
、温度３７℃の環境下、１０日間に亘り、回転数１５ｒ
、ｐ、ｍ、で培養容器を回転させて培養を行った。

その結果、培養細胞数は９．８×１０５個／ｄとなった
。

［発明の効果］ 本発明の培養方法によれば、浮遊増殖性細胞を液体培地
中に均一に分散し、粒子の存在により液体培地が容器で
移動し、浮遊増殖性細胞は常に新鮮な液体培地と接触す
ることができるため、浮遊増殖性細胞の培養を効率よく
行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１および２、比較例１および２で用いた
培養装置、第２図は実施例３で用いた培養装置を示す図
面である。 第３図は実施例１および比較例２の培養結果を示すグラ
フであり、第４図は実施例２および比較例２の培養結果
を示すグラフである。 培養日数（日） 第３図 ０　　　　１　　　　２　　　．３　　　　４　　　　
５培養日数（日） 第４図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）液体培地、粒子および浮遊増殖性細胞より成る混合
   系を実質的に充満するように充填した培養容器を実質上
   水平な軸の周りに自転するよう回転せしめて、当該混合
   系を前記培養容器と共に定常的に回転せしめることを特
   徴とする浮遊増殖性細胞の培養法。