JP2012205927A - 間葉系幹細胞を含む細胞シート - Google Patents
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Abstract
【解決手段】脂肪組織由来の間葉系幹細胞を培養して間葉系幹細胞シートを作製した。ラットに心筋梗塞を作製し,その4週間後に間葉系幹細胞シートを心臓に移植した。間葉系幹細胞シートは瘢痕化した心筋表面に容易に定着し,in situで徐々に成長し,4週間で厚い層(約600μm)を形成した。成長した移植間葉系組織は,新たに形成された血管,心筋細胞および未分化な間葉系細胞を含んでいた。定着した間葉系幹細胞は,心筋梗塞をもつラットにおいて,瘢痕領域の心筋壁の菲薄化を抑制し,心機能および生存率を改善した。
【選択図】なし
Description
心不全モデル
すべてのプロトコルは,The National Cardiovascular Research Institute, The Animal Care Ethics Committieのガイドラインにしたがって行われた。体重185-220gのラットを用いた。心筋梗塞モデルは左冠動脈の結紮術により作成した。ペントバルビタールナトリウム(30mg/kg)でラットを全身麻酔した後,人工呼吸下に左開胸切開を行い,心臓を露出させた。次に肺動脈円錐と左心房との間,つまり左冠動脈起始部から2-3mmの部位を6-0プロリンで結紮した。シャムコントロール群には,同様の開胸および心臓露出を行ったが,冠動脈結紮は行わなかった。手術後,ラットは標準的な餌および環境で飼育した。
間葉系幹細胞シート移植を施行した心不全ラット(MSC群:n=14),移植を行わない心不全ラット(未治療群:n=14),および移植を行わないシャムコントロールラット(シャム群:n=10)の3群を用意した。左室全体の25%以上の梗塞サイズを有するラットのみを慢性心不全モデルとして用いた。冠動脈結紮術の4週間後,MSC群には瘢痕化した心臓前面に間葉系幹細胞シート移植を行った。他の2群には,移植操作を伴わない開胸術を施行した。冠動脈結紮術の4または8週間後に心カテーテル検査,心エコー,および組織学的評価を行った。
冠動脈結紮術の直後に,各ラットから0.9−1.2gの皮下脂肪組織を右鼡径部から採取した。鋏で脂肪組織を細断し,タイプ1コラゲナーゼ溶液(0.1mg/ml)で37℃の温浴槽で1時間震盪した。メッシュフィルター(Costar 3480)で濾過し,2000rpmで8分間遠心した後,分離した細胞を10%FCSおよび抗生物質を加えたα-MEMに浮遊させた。これを100mmの培養皿に播種し,5%CO2,37℃の湿潤環境で培養した。
培養付着細胞をフローサイトメトリーで分析した。細胞をラットCD34(ICO-115),CD45(OX-1),およびCD90(OX-7)に対するFITC付加マウスモノクローナル抗体とともに4℃で30分間インキュベートした。FITC付加ハムスター抗ラットCD29モノクローナル抗体(Ha2/5)およびウサギ抗ラットc-Kitポリクローナル抗体(C-19)を用いた。コントールとして,同じアイソタイプの抗体を用いた。
ラット脂肪組織由来の間葉系幹細胞を通常のポリスチレン製培養皿またはコラーゲンシート上にコンフルエントになるまで培養した後,レーザーブレードまたはピンセットを用いて培養皿底面から間葉系幹細胞シートとして回収した。
IPAAmモノマー溶液をポリスチレン培養皿上に広げ,電子線(0.25MGy)を照射してIPAAmを表面に不動化させた後,蒸留水ですすぎ,窒素ガス中で乾燥させる。次に,PIPAAmグラフト表面を四角形のガラスカバースリップ(24x24mm)でマスクする。マスクした培養皿表面にアクリルアミド(AAm)モノマー溶液を広げる。次に,培養皿表面を電子線照射し,洗浄する。その結果,各培養皿の矩形領域はPIPAAmでグラフトされ(温度応答性),その周囲はポリAAmでグラフトされる(細胞非接着性)。このPIPAAmでグラフトした表面は37℃の培養条件では疎水性であり,32℃以下で可逆的に親水性となる。したがって,ディッシュ表面に付着した培養細胞は,酵素処理なしで回収される。間葉系幹細胞をこの温度応答性培養皿に播種し,コンフルエントになるまで培養した後,培養温度を37℃から32℃以下に変化させることにより間葉系幹細胞シートを作製することができる。
冠動脈結紮術の4週間後,ラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔し,左開胸下に心臓を注意深く露出させた後,間葉系幹細胞シートをプラスチックシート上からすべらせ,心前面の瘢痕上に置いた。移植20分後に閉胸した。未治療群およびシャム群については,グラフトなしで同じ手術操作を行った。
心エコー検査は,冠動脈結紮術の4および8週間後に行った。7.5MHzトランスデューサを備えた心エコーシステムを用いて,乳頭筋レベルのMモード画像を得た。拡張末期および収縮末期の前・後壁厚,左室拡張末期および収縮末期径,および左室短縮率は,the American Society for Echocardiographyのleading-edge methodにより,3回の連続心サイクルから測定した。左室壁応力は,0.344x左室圧x{左室径/(1+後壁厚/左室径)}(Douglas, P.S. et al. J. Am. Coll. Cardiol. 9, 945-951 (1987))とした。
心カテーテル検査は,冠動脈結紮術の8週間後,2回目の心エコーの後に行った。ペントバルビタールナトリウムで麻酔後,1.5Fのマイクロマノメータカテーテルを,右総頸動脈を通して左心室に進め,圧を測定した。その後,左右心室および肺を切除し,重量を測定した。梗塞のサイズは,既存の手法を用いて(Chien, Y.W et al. Am. J. Physiol. 254, R185-191 (1988)),全左室面積に対する百分率として求めた(各群 n=5)。
心筋の線維化を検出するために,左室心筋(各群n=5)を10%ホルマリンで固定後,パラフィン包埋し,マッソン染色を施行した。また,新たに5匹のラットを用いて,移植された間葉系幹細胞が血管内皮細胞および心筋細胞に分化するか否かを調べた。間葉系幹細胞を赤色蛍光色素(PKH26)で標識し,間葉系幹細胞シートを作製,冠動脈結紮術の4週間後に移植した。移植4週間後に心臓を取り出し,OCTに包埋後,液体窒素中で凍結させ,切片を作成した。蛍光免疫染色は,ポリクローナルウサギ抗フォンビルブラント因子抗体,モノクローナルマウス抗αSMA,抗デスミン,抗ビメンチン,抗トロポニンTおよび抗タイプ1コラーゲン抗体を用いて行った。
冠動脈結紮術の4および8週間後に尾静脈から血液サンプルを採取し,酵素免疫抗体法により血漿ANF濃度を測定した。間葉系幹細胞シートからの血管新生因子産生量を調べるために,培地交換の24時間後に,培養液中のVEGFおよびHGFの濃度を酵素免疫抗体法により測定した。
間葉系幹細胞シート移植が予後に及ぼす影響を調べるために,43匹のラットを無作為に2群に分けた(MSC群,n=21; 未治療群,n=22)。生存率は,冠動脈結紮術の日からラットの死亡または8週間後までを評価した。
データは平均±標準誤差で示した。3群間の多重比較は,一元配置分散分析Newman-Keul検定を施行した。反復を伴う多重比較には,二元配置分散分析とNewman-Keul検定を施行した。2群間の比較はt検定により行った。P値が0.05未満を有意差ありとした。
脂肪組織由来間葉系幹細胞の表面抗原分析
細断した脂肪組織を4日間培養した後,紡錘形の付着細胞が観察された。3−4継代した後,ほとんどの付着細胞はCD29およびCD90を発現していた。これに対し,付着細胞の大部分はCD34およびCD45について陰性であった。わずかの付着細胞がc-Kitを発現していた(図la)。骨髄由来間葉系幹細胞もまた,CD29およびCD90陽性であり,CD34およびCD45は陰性であった(図1b)。これらの結果は,脂肪組織由来の付着細胞(間葉系幹細胞)の特徴が骨髄由来間葉系幹細胞と類似していることを示唆する。
ラット脂肪組織由来の間葉系幹細胞を通常のポリスチレン製培養皿またはコラーゲンシート上にコンフルエントになるまで培養した後,レーザーブレードまたはピンセット等を用いて培養皿底面から間葉系幹細胞シートとして回収した。
脂肪組織由来間葉系幹細胞を温度応答性培養皿でコンフルエントとなるまで3日間培養した。図2は,播種の2日後(a)および第3日(b)における培養間葉系幹細胞を示す。間葉系幹細胞はPIPAAmをグラフトした領域(24x24mm)においてのみ増殖したが,この領域の外では細胞は認められなかった。培養温度を37℃から20℃に下げると,細胞は培養皿底面から容易に剥離し(c),12x12mmの間葉系幹細胞シートとなった(d)。ピペット操作により間葉系幹細胞シートをプラスチックシートに移して広げた。剥がした後,PIPAAm−グラフト表面に細胞は残っていなかった。図中,a−c,スケールバー,100 μm;d,スケールバー,50 mm。
24時間の培養中に,間葉系幹細胞シートは大量の血管新生因子および抗アポトーシス因子,例えば血管内皮成長因子(VEGF=562±70 pg/ml)および肝細胞増殖因子(HGF=834± 54 pg/ml)を培養液中に分泌した。一方,10%FCSを補充した培養液自体にはこれらのいずれも5 pg/ml未満しか含まれていなかった。これらの結果は,間葉系幹細胞自身が内皮細胞に分化する能力によるのみならず,成長因子によるパラクライン効果によっても,シート中で新生血管形成を誘導することを示唆する。移植された細胞の生存率が低いことが細胞移植による心筋再生治療の主要な問題点の1つであることを考慮すると,間葉系幹細胞による新生血管形成が厚みのある組織の構築に寄与していると考えられる。
移植された間葉系幹細胞シートは,前壁の瘢痕領域に良好に定着した(図3)。(a,b)移植された間葉系組織(GFP,緑)およびDNA(DAPI,青)。(c,d)ヘマトキシリン−エオシン染色(a,bの連続切片)。(e)GFP陽性間葉系組織の成長の経時変化。*,第1週におけるGFP陽性間葉系組織の厚さに対して有意差有り(P<0.05)。(f,g)写真は未治療群およびMSC群の心筋組織切片マッソン染色像を示す。成長した間葉系組織中で多数の血管(黒小矢印)および心筋構造(白小矢印)が認められる。(h,i)間葉系幹細胞シートの移植により左室拡大が抑制された。a−d,f,g,x100;h,i,x5。E,心外膜側;I,心内膜側。大きい矢印は移植された間葉系組織の厚さを示す。
移植4週間後,赤色蛍光色素で標識した間葉系幹細胞は,ホスト心筋組織の上に厚い層として確認された(図4)。(a−c)赤く蛍光標識されたMSCが,心外膜側に厚い層として示される。成長した間葉系組織は,フォンビルブラント因子(緑色)およびαSMA(緑色)陽性の多数の血管構造を含んでいた。血管形成に関与しなかった間葉系幹細胞の大部分は,筋線維芽細胞のマーカーであるαSMAが陰性であった。(d,e)成長した間葉系組織中のいくつかの間葉系幹細胞は,心筋マーカーであるトロポニンTおよびデスミンが陽性であった(緑色)。これらの結果は,間葉系幹細胞が間葉系組織中で分化して心筋細胞となったことを示唆する。(f)成長した間葉系組織のほとんどは,未分化な間葉系細胞のマーカーであるビメンチン(緑色)陽性であった。(g)ほとんどの間葉系幹細胞は,タイプ1コラーゲン(緑色)が陰性で,成長した間葉系組織の最外側縁においてのみ検出された。スケールバー,100μm。E,心外膜側;I,心内膜側。大きい矢印は,定着した間葉系組織の厚さを示す。
間葉系幹細胞シートの移植後の心臓の構造および機能を図5に示す。(a−c)心カテーテル検査により得られたパラメータ。(d−f)心エコー所見。(g)血漿中の心房性ナトリウム利尿因子(ANF)濃度。LVEDP,左室拡張末期圧;AWT,前壁厚;LVDD,左室拡張末期径;%FS,左室短縮率。治療前,冠動脈結紮術の4週間後;治療後,移植手術の4週間後(冠動脈結紮術の8週間後)。データは平均±標準誤差で表示。*,シャム群に対して有意差有り(P<0.05);†,未治療群に対して有意差あり(P<0.05);‡,治療前に対して有意差あり(P<0.05)。
心筋特異的トロポニンTの免疫組織学的染色に示されるように,全体的な移植細胞の増殖と比較して心筋への分化はごくわずかであったにもかかわらず,間葉系幹細胞シートの移植により,心機能の顕著な改善が得られた。これらの結果は,梗塞領域の壁の厚さが増加し,これが壁応力の低下につながったためであると考えられる。
キャプラン・マイヤー生存曲線は,冠動脈結紮術後4週間の生存率は未治療群とMSC群との間で有意に相違しないことを示した(図6)。しかし,間葉系幹細胞シートの移植後にラットは死ななかった。
Claims (5)
- 脂肪組織由来の間葉系幹細胞を含み、心外膜面に添付されることを特徴とする、心不全治療材としての移植用の細胞シート。
- 前記心外膜面は、心筋梗塞後の前壁梗塞巣の瘢痕領域であることを特徴とする、請求項1に記載の心不全治療材としての移植用の細胞シート。
- 移植用の細胞シートは、ヒトに対して移植されることを特徴とする、請求項1または2に記載の心不全治療材としての移植用の細胞シート。
- 前記脂肪組織由来の間葉系幹細胞は、疾患を有する前記ヒト自身の脂肪組織から分離されたものであることを特徴とする、請求項3に記載の心不全治療材としての移植用の細胞シート。
- 移植用の細胞シートは、温度応答性培養皿を用いて作製されることを特徴とする、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の心不全治療材としての移植用の細胞シート。
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