JP6685564B2

JP6685564B2 - 高分子化合物およびこれを用いた細胞操作方法

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Publication number: JP6685564B2
Application number: JP2018521777A
Authority: JP
Inventors: 公雄須丸; 高木　俊之; 俊之高木; 敏幸金森; 加奈森下
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2016-06-08
Filing date: 2017-06-08
Publication date: 2020-04-22
Anticipated expiration: 2037-06-08
Also published as: US20200317839A1; JPWO2017213226A1; EP3450471A1; WO2017213226A1; EP3450471B1; EP3450471A4; US11566093B2

Description

本発明は、光照射によって物性が変化する高分子化合物と、この高分子化合物を用いた細胞操作方法に関するものである。

外部からの刺激によって物性が変化する材料の応用が、バイオや医療などの分野で盛んに検討されている。細胞やタンパク質などを扱うバイオデバイスの部材として、水系で物性が大きく変化する材料が求められている。ヒトｉＰＳ由来細胞の活用が本格的に検討され、培養細胞を個別操作するニーズが急速に高まる昨今、μｍスケールの局所作用が可能である光で物性を制御できる材料の有用性は計り知れない。

これまでに、光によって水和性が増加する高分子材料が報告されている。しかしながら、これらの高分子材料は、細胞培養に適さない温度やｐＨで物性が変化するか、物性変化が不十分であった。また、光酸発生基を有し、大きな光物性変化を示す高分子材料の報告もある。しかし、この高分子材料は、水への不溶と可溶を光で制御するまでに至っていない。さらに、この高分子材料は、光開裂反応による低分子成分の遊離や、強い酸発生を伴うなど、細胞系への適用を制限する問題もあった。一方、光によって架橋する材料がフォトリソグラフィなどに活用されている。しかし、この材料の多くは高温加熱処理を要する。

T.Nishi, F.Tabusa, T.Tanaka, T.Shimizu, K.Nakagawa，Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1985，vol.33，No.3，p.1140-1147

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、高温処理が不要で、低分子成分をほとんど遊離させることなく、光照射によって水に不溶な状態から可溶な状態に変化する高分子化合物を提供することを目的とする。

本発明の高分子化合物は、主鎖と側鎖とを有し、側鎖が芳香環を備え、芳香環が、結合していた水素原子がニトロ基で置換された第一炭素原子と、結合していた水素原子がアルデヒド基または下記の化学式（１）で表される官能基で置換された第二炭素原子とを備え、第一炭素原子と第二炭素原子が、同じベンゼン環内で隣り合っている。

本発明の高分子化合物は、下記の化学式（２）で表される。

ただし、Ａは、単結合または官能基であり、Ｒ^１は、アルデヒド基または上記の化学式（１）で表される官能基であり、Ｒ^１とＮＯ_２は、隣り合った炭素原子にそれぞれ結合しており、Ｒ^２は、水素、アルキル基、下記の化学式（３）で表される官能基、および下記の化学式（４）で表される官能基の中から選ばれる少なくとも一種であり（Ｒ^６およびＲ^７は水素、アルキル基、または芳香環であり、Ｒ^８はアルキル基である）、

Ｒ^３およびＲ^４は、水素またはアルキル基であり、Ｇは、ベンゼン環の水素と置換されてもよい３個以下のアルキル基であり、ｗおよびｚは、モル百分率を示し、０＜ｗ≦１００、０≦ｚ＜１００である。

本発明の高分子化合物は、下記の化学式（５）で表される。

ただし、ＡおよびＢは、単結合または官能基であり、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^９は、水素またはアルキル基であり、Ｒ^６およびＲ^７は、水素、アルキル基、または芳香環であり、ｘ、ｙ、およびｚは、モル百分率を示し、０≦ｘ＜１００、０≦ｙ＜１００、０≦ｚ＜１００（ただしｘ＝ｙ＝０を除く）である。

本発明の複合材は、基材と、基材の表面に設けられた本発明の高分子化合物を含有する層とを有する。

本発明の光駆動アクチュエータは、光源と、本発明の複合材とを有する。

本発明の細胞操作方法は、本発明の複合材の高分子化合物を含有する層の表面で細胞を培養する培養工程と、培養工程の後、高分子化合物層の表面の少なくとも一部に光を照射する光照射工程と、光照射工程で光を照射した領域に存在する細胞を除去する除去工程とを有する。

本発明の化合物は、下記の化学式（６）で表される。

本発明の他の化合物は、下記の化学式（７）で表される。

本発明によれば、光照射によって水に不溶な状態から可溶な状態になるなどの物性が変化する高分子化合物が得られる。

本実施形態の高分子化合物の構造変化を示す模式図。本実施形態の高分子化合物の光応答架橋を示す模式図。実施例１４〜実施例２１で用いた本実施形態の高分子化合物の化学式。（ａ）実施例１４の光応答膨潤を説明するための模式図、（ｂ）光応答膨潤後の複合材底面の画像。（ａ）実施例１５の光応答剥離を説明するための模式図、（ｂ）光応答剥離後の複合材底面の画像。（ａ）実施例１６の光応答剥離を説明するための模式図、（ｂ）光応答剥離後の複合材底面の画像。（ａ）実施例１７の光応答剥離を説明するための模式図、（ｂ）光応答剥離後の複合材底面の画像。（ａ）実施例１８の光応答溶解抑制を説明するための模式図、（ｂ）光応答溶解抑制後の複合材底面の画像。（ａ）実施例１９の光応答架橋と架橋体の光応答溶解を説明するための模式図、（ｂ）光応答架橋後の複合材底面の画像、（ｃ）架橋体の光応答溶解後の複合材底面の画像。（ａ）実施例２０の光応答剥離膨潤を説明するための模式図、（ｂ）光応答剥離膨潤後の複合材底面の画像。（ａ）実施例２１の光架橋細胞パターニングを説明するための模式図、（ｂ）光架橋細胞パターニング後の複合材底面の画像。実施例２２〜実施例３３で用いた本実施形態の高分子化合物の化学式。（ａ）実施例２２の光応答溶解を説明するための模式図、（ｂ）光応答溶解後の複合材底面の画像。（ａ）実施例２３の光応答架橋と架橋体の光応答溶解を説明するための模式図、（ｂ）光応答架橋後の複合材底面の画像、（ｃ）架橋体の光応答溶解後の複合材底面の画像。（ａ）実施例２４の光応答剥離膨潤を説明するための模式図、（ｂ）光応答剥離膨潤後の複合材底面の画像。（ａ）実施例２５の光応答剥離を説明するための模式図、（ｂ）光応答剥離後の複合材底面の画像。（ａ）実施例２６の光応答溶解を説明するための模式図、（ｂ）光応答溶解後の複合材底面の画像。（ａ）実施例２７の光応答剥離を説明するための模式図、（ｂ）光応答剥離後の複合材底面の画像。本実施形態の高分子化合物の水溶液の波長７００ｎｍにおける濁度の温度依存性で、（ａ）ポリマー１２に関するグラフ、（ｂ）ポリマー１４に関するグラフ。（ａ）実施例２９の光応答剥離を説明するための模式図、（ｂ）紫外光照射前の複合材底面の画像、（ｃ）紫外光照射中の複合材底面の画像、（ｄ）紫外光照射直後の複合材底面の画像、（ｅ）培地吹付け後の複合材底面の画像。（ａ）実施例３０の光応答剥離を説明するための模式図、（ｂ）紫外光照射前の複合材底面の画像、（ｃ）紫外光照射後の複合材底面の画像。（ａ）実施例３１の光応答剥離を説明するための模式図、（ｂ）紫外光照射前の複合材上のｉＰＳ細胞コロニーの画像、（ｃ）紫外光照射後の複合材上のｉＰＳ細胞コロニーの画像。（ａ）実施例３２の光応答剥離を説明するための模式図、（ｂ）紫外光照射前の複合材上のｉＰＳ細胞コロニーの画像、（ｃ）紫外光照射中の複合材上のｉＰＳ細胞コロニーの画像、（ｄ）紫外光照射直後の複合材上のｉＰＳ細胞コロニーの画像、（ｅ）紫外光照射後に複合材上に培地を吹き付けた後のｉＰＳ細胞コロニーの画像。（ａ）実施例３３の光応答剥離を説明するための模式図、（ｂ）紫外光照射前の複合材上の細胞の画像、（ｃ）紫外光照射後の複合材上の細胞の画像。ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍコート層からの光応答剥離および一般的な酵素的剥離によって回収された細胞の生存率を示すグラフ。ＢＴＢを含むＮＢＡコポリマー水溶液の光応答ｐＨ変化を示す画像で、（ａ）光照射前の水溶液の画像、（ｂ）下半分への光照射後の水溶液の画像、（ｃ）全体への光照射後の水溶液の画像。いくつかのｐＨ条件で測定されたｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍ水溶液の各温度での濁度の光応答性を示すグラフ。いくつかのＮＢＡ導入率条件で測定されたｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍ水溶液の各温度での濁度の光応答性を示すグラフ。０または２０ｍｏｌ％のＮＴＢＡＡｍモノマー成分を含むｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍ（ＮＢＡ導入率：１０ｍｏｌ％）水溶液の各温度での濁度の光応答性を示すグラフ。ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍ溶液の光誘起溶解を示す画像で、（ａ）ｐＨ４．０での画像、（ｂ）ｐＨ５．０での画像、（ｃ）ｐＨ７．４での画像。ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍを介してＰＳ基材表面に固定されたＰＥ微粒子の光選択リリースを示す（ａ）断面模式図、（ｂ）底面画像。ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍを介してＰＳ基材表面に固定された蛍光標識ＢＳＡの光選択リリースを示す（ａ）断面模式図、（ｂ）底面画像。細胞接着阻害表面上のＮＢＡコポリマーコート膜を用いた培養細胞のパターニングと光選択剥離を示す画像で、（ａ）形成された培養パターンの画像、（ｂ）選択的光照射中の画像、（ｃ）表面への培地吹付け後の画像。ＮＢＡコポリマーを用いたひも状細胞組織体の形成過程を示す模式図。部分的に基材表面上に固定されたＨｅｐＧ２細胞からなるひも状組織体の画像。イオノマイシンの培養細胞への作用を説明するための模式図。（ａ）ＮＢＡコポリマーによるイオノマイシンの固定と光リリースを説明するための模式図、（ｂ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞へのパターン照射によって引き起こされた局所的細胞死の画像。

以下、本発明の高分子化合物、複合材、光駆動アクチュエータ、および細胞操作方法について、実施形態と実施例に基づいて説明する。重複説明は適宜省略する。なお、２つの数値の間に「〜」を記載して数値範囲を表す場合、この２つの数値も数値範囲に含まれる。

本発明の実施形態に係る高分子化合物は、主鎖と側鎖とを有し、側鎖が芳香環を備えている。芳香環は、結合していた水素原子がニトロ基で置換された第一炭素原子と、結合していた水素原子がアルデヒド基または下記の化学式（１）で表される官能基で置換された第二炭素原子とを備えている。第一炭素原子と第二炭素原子は、同じベンゼン環内で隣り合っている。

本実施形態の高分子化合物は、光照射によって溶媒溶解性、例えば水溶解性が大きく変化する。このため、操作対象物、例えば細胞を本実施形態の高分子化合物を含有する層の表面に固定したり、操作対象物をこの層の表面から除去したりする操作が、マイクロメータースケールからマクロなスケールまで、光照射によって自在に行える。ヒトｉＰＳ細胞の活用が活発に検討される昨今、培養基材上での有用細胞の選抜や不要細胞の除去などの新規な細胞操作のニーズが急速に高まっている。特に、中性付近での水に対する溶解性を光照射によって制御できる本実施形態の高分子化合物は、このようなニーズに応える材料として極めて有用である。

本実施形態の高分子化合物は、光照射によって溶媒可溶性が発現する。このため、この高分子化合物を含有する層を介して基材に固定された操作対象物を、光とその溶媒を用いて容易に除去できる。また、本実施形態の高分子化合物を用いれば、低分子化合物とは異なり、多くの接着剤と同様に、強い凝集力によって操作対象物を強く接着することが期待できる。光照射によって水に不溶な状態から可溶な状態に変化する本実施形態の高分子化合物は、水を用いる操作ができるため、有機溶媒を用いる操作と比べて環境負荷が小さい。また、光照射によって水系で物性が変化する材料は、細胞培養をはじめとするバイオ系の制御に用いることができる。このため、基材からの細胞剥離を光で作動したり、光で細胞をパターニングしたりするなどの細胞操作が容易となる。

本実施形態の高分子化合物として、下記の化学式（２）で表されるランダム共重合体の高分子化合物が挙げられる。

Ｒ^３およびＲ^４は、水素またはアルキル基であり、Ｇは、ベンゼン環の水素と置換されてもよい３個以下のアルキル基であり、ｗおよびｚは、モル百分率を示し、０＜ｗ≦１００、０≦ｚ＜１００である。なお、この高分子化合物への光照射による溶媒溶解性の変化が失われないのであれば、この高分子化合物は他の成分を含んでいてもよい。

より具体例な本実施形態の高分子化合物として、下記の化学式（５）で表されるランダム共重合体の高分子化合物が挙げられる。

ただし、ＡおよびＢは、単結合または官能基であり、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^９は、水素またはアルキル基であり、Ｒ^６およびＲ^７は、水素、アルキル基、または芳香環であり、ｘ、ｙ、およびｚは、モル百分率を示し、０≦ｘ＜１００、０≦ｙ＜１００、０≦ｚ＜１００（ただしｘ＝ｙ＝０を除く）である。なお、この高分子化合物への光照射による溶媒溶解性の変化が失われないのであれば、この高分子化合物は他の成分を含んでいてもよい。

主鎖とベンゼン環とをつないでいるＡおよびＢの構造には特に制限がない。ＡおよびＢとしては、単結合、またはエステル結合、エーテル結合、アミド結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、ウレタン結合、もしくはアルキレン基を備える官能基が挙げられる。すなわち、主鎖とベンゼン環が、単結合で直接結合されていてもよいし、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、ウレタン結合、またはアルキレン基を介して結合されていてもよいし、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、チオエーテル結合、チオエステル結合、ウレタン結合、またはアルキレン基を備える他の官能基を介して結合されていてもよい。

本実施形態の高分子化合物は、以下の方法で製造できる。まず、メタクリロイルクロリド等の重合性の酸クロリドまたはアルキルクロリドと、水酸基またはアミノ基を有する芳香環を含む化合物を反応させて重合性モノマーを合成する。この化合物は、２−ニトロベンズアルデヒド（以下「ＮＢＡ」と記載することがある）部位またはアセタール保護された２−ニトロベンズアルデヒド（以下「ＡＮＢＡ」と記載することがある）部位も備えている。つぎに、この重合性モノマーを重合または共重合させて、本実施形態の高分子化合物が得られる。

この重合性モノマーとして、下記の化学式（６）で表される化合物または下記の化学式（７）で表される化合物が挙げられる。これらの化合物のように、アセタール化されたアルデヒド基を有する化合物を用いて、本実施形態のＮＢＡまたはＡＮＢＡを含む高分子化合物を製造することが、収率などの点で好ましい。

また、酸クロリドまたはアルキルクロリドを有する反応性高分子と、ＮＢＡ部位またはＡＮＢＡ部位と、水酸基またはアミノ基とを有する芳香環を含む化合物を反応させても、本実施形態の高分子化合物が製造できる。水酸基とＮＢＡを有する化合物は、市販品がそのまま利用できる。アミノ基とＮＢＡを有する化合物は、市販のｐ−トルイジンのニトロ化によりメチル基のオルト位にニトロ基を導入した後、酸化によりメチル基をアルデヒド基に変換して得られる。アミノ基とＮＢＡを有する化合物は、市販の５−アミノ−２−ニトロ安息香酸のアミノ基をアセチル化保護した状態で、カルボキシル基を還元して得ることもできる。

図１は、本実施形態の高分子化合物の構造変化を模式的に示している。ニトロ基が結合している第一炭素原子と、アルデヒド基または上記の化学式（１）で表される官能基が結合している第二炭素原子が、同じベンゼン環内で隣り合っている。このため、水や他の溶媒中で、本実施形態の高分子化合物に波長３００ｎｍ以上４１０ｎｍ以下の光を照射すると、図１に示すように、ＮＢＡは高いプロトン解離能を有する２−ニトロソ安息香酸に変化し、ＡＮＢＡはエチレングリコールのフェニルエステル構造に変化する。

そして、ｐＨが４を超えると、２−ニトロソ安息香酸からプロトンが解離して負電荷を帯びる。こうして、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、もしくはＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドなどのアクリルアミド系モノマーから得られる高分子化合物、またはビニルエーテル系モノマーを（共）重合して得られる高分子化合物などの適度な水和性を有する高分子化合物は、光の照射によって水に不溶な状態から可溶な状態に変化する。

図２は、本実施形態の高分子化合物の光応答架橋を模式的に示している。空気中または貧溶媒中など、固相状態の本実施形態の高分子化合物に光照射した場合、図２に示すように、少なくとも一部のＮＢＡ基またはＡＮＢＡ基から生じるニトロソ基の平衡二量化などによって、高分子間の架橋がもたらされる。このため、固相状態の本実施形態の高分子化合物に光を照射すると溶媒溶解性が低下する。

本発明の実施形態に係る複合材は、基材と、基材の表面に設けられた本実施形態の高分子化合物を含有する層を備えている。本実施形態の複合材は、光の照射によって表面の物性を変化させることができる。より具体的には、複合材の表面に存在する高分子化合物の水などの溶媒への溶解性、または高分子化合物の架橋反応を、光照射によって誘起することができる。複合材の基材側から本実施形態の高分子化合物を含有する層に光を照射できるので、基材は光を透過する材料から構成されていることが好ましい。基材としては、ポリスチレン、ポリメチルペンテン、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー等のプラスチック基板もしくはフィルム、ガラス、石英、シリコーン樹脂、または透析膜などのセルロース系膜材料が挙げられる。

また、本実施形態の高分子化合物と光に応答しない高分子化合物を混合した複合層を、本実施形態の複合材の高分子化合物を含有する層として用いることもできる。この複合層の上にゲルなどからなる層状物をさらに担持した材料では、光を照射する本実施形態の高分子化合物の領域の物性変化に応じて、担持された層状物の剥離の促進と剥離の抑制が制御できる。本実施形態の複合材は、表面の細胞接着性を光の照射によって変化させることが可能である。

したがって、本実施形態の複合材を細胞の培養基材として用いれば、複合材の表面の全部または一部の領域に光を照射することによって細胞接着性が制御でき、培養細胞を選択的に剥離あるいは捕捉するなどの細胞分別操作が可能となる。特に、本実施形態の複合材によれば、接着細胞やコロニーの個別剥離はもちろん、細胞内の特定部位（例えば偽足）のみを剥離することが可能である。このため、本実施形態の高分子化合物は、純化や選択取得を含む細胞の選別操作に加え、個々の細胞接着状態の詳細な解析のための有用かつ強力な実現手段となることが強く期待される。

本発明の実施形態に係る細胞操作方法は、本実施形態の複合材の高分子化合物を含有する層の表面で細胞を培養する培養工程と、培養工程の後、高分子化合物を含有する層の表面の少なくとも一部に光を照射する光照射工程と、光照射工程で光を照射した領域に存在する細胞を除去する除去工程とを備えている。光照射工程では、基材側から光を照射することができる。除去工程では、高分子化合物を含有する層を水に溶かして、培養した細胞の一部を除去することができる。

本実施形態の高分子化合物が乾燥しているときや貧溶媒中に存在するときなど、固相状態の本実施形態の高分子化合物に光照射することによって、溶媒耐性を有する架橋構造が容易に形成される。このため、本実施形態の高分子化合物を含有する層の表面に、架橋ポリマーなどの別の材料をスピンコートで担持させることができる。

本実施形態の高分子化合物の光架橋反応を一部にとどめて光応答基を残存させ、水や他の溶媒中で本実施形態の高分子化合物に光照射して可溶性を誘起させることもできる。このため、本実施形態の高分子化合物を含有する層の上に溶媒中で膨潤するゲルを担持させれば、暗所では高分子化合物を含有する層の表面にゲル層が安定して固定されるが、光照射によって速やかに、高分子化合物を含有する層からゲル層を膨潤剥離させることができる。その際のゲル層の浮き上がりは大きな動きを伴うため、一方向の光駆動アクチュエータとして用いることができる。すなわち、本発明の実施形態に係る光駆動アクチュエータは、光源と、本実施形態の複合材を備えている。

以下の実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。また、特記しない限り、比は質量比を、％は質量％をそれぞれ意味する。

実施例１：化合物１の合成（下記反応式（Ｉ））

５−ヒドロキシ−２−ニトロベンズアルデヒド（１当量）、エチレングリコール（１．５当量）、およびp−トルエンスルホン酸・一水和物（触媒量）のベンゼン懸濁液を、ディーン・スターク装置を用いて数時間加熱還流した。冷後、減圧下で溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラム（メルク７７３４、酢酸エチル：ヘキサン＝１：４〜３：７（容量比））にて分離精製した。化合物１を８０〜９５％の収率で得た。なお、非特許文献１記載の方法によっても化合物１が合成できる。

実施例２：化合物２の合成（下記反応式（II））

メタクリロイルクロリド（１当量）、化合物１（１．１当量）、およびトリエチルアミン（１．２当量）のジクロロメタン溶液を、室温で数時間から一昼夜撹拌した後、反応液を希塩酸にて処理した。その後、ジクロロメタンで抽出し、濃縮した残渣をシリカゲルカラム（メルク７７３４、酢酸エチル：ヘキサン＝３：７（容量比））にて精製した。化合物２（上記の化学式（６）で表される化合物）を９０％以上の収率で得た。
¹H-NMR (CDCl₃): 8.02 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.57 (1H, d, J = 2.6 Hz), 7.29 (1H, dd, J = 8.8, 2.6 Hz), 6.54 (1H, s), 6.39 (1H, m), 5.84 (1H, m), 4.04 (4H, m), 2.07 (3H, dd, J = 1.5, 1.0 Hz)

実施例３：化合物３の合成（下記反応式（III））

化合物２、メタクリル酸メチル、およびアゾイソブチロニトリルの無水テトラヒドロフラン溶液を、窒素気流下、６５℃で一昼夜撹拌した。冷後、エーテルに滴下して生じた析出物を濾取した。テトラヒドロフラン−エーテル溶液を用いて再沈殿させ化合物３を得た。具体的には、化合物２：メタクリル酸メチル：アゾイソブチロニトリルが、約５０：５０：１〜２（モル比）になるように秤量した後、重合反応および精製により化合物３を６０〜７０％の収率で得た。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、化合物３の組成比ｙ：ｚを４９：５１と概算した。
¹H-NMR (d-acetone): 8.04 (1H, bs), 7.58 (1H, bs), 7.45 (1H, bs), 6.42 (1H, bs), 3.97 (4H, m, OCH₂OCH₂O), 3.65 (3H, m), 2.67-1.71 (4H, m), 1.71-0.77 (6H, m)

実施例４：化合物４の合成（下記反応式（IV））

化合物３のクロロホルム溶液に希塩酸または濃塩酸を加え、４０〜７０℃で数時間から数日間撹拌した。濃縮後、エーテルに滴下して生じた析出物を濾取した。テトラヒドロフラン−エーテル溶液を用いて再沈殿させ化合物４を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）スペクトルで、アルデヒド基を保護していたアセタールに由来する３．９７ｐｐｍおよび６．４２ｐｐｍのピークが消失したこと、ならびにアルデヒド基に由来する１０．３６ｐｐｍのピークが出現したことから、化合物４の生成を確認した。また、本実施例における化合物４の組成比ｘ：ｙ：ｚは、ニトロベンズアルデヒド基の芳香環に由来する７〜８ｐｐｍおよび１０ｐｐｍ付近のピークの積分値と、メトキシ基に由来する３．６ｐｐｍ付近のピークの積分値から、ｘ：ｙ：ｚ＝４９：０：５１と概算した。

実施例５：化合物５の合成（下記反応式（Ｖ））

化合物２、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、およびアゾイソブチロニトリルの無水テトラヒドロフラン溶液を、窒素気流下、６５℃で一昼夜撹拌した。冷後、エーテルに滴下して生じた析出物を濾取した。テトラヒドロフラン−エーテル溶液を用いて再沈殿させ化合物５を得た。具体的には、化合物２：Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド：アゾイソブチロニトリルが、約１０：９０：１（モル比）になるように秤量した後、重合反応および精製により化合物５を５１％の収率で得た。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、化合物５の組成比ｙ：ｚを１４：８６と概算した。
¹H-NMR (CDCl₃): 7.97 (1H, bs), 7.47 (1H, bs), 7.23 (1H, bs), 6.39 (1H, bs), 4.02 (4H, bs, OCH₂CH₂O), 3.25-0.86 (60H, m)

実施例６：化合物６の合成（下記反応式（VI））

化合物５のクロロホルムまたはテトラヒドロフラン溶液に濃塩酸を加え、６０℃で数時間〜数日間撹拌した。エーテル希釈により生じた析出物を、テトラヒドロフラン−エーテルを用いて再沈殿させ化合物６を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）スペクトルで、アルデヒド基を保護していたアセタールに由来する４ｐｐｍ付近のピークと、アルデヒド基に由来する１０ｐｐｍ付近のピークの積分値より、化合物６の組成比ｘ：ｙ：ｚを３２：１１：５７と算出した。

実施例７：化合物７の合成（下記反応式（VII））

氷冷した３−クロロプロピルアミンの塩酸塩（１．５当量）およびトリエチルアミン（３当量）の無水ジクロロメタン溶液に、メタクリロイルクロリド（１当量）の無水ジクロロメタン溶液を窒素気流下で滴下し、室温にて一昼夜撹拌した。希塩酸処理後、ジクロロメタン抽出を行い、濃縮により得た残渣をシリカゲルカラム（メルク７７３４、酢酸エチル：ヘキサン＝３：２（容量比））にて精製した。化合物７を５０〜６０％の収率で得た。
¹H-NMR (CDCl₃): 6.08 (1H, bs), 5.69 (1H, bs), 5.34 (1H, bs), 3.61 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.46 (2H, dt, J = 6.0, 6.6 Hz), 2.05 (2H, tt, J = 6.6, 6.3 Hz), 1.97 (3H, bs)

実施例８：化合物８の合成（下記反応式（VIII））

化合物７（１．１当量）、化合物１（１当量）、および無水炭酸カリウム（１．２当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液を、１２０℃で数時間撹拌した後、氷水で処理した。エーテル抽出後、濃縮により得た残渣をシリカゲルカラム（メルク７７３４、酢酸エチル：ヘキサン＝９：１（容量比））にて精製した。化合物８（上記の化学式（７）で表される化合物）を５０〜６０％の収率で得た。
¹H-NMR (CDCl₃): 8.03 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.29 (1H, d, J = 2.8 Hz), 6.91 (1H, dd, J = 9.0, 2.8 Hz), 6.55 (1H, s), 6.12 (1H, bs), 5.70 (1H, bs), 5.35 (1H, m), 4.15 (2H, t, J = 5.9 Hz), 4.05 (4H, m), 3.54 (2H, m), 2.10 (2H, m), 1.98 (3H, bs)

実施例９：化合物９の合成（下記反応式（IX））

化合物８：Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド：アゾイソブチロニトリルが２５：７５：１（モル比）で含まれる無水テトラヒドロフラン溶液を、窒素気流下、６５℃で一昼夜撹拌した。冷後、エーテルに滴下することで生じた析出物を濾取した。テトラヒドロフラン−エーテル溶液を用いて再沈殿させ化合物９を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）スペクトルで、化合物８に由来する６〜８ｐｐｍのピークと、１〜４ｐｐｍに出現するその他のピークの積分値から、化合物９の組成比ｙ：ｚを２２：７８と概算した。

実施例１０：化合物１０の合成（下記反応式（X））

化合物９のクロロホルム溶液に希塩酸を加え、６０℃で３日間撹拌した。エーテル希釈により生じた析出物を、テトラヒドロフラン−エーテルを用いて再沈殿させ化合物１０を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）スペクトルで、アルデヒド基を保護しているアセタールに由来する４ｐｐｍのピークと、芳香族およびＮＨ基に由来する７〜８ｐｐｍのピークの積分値から、化合物１０の組成比ｘ：ｙ：ｚを１７：５：７８と概算した。

実施例１１：化合物１１の合成（下記反応式（XI））

化合物８：Ｎ−イソプロピルアクリルアミド：アゾイソブチロニトリルが２５：７５：１（モル比）で含まれる無水テトラヒドロフラン溶液を、窒素気流下、６５℃で一昼夜撹拌した。冷後、エーテルに滴下することで生じた析出物を濾取した。テトラヒドロフラン−エーテル溶液を用いて再沈殿させ化合物１１を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）スペクトルで、化合物８の芳香族に由来する７〜８ｐｐｍのピークと、１〜４ｐｐｍに出現するその他のピークの積分値から、化合物１１の組成比ｙ：ｚを２５：７５と概算した。化合物１１の組成比は、原料の仕込み比とほぼ一致していた。

実施例１２：化合物１２の合成（下記反応式（XII））

化合物１１のクロロホルム溶液に希塩酸を加え、６０℃で３日間撹拌した。エーテル希釈により生じた析出物を、テトラヒドロフラン−エーテルを用いて再沈殿させ化合物１２を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）スペクトルで、アルデヒド基を保護しているアセタールに由来する４ｐｐｍのピークが消失したことから、化合物１２の組成比ｘ：ｙ：ｚを２５：０：７５と概算した。すなわち、化合物１２は、化合物１１のアセタール保護されたアルデヒド基のほとんどが、アルデヒド基に変化した化合物であった。

実施例１３：化合物１３の合成（下記反応式（XIII））

塩化メタクリロイド（１．１当量）、５−ヒドロキシ−２−ニトロベンズアルデヒド（１当量）、およびトリエチルアミン（１．２当量）の無水ジクロロメタン溶液を、一昼夜撹拌後、反応液を希塩酸で処理した。ジクロロメタン抽出後、濃縮により得た残渣をシリカゲルカラム（メルク７７３４、酢酸エチル：ヘキサン＝３：７（容量比））で精製した。化合物１３を８７％以上の収率で得た。
¹H-NMR（CDCl₃）: 10.45 (1H, s), 8.22 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.71 (1H, d, J = 2.6 Hz), 7.55 (1H, dd, J = 8.8, 2.6 Hz), 6.41 (1H, s), 5.88 (1H, m), 2.08 (3H, dd, J = 1.4, 1.0 Hz)

実施例１４：化合物４（ｘ＝３３、ｙ＝１６、ｚ＝５１）の光応答膨潤
実施例４と同様の方法で、図３に示すポリマー１（化合物４でｘ＝３３、ｙ＝１６、ｚ＝５１）を調製した。親水処理化ポリスチレン基板上に、ポリマー１の２％2,2,2-trifluoroethanol（ＴＦＥ）溶液をスピンコートし、８５℃で１時間加熱して複合材を得た。この複合材をｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に浸漬した状態で、図４（ａ）に示すように、ポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光を所定パターンのドット状にポリマー１に１０秒間照射すると、直ちに光を照射した領域のポリマー１が膨潤した。図４（ｂ）は、光応答膨潤後に、倒立顕微鏡で複合材を底面から観察した画像である。

実施例１５：化合物４（ｘ＝４９、ｙ＝０、ｚ＝５１）の光応答剥離
ポリアクリル酸（ＰＡＡｃ）の０．０５％メタノール溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２時間加熱して、ＰＡＡｃ修飾ポリスチレン基材を調製した。また、実施例４と同様の方法で、図３に示すポリマー２（化合物４でｘ＝４９、ｙ＝０、ｚ＝５１）を調製した。2,2,2,3,3,3-hexafluoroisopropanol（ＨＦＩＰ）とＴＦＥの混合溶媒にポリマー２を０．２％溶解させた溶液をこの基材上にスピンコートし、８５℃で３０分間加熱して複合材を得た。この複合材を０．０５ｍＮ水酸化ナトリウム水溶液に浸漬した状態で、図５（ａ）に示すように、ポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度６６ｍＷ／ｃｍ^２の光を所定パターンのドット状にポリマー２に３０秒間照射した。その後、複合材の表面をピペッティングすると、光を照射した領域からポリマー２が剥離した。

実施例１６：化合物４（ｘ＝０、ｙ＝４９、ｚ＝５１）の光応答剥離
ＰＡＡｃの０．１％メタノール溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２時間加熱して、ＰＡＡｃ修飾ポリスチレン基材を調製した。また、実施例４と同様の方法で、図３に示すポリマー３（化合物４でｘ＝０、ｙ＝４９、ｚ＝５１）を調製した。ＨＦＩＰ７７％とＴＦＥ２３％の混合溶媒にポリマー３を０．４１％溶解させた溶液をこの基材上にスピンコートし、８５℃で２時間加熱して複合材を得た。この複合材をｐＨ７．４のＰＢＳに浸漬した状態で、図６（ａ）に示すように、ポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光を所定パターンのドット状にポリマー３に２分間照射した。その後、複合材の表面をピペッティングすると、光を照射した領域からポリマー３が剥離した。

実施例１７：化合物４（ｘ＝０、ｙ＝４９、ｚ＝５１）と部分加水分解ＰＭＭＡの複合層からのヒドロキシプロピルセルロースゲル層の光応答剥離
図３に示すポリマー３の２％ＴＦＥ溶液と、部分加水分解ＰＭＭＡの０．２％ＴＦＥ溶液を１：５で混合した混合溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートして、ポリマー３と部分加水分解ＰＭＭＡの複合層を表面に備える複合材を得た。ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を２％、tetramethoxymethyl glycoluril（ＴＭＭＧＵ）を０．０１５％、Ｈ_２ＳＯ_４を３ｍｍｏｌ／ｋｇを含むメタノール溶液を、この複合材の複合層にスピンコートし、８５℃で２時間加熱することによって架橋ＨＰＣ層を形成した。

図７（ａ）に示すように、架橋ＨＰＣ層を形成したこの材料のポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度６６ｍＷ／ｃｍ^２の光を所定パターンの反転ドット状に複合層に４分間照射した。その後、エタノールと水を７:３で混合した混合液にこの材料を浸漬すると、光を照射しなかったドット状の領域では架橋ＨＰＣ層が複合層から自発的に剥離した。これに対して、光を照射した反転ドット状の領域では、架橋ＨＰＣ層の複合層からの剥離が抑制された。

実施例１８：化合物６（ｘ＝０、ｙ＝２０、ｚ＝８０）の光応答溶解抑制
実施例６と同様の方法で、図３に示すポリマー４（化合物６でｘ＝０、ｙ＝２０、ｚ＝８０）を調製した。ポリスチレン基板上に、ポリマー４の１％ＴＦＥ溶液をスピンコートし、８５℃で３０分間加熱して複合材を得た。図８（ａ）に示すように、空気中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度６６ｍＷ／ｃｍ^２の光を所定パターンのドット状にポリマー４に３０秒間照射した。その後、エタノールと水を７:３で混合した混合液に複合材を浸漬した。光を照射しなかった領域では、ポリマー４が混合液に溶解して複合材から除去されたのに対して、光を照射した領域では、ポリマー４の架橋反応によって混合液への溶解が抑制され、複合材にポリマー４の架橋物が残存した。

実施例１９：化合物６（ｘ＝０、ｙ＝１４、ｚ＝８６）の光応答架橋と架橋体の光応答溶解
実施例６と同様の方法で、図３に示すポリマー５（化合物６でｘ＝０、ｙ＝１４、ｚ＝８６）を調製した。ポリスチレン基板上に、ポリマー５の１％ＴＦＥ溶液をスピンコートして複合材を得た。図９（ａ）に示すように、空気中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度６６ｍＷ／ｃｍ^２の光を所定パターンのドット状にポリマー５に２０秒間照射した。

その後、エタノールと水を７:３で混合した混合液に複合材を浸漬すると、光を照射しなかった領域では、ポリマー５が混合液に溶解して複合材から除去されたのに対して、光を照射した領域では、ポリマー５の架橋反応によって混合液への溶解が抑制され、複合材にポリマー５の架橋物が残存した。さらに、波長３６０〜４４０ｎｍ、強度４００ｍＷ／ｃｍ^２の光を所定パターンのドット状の局所のポリマー５に１分間照射した。その結果、追加の光を照射した局所領域では、ポリマー５の架橋物が混合液に溶解して複合材から除去された。

実施例２０：化合物６（ｘ＝３２、ｙ＝１１、ｚ＝５７）の光応答剥離膨潤
ＰＡＡｃの０．０５％メタノール溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２時間加熱して、ＰＡＡｃ修飾ポリスチレン基材を調製した。また、実施例６と同様の方法で、図３に示すポリマー６（化合物６でｘ＝３２、ｙ＝１１、ｚ＝５７）を調製した。ポリマー６の０．５％ＴＦＥ溶液をこの基材上にスピンコートして複合材を得た。この複合材を５ｍＮのＮａＯＨ水溶液に浸漬した状態で、図１０（ａ）に示すように、ポリスチレン基板側から、波長３６０〜４４０ｎｍ、強度４００ｍＷ／ｃｍ^２の光を所定パターンのドット状にポリマー６に１０秒間照射した。光を照射した領域ではポリマー６がＰＡＡｃ層から直ちに剥離膨潤した。

実施例２１：化合物６（ｘ＝０、ｙ＝２３、ｚ＝７７）の光架橋細胞パターニング
実施例６と同様の方法で、図３に示すポリマー７（化合物６でｘ＝０、ｙ＝２３、ｚ＝７７）を調製した。また、ＨＰＣを０.２％、ＴＭＭＧＵを０．００１５％、Ｈ_２ＳＯ_４を０．５ｍｍｏｌ／ｋｇそれぞれ含むメタノール溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２時間加熱して細胞接着阻害性の架橋ＨＰＣ層を形成し、ＨＰＣゲル修飾ポリスチレン基材を調製した。さらに、ＴＦＥとｎ−ブタノールを７:３で混合した混合溶媒にポリマー７を０．７％溶解した溶液を、この架橋ＨＰＣ層上にスピンコートして複合材を得た。

図１１（ａ）に示すように、空気中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光を所定パターンのドット状にポリマー７に１分間照射した。エタノールと水を７:３で混合した混合液を、複合材の表面に吹き付けて２分間静置し、軽く揺すってからこの混合液を吸引除去した。その後、複合材を水で２回洗浄したところ、光を照射しなかった領域では架橋ＨＰＣ層からポリマー７が除去された。一方、光を照射した領域では、ポリマー７の架橋物が架橋ＨＰＣ層上に残存した。そして、培地に分散させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を複合材に播種し、翌日まで培養したところ、光を照射した領域に残存していたポリマー７の架橋物の表面に細胞が接着した。

実施例２２：化合物１０（ｘ＝１７、ｙ＝５、ｚ＝７８）の光応答溶解
実施例１０と同様の方法で、図１２に示すポリマー９（化合物１０でｘ＝１７、ｙ＝５、ｚ＝７８）を調製した。ポリスチレン基板上に、ポリマー９の１％ＴＦＥ溶液をスピンコートし、８５℃で２時間加熱して複合材を得た。図１３（ａ）に示すように、培地中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光を所定パターンのドット状にポリマー９に２秒間照射すると、光を照射した領域のポリマー９が培地に溶解した。

実施例２３：化合物１０（ｘ＝１７、ｙ＝５、ｚ＝７８）の光応答架橋と架橋体の光応答溶解
図１２に示すポリマー９の１％ＴＦＥ溶液を、組織培養用ポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で１５分間加熱して複合材を得た。図１４（ａ）に示すように、空気中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度６６ｍＷ／ｃｍ^２の光を所定パターンのドット状にポリマー９に５秒間照射して、水でリンスした。その後、複合材をｐＨ７．４のＰＢＳに浸漬したところ、光を照射しなかった領域ではポリマー９が徐々にＰＢＳに溶解した。一方、光を照射した領域では、ポリマー９の架橋物がポリスチレン基板上に残存した。さらに、ＰＢＳ中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光を、残存したポリマー９の一部（長方形状）に１秒間照射すると、光を照射した領域のポリマー９はＰＢＳに溶解した。

実施例２４：化合物１０（ｘ＝１７、ｙ＝５、ｚ＝７８）からのＨＰＣ層の光応答剥離膨潤
図１２に示すポリマー９の１％ＴＦＥ溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２時間加熱して複合材を得た。この複合材のポリマー９の層の表面全体に、波長３６５ｎｍ、強度２８ｍＷ／ｃｍ^２の光を１０秒間照射し、水でリンスした後に乾燥した。さらに、ＨＰＣを３．６％、ＴＭＭＧＵを０．０４４％、Ｈ_２ＳＯ_４を４．４ｍｍｏｌ／ｋｇそれぞれ含むメタノール溶液を、複合材のポリマー９の層にスピンコートし、８５℃で２時間加熱することによって架橋ＨＰＣ層を形成した。図１５（ａ）に示すように、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で複合材のポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光を所定パターンの六角形状にポリマー９に５秒間照射した。光を照射した領域ではポリマー９がポリスチレン基板から直ちに剥離膨潤した。

実施例２５：化合物１０（ｘ＝１７、ｙ＝５、ｚ＝７８）からの細胞の光応答剥離
図１２に示すポリマー９の１％ＴＦＥ溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２時間加熱して複合材を得た。培地に分散させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞をこの複合材に播種した。半日培養したところ、図１６（ａ）に示すように、ポリマー９の層の表面全面に細胞が接着伸展した。複合材のポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光を局所的にポリマー９に１分間照射したところ、光を照射した領域では伸展していた細胞が丸く変化した。１時間後、複合材の表面全体に培地を軽く吹き付けると、光を照射した領域では細胞がポリマー９から剥離した。

実施例２６：化合物１２（ｘ＝２５、ｙ＝０、ｚ＝７５）の光応答溶解
実施例１２と同様の方法で、図１２に示すポリマー１１（化合物１２でｘ＝２５、ｙ＝０、ｚ＝７５）を調製した。ポリマー１１を１．５％含むＴＦＥ溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２．５時間加熱して複合材を得た。図１７（ａ）に示すように、ＰＢＳ中でこの複合材のポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光を、所定パターンのドット状にポリマー１１に２秒間照射すると、光を照射した領域のポリマー１１はＰＢＳに溶解した。

実施例２７：化合物１２（ｘ＝２５、ｙ＝０、ｚ＝７５）と細胞の光応答剥離
ポリマー１１を１．５％含むＴＦＥ溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２．５時間加熱して複合材を得た。培地に分散させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞をこの複合材に播種した。半日培養したところ、図１８（ａ）に示すように、ポリマー１１の層の表面全面に細胞が接着伸展した。複合材のポリスチレン基板側から、波長３６５ｎｍ、強度６６ｍＷ／ｃｍ^２の光を、局所的な長方形状にポリマー１１に１０秒間照射した。３０分後、複合材の表面全体に培地を軽く吹き付けると、光を照射した領域では、細胞とポリマー１１が一体となった状態でポリスチレン基板から剥離した。

実施例２８：化合物１２（ｘ＝１０、ｙ＝０、ｚ＝９０とｘ＝４、ｙ＝０、ｚ＝９６）水溶液の濁度の温度依存性
実施例１２と同様の方法で、図１２に示すポリマー１２（化合物１２でｘ＝１０、ｙ＝０、ｚ＝９０）とポリマー１４（化合物１２でｘ＝４、ｙ＝０、ｚ＝９６）を調製した。ポリマー１２とポリマー１４をそれぞれ０．０１％含む２種類のリン酸緩衝水溶液（いずれもｐＨ７．４１）を調製した。これら２種類の水溶液の波長７００ｎｍにおける濁度（光路長１ｃｍ）の温度依存性を、波長３６５ｎｍの紫外光の照射前後で測定した。なお、紫外光照射後の各水溶液は、十分量の紫外光を照射したものである。その結果を図１９に示す。紫外光照射前の濁度を■で、紫外光照射後の濁度を●で表している。

紫外光照射前のポリマー１２の水溶液およびポリマー１４の水溶液の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は、それぞれ１０℃および２０℃であった。なお、ＬＣＳＴは、その温度以下でポリマーが水溶するときの温度である。一方、紫外光照射後のポリマー１２の水溶液およびポリマー１４の水溶液では、測定した６０℃以下の温度範囲においてＬＣＳＴが観察されなかった。このことから、ｐＨ７．４１において、ポリマー１２は少なくとも１０℃以上６０℃以下の範囲で、ポリマー１４は少なくとも２０℃以上６０℃以下の範囲で、紫外光照射によって水に不溶な状態から水に可溶な状態に変化することが確認できた。

実施例２９：化合物１２（ｘ＝１０、ｙ＝０、ｚ＝９０）と細胞の光応答剥離
ポリマー１２を０．９％含むＴＦＥ溶液８８％とｎ−ＢｕＯＨ１２％の混合溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２時間加熱して複合材を得た。この複合材を３７℃の水に１時間浸漬した後、培地に分散させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞をこの複合材に播種した。半日培養したところ、図２０（ａ）に示すように、ポリマー１２の層の表面全体で細胞が接着伸展した。

そして、複合材上の一部の細胞に、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光をポリスチレン基板側から３秒間照射した。その直後に複合材の表面全体に培地を軽く吹き付けると、光を照射した領域のみの接着伸展していた細胞が、ポリマー１２と一体となった状態でポリスチレン基板から剥離し回収できた。同様の条件で多数の細胞を回収し、トリパンブルーで染色したところ、光を照射した領域から回収した細胞の９８％が生存していた。

実施例３０：化合物１２（ｘ＝１０、ｙ＝０、ｚ＝９０）とｐＮＩＰＡＡｍの複合層からの細胞の光応答剥離
ポリマー１２を０．９１％、および無修飾Poly(N-isopropylacrylamide)（ｐＮＩＰＡＡｍ）を０．３６％含むＴＦＥ溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２．５時間加熱して、ポリマー１２とｐＮＩＰＡＡｍの複合層を表面に備える複合材を得た。ＭＤＣＫ細胞を培地に分散してこの複合材に播種した。半日培養したところ、図２１（ａ）に示すように、この複合層の表面全体で細胞が接着伸展した。複合材上の細胞の一部の領域に、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光をポリスチレン基板側から３秒間照射した。光を照射した領域では複合層が培地に溶解し、溶解した複合層上に接着伸展していた細胞が個別に剥離した。本発明の高分子化合物を用いて細胞１個単位で操作できることが実証された。

実施例３１：化合物１２（ｘ＝１０、ｙ＝０、ｚ＝９０）とｐＮＩＰＡＡｍの複合層と細胞コロニーの光応答剥離
ポリマー１２を１．５％、および無修飾ｐＮＩＰＡＡｍを０．４４％含むＴＦＥ溶液９１％とｎ−ＢｕＯＨ９％の混合溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２時間加熱して、ポリマー１２とｐＮＩＰＡＡｍの複合層を表面に備える複合材を得た。室温に保った状態で、この複合材の表面に膜調整剤（コーニング社、マトリゲル）をコートし、さらにヒトｉＰＳ細胞の集塊を播種した。

２日間培養したところ、複合材の表面全体でヒトｉＰＳ細胞のコロニーが接着伸展した。コロニーの一つが接着していた複合層の領域に、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光をポリスチレン基板側から３秒間照射した。図２２（ａ）に示すように、光を照射した領域では、複合層がポリスチレン基板から剥離し、接着伸展していたコロニーが顕著に収縮した。

実施例３２：化合物１２（ｘ＝７、ｙ＝０、ｚ＝９３）と細胞コロニーの光応答剥離
実施例１２と同様の方法で、図１２に示すポリマー１３（化合物１２でｘ＝７、ｙ＝０、ｚ＝９３）を調製した。ポリマー１３の０．８８％ＴＦＥ溶液をポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２．５時間加熱して複合材を得た。室温に保った状態で、この複合材の表面に膜調整剤（コーニング社、マトリゲル）をコートし、さらにヒトｉＰＳ細胞の集塊を播種した。

６日間培養したところ、複合材の表面全体でヒトｉＰＳ細胞のコロニーが接着伸展した。コロニーの一つが接着していたポリマー１３の領域に、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光をポリスチレン基板側から３秒間照射した。図２３（ａ）に示すように、光を照射した領域では、ポリマー１３の層がポリスチレン基板から剥離し、接着伸展していたコロニーが顕著に収縮した。さらに、複合材の表面に培地を軽く吹き付けると、接着伸展していたコロニーとポリマー１３が一体となった状態で、ポリスチレン基板から分離・除去された。

実施例３３：化合物１２（ｘ＝１０、ｙ＝０、ｚ＝９０）とｐＮＩＰＡＡｍの複合層からの細胞内特定部位の選択的な光応答剥離
ポリマー１２を０．８１％、および無修飾ｐＮＩＰＡＡｍを０．５６％含むＴＦＥ溶液を、ポリスチレン基板にスピンコートし、８５℃で２．５時間加熱して、ポリマー１２とｐＮＩＰＡＡｍの複合層を表面に備える複合材を得た。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を培地に分散してこの複合材に播種した。半日培養したところ、図２４（ａ）に示すように、この複合層の表面全体で細胞が接着伸展した。いくつかの細胞の偽足先端が存在していた複合層の領域に、波長３６５ｎｍ、強度１２０ｍＷ／ｃｍ^２の光をポリスチレン基板側から３秒間照射した。光を照射した領域の複合層の表面のみから偽足の先端が外れ、偽足が収縮した。本発明の高分子化合物を用いて個別細胞の特定部位を独立して操作できることが実証された。

実施例３４：化合物１５および化合物１６の合成（下記反応式（XIV））

適度に疎水的なモノマー成分として、ＮＢＡ基を有する重合性モノマーである化合物１４を用いて、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＮＴＢＡＡｍ）を含むＮＢＡポリマー（化合物１５および化合物１６）を、以下の通り合成した。まず、化合物１４：Ｎ−イソプロピルアクリルアミド：Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド：アゾイソブチロニトリルを下記の表１に記載した原料モル比（ｘ：ｙ：ｚ：ＡＩＢＮ）で含む無水テトラヒドロフラン溶液を、窒素気流下、６５℃で一昼夜撹拌した。冷後、エーテルに滴下することで生じた析出物をテトラヒドロフラン−エーテル溶液を用いて再沈殿させ、化合物１５を得た。

化合物１５の組成比は、^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）スペクトルで、６〜８ｐｐｍ付近に出現する芳香族、ＮＨ基、およびベンジル位の水素原子に由来するピークと、１〜４ｐｐｍ付近に出現するその他のピークの積分値より概算した。なお、実施例３４−６では、化合物１５の組成比は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのイソプロピル基のメチン水素ピーク（４ｐｐｍ）を基準に概算した。

化合物１５のクロロホルム、テトラヒドロフラン、または１，４−ジオキサン溶液に塩酸を加え、６０℃で３日間撹拌した。エーテル希釈により生じた析出物を、テトラヒドロフラン−エーテルによって再沈殿して化合物１６を得た。化合物１６の脱保護化率は、^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３またはＣＤ_３ＣＯＣＤ_３）スペクトルで、４ｐｐｍに出現するアルデヒド基を保護しているアセタールに由来するピークの消失、および７〜８ｐｐｍ付近に出現する芳香族由来のピークが単一であることを確認した場合は１００％とした。一方、４ｐｐｍに出現するアルデヒド基を保護しているアセタールに由来するピークの残存、および７〜８ｐｐｍ付近に出現する芳香族由来のピークを２種類確認した場合は、１１ｐｐｍ付近に出現するアルデヒド基由来のピークを基準に化合物１６の脱保護化率を概算した。

実施例３５：ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍコート層からの光応答剥離によって回収された細胞の生存率
エーテル基を介してＮＢＡ基を導入率４ｍｏｌ％で修飾したｐＮＩＰＡＡｍ（図１２の化合物１４。以下、エーテル基を介してＮＢＡ基を導入したｐＮＩＰＡＡｍを「ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍ」ということがある）を基板にコートした。そのコート層にＮＩＨ／３Ｔ３細胞を播種し、３７℃で２日間培養した。そして、基板の底面側から、中心波長３６５ｎｍ、強度４０ｍＷ／ｃｍ^２の光を１０秒間照射し、表面に培地を軽く吹き付けることによって細胞を回収した。１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液で、単細胞にまで分散した後、トリパンブルーで染色した。染色細胞と非染色細胞の個数をカウントして、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の生存率を９６％と見積もった（図２５のグラフの左）。

また、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン−０．５３ｍＭのＥＤＴＡ溶液を通常の培養ディッシュに３７℃で２分間作用させた後に回収したＮＩＨ／３Ｔ３細胞について、同様の方法で生存率を見積もったところ９８％だった（図２５のグラフの右）。ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍの光応答溶解によって剥離された細胞の生存率は、一般的な酵素的剥離によって回収された細胞の生存率とほとんど差がないことがわかった。

実施例３６：ＮＢＡコポリマー水溶液の光応答ｐＨ変化
光路長１ｃｍの四面透過光学セル（キュベット）内で、ＮＢＡ基の導入率が１０ｍｏｌ％のｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍの０．０１％水溶液に微量のＢＴＢを加えた。約１％の０．０１ＮのＮａＯＨ水溶液をさらに添加して、図２６（ａ）に示すような弱塩基性の青色水溶液を調製した。そして、キュベット内の水溶液の下半分に中心波長３６５ｎｍの紫外光を照射した。図２６（ｂ）に示すように、光照射された領域で速やかに黄色に変化した。

さらに、水溶液全体に光照射したところ、図２６（ｃ）に示すように、キュベット内全体が黄色に変化した。つまり、光照射によって水溶液のｐＨ低下が引き起こされた。この結果から、ポリマー側鎖のＮＢＡ基の光反応によって、弱酸であるｏ−ニトロソ安息香酸基が生成してプロトンを放出しｐＨが低下したこと、およびこのプロトン放出によってポリマーがイオン化したことがわかった。

実施例３７：光応答脱水和特性のｐＨ依存性
ＮＢＡ基の導入率が１０ｍｏｌ％のｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍの１％水溶液と、各種ｐＨの緩衝液または塩酸水溶液とを、ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍの０．０１％水溶液となるようにキュベット内で混合した。この水溶液の温度を０℃から６０℃まで徐々に上昇させながら、波長７００ｎｍの光の吸光度が０となる水溶液の光学密度を測定して濁度とした。その後、再び水溶液を０℃に冷却し、スペクトル変化が飽和するまで、中心波長３６５ｎｍの紫外光を水溶液に照射した。そして、再び水溶液の温度を徐々に上昇させながら、各温度での水溶液の濁度を測定した。この結果を図２７に示す。

図２７に示すように、ｐＨ１．７〜７．４では、紫外光照射前の水溶液の転移温度（１１〜１５℃）が、ｐＮＩＰＡＡｍホモポリマー水溶液の転移温度３１℃よりかなり低かった。なお、転移温度が高いほど、ポリマーの溶解性が高い。この結果から、ＮＢＡの導入によって、ｐＮＩＰＡＡｍの溶解性が低下することがわかった。一方、紫外光照射後の水溶液では、ｐＨ７．４の水溶液の転移温度が６０℃以下で観察されなかった。これに対して、ｐＨ４．０の水溶液の転移温度は３３℃付近に、ｐＨ１．７の水溶液の転移温度は２１℃付近にそれぞれ観察された。この結果から、ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍへの光照射によって、弱酸であるｏ−ニトロソ安息香酸が生成したことが示された。

実施例３８：光応答脱水和特性のＮＢＡ導入率依存
実施例３７と同様にして、ＮＢＡ基の導入率が０ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、および１０ｍｏｌ％の４種類のｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍを０．０１％含むｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液の７００ｎｍにおける濁度を０℃から６０℃で測定した。その結果を図２８に示す。図２８に示すように、ＮＢＡ基の導入率の増加にともなって、紫外光照射前の水溶液の転移温度が低下した。つまり、ＮＢＡ基の導入率の増加にともなって、ポリマーの溶解性が低くなった。一方、紫外光照射後の転移温度は、ＮＢＡ基の導入率の増加にともなって著しく上昇した。

実施例３９：光応答脱水和特性のＮＴＢＡＡｍ導入率依存
実施例３７と同様にして、ＮＢＡ基の導入率が１０ｍｏｌ％のｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍで、ＮＴＢＡＡｍを含まないｐＮＩＰＡＡｍの０．０１％リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）、およびＮＴＢＡＡｍを２０ｍｏｌ％含むｐＮＩＰＡＡｍの０．０１％リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）の７００ｎｍにおける濁度を０℃から６０℃で測定した。その結果を図２９に示す。図２９に示すように、ＮＴＢＡＡｍを含むｐＮＩＰＡＡｍ水溶液の紫外光照射前の転移温度は、ＮＴＢＡＡｍを含まないｐＮＩＰＡＡｍ水溶液の紫外光照射前の転移温度より低下した。つまり、ＮＴＢＡＡｍの導入により、ｐＮＩＰＡＡｍポリマーの暗所安定性が高くなった。一方、紫外光照射後の転移温度は、ＮＴＢＡＡｍの有無に関わらず著しく上昇した。

実施例４０：ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍコート膜の光応答溶解
ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、およびｐＨ７．４の各ｐＨ緩衝液（２５℃）中で、ＮＢＡ基の導入率が１０ｍｏｌ％のｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍをコートした層に、直径１００μｍの微小水玉模様のパターンに沿って紫外光を照射し、光応答溶解特性を観察した。その結果を図３０に示す。図３０（ａ）に示すように、ｐＨ４．０では十分量の紫外光を照射してもポリマー膜が溶解しなかった。図３０（ｂ）および図３０（ｃ）に示すように、ｐＨ５．０およびｐＨ７．４では、紫外光照射に応答してポリマー膜が速やかに溶解した。なお、このｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍコート膜は、３７℃、ｐＨ７．４の緩衝溶液に浸漬した状態で１ヶ月間不溶状態保った。その後、このｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍコート膜に光照射を行うと、鋭敏に溶解することが観察された。

実施例４１：ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍに固定されたポリエチレン微粒子の光リリース制御
ＮＢＡ基の導入率が１０ｍｏｌ％のｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍのＴＦＥ溶液に微量のポリエチレン微粒子を分散させた分散液をポリスチレン基材にキャストした。ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍを介してポリエチレン微粒子がポリスチレン基材表面に固定された試料を得た。顕微鏡で観察しながら、ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液中で、所定の微粒子凝集体が存在する領域に、波長３６５ｎｍの光を基材底面から照射した。ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍが溶解して、光が照射された微粒子のみが選択的に浮上することが観察された。この結果を図３１に示す。この結果から、手操作で基材から剥離できないような微小物体を、光制御で基材から剥離できることが実証された。

実施例４２：ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍに固定化された蛍光標識ウシ血清アルブミンの光リリース制御
ＮＢＡ基の導入率が７ｍｏｌ％のｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍをポリスチレン基材上にコートした。ローダミンで蛍光標識されたウシ血清アルブミン（ＲＢＳＡ）のリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）をこのｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍ膜上に載せた。そして、３７℃で３０分間静置して、ｐＮＢＡＮＩＰＡＡｍの薄層を介して、ＲＢＳＡが基材表面に固定された試料を得た。基材底面側からこの試料に微小の文字パターンの光を照射して、照射前後の蛍光分布を共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。図３２（ａ）は、ＲＢＳＡが光リリースされる様子を模式的に示している。図３２（ｂ）は、光照射前（左）と光照射後（右）のそれぞれの蛍光分布像である。図３２（ｂ）に示すように、光照射域のみから蛍光が消失した。すなわち、基材表面に固定されたＲＢＳＡが、局所光照射によって選択的に基材表面からリリースされた。

実施例４３：細胞接着阻害表面上のＮＢＡコポリマーコート膜を用いた培養細胞のパターニングと光選択剥離
５ｍｏｌ％のメタクリル酸を含むｐＮＩＰＡＡｍを０．２０％、および両末端にグリシジル基を有するポリエチレングリコールを０．０３９％含む塩基性メタノール溶液をポリスチレン基材表面にスピンコートした。そして、８０℃で２時間加熱することにより、細胞接着阻害表面を作製した。１０ｍｏｌ％のＮＢＡ基および２０ｍｏｌ％のＮＴＢＡＡｍを含むＮＩＰＡＡｍを１．３％、ならびに無修飾ｐＮＩＰＡＡｍを０．２３％含むＴＦＥ溶液をこの細胞接着阻害表面にスピンコートし、８５℃で１．５時間加熱した。

その後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝水溶液を載せ、ドットパターンの反転パターンに沿って波長３６５ｎｍ、強度３０ｍＷ／ｃｍ^２の光を６秒間照射して、光照射域のブレンドポリマーを溶解し、ドットパターン状のブレンドポリマー層を得た。ＭＤＣＫ細胞を培地に分散した分散液をこのブレンドポリマー層上に播種し、半日培養した。この結果を図３３に示す。

図３３（ａ）に示すように、ドットパターン状のブレンドポリマー層上のみで細胞が接着伸展していることを確認した。そして、図３３（ｂ）に示すように、これらのドット領域の特定の約半数の箇所（横方向のストライプ状）に、波長３６５ｎｍ、強度３０ｍＷ／ｃｍ^２の光を４０秒間照射した。その後、表面に培地を軽く吹き付けると、図３３（ｃ）に示すように、光照射されたストライプ状のドット領域のみから、細胞が選択的に剥離した。この結果から、光操作によって、細胞のパターニングと、細胞の選択的な剥離回収がそこからできることが実証された。

実施例４４：ＮＢＡコポリマーを用いたひも状細胞組織体の形成
肝実質細胞やそれに由来する株化細胞の培養系を用いて、薬物等の肝代謝や肝毒性を評価する試みがなされている。しかし、一般的な培養方法では肝特異的機能がほとんど発現しないことが問題になっている。このため、機能低下を改善する手法として、細胞同士が凝集した組織体としての培養が検討されている。しかし、細胞集塊内部への酸素や栄養分の供給の難しさが課題となっている。そこで、組織体と基材の隙間を培地が流れる構造として、培養基材上に固定されたひも状の組織体構造を、ＮＢＡ修飾ポリマーの光特性を応用して構築することを試みた。この構造の形成過程を図３４に模式的に示す。

まず、ヒドロキシプロピルセルロースを０．３０％、両末端にカルボキシル基を有するポリエチレングリコールを０．０４２％含む酸性メタノール溶液をポリスチレン基材表面にスピンコートした。そして、これを８５℃で３時間加熱して、細胞接着阻害表面を作製した。その後、１５ｍｏｌ％のＮＢＡ基と２０ｍｏｌ％のＮＴＢＡＡｍを含むｐＮＩＰＡＡｍの１．６％ＴＦＥ溶液をこの細胞接着阻害表面にスピンコートした。これを８５℃で１時間加熱した後、フィブロネクチンコートした。

ｐＨ７．４のリン酸緩衝水溶液中で、このフィブロネクチンコートにストライプ状のパターンで光照射して、光照射域から光応答ポリマー層を溶解除去した。そこにヒト肝実質細胞由来の株化細胞であるＨｅｐＧ２細胞を播種して、ストライプ状に残存した光応答ポリマー層上にパターン状に接着させた。２日間培養後、局所光照射によってＨｅｐＧ２細胞が接着した光応答ポリマー層の一部を残して基材表面から剥離し、基材から浮き上がったひも状の組織体が形成できることを確認した。この画像を図３５に示す。

実施例４５：ＮＢＡコポリマーを用いた培養機材からの光応答イオノマイシン供給
細胞培養系において、カルシウムイオンがｍＭオーダーの濃度で培地に含まれる。しかし、細胞膜に存在するカルシウムイオンポンプの働きによって、細胞培養系の細胞内では、カルシウムイオンがｎＭオーダーの非常に低い濃度に保たれている。細胞培養系の細胞にイオノマイシンを添加すると、イオノマイシンが細胞膜に取り込まれて細胞膜のカルシウム透過を誘起する。細胞膜のカルシウム透過が著しい場合には、細胞死が引き起こされる。この機構を図３６に模式的に示す。

生理活性を有する化合物の光放出制御技術の例として、イオノマイシンを安定に固定化し、かつ任意のタイミングで任意の箇所に供給できる基材を調製した。１０ｍｏｌ％のＮＢＡ基と５０ｍｏｌ％のＮＴＢＡＡｍを含むｐＮＩＰＡＡｍと、イオノマイシンを含むＴＦＥ溶液を、ポリスチレン基材表面にスピンコートした。この上にＮＩＨ／３Ｔ３細胞を播種し、半日培養した。その後、通常培地中で波長３６５ｎｍの紫外光を局所照射すると、その照射領域のみで細胞死が引き起こされた。イオノマイシンの固定と光リリースの機構を図３７（ａ）に模式的に示す。また、この局所的細胞死を示す画像を図３７（ｂ）に示す。

一方、光照射前に通常培地からカルシウムイオンを含まない培地に置換した場合には、光照射後に細胞死が誘起されなかった。この結果は、光照射によって引き起こされた細胞死が、イオノマイシンによってもたらされた細胞へのカルシウムイオンの流入であることを示している。また、ＮＴＢＡＡｍ含有量が２０ｍｏｌ％のポリマーを用いた場合では、ポリマーのイオノマイシンの保持が不十分だった。このため、暗所でも、イオノマイシンがポリマーから培養系に放出され、細胞が全体的にダメージを受けることが観察された。さらに、ＮＢＡ基のモノマー成分以外のモノマーがＮＴＢＡＡｍであるポリマーを用いた場合では、光照射によってもイオノマイシンは放出されず、細胞のダメージが誘起されなかった。

Claims

主鎖と側鎖とを有する高分子化合物であって、
前記側鎖が芳香環を備え、
前記芳香環が、結合していた水素原子がニトロ基で置換された第一炭素原子と、結合していた水素原子がアルデヒド基または下記の化学式（１）で表される官能基で置換された第二炭素原子とを備え、
前記第一炭素原子と前記第二炭素原子が、同じベンゼン環内で隣り合っている高分子化合物。
請求項１において、
下記の化学式（２）で表される高分子化合物。

ただし、Ａは、単結合または官能基であり、
Ｒ^１は、アルデヒド基または上記の化学式（１）で表される官能基であり、
Ｒ^１とＮＯ_２は、隣り合った炭素原子にそれぞれ結合しており、
Ｒ^２は、水素、アルキル基、下記の化学式（３）で表される官能基、および下記の化学式（４）で表される官能基の中から選ばれる少なくとも一種であり（Ｒ^６およびＲ^７は水素、アルキル基、または芳香環であり、Ｒ^８はアルキル基である）、

Ｒ^３およびＲ^４は、水素またはアルキル基であり、
Ｇは、ベンゼン環の水素と置換されてもよい３個以下のアルキル基であり、
ｗおよびｚは、モル百分率を示し、０＜ｗ≦１００、０≦ｚ＜１００である。
下記の化学式（５）で表される高分子化合物。

ただし、ＡおよびＢは、単結合または官能基であり、
Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^９は、水素またはアルキル基であり、
Ｒ^６およびＲ^７は、水素、アルキル基、または芳香環であり、
ｘ、ｙ、およびｚは、モル百分率を示し、０≦ｘ＜１００、０≦ｙ＜１００、０≦ｚ＜１００（ただしｘ＝ｙ＝０を除く）である。
基材と、前記基材の表面に設けられた請求項１から３のいずれかに記載の高分子化合物を含有する層とを有する複合材。
光源と、請求項４に記載の複合材とを有する光駆動アクチュエータ。
請求項４に記載の複合材の前記高分子化合物を含有する層の表面で細胞を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記高分子化合物を含有する層の表面の少なくとも一部の領域に光を照射する光照射工程と、
前記光照射工程で光を照射した領域に存在する細胞を除去する除去工程と、
を有する細胞操作方法。
請求項６において、
前記除去工程で、前記高分子化合物を含有する層の一部を水に溶かして、前記培養した細胞の一部を除去する細胞操作方法。
下記の化学式（６）で表される化合物。
下記の化学式（７）で表される化合物。