JPH0292278A - 細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は細胞、特に動物細胞を長期間培養する方法に関
するものである。

［従来の技術］ 一般に細胞の培養においては、培養対象細胞が浮遊増殖
性細胞、すなわち液体培地中に細胞自体が浮遊した状態
で増殖が可能な細胞である場合には、その栄養源である
液体培地中に浮遊させることにより培地と接触させるこ
とが、或いは細胞が接着依存性細胞、すなわち液体培地
中における生育および増殖において、基質に対する接着
が必須の細胞である場合には、適当な基質の表面に当該
細胞を接着させた上で液体培地と接触させることが必要
である。

［発明が解決しようとする問題点コ 面して目的とする細胞の培養を高い効率で実行するため
には、培養対象細胞を常に新しい培地と接触させること
が肝要であり、そのためには浮遊増殖性細胞または接着
依存性細胞を接着した担体粒子（以下、これらを合せて
単に「細胞」ということがある）を液体培地中に高い分
散度で分散せしめること、および培養容器内に常に新鮮
な培地を供給することが必要である。

このような問題を解消するために種々の方策が研究され
ており、上記問題を本質的に解決する細胞培養法として
、特開昭６２−６６７０号公報に記載されるような培養
容器を回転させる培養法が提案されている。

しかし、上記の培養法は培養効率は高いが液体培地の供
給を細胞に対して不透過性で、液体培地に対して透過性
の網または膜を介して行っているため、特に浮遊増殖性
細胞の場合、これらの網または膜への目詰りが生じやす
いという問題がある。

本発明はこれらの問題点を解決し、長期間に渡り高い培
養効率で細胞を培養することのできる細胞培養方法を提
供するものである。

［問題点を解決するための手段］ すなわち本発明は、液体培地および接着依存性細胞を付
着してなる被分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞より成る
混合系を実質的に充満するように充填した培養容器を実
質上水平な軸の周りに回転せしめて、当該混合系を前記
培養容器と共に回転せしめ、以って前記被分散粒子もし
くは浮遊増殖性細胞を前記液体培地中に分散せしめる工
程を有する細胞培養方法において、前記培養容器の少な
くとも一部が半透膜により構成されていることを特徴と
する細胞培養方法を提供するものである。

本発明においては、例えば第１図または第２図に示す培
養装置を使用することが好ましい。以下、当該装置を示
す図面をもとに本発明を具体的に説明する。

第１図の例において、底板７０と有底筒状の容器本体７
１とにより培養容器が構成されている。

すなわち、容器本体７１は、底板７０に固定して設けた
押え機構７２によって底板７０に０リング７３を介して
押圧され、その内部空間が培養領域とされる。底板７０
は回転スリーブ７５に固定され、回転スリーブ７５はド
ライベアリング７６を介して、スタンド７７によって保
持された外套部材７８に回転自在にかつ水平方向に保持
されている。底板７０は中央に開口を有し、この開口は
半透膜８０により塞がれている。

半透膜の培養領域外側（以下、「半透膜外側」と呼ぶ）
には中央および周辺部に貫通口８３を有した円盤８２が
固定され、中央の貫通口には内導管８１が固定されてい
る。この内導管８１はその先端に開口を有し、回転スリ
ーブ７５内を通って伸び、その後端は連結シール部９０
において外部よりの供給管９１に連通ずるようにこれに
回転自在に連結されている。回転スリーブ７５の内周に
は、外廓管８２が内導管８１に対して二重管構造となる
よう固定され、その先端は底板７０の開口に連通ずるよ
う連結されており、その後端は連結シール部９０におい
て回転自在であって、しかも外部に伸びる排出管９２と
連通されている。１００は回転スリーブ７５に固定した
被動歯車であり、モータ（図示せず）によって駆動され
る駆動歯車１０１と噛合している。

以上の如き構成においては、駆動歯車１０１が駆動され
ることによって回転スリーブ７５が回転し、これによっ
て底板７０と容器本体７１とにより構成される培養容器
が水平な軸の周りに回転され、同時に内導管８１および
外廓管８２も共に回転する。

而してこの装置においては、供給管９１が内導管８１に
連通し、外廓管８２が排出管９２に連通しているので、
これらにより培養容器を回転させて細胞の分散を図りな
がら、当該培養容器内に半透膜を介して新たな液体培地
を供給することができる。

第２図は、本発明の細胞培養方法の他の例を示す装置で
ある。

容器部１は、容器３と筒状の培養容器４およびこれを吊
り支える支持板５とにより構成され、容器３においては
、培養容器４を支持板５の側面に実質的に水平な方向に
伸びた回転軸８を軸支するための回転軸受６および他方
の回転軸受７とにより固定している。回転軸８はその軸
内部が中空であり、サンプリング管９とつながっている
。さらに回転軸８は開口部を有し、その開口部およびサ
ンプリング管９を通じて細胞などの注入が行われる。培
養容器４の側面は半透膜１０により構成されている。

本発明において使用される半透膜としては、再生セルロ
ース、セルロースアセテートなどのセルロース系の半透
膜のほか、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアク
リルニトリルなどよりなる半透膜が挙げられる。

半透膜の孔径は細胞が透過せず、さらに培養容器内に血
清、血漿、酵素などの高分子の添加物を加える場合は、
これらの添加物が透過しない孔径を、また培養容器外の
液体培地に血清などの添加物を加える場合は、高分子の
添加物が透過する孔径の膜を選択する。通常、細胞を透
過させないためには、孔径１０μｍ以下が望ましい。

また、培養容器における半透膜の割合は、通常、培養容
器の全表面積の通常１０％以上、好ましくは２０％以上
である。

本発明において、培養容器内には液体培地、粒子および
細胞の混合系が空間に存在しないように充満状態に充填
されていることが望ましく、これによって当該混合系を
確実に培養容器と共に回転させることが容易となり、空
間が存在するときにも、それが僅かであればその空間が
存在することによる液体培地における撹乱は、培養容器
内の混合系の上部部分の僅かな領域に限定されるので、
事実上本発明による効果を無効とするものではない。し
かし培養容器内の空間の割合が多くなると、混合系を撹
乱することなく培養容器と共に回転させることができず
、本発明の目的を達成することができない。このために
本発明においては、培養容器内における混合系の充填割
合が８０容量％以上の場合を実質的な充満状態とし、充
填割合は好ましくは９０容量％以上であり、特に好まし
くは９８容量％以上である。

本発明において、培養容器の自転における回転速度は、
細胞の大きさおよび比重、粒子の大きさおよび比重、液
体培地の粘度、培養容器の形状および大きさなどによっ
て一概に規定することができないが、通常は５〜５０ｒ
ｐｍ、好ましくは１０〜３０　ｒｐｍ程度となるように
回転速度を調整する。

本発明の適用においては、細胞としては何ら制限される
ものではなく、例えばリンパ球、リンパ芽球、パーキッ
トクンパ腫、急性リンパ芽球性白血病細胞、骨髄腫など
のミエローマ細胞、またはこれらによるハイブリドーマ
細胞、Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの膵臓細胞とＮ５−１細胞と
のハイブリドーマ、黒色種由来のＢＯＷＥＳ細胞、ハイ
ブリドーマの作製に用いる親株であるミエローマ、例え
ばＳＰ２１０−Ａｇ−１４やＰ３／ＮＳｌ−Ａｇ４−１
などの浮遊増殖性細胞、ヒト子宮ガン細胞ＨｅＬａ、チ
ャイニーズ−ハムスター−肺細胞Ｖ−７９、ヒト胎児肺
細胞ＭＲＣ−５、チンパンジー肝繊維芽細胞、ヒト包皮
細胞、ニワトリ胎児繊維芽細胞、初代サル腎細胞、マウ
ス転移繊維芽細胞、脳下垂体腫瘍細胞、アフリカミドリ
ザル腎細胞Ｖｅｒｏ、副腎腫瘍細胞などの接着依存性細
胞、殺腫瘍細胞活性を示す一群のキラー細胞であるＬＡ
Ｋ細胞（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　
Ｋ１１ｌｅｒ　Ｃｅ１ｌ）、ＴＩＬ細胞（Ｔｕｍｏｒ　
Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ　Ｌｙａ＋ｐｈｏｃｙｔｅ）
、ＣＴＬ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｌｃ　Ｔ　Ｌｙｍｐｈｏ
ｃｙｔｅ）などを挙げることができる。

本発明の適用における細胞培養用の液体培地は特に限定
されるものではなく、公知の培地をそのまま使用するこ
とができ、例えばＲＰＭ１１６４０培地、イーグルＭＥ
Ｍ培地、ダルベツコ変法イーグル培地、Ｅａｒｌｅ培地
１９９、ハムＦ１２培地などを挙げることができ、これ
らの培地には５〜１０容量％の割合で、例えば胎児ウシ
血清、新生児ウシ血清、ウマ血清、ヒト血清を添加して
用いることが好ましい。また、血清を用いない無結成培
地、例えばＨＢ１０２　（ハナバイオロジクス社）　、
ＲＩＴＣ５５−９培地なども用いることができる。これ
らの液体培地の比重は１．００〜１．０５のものが一般
的である。なおこれらの液体培地には、通常、酸素およ
び炭酸ガスを溶存させることが必要であり、細胞の生存
維持は、通常、３０〜４０℃、好ましくは３６〜３７℃
で行う。

さらに、接着依存性細胞を培養する場合に用いる担体粒
子も特に制限があるものではなく、接着依存性細胞の接
着性および増殖性に適したものであればよく、例えばポ
リスチレンなどの合成高分子、タン白質や多糖類などの
天然高分子により表面が形成された粒子を挙げることが
できるが、担体粒子は磁性を有するものであることが便
利であり、これによって磁石を用いて担体粒子の捕集、
移動、処理、その他の取扱いを簡便にかつ迅速に行うこ
とが可能となる。

磁性を有する担体粒子としては、磁性体粉を高分子材料
により結着してなるもの、磁性を有するコアを高分子材
料により被覆してなるものがあり、磁性体の具体例とし
ては、鉄、コバルト、ニッケル、これらの合金、低炭素
鋼、ケイ素鋼、γ−酸化鉄、フェライト、マグネタイト
、その他を挙げることができる。担体粒子の比重は液体
培地の粘性および比重などによっても異なるが、一般的
に１．０〜１．５の範囲内のものとされる。また担体粒
子の粒径は４０〜５００μｍ程度が好ましく、形状は球
形が望ましいが、顆粒状、円筒状などであってもよく、
不定形のものであっても差支えない。

液体培地１ｍｌ当りの浮遊増殖性細胞または接着依存性
細胞の播種量は、一般的にはｌＸ１０４〜１Ｘ１０６個
であり、接着依存性細胞を培養するために使用する担体
粒子の数は、通常、液体培地１ｍｌ当りｌＸ１０４〜１
Ｘ１０７個である。

なお上記条件などにおいて、細胞は液体培地よりも比重
が小さくてもよく、液体培地より比重が小さい細胞は、
重力によらずに浮力によって比重が大きい細胞の場合と
同様に液体培地中において運動し、均一に分散するよう
になる。

［実　施　例］ 次に実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。

実施例１ （１）　　リンパ球の分離 ヘパリンを加えて採血したヒト末梢血１００ｍ１をフィ
コルバークー（Ｐｉｃｏｌｌ　Ｐａｑｕｅ）比重勾配遠
心法により分離し、リン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）にて３
回洗浄した後、液体培地１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧカ
リウムおよび自己の血清６Ｖ／Ｖ％を添加した液体培地
ＲＰＭ１１６４０に浮遊させた。

（２）培　養 第１図の装置の内容量１００ｍ１の培養容器７１に液体
培地ＲＰＭ１１６４０およびリンパ球を導入し、さら＋
：６Ｖ／Ｖ％ヒト血漿、６０Ｕ／ｍ１ｙＩ　Ｌ−２およ
び撹拌促進剤としてバイオシロン（日本インターメッド
社製）沈査１ｍｌを添加して培養容器７１を充満し、３
７℃の条件下で、（１）で分離したリンパ球をｌＸ１０
６個／ｍｌの密度、回転数１５ｒｐｍで培養を行った。

この際、管９１から５Ｖ／Ｖ％二酸炭素で平衡化させた
液体培地ＲＰＭ１１６４０を導入した後、管９１と管９
２を接続して半透膜８０を介して還流させた。また、２
〜３日ごとに培養容器７１内へ６Ｖ／Ｖ％ヒト血漿およ
び３０Ｕ／ｍｌγＩ　Ｌ−２を加え、４〜５日ごとに使
用した液体培地ＲＰＭ１１６４０を全量交換した。培養
は３０日間行い、ＬＡＫ細胞を得た。

（３）殺腫瘍細胞活性の測定 ５１Ｃｒでラベルした腫瘍細胞（Ｔ）ＩＸＩＯ’個と（
２）で得られた培養液を遠心分離して得られたＬＡＫ細
胞（Ｅ）２ｘ１０５個（Ｅ／Ｔ比＝２０：１）を液体培
地ＲＰＭ１１６４０　２００μ２に入れたものをＵ底マ
イクロプレートに加え、３７°Ｃ１５Ｖ／Ｖ％、二酸化
炭素を含む空気中で４時間培養し、放出される５１（：
、の量をオート−γ−シンチカウンターで測定した。そ
して殺腫瘍細胞活性を次式により算出した。

試験放出量−自然放出量 殺腫瘍細胞活性（％）−Ｘ１００ 最大放出量−自然放出量 ここで最大放出量は、ＩＷ／Ｗ％トリトンＸを加えて標
識細胞を溶解した際の５１Ｃｒ放出量であり、自然放出
量はＬＡＫ細胞のかわりに培地のみを加えたときの５１
Ｃｒ放出量であり、試験放出量はＬＡＫ細胞を加えたと
きの５１（：ｒ放出量である。

そして、ＬＡＫ細胞による殺腫瘍細胞活性は、Ｒｏｊｉ
細胞およびＤａｕｄｉ細胞を腫瘍細胞として用いて測定
したところ、培養開始から１週間後には７６％（Ｒｏｊ
ｉ）、７５％（Ｄａｕｄｉ）、３週間後には９０％（Ｒ
ｏ　ｊ　ｉ）　、８６％（Ｄａｕｄｉ）と高値であった
。

［発明の効果］ 本発明の培養方法によれば、細胞を液体培地中に均一に
分散し、常に新鮮な培地と接触することができるため、
細胞の培養を長期間にわたり効率良く行うことができる
。また半透膜の使用により、血清や添加物の使用量の低
減ができ、また抗体のような細胞生産物が培養容器外に
流出しないため、細胞生産物の濃縮が簡単に行うことが
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、本発明を実施するための培養装
置の例を示す概略図である。 ７０・・・・・・・・・底　　板 ７１・・・・・・・・・培養容器 ７２・・・・・・・・・押え機構 ７５・・・・・・・・・回転スリーブ ７６・・・・・・・・・ドライベアリング７７・・・・
・・・・・スタンド ７８・・・・・・・・・外套部材 ８０・・・・・・・・・半透膜 ８１・・・・・・・・・内導管 １７・・・・・・・・・液体培地供給管１８・・・・・
・・・・液体培地排出管２０・・・・・・・・・液体培
地供給タンク２１・・・・・・・・・容　　器 ２２・・・・・・・・・液体培地排出タンク２３・・・
・・・・・・モニター機構 ２４・・・・・・・・・ｐＨセンサー ２５・・・・・・・・・ＤＯセン、サー２６・・・・・
・・・・培養容器

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）液体培地および接着依存性細胞を付着してなる被
   分散粒子もしくは浮遊増殖性細胞より成る混合系を実質
   的に充満するように充填した培養容器を実質上水平な軸
   の周りに回転せしめて、当該混合系を前記培養容器と共
   に回転せしめ、以って前記被分散粒子もしくは浮遊増殖
   性細胞を前記液体培地中に分散せしめる工程を有する細
   胞培養方法において、前記培養容器の少なくとも一部が
   半透膜により構成されていることを特徴とする細胞方法
   。