WO2007040118A1 - 感熱応答性高分子を用いた穴パタン付き膜を有するチップ及びその製造方法 - Google Patents

感熱応答性高分子を用いた穴パタン付き膜を有するチップ及びその製造方法 Download PDF

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Eiichi Tamiya
Yoshiyuki Yokoyama
Satoshi Fujiki
Katsumi Tanino
Atsushi Muraguchi
Hiroyuki Kishi
Yoshiharu Tokimitsu
Shohei Yamamura
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Toyama Prefecture
Nissan Chemical Industries, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a chip having a film having a hole pattern using a thermosensitive polymer on a substrate surface and a method for manufacturing the same.
  • PNIPAAm Poly (N-isopropylacrylamide)
  • NIPAAm N-isopropylacrylamide
  • NIPAAm is easily polymerized with a radical initiator to give PNIPAAm.
  • NIPAAm is also known to copolymerize with other functional monomers, and the resulting polymer responds not only to temperature changes but also to various stimuli such as light, electric field, pH change, and solvent exchange.
  • thermosensitive polymer is used as a material for fixing a biological material (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-102466 (Patent Document 1), Japanese Patent Laid-Open No. No. 23876 (Patent Document 2)).
  • PNIPAAm coating film is very soluble in water and polar organic solvents. Therefore, when the PNIPAAm coating film is used to fix the biological material such as cells, the part that has come into contact with the water will be gradually dissolved. In addition, if a PNIPAAm coating film is applied to the upper layer of the PNIPAAm coating layer to finely process the PNIPAAm coating film, the PNIPA Am dissolves in the resist solvent and the two layers mix.
  • an object of the present invention is to arbitrarily change the size of the hole of the hole pattern, so that when the cells are scattered and collected, the holes are easy to enter and exit from the holes during washing or antigen stimulation. It is an object of the present invention to provide a chip that is useful for applications such as a new cell having a mechanism and a structure that are difficult to get out of the structure.
  • the cross-linked product of the temperature-responsive polymer has an N-alkyl (meth) acrylamide having a repeating unit represented by the general formula (1) and a weight average molecular weight of 500 to 5,000,000.
  • Cross-linked product of copolymer and cross-linking agent has an N-alkyl (meth) acrylamide having a repeating unit represented by the general formula (1) and a weight average molecular weight of 500 to 5,000,000.
  • R and R may be the same or different.
  • R represents a hydrogen atom or a methyl group
  • the hole size of the hole pattern is such that the diameter of the inscribed circle is in the range of 10 nm to 1000 ⁇ m
  • the hole of the hole pattern has dots formed on the substrate surface in which the temperature-responsive polymer cross-linked product is independent of the film, [1] to [9] The chip according to crab.
  • the film temperature of the chip according to any one of [1] to [9] is controlled so that the diameter of the hole of the hole pattern included in the chip is a temperature at which a biological material can be stored.
  • the biological material is stored in the hole of the hole pattern, and then
  • a method for encapsulating a biological material in a hole pattern of a chip comprising controlling a membrane temperature of the chip to a temperature for enclosing the biological material with a diameter of a hole storing the biological material.
  • the film temperature of the chip enclosing the biological material by the method described in [12] is controlled so that the hole diameter of the hole pattern possessed by the chip is a temperature at which the biological material can be released.
  • a method for releasing a biological material included in a chip is controlled so that the hole diameter of the hole pattern possessed by the chip is a temperature at which the biological material can be released.
  • a method for producing a chip comprising a cross-linked product of a temperature-responsive polymer as a constituent component and a film having a hole pattern on a substrate surface
  • a composition containing a crosslinkable temperature responsive polymer, a crosslinkable temperature responsive polymer and a crosslinker, or a composition comprising a temperature responsive polymer and a crosslinker is applied to the substrate surface.
  • a coating film To form a coating film,
  • composition containing the crosslinkable temperature-responsive polymer and crosslinking agent or the composition containing the temperature-responsive polymer and crosslinking agent has a repeating unit represented by the general formula (1).
  • an N-alkyl (meth) acrylamide copolymer having a weight average molecular weight of 500 to 5,000,000 and a crosslinking agent
  • R and R may be the same or different.
  • R represents a hydrogen atom or a methyl group
  • (meth) acrylamide represents both methacrylamide and acrylamide.
  • a method for producing a chip comprising a cross-linked product of a temperature-responsive polymer as a constituent component and having a film having a hole pattern on a substrate surface
  • a coating film is formed by applying a composition containing
  • the application of the composition to the substrate includes a step of dissolving the composition in a solvent, a step of dropping the obtained solution onto the substrate, and a step of evaporating the solvent to obtain a coating film.
  • the hole pattern is formed on the coating film by a photolithography method.
  • the hole pattern is formed in the coating film by a photolithography method.
  • the composition for forming a coating film further contains an acid generator, and after forming the coating film, a mask for forming a hole pattern is formed on the coating film.
  • the coating film of the irradiated part is crosslinked, and after removing the mask, the coating film of the uncrosslinked part is removed.
  • the hole pattern is formed on the coating film by a screen printing method, an ink jet method, a contact printing method, or an embossing method.
  • the manufacturing method according to any one of [14] to [18]
  • the formation of hole patterns in the coating film by the screen printing method, ink jet method, contact printing method or embossing method involves forming a hole pattern in the coating film before crosslinking and then forming a hole pattern.
  • the hydrocarbon structure having a functional group capable of cross-linking with the cross-linking agent has a (meth) acrylate structure or a (meth) acrylamide structure having a functional group cross-linkable with the cross-linking agent in the side chain.
  • (meth) acrylate represents both meta acrylate and acrylate.
  • the crosslinking agent is a compound having two or more epoxy-based crosslinking agents, melamine-based crosslinking agents, glycoluril-based crosslinking agents, hydroxyl groups, carboxyl groups, azide groups or butyl ether groups. [15] to [26 ], The manufacturing method according to any one of the above.
  • Compounds having two or more hydroxyl, carboxyl, azide or vinyl ether groups are 1,2-dihydroxynaphthalene, 1,3-dihydroxynaphthalene, 1, 4 --Dihydroxynaphthalene, 1,5 dihydroxynaphthalene, 1,6 dihydroxynaphthalene, 1,7 dihydroxynaphthalene, 1,8 dihydroxynaphthalene, 2,3 dihydroxynaphthalene, 2,6 dihydroxynaphthalene, 2,7 dihydroxynaphthalene, 1, 3 Chiral pentanediol, 2,6 quinolinediol, 2,3 dihydroxyquinoxaline, 1,4 dioxanediol, 1,4-cyclohexanedimethanol, polyvinyl alcohol, 1,2 naphthalene dicarboxylic acid, 1,3 naphthalene dicarboxylic acid Acid, 1, 4 naphthalene dicarboxylic acid, 1, 5 naphthalene dicarboxylic acid, 1,
  • a mechanism and structure that uses a heat-responsive material to prevent cells from coming out of the hole during washing or antigen stimulation when the cells are scattered and collected, or when the cells are easily washed in and out. It is possible to provide a chip for a new cell or the like having
  • the chip of the present invention comprises a film having a temperature-responsive polymer cross-linked product as a constituent component and a hole pattern on the surface of the substrate, and this chip manufacturing method mainly forms a coating film. Also, the three process forces of coating film cross-linking and hole pattern formation are provided.
  • the coating film is formed by (1) a composition containing a cross-linkable temperature-responsive polymer, a cross-linkable temperature-responsive polymer and a cross-linking agent, or a temperature-responsive polymer. And a composition containing a crosslinking agent and a composition containing a monomer for forming a temperature-responsive polymer capable of crosslinking (2).
  • a coating film is formed by coating a substrate, a composition containing a crosslinkable temperature-responsive polymer-forming monomer and a crosslinking agent, or a composition containing a temperature-responsive polymer-forming monomer and a crosslinking agent on the substrate surface. And a method (a method according to claim 16).
  • the method (1) is a method using a temperature-responsive polymer
  • the method (2) is a method using a monomer for forming a temperature-responsive polymer.
  • a composition containing a temperature-responsive polymer is prepared in advance, and a film is obtained by performing a crosslinking reaction after forming a coating film.
  • a composition containing a temperature-responsive polymer-forming monomer is applied on a substrate, and a film is obtained by performing a polymerization reaction and a crosslinking reaction to obtain a temperature-responsive polymer. Is obtained.
  • the method (1) is preferred in that a large amount of composition can be synthesized and adjusted in a separate container. Moreover, it is preferable also at the point which can form a coating film easily and can form a fine hole.
  • compositions containing a cross-linkable temperature-responsive polymer (b) a composition containing a cross-linkable temperature-responsive polymer and a cross-linking agent, or (c) a temperature response A composition containing a temperature-responsive polymer of any one of the compositions comprising a polymer and a crosslinking agent is used.
  • the temperature-responsive polymer is a crosslinkable polymer, and the crosslinking after the coating film is formed is performed using a crosslinkable group of the temperature-responsive polymer. In this case, the polymer chains are directly crosslinked with each other.
  • the temperature-responsive polymer is a crosslinkable polymer and contains a crosslinking agent.
  • the temperature-responsive polymer is a polymer that does not have a crosslinkable group, but contains a crosslinking agent, so that the crosslinking after the formation of the coating film is performed by the crosslinking agent. In this case, a crosslink is formed through the chain of the crosslinker.
  • Cross-linking via the chain of the cross-linking agent rather than direct cross-linking of the polymer chains results in the inter-polymer chain force being connected by the flexible cross-linking agent chain, and the temperature response after cross-linking From these viewpoints (volume change during swelling and shrinkage, response speed), it is more preferable.
  • the temperature-responsive polymer having a functional group capable of reacting with a cross-linking agent is a copolymer of a site exhibiting temperature responsiveness and a site having a functional group capable of reacting with the cross-linking agent. But it can.
  • the temperature-responsive polymer that can be cross-linked between cross-linkable groups has a site that exhibits temperature responsiveness and a cross-linkable group in which the cross-linkable groups of the polymer chain can cross-link each other. It can be a copolymer with the site.
  • the temperature-responsive polymer may be a homopolymer that has a force only at a site that exhibits temperature-responsiveness, or a copolymer with another monomer. But you can do it.
  • the crosslinking agent that can be used include a crosslinking agent having two or more radical generating groups. Due to its high reactivity, the radical generating group of the cross-linking agent can bind the cross-linking agent itself to any part of the covalent bond constituting the temperature-responsive polymer.
  • radical generating groups include azide groups
  • crosslinking agents include 2,6-bis (azidobenzylidene) cyclohexanone and 4,4′-diazidostilbene 2,2 ′ disodium disulphonate. .
  • the copolymer of the site exhibiting temperature responsiveness and the site having a functional group capable of reacting with a crosslinking agent has a repeating unit represented by the general formula (1) and has a weight average molecular weight of 5 N alkyl (meth) acrylamide copolymers that are 00 to 5,000,000 can be.
  • the weight average molecular weight of the N alkyl (meth) acrylamide copolymer is preferably in the range of 5,000-100,000 from the viewpoint of the viscosity of the coating solution and the swelling performance after crosslinking.
  • R and R may be the same or different hydrogen atoms or
  • R represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R is It represents a hydrocarbon structure having a functional group capable of crosslinking with the crosslinking agent.
  • the alkyl group having 1 to 4 carbon atoms is, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, or a butyl group.
  • the x component is the chemical structure that controls the temperature response
  • the y component is the chemical structure that controls the crosslinking reaction.
  • the range of 0.6 ⁇ x is preferable because the temperature responsiveness can be sufficiently maintained. Further, the range of 0.05 ⁇ y is preferable because sufficient crosslinking density (solvent resistance) can be obtained. Furthermore, it is preferable that 0.6 ⁇ x ⁇ 0.95 and 0.05 ⁇ y ⁇ 0.4 from the viewpoint of maintaining a temperature responsiveness and obtaining a sufficient crosslink density.
  • (meth) acrylamide represents both methacrylamide and acrylamide.
  • the structure of the site that exhibits temperature responsiveness is not particularly limited, but from the viewpoint of temperature response performance (volume change during swelling / shrinkage, response speed), N contained in general formula (1) —Alkyl (meth) acrylamide structure is preferred, and N-isopropylacrylamide structure is more preferred. In addition, since it can be easily copolymerized with other functional monomers, it can be changed to respond to various stimuli such as light, electric field, pH change, solvent exchange, and antigen-antibody recognition. (Meth) acrylamide structure is preferred.
  • the specific structure of the temperature responsiveness includes, for example, N-isopropyl (meth) acrylamide, N-ethyl (meth) acrylamide, N-normalpropyl (meth) atrylamide, N-cyclo Propyl (meth) acrylamide, N, N-Jetyl (meth) acrylamide, N-Atarylloyl biperidine, N-Ataryllopyrrolidine, N-Buylisobutyl amide, 2-carboxyisopropyl (meth) acrylamide, Polyethylene Examples include (meth) acrylamide having a side chain with xoxide, and (meth) acrylate having a side chain with polyethylene oxide. Since the temperature-responsive polymer using the above structure has a temperature (lower critical temperature; LCST) that causes an intrinsic phase transition, the structure to be used can be selected according to the desired transition temperature.
  • LCST lower critical temperature
  • the structure of the site having a functional group capable of reacting with the cross-linking agent includes a reactive group (carboxyl group, epoxy group, amino group, succinimide group, etc.) capable of reacting with the cross-linking agent in the side chain (meta). It can be an attalylate structure or a (meth) acrylamide structure. Concrete structure and , (Meth) acrylic acid, glycidyl (meth) acrylate, glycidyl (meth) acrylamide, (meth) acrylic acid succinimide ester, ⁇ -hydroxy acid (meth) acrylate, ⁇ -hydroxy acid (meth) acrylamide, Examples include 2-carboxyisopropyl (meth) acrylamide.
  • the molar fraction in the polymer of the site having a functional group capable of reacting with the cross-linking agent can be appropriately determined in consideration of the cross-linking density and swelling degree of the polymer film, for example, in the range of 1 to 50 mol%. be able to.
  • a temperature-responsive polymer having a functional group capable of reacting with a cross-linking agent a reactive group (hydroxyl group, carboxyl group, amino group, epoxy group, etc.) capable of reacting with the cross-linking agent is incorporated in the chemical structure.
  • the temperature-responsive polymer originally possessed by can be used as a homopolymer without being copolymerized.
  • polypeptide Examples include Poly (VPGVG) (where V represents parin, P represents proline, and G represents glycine), polyethylene oxide having a hydroxyl group at the terminal, and the like. Since the above temperature-responsive polymer has a temperature (lower critical temperature; LCST) that causes an intrinsic phase transition, the polymer to be used can be selected according to the desired transition temperature.
  • LCST lower critical temperature
  • elastin, Poly (VPGVG), and cellulosic polymers which are temperature-responsive polymers derived from living bodies, are preferable from the viewpoint of biocompatibility when used as a nanochip.
  • the crosslinking agent can be, for example, an epoxy crosslinking agent, a melamine crosslinking agent, a glycoluril crosslinking agent, a compound having two or more hydroxyl groups, carboxy groups, azide groups, or vinyl ether groups.
  • Epoxy crosslinking agents include, for example, trimethylolpropane triglycidyl ether, 1,2-cyclohexanedicarboxylic acid diglycidyl ester, 1,2-naphthalenedicarboxylic acid diglycidyl ester, 1,3 naphthalenedicarboxylic acid diglycidyl ester 1, 4 naphthalene dicarboxylic acid diglycidyl ester, 1, 5 naphthalene dicarboxylic acid diglycidyl ester, 1, 6 naphthalene dicarboxylic acid diglycidyl ester, 1, 7 naphthalene dicarboxylic acid diglycidyl ester, 1, 8 naphthalene dicarboxylic acid diglycidyl ester Ester, 2, 3 Naphthalenedicarboxylic acid diglycidyl ester, 2, 6 Naphthalenedicarboxylic acid diglycidyl ester, 2, 7 Naphthalenedicarboxylic acid
  • the melamine-based crosslinking agent can be, for example, hexamethoxymethyl melamine, hexaethoxymethyl melamine, or hexapropoxymethyl melamine.
  • the glycoluril-based crosslinking agent is, for example, 1, 3, 4, 6-tetrakis (methoxymethyl) glycolyl, 1, 3, 4, 6-tetrakis (ethoxymethyl) glycolyl, or 1, 3, 4, 6 — Can be tetrax (propoxymethyl) glycolyl.
  • Compounds having two or more hydroxyl groups, carboxyl groups, azide groups or butyl ether groups are, for example, 1,2 dihydroxynaphthalene, 1,3 dihydroxynaphthalene, 1,4-dihydroxynaphthalene, 1,5 dihydroxy.
  • the content of the crosslinking agent is appropriately determined in consideration of the crosslinking density and swelling degree of the temperature-responsive polymer film. For example, it can be in the range of 0.5 to 50 parts by weight per 100 parts by weight of the temperature-responsive polymer.
  • a transparent 'non-fluorescent cross-linking agent is more preferable for light having a wavelength of 400 nm and 600 nm because it does not interfere with optical microscope observation and fluorescence observation.
  • water can be used as a coating solvent, which is preferable from the viewpoint of environmental load than using an organic solvent. It is also preferable because it can be applied on a substrate with low solvent resistance.
  • the method (1) [method using a composition containing a temperature-responsive polymer] has been described above
  • the method (2) [composition containing a monomer for forming a temperature-responsive polymer]
  • the monomer for forming a temperature-responsive polymer used in the method using a product can be a monomer including each structure described as a constituent of the polymer.
  • monomers containing a site that exhibits temperature responsiveness include N-isopropyl (meth) acrylamide monomer, N-ethyl (meth) acrylamide monomer, N-normal propyl (meth) acrylamide monomer, N- Cyclopropyl (meth) acrylamide monomer, N, N-Jetyl (meth) acrylamide monomer, N-Atariloylbiperidine monomer, N-Ataryllopyrrolidine monomer, N-vinylisobutyramide monomer, 2-Carboxyisopropyl (meth) Examples thereof include acrylamide monomers and (meth) acrylate monomers having polyethylene oxide in the side chain and (meth) acrylate monomers having polyethylene oxide in the side chain.
  • Monomers containing a site having a functional group capable of reacting with a crosslinking agent include hydroxyethyl (meth) acrylate monomers, hydroxyethyl (meth) acrylamide, (meth) acrylate monomers, glycidyl (meth) acrylate.
  • Monomer, glycidyl (meth) acrylamide monomer, (meth) acrylic acid succinimide ester monomer, ⁇ -hydroxy acid (meth) acrylate monomer, ⁇ -hydroxy acid (meth) acrylamide monomer, 2-carboxyisopropyl (meth) acrylamide monomer Can be mentioned.
  • the crosslinking agent used in the method (2) is the same as that mentioned in the method (1). Furthermore, a compound having two or more polymerizable groups can be used as a crosslinking agent. Specific examples include bis (meth) acrylamide monomers and bis (meth) acrylate monomers. Further, the content of the crosslinking agent can be appropriately determined based on the explanation of the polymer in (1). [0035] (Formation of coating film)
  • the coating film is formed by dissolving the composition containing any one of the temperature-responsive polymers (a) to (c) in a solvent and applying the solution to a substrate.
  • the composition containing the corresponding monomer is dissolved in a solvent and applied to a substrate.
  • a coating film can be formed without using a solvent. In that case, you may form a coating film, without using a solvent.
  • Solvents that dissolve when the composition is applied include, for example, water, methanol, ethanol, 1-methoxy-2-propanol, ethyleneglycololemonomethinoleether, methinorecero soap acetate, toluene, xylene, diacetone alcohol , Cyclohexanone, 2-hydroxypropionate ethyl, 2-hydroxy-2-methylpropionate ethyl, ethyl acetate, ethyl acetate, 2-hydroxy-3-methylbutanoate, 3-methoxypropionate, 3-methoxypropionate Ethyl bionate, ethyl 3-ethoxynalarovate, methyl 3-ethoxypropionate, methyl pyruvate, ethyl pyruvate, ethyl acetate, butyl acetate, ethyl acetate, and butyl lactate can be used.
  • solvents can be used alone or in combination of two or more.
  • the amount of the solvent can be appropriately determined in consideration of the desired solution viscosity, the obtained coating film thickness, etc., for example, in the range of 100 to 5000 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the temperature-responsive polymer. Can do.
  • the crosslinking agent is water-soluble, when water is used as the solvent, the viewpoint of environmental impact is more preferable than when an organic solvent is used.
  • the substrate on which the coating film is formed can be, for example, a silicon substrate, a glass substrate, a plastic substrate, a micro substrate, a ceramic substrate, or a metal substrate.
  • a hydroxyl group, a carboxyl group In the case of a glass substrate, silicon wafer, or quartz substrate, in order to fix the space between the substrate and the temperature-responsive polymer film by a crosslinking reaction, a hydroxyl group, a carboxyl group, It is preferable to use a silane coupling agent having an epoxy group or an amino group at the terminal.
  • a gold substrate it is preferable to use a thiol compound having a hydroxyl group, a carboxyl group, an epoxy group, an amino group or the like at the terminal.
  • oxygen plasma treatment In the case of a microphone substrate or plastic substrate, oxygen plasma treatment, Alternatively, it is preferable to perform a treatment for forming a hydroxyl group or a carboxyl group on the substrate surface by performing a uv treatment or an ozone treatment.
  • Cross-linking polymerization and cross-linking of monomers in the case of (2)
  • hole pattern formation of the coating film formed on the substrate are partially different depending on the hole pattern formation method.
  • the hole pattern can be formed by, for example, a photolithography method, an embossing method, a screen printing method, a contact printing method, or an ink jet method.
  • photolithographic method after a coating film is formed, photolithography is performed through a mask. It is also performed by ink jet printing or screen printing through a mask.
  • the above-mentioned coating solution is applied to the convex part of the stamper having irregularities and pressed against the substrate, or the contact stamp method for transferring the solution, or the stamper having irregularities is pressed after forming the coating film on the substrate.
  • the embossing method is also used to transfer the uneven pattern.
  • the hole formed by the above process may or may not completely penetrate the coating film.
  • the coating film is formed by applying a solution prepared by dissolving the thermosensitive polymer-containing composition or the thermosensitive polymer-forming monomer-containing composition and the acid generator in a solvent onto a substrate.
  • the resulting coating film is irradiated with radiation that activates the acid generator through a mask, the crosslinking reaction of the portion where the acid catalyst is generated proceeds by heating, and the uncrosslinked portion is dissolved and removed by development. , Forming a hole pattern.
  • the active radiation may be, for example, mercury lamp light, electron beam, excimer laser, X-ray, or xenon lamp.
  • the acid generator is not particularly limited as long as it generates an acid upon irradiation with actinic radiation.
  • triphenylsulfonium triflate triphenylsulfonomonaflate, phenyldimethylsulfo-umtriflate, trimethylsulfo-umtriflate, dihydro Naphthyl dimethyl sulfone triflate, diphenyl rhodony triflate, triphenyl sulfoni Oum salts such as umcamphor sulfonate, N-trifluoromethanesulfuroxy naphthylimide, N-methanesulfoloxy naphthyl imide, etc., 2, 4, 6 Tris (trichloromethyl) Examples include 1, 3, 5 triazine, and sulfonic acid ester.
  • a transparent 'non-fluorescent acid generator for 400 nm force 600 nm light is more preferable because it does not interfere with optical microscope observation and fluorescence observation.
  • a water-soluble acid generator water can be used as a coating solvent, and the viewpoint of environmental load is more preferable than using an organic solvent. Further, it is preferable in that it can be applied on a substrate having low solvent resistance.
  • the content of the acid generator can be appropriately determined in consideration of the exposure sensitivity necessary for pattern formation. For example, the content of the acid generator is in the range of 0.1 to 20 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the thermosensitive polymer. can do.
  • the solvent for dissolving the composition and the acid generator the same ones as described in the formation of the coating film can be used.
  • the crosslinking agent and the acid generator are water-soluble, and water is used as the solvent, the viewpoint of environmental impact is more preferable than the use of an organic solvent. It is also preferred because it has low solvent resistance and can be applied onto a substrate.
  • the developer used for development is not particularly limited as long as it can dissolve the temperature-responsive polymer in the uncrosslinked portion.
  • water at a temperature below LCST water at a temperature below LCST, methanol, ethanol, 1-methoxy-2-pronoanol, ethylene Glycolenomonomethinoreethenole, methinorecello soap acetate, toluene, xylene, diacetone alcohol, cyclohexanone, 2-hydroxypropionate ethyl, 2-hydroxy-2-methylpropionate ethyl, ethoxylate ethyl acetate, hydroxyethyl acetate 2 Methyl 3-hydroxybutanoate, Methyl 3-methoxypropionate, Ethyl 3-methoxypropionate, Ethyl 3-ethoxynalobionate, Methyl 3-ethoxypropionate, Methyl pyruvate, Ethyl pyruvate, E
  • the coating film is formed by applying a solution obtained by dissolving the heat-sensitive polymer composition and the acid generator in a solvent onto a substrate, and the substrate on which the solution is dropped is rotated to rotate the solvent.
  • the evaporation of the solvent by rotation can be performed, for example, by an air flow generated by the rotation or by heating from the outside with a heater.
  • the rotation speed of the spin coater can be appropriately determined in consideration of a desired coating film thickness, and can be, for example, in the range of 500 to 8000 rpm. Moreover, since the depth of the hole pattern of the responsive polymer obtained by the coating thickness force photolithography obtained here is the depth of the hole pattern of the responsive polymer, the depth of any hole pattern can be controlled by controlling the thickness of the coating film. This makes it possible to produce a chip with a certain thickness.
  • water When water is used as the developer, it is preferable from the viewpoint of environmental load than using an organic solvent. Further, it is preferable in that it can be used even with a substrate having low solvent resistance. It is also preferable for improving the resolution.
  • the developer penetrates into the cross-linked and insolubilized portion and is in a swollen state. If the developer is removed in this state, the pattern shape may be lost or the patterns may stick together, and high resolution cannot be obtained.
  • water when water is used during development, when the water is removed after development, and when the water temperature is set to LCST or higher, the internal force of the swollen pattern is expelled, shrinking, and becoming hard. Become. For this reason, the decay of the methane can be prevented, and high resolution can be obtained.
  • the coating film is formed by applying a solution obtained by dissolving the thermosensitive polymer composition in a solvent onto a substrate to form a hole pattern, and then proceeding with a crosslinking reaction.
  • the above solution is screen-printed on a substrate through a mask to form a coating film having a hole pattern.
  • a solution is sprayed onto a portion other than a hole pattern to form a coating film having a hole pattern.
  • the above-mentioned coating solution is applied to the convex portions of a stamper having irregularities and pressed against the substrate to transfer the solution to form a coating film having a hole pattern.
  • the above solution is spin-coated to form a coating film on a substrate, and then a stamper having projections and depressions is pressed to transfer the projections and depressions to the hole pattern.
  • the coating film which has is formed.
  • Crosslinking by heating of a coating film having a hole pattern is performed in a temperature range of 170 ° C or more and 300 ° C or less using, for example, a hot plate or a baking furnace when the coating film does not contain an acid catalyst. In 30 minutes or more and 24 hours or less.
  • the coating film contains an acid catalyst
  • crosslinking by heating the hole pattern is performed at 90 ° C or higher and lower than 170 ° C for 10 seconds or longer and less than 30 minutes using a hot plate or a baking furnace. It can be carried out.
  • the acid catalyst may be an acid directly added to the coating solution, or an acid generated by irradiation of the coating film containing the acid generator. In this way, a substrate having a coating film with a hole pattern can be obtained.
  • a polymerization initiator is included in the coating solution.
  • the polymerization initiator can be allowed to proceed simultaneously with the crosslinking reaction by the polymerization initiator.
  • examples of the polymerization initiator include azoisobutyric-tolyl, azoisobutyrobutyric acid, and benzoyl peroxide.
  • the chip of the present invention is a chip having a cross-linked product of a temperature-responsive polymer as a constituent component and a film having a hole pattern on the substrate surface, and is obtained by the production method of the present invention.
  • This chip opens and closes the hole size of the hole pattern by controlling the coating film temperature, so that, for example, a biological substance is included in the hole or the hole force is released.
  • the thickness, hole size, depth, shape, density, arrangement (pattern shape), etc. of the film having a hole pattern are appropriately determined according to the desired object to be held on the substrate according to the purpose. it can.
  • the thickness of the film having the hole pattern is, for example, ⁇ ! Can be in the range of ⁇ 100 m.
  • the hole pattern can be round or rectangular (eg, square, rectangular, hexagonal), gourd or star, and the hole density can be 1 to 1,000 per 1 cm 2 , for example. , 000, 000 can be used.
  • Examples of the hole area include lnm 2 or more and 1 cm 2 or less.
  • the size of the hole can be in the range of the diameter of the inscribed circle from 1011111 to 1000111. If the shape of the hole is a circle, the diameter is, for example, ⁇ ! It can be in the range of ⁇ 1000 m. These ranges are preferably ⁇ ! The range is up to 20 m.
  • the depth of the hole in the hole pattern is, for example, in the range of 10 nm to 100 m.
  • the substrate on which the composition is applied has a surface on which the composition is applied.
  • the coating film may have a concave portion in a portion corresponding to the lower portion of at least a part of the holes (FIG. 11).
  • a recess can be formed later in the substrate portion corresponding to the lower part of at least some of the holes of the coating film.
  • the cross-sectional shape of the hole in the coating and the recess in the substrate may be the same or different.
  • the diameter of the hole in the coating film and the concave portion of the substrate may be the same or different.
  • the depth of the concave portion of the substrate can be appropriately determined according to the substance to be held, and can be, for example, in the range of 0.1 to: LOO / zm.
  • the bottom of the concave portion of the substrate may be horizontal, hemispherical, or a rotational shape (for example, a triangular pyramid) around the center of the bottom.
  • the concave portion of the substrate may have a through hole that leads to the opposite surface of the substrate.
  • the through hole may have an openable / closable plug or lid, and the cross section of the through hole may be smaller, the same as, or larger than the cross section of the recess of the substrate.
  • the chip of the present invention in which the substrate has a recess in the lower part of the hole in the coating film and forms a single well with the hole in the coating film and the recess in the substrate can be formed as follows. .
  • a solution in which the heat-sensitive polymer composition and the acid generator are dissolved in a solvent is applied on a flat substrate, and a hole pattern is formed by the photolithography.
  • the coating film in which the hole pattern is formed as an etching mask the substrate portion exposed at the lower part of the hole is etched to a desired depth by wet etching or dry etching. This method is preferred in that positioning can be performed easily and with higher accuracy than a method in which a concave portion is formed on a substrate and then a hole portion of the coating film is formed in accordance with the position.
  • the hole of the hole pattern may have dots formed of the composition independent of the coating film on the substrate surface therein (FIG. 12).
  • the cross-linked product that forms a coating film having a hole pattern and the cross-linked product that forms dots may have the same composition or different compositions.
  • the chip of the present invention having dots in the holes can be formed as follows.
  • a flat substrate obtained by dissolving the above heat-sensitive polymer composition and acid generator in a solvent. Then, the hole pattern is formed by photolithography. Next, the thermosensitive polymer composition is ejected to the hole pattern position by the ink jet method on the coating film in which the hole pattern is formed, and dots are formed inside the hole, followed by thermal crosslinking. In the chip having dots on the substrate surface in the hole of the hole pattern, the cross-linked product expands as shown in FIG.
  • the cross-linked product that forms the dots also expands and the hole depth decreases.
  • the substance handled in the chip of the present invention can be, for example, a biological substance, and the biological substance is not particularly limited.
  • the biological substance is not particularly limited.
  • lymphocytes epidermal cells, hepatocytes, nerve cells, stem cells, etc.
  • Cell protein, chromosome, DNA and the like.
  • these biological substances can be fixed on a carrier such as bead particles.
  • the chip of the present invention can change the size of the hole pattern arbitrarily by swelling or shrinking a part or the whole of the film by changing a part or the whole of the film temperature. Can do. As a result, the biological material stored in the hole of the hole pattern can be brought into a state of being enclosed or released in the hole of the hole pattern by changing the membrane temperature.
  • the membrane temperature of the chip of the present invention is controlled so that the diameter of the hole of the hole pattern included in the chip is a temperature at which a biological substance can be stored, and a living body is placed in the hole of the hole pattern.
  • the present invention includes controlling the film temperature of the chip enclosing the biological material by this method so that the diameter of the hole pattern of the chip has a temperature at which the biological material can be released. And a method of releasing the biological material included in the chip.
  • the uncrosslinked temperature-responsive polymer has a lower critical point temperature (LC ST) specific to each chemical structure. At temperatures below the lower critical temperature, the molecular surface is hydrophilic or water-soluble and dissolves in water, but at temperatures above the critical temperature, the molecular surface is hydrophobic and precipitates in water.
  • the coating film obtained by crosslinking the temperature-responsive polymer used for the chip of the present invention also has the above-described LCST corresponding to the chemical structure of the thermosensitive polymer used for coating film formation. When the temperature is higher than LCST, the coating film becomes hydrophobic and water is drawn from the inside of the film. By ejecting, the coating film is in a contracted state. When the temperature is lower than the above LCST, the membrane surface becomes hydrophilic, and water is taken into the membrane, so that the coating becomes swollen and the volume increases.
  • the lower critical point temperature of N-isopropylacrylamide polymer is about 32 ° C
  • this chip using thermosensitive polymer having N-isopropylacrylamide structure is around 35 ° C above LCST.
  • the film is contracted and the hole pattern is expanded.
  • biological material smaller than the hole pattern is seeded on the chip, the biological material can be easily put into the hole. You can also easily remove the biological material that has entered the hole.
  • Examples of means for holding the chip above LCST include a method of placing the substrate in a constant temperature bath above LCST or placing the substrate on a plate above LCST. In addition, it is necessary to keep the entire chip above LCST.Only the coating around the part where the hole pattern is to be expanded can be heated locally by infrared laser irradiation or a small heater to make it higher than LCST. is there.
  • the structure of the obtained polymer is a high molecular weight (1) with various analytical power N-isopropyl acrylamide structure 80% mole fraction and hydroxyethyl acrylate structure 20% mole fraction. all right.
  • the weight average molecular weight was 63,000 and the number average molecular weight was 45,000.
  • the above coating solution was spin coated at a spin coater rotation speed of 3000 rpm. After application Heat treatment was performed at 120 ° C for 5 minutes to volatilize the solvent, and a coating film having a thickness of 2 m was obtained. Using a mask aligner with a high-pressure mercury lamp as the light source, the coating was exposed through the mask. After the exposure, heat treatment was performed at 120 ° C for 5 minutes, and only a portion where acid was generated by the exposure was allowed to proceed with a crosslinking reaction by an acid catalyst reaction. Thereafter, development processing for dissolving and removing the uncrosslinked portion was performed for 2 minutes using 15 ° C. water. Subsequently, the temperature of the developer was raised to 35 ° C, which is above the lower critical temperature, and the development was completed with water being expelled from the coating film and shrinking.
  • the entire surface was exposed with a xenon mercury lamp and heat-treated at 120 ° C for 5 minutes.
  • the sprayed temperature-responsive polymer was firmly fixed to the substrate by a crosslinking reaction, and a hole pattern having a diameter of 100 m and a depth of 0.5 m was formed on the substrate at a density of 2,500 pieces / cm 2. I was able to make it.
  • the chips were washed with 15 ° C water in a beaker, and excess beads not grasped were washed away.
  • the chip was kept at a low temperature during washing, the beads in the hole were firmly held by the swollen temperature-responsive polymer, so that even if washed strongly, it could not flow away. As a result, it was possible to separate and fix one bead for each hole pattern only.
  • the chip temperature was returned to a high temperature (about 35 ° C), the temperature-responsive polymer contracted and the beads could be released again.
  • lymphocytes B cells with a diameter of about 6 ⁇ m
  • the chip temperature was maintained at a high temperature (about 35 ° C)
  • the lymphocyte suspension was dropped, and the lymphocytes were allowed to settle naturally for 5 minutes.
  • the tip temperature was lowered to a low temperature (about 15 ° C)
  • the temperature-responsive polymer was swollen and only the lymphocytes in the hole were grasped.
  • the chip was washed with 15 ° C PBS buffer in a beaker to wash away excess lymphocytes that were not grasped. As a result, it was possible to separate and fix one of the ball spheres only in the hole pattern.
  • the cell retention rate at this time was about 16%.
  • the cell retention rate here is expressed as the number of cells held in the hole on the chip Z the number of holes on the chip X 100.
  • the chip temperature was returned to a high temperature (about 35 ° C), the temperature-responsive polymer contracted and lymphocytes could be released again.
  • Figure 3 shows the results.
  • Example 8 we were able to retain, arrange, and collect other blood cells, E. coli, chromosomes, etc. by changing the size of the hole pattern using lymphocytes as the biomaterial. In addition, fluorescent dyed and magnetically labeled biomaterials could be retained, arranged and recovered. [0076] Example 8
  • the transition temperature of the chip having the hole pattern created by the above photolithographic method (temperature at which the temperature-responsive polymer fixed on the chip changes from the swollen state to the contracted state, or the contracted state force to the swollen state)
  • the state of swelling / contraction was examined in detail by observing under a microscope while changing the chip temperature. As a result, it was found that the transition temperature of the chip made from the temperature-responsive polymer (1) was about 28 ° C.
  • a temperature-responsive polymer synthesized using N-normal propyl acrylamide instead of N-isopropylacrylamide (the synthesis method is N-isopropylacrylamide of temperature-responsive polymer (1). It was found that the transition temperature of the chip made using the same synthetic method (except that it was replaced with normal propyl acrylamide) was about 16 ° C.
  • the transition temperature is set so as not to cause death or denaturation. It was preferable that it existed in a range higher than 0 ° C and lower than 45 ° C.
  • the depth of the hole pattern formed by the above photolithography method corresponds to the film thickness of the temperature-responsive polymer at the time of spin coating, so it is easy to control the film thickness at the time of coating film formation.
  • the depth of the hole can be controlled.
  • Figure 4 shows the film thickness of the coating film obtained when the polymer concentration of the coating solution is changed and the rotation speed of the spin coater is 3000 rpm.
  • Figure 5 shows the film thickness of the coating film obtained when the polymer concentration of the coating solution is 33 wt% and the spin coater rotation speed is changed.
  • the amount of change in volume during swelling can be controlled by the depth of the hole pattern (corresponding to the film thickness of the temperature-responsive polymer) formed by the photolithographic method described above.
  • the direct pattern and depth of the hole pattern can be controlled.
  • the volume increase increases as the film thickness of the temperature-responsive polymer increases, and decreases as the film decreases.
  • the hole pattern shrinks due to the increase in volume of the temperature-responsive polymer during swelling.
  • the hole pattern had a diameter of 6; ⁇ ⁇ and a depth (film thickness) of 6 ⁇ m.
  • the cell retention rate was About 16%.
  • Biomaterials such as cells and chromosomes are softer and easier to deform than polystyrene beads. For this reason, if the hole pattern is shallow, there is a possibility that the cell is slightly deformed and escapes from the hole force in the process of grasping the cell or washing. Therefore, we attempted to improve cell retention by changing the hole depth (by changing the film thickness of the temperature-responsive polymer).
  • a chip having a hole pattern made of a temperature-responsive polymer with a diameter of 10; ⁇ ⁇ and a depth (film thickness) of 2 m force changed to 3.5 m was prepared by the above photolithography method.
  • the hole depth (film thickness) was changed by changing the polymer concentration of the coating solution at the time of spin coating formation from 28 wt% to 33 wt%.
  • lymphocytes B cells ⁇ diameter of about 6 m
  • each lymphocyte was separated and held on the chip.
  • the tip temperature is maintained at a high temperature (about 35 ° C)
  • the lymphocyte suspension is dropped and the lymphocytes spontaneously settled. Waited 5 minutes.
  • NIPAAm was swollen and only the lymphocytes in the hole were grasped.
  • the tip with a hole pattern of 3.5 m is thicker than the tip with a hole pattern with a depth (thickness) of 2 / zm.
  • the immune cells were completely wrapped in the swollen temperature-responsive polymer, and the holes were completely closed (Fig. 6).
  • the temperature-responsive polymer (1), cross-linking agent (hexamethoxymethyl melamine), and acid generator (triphenylsulfo-um triflate) used in this experiment all emitted light at 400 nm and 600 nm.
  • cross-linking agent hexamethoxymethyl melamine
  • acid generator triphenylsulfo-um triflate
  • the chip was washed with 15 ° C PBS buffer in a beaker to wash away any unencapsulated lymphocytes.
  • the trapped cells were firmly held in the holes even after extensive washing in the flask. As a result, it was possible to separate and retain lymphocytes one by one in the hole pattern only (Fig. 7).
  • the cell retention rate at this time improved to about 87%.
  • the temperature-responsive polymer in the swollen state did not crush cells that were gelled and sufficiently softly confined.
  • a chip having a hole pattern made of a temperature-responsive polymer with a diameter of 10; ⁇ ⁇ and a depth (film thickness) of 10 m was formed by the photolithography method described above.
  • two lymphocytes were placed in one hole, and it was impossible to separate and hold one lymphocyte in each hole pattern.
  • the depth of the hole is preferably 1.5 m or more and 9 m or less. Furthermore, in order to obtain a high cell retention rate, it was more preferable that it be 3 ⁇ m or more and 9 ⁇ m or less.
  • a chip having a hole pattern made of a temperature-responsive polymer with a diameter of 5 ⁇ m and a depth (film thickness) of 3.5 ⁇ m was prepared by the above photolithography method.
  • the hole diameter was changed by changing the mask pattern used in the photolithography process.
  • the diameter of the hole was too small to contain lymphocytes, and it was impossible to separate and retain each lymphocyte in the hole pattern.
  • a chip having a hole pattern of a temperature-responsive polymer having a diameter of 15 m and a depth (film thickness) of 3.5 ⁇ m was prepared by the photolithography method described above.
  • the hole diameter was changed by changing the mask pattern used in the photolithography process.
  • three lymphocytes were placed in one hole, and one lymphocyte could not be separated and retained only in the hole pattern.
  • the hole diameter was 6 ⁇ m or more and 12 ⁇ m or less.
  • any number of immune cells and beads can be retained in a single hole.
  • the size and shape of the hole can be changed by changing the mask pattern used in the photolithography process, and the hole depth (film thickness) can be easily changed by changing the spin coating conditions.
  • a chip having a hole pattern made of a temperature-responsive polymer with a long side m, a short side 8 rectangle, and a depth (film thickness) of 3.5 ⁇ m was prepared by the above photolithography method.
  • two lymphocytes could be reliably retained in one hole (Fig. 8).
  • Example 14 By confining an arbitrary number of immune cells in one hole, analysis of interaction between multiple cells, cell fusion between multiple cells, etc. can be selectively performed at any position on the substrate. It was easy to do while observing. [0090] Example 14
  • a hole pattern made of a temperature-responsive polymer with a diameter of 10 ⁇ m and depth (film thickness) of 3 ⁇ m was created on a silicon wafer by the photolithography method described above.
  • the silicon part exposed through the hole pattern of the temperature-responsive polymer was dry-etched 7 m vertically.
  • the temperature-responsive polymer itself was scraped by 1 m in the vertical direction by dry etching, and the film thickness became. This process is shown in FIG.
  • a cell holding experiment was performed. First, the tip temperature was kept at a high temperature (about 35 ° C), and the lymphocyte suspension was dropped while the lid with the temperature-responsive polymer was open, and the lymphocytes were allowed to settle naturally for 5 minutes. . Next, by lowering the chip temperature to a low temperature (about 15 ° C), the temperature-responsive polymer was swollen and the lid with the temperature-responsive polymer was closed. Thereafter, the chip was washed with 15 ° C PBS buffer in a beaker to wash away excess lymphocytes not in the holes.
  • the cell retention rate at this time was about 85%.
  • the chip temperature was returned to a high temperature (about 35 ° C)
  • the lid with the temperature-responsive polymer was released, and the lymphocytes could be aspirated and collected by the first one.
  • the above coating solution was spin-coated at a rotation speed of a spin coater of 500 rpm on a polymethylmetatalylate substrate surface-treated with oxygen plasma. After coating, the film was heated at 90 ° C for 30 minutes to evaporate the solvent and obtain a coating film. Using a mask aligner with a high-pressure mercury lamp as the light source, the coating was exposed through a mask. After the crosslinking reaction by heating after the exposure, a developing process for dissolving and removing the uncrosslinked portion was performed using 15 ° C. water for 1 minute. That As a result, a hole pattern made of a temperature-responsive polymer with a diameter of 10 / zm was fabricated on a substrate at a density of 250,000 / cm 2 . Since water is used as the coating solvent, the plastic material polymethylmetatalylate substrate was strongly affected by the solvent during spin coating. In addition, even when developing with water, all the constituent components were water-soluble, so that they could be carried out satisfactorily without residue.
  • soluble elastin derived from cattle
  • a temperature-responsive polymer derived from living organisms a temperature-responsive polymer derived from living organisms
  • disodium salt 4, 4 'diazostilbene 2, 2'
  • a water-soluble bisazide compound as a photocrosslinking agent was dissolved in 1000 parts by weight of distilled water as a solvent, and this was filtered using a filter having a pore size of 0.40 m to obtain a coating solution.
  • the above coating solution was spin coated at a spin coater rotation speed of 500 rpm. After coating, the film was heated at 80 ° C. for 10 minutes to volatilize the solvent and obtain a coating film. The coating film was exposed through a mask using a mask aligner using a high-pressure mercury lamp as a light source. After the cross-linking reaction by exposure, development processing was performed for 2 minutes using 15 ° C water to dissolve and remove uncrosslinked portions. As a result, a hole pattern of a temperature-responsive polymer derived from a living body having a diameter of 10 m was produced on a substrate at a density of 250,000 / cm 2 .
  • the chip of the present invention is required to temporarily fix a biomaterial.
  • Various technical fields for example, a large number of lymphocyte forces, select specific antigen-specific lymphocytes, This is useful for the creation method. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 shows the result of observing changes in the hole size while keeping the chip at various temperatures after water was dropped on the chip having the hole pattern created by the photolithographic method in Example 5.
  • FIG. 2 shows the result of conducting an experiment for holding polystyrene beads having a diameter of 10 m using a chip having a hole pattern created by a photolithographic method in Example 6.
  • FIG. 3 shows the result of a retention experiment on lymphocytes (B cells, about 6 m in diameter) using a chip having a hole pattern prepared by a photolithographic method in Example 7.
  • FIG. 4 shows the film thickness of the coating film obtained in Example 9 when the polymer concentration of the coating solution is changed and the spin coater rotation speed is 3000 rpm.
  • FIG. 5 shows the film thickness of the coating film obtained in Example 9 when the polymer concentration of the coating solution is 33 wt% and the rotation speed of the spin coater is changed.
  • FIG. 6 shows the results of a lymphocyte retention experiment in Example 11.
  • FIG. 7 shows the results of a lymphocyte retention experiment in Example 12.
  • FIG. 8 shows the results of a lymphocyte retention experiment in Example 13.
  • FIG. 9 is a schematic explanatory diagram of the process of Example 14.
  • FIG. 10 is an explanatory diagram of one embodiment of a chip of the present invention.
  • FIG. 11 is an explanatory diagram of one embodiment of a chip of the present invention.
  • FIG. 12 is an explanatory diagram of one embodiment of a chip of the present invention.

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Abstract

【課題】穴パタンの穴の大きさを任意に変化させることによって、細胞をばらまく時及び回収する時は細胞が穴から出入り易く、洗浄時や抗原刺激時は穴から出にくい機構、構造を有する新たな細胞用等の用途に有用なチップを提供すること。 【解決手段】温度応答性高分子の架橋生成物を構成成分とし、かつ穴パタンを有する膜を基板表面に有するチップ。温度応答性高分子の架橋生成物を構成成分とし、かつ穴パタンを有する膜を基板表面に有するチップの製造方法。架橋可能な温度応答性高分子を含有する組成物、架橋可能な温度応答性高分子および架橋剤を含有する組成物、または温度応答性高分子および架橋剤を含む組成物を基板表面に塗布して塗膜を形成し、前記塗膜を架橋させて、前記架橋生成物を生成し、かつ前記架橋生成物の塗膜に穴パタンを形成する工程を含む。

Description

明 細 書
感熱応答性高分子を用いた穴パタン付き膜を有するチップ及びその製造 方法
技術分野
[0001] 本発明は、感熱応答性高分子を用いた穴パタンを有する膜を基板表面に有するチ ップ及びその製造方法に関する。
背景技術
[0002] ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド） (PNIPAAm)は感熱応答性高分子として知られ ている。 PNIPAAmの水溶液は温度変化によって相分離を起こし、 31 °C以下では水 に溶解、それ以上の温度では不溶ィ匕し析出する。 N-イソプロピルアクリルアミド (NIPA Am)は、ラジカル開始剤により容易に重合し、 PNIPAAmが得られる。また、 NIPAAmは 他の機能性モノマーと共重合することも知られており、得られる高分子は、温度変化 のみならず、光、電場、 pH変化、溶媒交換などのいろいろな刺激に応答する。
[0003] 感熱応答性高分子は、生体材料を固定ィ匕するための材料として使用されることも知 られて!ヽる (特開 2003-102466号公報 (特許文献 1)、特開平 9-23876号公報 (特許文献 2))。
[0004] 一方、細胞を 1つ 1つのレベルで特定し、選別し、選別された細胞を用いる試みがな されている。例えば、 1つ 1つのリンパ球の抗原特異性を個別に検出し、さらに検出さ れた 1つの抗原特異的リンパ球を回収し、回収された 1つの抗原特異的リンパ球を用 いて、例えば、抗体を製造することが検討されている（民谷ら、 BIO INDUSTRY, p60- 67, Vol.20, No.7, 2003 (非特許文献 1)、特開 2004— 173681号公報（特許文献 3) )。
[0005] しかし、通常の PNIPAAmの塗布膜は、水や極性有機溶媒に、非常に溶解しやす ヽ 。従って、 PNIPAAmの塗布膜を用いて、細胞等の生体材料を固定ィ匕しょうとすると、 水に触れた部分がどんどん解け出してしまう。また、 PNIPAAmの塗布膜を微細加工し ようと、レジストを PNIPAAmの塗布膜の上層に重ね塗りすると、レジスト溶媒に PNIPA Amが溶け出し、両層が混合してしまう。
[0006] そこで本発明者らは、先に、水や水溶液、さら〖こは、有機溶媒に不溶性であり、か っ感熱応答性を有する材料 (NIPAAm)を提供するとともに、この感熱応答性を有する 材料の材料が有する、温度変化に応じて親水性力 疎水性へと変わる性質を利用し て、細胞に対する接着力が変化することを利用したチップを開発し、特許出願した（ WO2005/095510) o
[0007] しかし、親水性力 疎水性へと変わる温度応答性 (その結果、細胞に対する接着力 が変化する)を利用したチップでは、洗浄工程で、強く洗い過ぎると全てのリンパ球が 流れ去ってしまい、弱過ぎると不必要な箇所にもリンパ球が残ってしまうという欠点が あることが判明した。
[0008] そこで本発明の目的は、穴パタンの穴の大きさを任意に変化させることによって、細 胞をばらまく時及び回収する時は細胞が穴から出入り易ぐ洗浄時や抗原刺激時は 穴から出にくい機構、構造を有する新たな細胞用等の用途に有用なチップを提供す ることを目的とする。
発明の開示
課題を解決するための手段
[0009] 上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
[1]温度応答性高分子の架橋生成物を構成成分とし、かつ穴パタンを有する膜を基 板表面に有するチップ。
[2]前記温度応答性高分子の架橋生成物が、温度応答性高分子間の架橋生成物ま たは架橋剤を介しての架橋生成物である [1]に記載のチップ。
[3]前記温度応答性高分子の架橋生成物は、一般式（1)で示される繰り返し単位を 持ち、かつ重量平均分子量が 500〜5, 000, 000である N—アルキル (メタ）アクリル アミド共重合体と架橋剤との架橋生成物
[化 1]
Figure imgf000005_0001
(一般式（1)において、 R及び Rは、同一または異なっても良ぐ水素原子または炭
1 2
素数 1から 4のアルキル基を表し、 Rは、水素原子またはメチル基を表し、 Rは、前記
3 4 架橋剤と架橋可能な官能基を有する炭化水素構造を表す。 X及び yは、それぞれ X +y = l、 0く Xく 1、 0< y< lを満たす任意の数である。 )
である [1]または [2]に記載のチップ。
[4]穴パタンを有する膜の厚みは、 10nm〜1000 μ mの範囲である [1]〜 [3]の!ヽ ずれかに記載のチップ。
[5]穴パタンの穴の大きさは、内接する円の直径が 10nm〜 1000 μ mの範囲である
[ I]〜 [4]の!、ずれかに記載のチップ。
[6]穴パタンの穴の深さが、 10nm〜100 μ mの範囲である [1]〜 [5]の!、ずれかに 記載のチップ。
[7]穴パタンの穴は、 1cm2当たり 1個〜 1, 000, 000, 000個である [1]〜[6]のいず れかに記載のチップ。
[8]基板は、膜を有する表面の、膜が有する少なくとも一部の穴の下部に相当する部 分に凹部を有する [1]〜 [7]の ヽずれかに記載のチップ。
[9]穴パタンの穴は、その中の基板表面上に、膜とは独立した前記温度応答性高分 子の架橋生成物で形成されたドットを有する [1]〜 [9]の 、ずれかに記載のチップ。
[10]膜温度の一部分、または全体を変化させることにより、膜の一部分、または全体 を膨潤または収縮させて、穴パタンの穴の大きさを任意に変化させることができる [1] 〜 [9]の!、ずれかに記載のチップ。
[I I]前記穴パタンの穴に格納された生体物質を、膜温度の変化により、穴パタンの 穴において、包接した状態にする力、または解放した状態にする [10]に記載のチッ プ。
[12] [1]〜 [9]のいずれかに記載のチップの膜温度を、前記チップが有する穴バタ ンの穴の径を、生体物質が格納可能な大きさになる温度に制御し、
前記穴パタンの穴に生体物質を格納し、次いで
チップの膜温度を、前記生体物質を格納した穴の径を、生体物質を包接する温度 に制御することを含む、チップの穴パタンに生体物質を包接する方法。
[13] [12]に記載の方法で生体物質を包接したチップの膜温度を、前記チップが有 する穴パタンの穴の径を、生体物質を解放可能な大きさになる温度に制御することを 含む、チップに包接された生体物質を解放する方法。
[14]温度応答性高分子の架橋生成物を構成成分とし、かつ穴パタンを有する膜を 基板表面に有するチップの製造方法であって、
架橋可能な温度応答性高分子を含有する組成物、架橋可能な温度応答性高分子 および架橋剤を含有する組成物、または温度応答性高分子および架橋剤を含む組 成物を基板表面に塗布して塗膜を形成し、
前記塗膜を架橋させて、前記架橋生成物を生成し、かつ
前記架橋生成物の塗膜に穴パタンを形成する工程を含むことを特徴とする、前記 製造方法。
[15]前記架橋可能な温度応答性高分子および架橋剤を含有する組成物、または温 度応答性高分子および架橋剤を含有する組成物は、一般式（1)で示される繰り返し 単位を持ち、かつ重量平均分子量が 500〜5, 000, 000である N—アルキル (メタ） アクリルアミド共重合体と架橋剤とを含有する組成物
[化 2]
Figure imgf000007_0001
(一般式（1)において、 R及び Rは、同一または異なっても良ぐ水素原子または炭
1 2
素数 1から 4のアルキル基を表し、 Rは、水素原子またはメチル基を表し、 Rは、前記
3 4 架橋剤と架橋可能な官能基を有する炭化水素構造を表す。 X及び yは、それぞれ X +y = l、 0<χ< 1、 0< y< lを満たす任意の数である。ここで、（メタ）アクリルアミドと は、メタクリルアミドとアクリルアミドの両方を表す。 )
である [14]に記載の製造方法。
[16]温度応答性高分子の架橋生成物を構成成分とし、かつ穴パタンを有する膜を 基板表面に有するチップの製造方法であって、
架橋可能な温度応答性高分子形成用モノマーを含有する組成物、架橋可能な温 度応答性高分子形成用モノマーおよび架橋剤を含有する組成物、または温度応答 性高分子形成用モノマーおよび架橋剤を含む組成物を基板表面に塗布して塗布膜 を形成し、
塗膜を重合および架橋させて、前記架橋生成物を生成し、かつ
前記架橋生成物の塗膜に穴パタンを形成する工程を含むことを特徴とする、前記 製造方法。
[17]組成物を塗布する基板は、シリコン基板、ガラス基板、プラスチック基板、マイ力 基板、セラミック基板、または金属基板である [14]〜 [16]に記載のいずれかに記載 の製造方法。
[18]組成物の基板への塗布は、組成物を溶剤に溶解する工程、得られた溶液を基 板上に滴下する工程、溶媒を蒸発させ塗膜を得る工程を含むことを特徴とする [14] 〜 [ 17]の 、ずれかに記載の製造方法。 [19]塗膜への穴パタンの形成は、フォトリソグラフィ一法により行う [14]〜 [18]のい ずれかに記載の製造方法
[20]フォトリソグラフィ一法による塗膜への穴パタンの形成は、前記塗膜形成用の組 成物にさらに酸発生剤を含有させ、塗膜形成後、塗膜に穴パタン形成用マスクを介 して酸発生剤を活性化させる放射線を照射して、放射線が照射された部分の塗膜を 架橋させ、次いで、前記マスクを除去した後に、未架橋部分の塗膜を除去することに よって行う [19]に記載の製造方法。
[21]酸発生剤は、ォ -ゥム塩、スルホ-ルォキシイミド、トリァジン及びスルホン酸ェ ステルカ 成る群力 選ばれる少なくとも 1種である [20]に記載の製造方法。
[22]放射線が、水銀ランプ光、電子線、エキシマレーザー、 X線、またはキセノンラン プである [20]または [21]に記載の製造方法。
[23]塗膜への穴パタンの形成は、スクリーン印刷法、インクジェット法、コンタクトプリ ント法またはエンボス加工法により行う、 [14]〜 [18]の 、ずれかに記載の製造方法
[24]スクリーン印刷法、インクジェット法、コンタクトプリント法またはエンボスカ卩工法に よる塗膜への穴パタンの形成は、架橋前の塗膜に穴パタンを形成し、次いで穴バタ ンを形成した塗膜を架橋させることで行う、 [23]に記載の製造方法。
[25]前記架橋剤と架橋可能な官能基を有する炭化水素構造は、前記架橋剤と架橋 可能な官能基を側鎖に持つ (メタ)アタリレート構造または (メタ)アクリルアミド構造 (こ こで、（メタ)アタリレートとは、メタタリレートとアタリレートの両方を表す。）である請求 項 15〜24のいずれかに記載の製造方法。
[26]前記架橋剤と架橋可能な官能基は、ヒドロキシル基、カルボキシ基、エポキシ基 、アミノ基またはスクシンイミド基である [ 15]〜 [25]の 、ずれかに記載の製造方法。
[27]架橋剤は、エポキシ系架橋剤、メラミン系架橋剤、グリコゥリル系架橋剤、ヒドロ キシル基、カルボキシル基、アジド基またはビュルエーテル基を 2つ以上有する化合 物である [15]〜 [26]の 、ずれかに記載の製造方法。
[28]ヒドロキシル基、カルボキシル基、アジド基またはビニルエーテル基を 2つ以上 有する化合物は、 1, 2—ジヒドロキシナフタレン、 1, 3—ジヒドロキシナフタレン、 1, 4 ージヒドロキシナフタレン、 1, 5 ジヒドロキシナフタレン、 1, 6 ジヒドロキシナフタレ ン、 1, 7 ジヒドロキシナフタレン、 1, 8 ジヒドロキシナフタレン、 2, 3 ジヒドロキシ ナフタレン、 2, 6 ジヒドロキシナフタレン、 2, 7 ジヒドロキシナフタレン、 1, 3 シク 口ペンタンジオール、 2, 6 キノリンジオール、 2, 3 ジヒドロキシキノキサリン、 1, 4 ジォキサンジオール、 1, 4ーシクロへキサンジメタノール、ポリビニルアルコール、 1, 2 ナフタレンジカルボン酸、 1, 3 ナフタレンジカルボン酸、 1, 4 ナフタレンジ カルボン酸、 1, 5 ナフタレンジカルボン酸、 1, 6 ナフタレンジカルボン酸、 1, 7 ナフタレンジカルボン酸、 1, 8 ナフタレンジカルボン酸、 2, 3 ナフタレンジカル ボン酸、 2, 6 ナフタレンジカルボン酸、シクロへキサンジカルボン酸、テレフタル酸 、 1, 2 シクロペンタンジカルボン酸、 2, 5 チォフェンジカルボン酸、 2—メチルー 3, 4 キノリンジカルボン酸、 9, 10 アントラセンジカルボン酸、ジヒドロアントラセン 9, 10 ジカルボン酸、クェン酸、こはく酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、 2, 6 ビス（4 アジドベンジリデン）シクロへキサノン、ビス（4 ビ-ロキシブチル）テレフ タレートまたはビス (4 ビ-ロキシブチル)アジペートである [26]または [27]に記載 の製造方法。
発明の効果
[0010] 本発明によれば、感熱応答性を有する材料を用いて、細胞をばらまく時及び回収 する時は細胞が穴力 出入り易ぐ洗浄時や抗原刺激時は穴から出にくい機構、構 造を有する新たな細胞等用のチップを提供することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0011] (温度応答性高分子組成物）
本発明のチップは、温度応答性高分子の架橋生成物を構成成分とし、かつ穴バタ ンを有する膜を基板表面に有するものであり、このチップの製造方法は、主に、塗膜 の形成、塗膜の架橋および穴パタンの形成の 3つの工程力もなる。
[0012] 塗膜の形成は、（1)架橋可能な温度応答性高分子を含有する組成物、架橋可能 な温度応答性高分子および架橋剤を含有する組成物、または温度応答性高分子お よび架橋剤を含む組成物を基板表面に塗布して塗膜を形成する方法 (請求項 14〖こ 記載の方法)と、（2)架橋可能な温度応答性高分子形成用モノマーを含有する組成 物、架橋可能な温度応答性高分子形成用モノマーおよび架橋剤を含有する組成物 、または温度応答性高分子形成用モノマーおよび架橋剤を含む組成物を基板表面 に塗布して塗布膜を形成する方法 (請求項 16に記載の方法）、とに大別される。（1) の方法は、温度応答性高分子を用いる方法であり、（2)の方法は、温度応答性高分 子形成用モノマーを用いる方法である。（1)の方法では、温度応答性高分子を含有 する組成物を予め調整し、塗膜形成後に架橋反応を行って、膜が得られる。それに 対して、（2)の方法では、温度応答性高分子形成用モノマーを含有する組成物を基 板上に塗布し、温度応答性高分子を得るための重合反応と架橋反応を行って膜が 得られる。（1)の方法の方が、別容器で大量に組成物を合成 '調整できる点で好まし い。また、塗膜の形成しやすさ、微細な穴形成ができる点でも好ましい。
[0013] まず（1)の方法について説明する。
(1)の方法では、（a)架橋可能な温度応答性高分子を含有する組成物、（b)架橋 可能な温度応答性高分子および架橋剤を含有する組成物、または (c)温度応答性 高分子および架橋剤を含む組成物のいずれかの温度応答性高分子を含有する組 成物を用いる。（a)の組成物では、温度応答性高分子が架橋可能な高分子であり、 塗膜形成後の架橋は、温度応答性高分子が有する架橋可能な基を用いて行われる 。この場合、高分子鎖同士が互いに直接架橋される。（b)の組成物では、温度応答 性高分子が架橋可能な高分子であり、かつ架橋剤を含有するので、塗膜形成後の 架橋は、温度応答性高分子が有する架橋可能な基および架橋剤の両方を用いて行 われる。この場合、高分子鎖同士の直接架橋および架橋剤の鎖を介しての架橋が形 成される。（c)の組成物では、温度応答性高分子は架橋可能な基を有さない高分子 であり、しかし架橋剤を含有するので、塗膜形成後の架橋は、架橋剤によって行われ る。この場合、架橋剤の鎖を介しての架橋が形成される。
[0014] 高分子鎖同士の直接架橋よりは、架橋剤の鎖を介しての架橋の方が、高分子鎖間 力 フレキシブルな架橋剤の鎖でつながれる結果になり、架橋後の温度応答性の観 点 (膨潤'収縮時の体積変化量、応答速度)から、より好ましい。
[0015] 架橋剤と反応可能な官能基を有する温度応答性高分子としては、温度応答性を発 現する部位と、架橋剤と反応可能な官能基を有する部位との共重合体であることが できる。
[0016] 架橋可能な基の間で架橋可能な温度応答性高分子としては、温度応答性を発現 する部位と、高分子鎖が有する架橋可能な基同士が互いに架橋できる架橋可能な 基を有する部位との共重合体であることができる。
[0017] 架橋可能な基を有さな!/、温度応答性高分子としては、温度応答性を発現する部位 のみ力もなるホモポリマーであってもよぐまた、他のモノマーとの共重合体でもあつ てもよい。用いることのできる架橋剤としては、ラジカル発生基を 2つ以上有している 架橋剤が挙げられる。架橋剤の持つラジカル発生基は、その高い反応性によって、 温度応答性高分子を構成する共有結合のあらゆる部分に架橋剤自身を結合するこ とができる。ラジカル発生基としては、アジド基が挙げられ、架橋剤としては、 2, 6- ビス（アジドベンジリデン）シクロへキサノン、 4, 4 'ージアジドスチルベン 2, 2'ジス ルホン酸ニナトリウムが挙げられる。
[0018] 温度応答性を発現する部位と、架橋剤と反応可能な官能基を有する部位との共重 合体としては、一般式（1)で示される繰り返し単位を持ち、かつ重量平均分子量が 5 00〜5, 000, 000である N アルキル (メタ）アクリルアミド共重合体であることができ る。上記 N アルキル (メタ)アクリルアミド共重合体の、重量平均分子量は好ましくは 、塗布溶液の粘性、架橋後の膨潤性能の観点から、 5, 000-100, 000の範囲であ る。
[0019] [化 3]
Figure imgf000011_0001
一般式（1)において、 R及び Rは、同一または異なっていても良ぐ水素原子また
1 2
は炭素数 1から 4のアルキル基を表し、 Rは、水素原子またはメチル基を表し、 Rは、 前記架橋剤と架橋可能な官能基を有する炭化水素構造を表す。炭素数 1から 4のァ ルキル基は、例えば、メチル基、ェチル基、プロピル基、ブチル基である。 X及び yは 、それぞれ x+y= l、 0く Xく l、0<y< 1を満たす任意の数である。好ましくは、 0. 6< x≤0. 95、 0. 05≤y< 0. 4を満たす任意の数である。 x成分が温度応答性をつ 力さどる化学構造であり、 y成分が架橋反応をつかさどる化学構造である。 0.6< xの 範囲であれば、温度応答性が充分維持できることから好ましい。また、 0.05≤yの範 囲であれば、充分な架橋密度 (耐溶剤性)が得られることから好ましい。さらに、温度 応答性を維持できて、且つ、充分な架橋密度が得られる範囲という観点から、 0.6<x ≤ 0.95及び 0.05≤y< 0.4であることが好ましい。ここで、（メタ）アクリルアミドとは、メタ クリルアミドとアクリルアミドの両方を表す。
[0021] 温度応答性を発現する部位の構造としては、特に制限はないが、温度応答性能の 観点 (膨潤 ·収縮時の体積変化量、応答速度)から、一般式 (1)に含まれる N—アル キル (メタ）アクリルアミド構造が好ましぐさらには、 N—イソプロピルアクリルアミド構 造がより好ましい。また、他の機能性モノマーとの共重合が容易なため、光、電場、 p H変化、溶媒交換、抗原抗体認識などのいろいろな刺激に応答するようにも変更で きる点でも、 N—アルキル (メタ）アクリルアミド構造が好ま 、。
[0022] 温度応答性を発現する部位の具体的な構造としては、例えば、 N—イソプロピル (メ タ）アクリルアミド、 N—ェチル (メタ）アクリルアミド、 N—ノルマルプロピル (メタ）アタリ ルアミド、 N—シクロプロピル (メタ）アクリルアミド、 N, N—ジェチル (メタ）アクリルアミ ド、 N—アタリロイルビペリジン、 N—アタリロイルピロリジン、 N—ビュルイソブチルアミ ド、 2—カルボキシイソプロピル (メタ)アクリルアミド、ポリエチレンォキシドを側鎖に有 する (メタ)アクリルアミド、ポリエチレンォキシドを側鎖に有する (メタ)アタリレートが挙 げられる。上記構造を用いた温度応答性高分子は、固有の相転移を引き起こす温度 (下限臨界温度; LCST)を持っため、所望の転移温度に合わせて、使用する構造を 選択することができる。
[0023] 架橋剤と反応可能な官能基を有する部位の構造としては、架橋剤と反応可能な反 応基 (カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、スクシンイミド基等）を側鎖に持つ (メタ )アタリレート構造または (メタ)アクリルアミド構造であることができる。具体的な構造と ド、（メタ)アクリル酸、グリシジル (メタ)アタリレート、グリシジル (メタ)アクリルアミド、（メ タ）アクリル酸スクシンイミドエステル、 γ—ヒドロキシ酸 (メタ）アタリレート、 γ—ヒドロ キシ酸 (メタ)アクリルアミド、 2—カルボキシイソプロピル (メタ）アクリルアミド等が挙げ られる。架橋剤と反応可能な官能基を有する部位の高分子中におけるモル分率は、 高分子膜の架橋密度、膨潤度を考慮して適宜決定でき、例えば、 1〜50モル％の範 囲とすることができる。
[0024] 架橋剤と反応可能な官能基を有する温度応答性高分子としては、架橋剤と反応可 能な反応基 (ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基等）を、化学構造 の中に元々有する温度応答性高分子は、共重合せずにホモポリマーとしてそのまま 用いることができる。例えば、ポリヒドロキシプロピルアタリレート、ポリビュルアルコー ノレ、メチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレ口 ース、 2—カルボキシイソプロピル (メタ）アクリルアミド、可溶性エラスチンタンパク、ポ リペプチドである Poly(VPGVG) (ここで、 Vはパリン， Pはプロリン， Gはグリシンを表 す)、末端に水酸基を有するポリエチレンォキシド等が挙げられる。上記の温度応答 性高分子は、固有の相転移を引き起こす温度（下限臨界温度; LCST)を持っため、 所望の転移温度に合わせて、使用する高分子を選択することができる。また、生体由 来の温度応答性高分子であるエラスチン、 Poly(VPGVG)、セルロース系高分子は 、ノィォチップとして用いた時には、生体適合性の点から好ましい。
[0025] 架橋剤は、例えば、エポキシ系架橋剤、メラミン系架橋剤、グリコゥリル系架橋剤、ヒ ドロキシ基、カルボキシ基、アジド基またはビニルエーテル基を 2つ以上有する化合 物であることができる。
[0026] エポキシ系架橋剤は、例えば、トリメチロールプロパントリグリシジルエーテル、 1, 2 ーシクロへキサンジカルボン酸ジグリシジルエステル、 1, 2—ナフタレンジカルボン酸 ジグリシジルエステル、 1, 3 ナフタレンジカルボン酸ジグリシジルエステル、 1, 4 ナフタレンジカルボン酸ジグリシジルエステル、 1, 5 ナフタレンジカルボン酸ジグリ シジルエステル、 1, 6 ナフタレンジカルボン酸ジグリシジルエステル、 1, 7 ナフタ レンジカルボン酸ジグリシジルエステル、 1, 8 ナフタレンジカルボン酸ジグリシジル エステル、 2, 3 ナフタレンジカルボン酸ジグリシジルエステル、 2, 6 ナフタレンジ カルボン酸ジグリシジルエステル、 2, 7 ナフタレンジカルボン酸ジグリシジルエステ ル、 1, 4ーシクロへキサンジメタノールジグリシジルエーテル、ビスフエノールー A— ジグリシジルエーテル、ビスフエノール一 S ジグリシジルエーテル、ビス [4— (2, 3 エポキシプロピルチオ）フエ-ル]サルファイド、または 1, 4 ビス（グリシジルォキ シ）ベンゼンであることができる。
[0027] メラミン系架橋剤は、例えば、へキサメトキシメチルメラミン、へキサエトキシメチルメ ラミンまたはへキサプロポキシメチルメラミンであることができる。
[0028] グリコゥリル系架橋剤は、例えば、 1, 3, 4, 6—テトラキス (メトキシメチル)グリコゥリ ル、 1, 3, 4, 6—テトラキス（エトキシメチル)グリコゥリル、または 1, 3, 4, 6—テトラキ ス（プロボキシメチル)グリコゥリルであることができる。
[0029] ヒドロキシル基、カルボキシル基、アジド基またはビュルエーテル基を 2つ以上有す る化合物は、例えば、 1, 2 ジヒドロキシナフタレン、 1, 3 ジヒドロキシナフタレン、 1, 4ージヒドロキシナフタレン、 1, 5 ジヒドロキシナフタレン、 1, 6 ジヒドロキシナ フタレン、 1, 7 ジヒドロキシナフタレン、 1, 8 ジヒドロキシナフタレン、 2, 3 ジヒド ロキシナフタレン、 2, 6 ジヒドロキシナフタレン、 2, 7 ジヒドロキシナフタレン、 1, 3 ーシクロペンタンジオール、 2, 6 キノリンジオール、 2, 3 ジヒドロキシキノキサリン 、 1, 4 ジォキサンジオール、 1, 4ーシクロへキサンジメタノール、ポリビニルアルコ ール、 1, 2 ナフタレンジカルボン酸、 1, 3 ナフタレンジカルボン酸、 1, 4 ナフ タレンジカルボン酸、 1, 5 ナフタレンジカルボン酸、 1, 6 ナフタレンジカルボン酸 、 1, 7 ナフタレンジカルボン酸、 1, 8 ナフタレンジカルボン酸、 2, 3 ナフタレン ジカルボン酸、 2, 6 ナフタレンジカルボン酸、シクロへキサンジカルボン酸、テレフ タル酸、 1, 2 シクロペンタンジカルボン酸、 2, 5 チォフェンジカルボン酸、 2—メ チルー 3, 4 キノリンジカルボン酸、 9, 10 アントラセンジカルボン酸、ジヒドロアン トラセン 9, 10 ジカルボン酸、クェン酸、こはく酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸 、 2, 6 ビス（4 アジドベンジリデン）シクロへキサノン、ビス（4 ビ-ロキシブチル） テレフタレートまたはビス（4 ビ-ロキシブチル）アジペートであることができる。
[0030] 架橋剤の含有量は、温度応答性高分子膜の架橋密度、膨潤度を考慮して適宜決 定でき、例えば、温度応答性高分子 100重量部に対して、 0. 5〜50重量部の範囲と することができる。 400nm力ら 600nmの光〖こ対して、透明'無蛍光な架橋剤の方が 、光学顕微鏡観察'蛍光観察を妨げないので、より好ましい。また、水溶性の架橋剤 を用いると、塗布溶媒に水を用いることができ、有機溶媒を用いるよりも環境負荷の 観点から好ましい。また、耐溶剤性の低い基板の上にも塗布できるようになる点で好 ましい。
[0031] 以上、（1)の方法 [温度応答性高分子を含有する組成物を用いる方法]について説 明をしたが、（2)の方法 [温度応答性高分子形成用モノマーを含有する組成物を用 いる方法]において用いる温度応答性高分子形成用モノマーは、上記高分子の構成 成分としていて説明した各構造を含むモノマーであることができる。
[0032] 例えば、温度応答性を発現する部位を含むモノマーとしては、 N—イソプロピル (メ タ）アクリルアミドモノマー、 N—ェチル (メタ）アクリルアミドモノマー、 N—ノルマルプロ ピル (メタ）アクリルアミドモノマー、 N—シクロプロピル (メタ）アクリルアミドモノマー、 N , N—ジェチル (メタ）アクリルアミドモノマー、 N—アタリロイルビペリジンモノマー、 N —アタリロイルピロリジンモノマー、 N—ビニルイソブチルアミドモノマー、 2—カルボキ シイソプロピル (メタ)アクリルアミドモノマー、ポリエチレンォキシドを側鎖に有する (メ タ）アクリルアミドモノマー、ポリエチレンォキシドを側鎖に有する (メタ）アタリレートモノ マーを挙げることができる。
[0033] 架橋剤と反応可能な官能基を有する部位を含むモノマーとしては、ヒドロキシェチ ル (メタ）アタリレートモノマー、ヒドロキシェチル (メタ）アクリルアミド、 （メタ）アクリル酸 モノマー、グリシジル (メタ）アタリレートモノマー、グリシジル (メタ）アクリルアミドモノマ 一、（メタ）アクリル酸スクシンイミドエステルモノマー、 γ —ヒドロキシ酸 (メタ）アタリレ ートモノマー、 γ—ヒドロキシ酸 (メタ）アクリルアミドモノマー、 2—カルボキシイソプロ ピル (メタ）アクリルアミドモノマーを挙げることができる。
[0034] (2)の方法で用いる架橋剤は、（1)の方法で挙げたもの同様である。さらには、 2個 以上の重合基を有している化合物を架橋剤として用いることができる。具体的には、 ビス (メタ）アクリルアミドモノマー、ビス (メタ）アタリレートモノマーが挙げられる。また、 架橋剤の含有量は、（1)の高分子についての説明を基礎に適宜決定できる。 [0035] (塗膜の形成）
塗膜の形成は、（1)の方法では、前記 (a)〜(c)の何れか温度応答性高分子を含 有する組成物を溶剤に溶解し、これを基板に塗布することで行われる。また、（2)の 方法では、対応するモノマーを含有する組成物を溶剤に溶解し、これを基板に塗布 することで行われる。但し、溶媒を使用せずに塗膜を形成することができる場合もある 。その場合は、溶媒を使用せずに塗膜を形成してもよい。
[0036] 組成物を塗布する際に溶解する溶剤としては、例えば、水、メタノール、エタノール 、 1ーメトキシー 2—プロパノール、エチレングリコーノレモノメチノレエーテル、メチノレセロ ソルプアセテート、トルエン、キシレン、ジアセトンアルコール、シクロへキサノン、 2— ヒドロキシプロピオン酸ェチル、 2—ヒドロキシ 2—メチルプロピオン酸ェチル、ェトキ シ酢酸ェチル、ヒドロキシ酢酸ェチル、 2 ヒドロキシー 3 メチルブタン酸メチル、 3— メトキシプロビオン酸メチル、 3—メトキシプロビオン酸ェチル、 3—エトキシナロビオン 酸ェチル、 3—エトキシプロピオン酸メチル、ピルビン酸メチル、ピルビン酸ェチル、酢 酸ェチル、酢酸ブチル、乳酸ェチル、乳酸ブチルを用いることができる。これらの溶 剤は単独で、または 2種以上の組合せで使用することができる。溶媒の量は、所望の 溶液粘度、得られる塗膜厚さ等を考慮して適宜決定でき、例えば、温度応答性高分 子 100重量部に対して、 100〜5000重量部の範囲とすることができる。特に、架橋 剤が水溶性の場合、溶剤に水を用いると、有機溶媒を用いるよりも環境負荷の観点 力も好ましい。また、耐溶剤性の低い基板の上にも塗布できるようになる点で好ましい
[0037] 塗膜を形成する基板は、例えば、シリコン基板、ガラス基板、プラスチック基板、マイ 力基板、セラミック基板、または金属基板であることができる。
[0038] 基板と温度応答性高分子膜間をしつかりと架橋反応によって固定するために、ガラ ス基板、シリコンウエノ、、石英基板の場合は、表面処理剤として、ヒドロキシル基、カル ボキシル基、エポキシ基またはアミノ基等を末端に有するシランカップリング剤を用い ることが好ましい。金基板の場合は、ヒドロキシル基またはカルボキシル基またはェポ キシ基またはアミノ基等を末端に有するチオールィ匕合物を用いることが好ま 、。マ イカ基板、プラスチック基板の場合は、表面処理剤の代わりに、酸素プラズマ処理、 または uv処理、またはオゾン処理を行うことによって、基板表面にヒドロキシル基や カルボキシル基を形成する処理を行うことが好ましい。
[0039] (架橋および穴パタン形成）
基板に形成された塗膜を架橋（（2)の場合はモノマーの重合および架橋)および穴 ノ タン形成は、穴パタンの形成方法によって、手順が一部異なる。
穴パタン形成は、例えば、フォトリソグラフィ一法、エンボス加工法、スクリーン印刷 法、コンタクトプリント法またはインクジェット法により行うことができる。
[0040] フォトリソグライ一法では、塗膜形成後、マスクを介してフォトリソグラフィーを行うこと によって行われる。また、インクジェット印刷や、マスクを介してのスクリーン印刷によ つても行われる。これら以外にも、凹凸を有するスタンパーの凸部に上記塗布溶液を 塗り、基板に押し当てて、溶液を転写するコンタクトプリント法や、塗膜を基板上に形 成後、凹凸を有するスタンパーを押し当てて、凹凸パタンを転写するエンボス加工法 によっても行われる。また、上記工程によって形成される穴は、塗膜を完全に貫通し ていても、貫通していなくてもよい。
[0041] フォトリソグラフィ一法を用いた穴パタン形成工程
以下、酸発生剤を使用したフォトリソグラフィ一法について説明する。この方法では 、塗膜の形成を、上記感熱応答性高分子含有組成物または感熱応答性高分子形成 用モノマー含有組成物及び酸発生剤を溶剤に溶解した溶液を基板上に塗布して行 われ、得られた塗膜にマスクを介して酸発生剤を活性化させる放射線を照射し、酸触 媒が発生した部分の架橋反応を加熱によって進行させ、現像によって未架橋部分を 溶解除去することによって、穴パタンを形成する。
[0042] 酸発生剤は、活性放射線照射により酸を発生するものであれば良ぐ活性放射線 は、例えば、水銀ランプ光、電子線、エキシマレーザー、 X線、またはキセノンランプ であることができる。
[0043] 酸発生剤は、活性放射線照射により酸を発生するものであれば良ぐ例えば、トリフ ェニルスルホニゥムトリフレート、トリフエニルスルホニゥムノナフレート、フエニルジメチ ルスルホ -ゥムトリフレート、トリメチルスルホ -ゥムトリフレート、ジヒドロナフチルジメチ ルスルホニゥムトリフレート、ジフエ二ルョードニゥムトリフレート、トリフエニルスルホニ ゥムカンファースルホン酸塩等のォ-ゥム塩、 N—トリフルォロメタンスルホ-ルォキシ ナフチルイミド、 N—メタンスルホ-ルォキシナフチルイミド等のスルホ-ルォキシイミ ド、 2, 4, 6 トリス（トリクロロメチル） 1, 3, 5 トリァジン、さらにはスルホン酸エス テル等を挙げることができる。 400nm力 600nmの光に対して、透明'無蛍光な酸 発生剤の方が、光学顕微鏡観察'蛍光観察を妨げないので、より好ましい。また、水 溶性の酸発生剤を用いると、塗布溶媒に水を用いることができ、有機溶媒を用いるよ りも環境負荷の観点力も好ましい。また、耐溶剤性の低い基板の上にも塗布できるよ うになる点で好ましい。酸発生剤の含有量は、パタン形成に必要な露光感度を考慮 して適宜決定でき、例えば、感熱応答性高分子 100重量部に対して、 0. 1重量部か ら 20重量部の範囲とすることができる。
[0044] 組成物及び酸発生剤を溶解する溶剤は、前記塗膜の形成で説明したものと同様の 物を用いることができる。特に、架橋剤と酸発生剤を共に水溶性のものを用いて、溶 剤に水を用いると、有機溶媒を用いるよりも環境負荷の観点力も好ましい。また、耐 溶剤性の低 、基板の上にも塗布できるようになる点で好ま 、。
現像に用いる現像液としては、未架橋部分の温度応答性高分子を溶解できるもの であれば、特に制限はなぐ例えば、 LCST以下の温度の水、メタノール、エタノール 、 1ーメトキシー 2—プロノ ノーノレ、エチレングリコーノレモノメチノレエーテノレ、メチノレセロ ソルプアセテート、トルエン、キシレン、ジアセトンアルコール、シクロへキサノン、 2— ヒドロキシプロピオン酸ェチル、 2—ヒドロキシ 2—メチルプロピオン酸ェチル、ェトキ シ酢酸ェチル、ヒドロキシ酢酸ェチル、 2 ヒドロキシー 3 メチルブタン酸メチル、 3— メトキシプロビオン酸メチル、 3—メトキシプロビオン酸ェチル、 3—エトキシナロビオン 酸ェチル、 3—エトキシプロピオン酸メチル、ピルビン酸メチル、ピルビン酸ェチル、酢 酸ェチル、酢酸ブチル、乳酸ェチル、乳酸ブチル、またはテトラメチルアンモ -ゥム ハイドロォキシド水溶液を用いることができる。これらの溶剤は単独で、または 2種以 上の組合せで使用することができる。現像時間は、 10秒から 30分の範囲とすることが できる。
[0045] 塗膜の形成は、上記感熱応答性高分子組成物及び酸発生剤を溶剤に溶解した溶 液を基板上に塗布して行われ、溶液を滴下した基板は、回転することによって溶媒を 蒸発させて塗膜を得る。回転による溶媒の蒸発は、例えば、回転によって生じる気流 によって、さらには、外部からヒーターによって加熱を行うことによって行うことができる
[0046] スピンコーターの回転速度は、所望の塗膜厚さを考慮して適宜決定でき、例えば、 500〜8000rpmの範囲とすることができる。また、ここで得られた塗膜厚さ力 フォトリ ソグラフィ一によつて得られる度応答性高分子の穴パタンの深さとなるため、塗膜厚さ をコントロールすることによって、任意の穴パタンの深さを持ったチップを作製すること ができる。
[0047] 現像液に水を用いると、有機溶媒を用いるよりも環境負荷の観点から好ましい。ま た、耐溶剤性の低い基板でも使用できるようになる点で好ましい。また、解像性の向 上のためにも好ましい。通常、現像後には、架橋し不溶化した部分にも現像液が浸 透し、膨潤状態となっている。その状態で、現像液を除去すると、パタン形状が崩れ たり、パタン同士がくっつきあったりして、高い解像性が得られない。しかし、現像時 に水を用いた場合は、現像後に、水を除去する時点で、ー且、水の温度を LCST以 上にすると、膨潤していたパタン内部力も水が追い出され、収縮し硬くなる。そのため 、ノ タン崩壊を防ぐことができ、高い解像性が得られる。
[0048] スクリーン印刷法、インクジェット法、コンタクトプリント法またはエンボスカ卩工法を用い た穴パタン形成工程
以下、スクリーン印刷法、インクジェット法、コンタクトプリント法またはエンボスカロェ 法を用いた穴パタン形成工程について説明する。この方法では、塗膜の形成を、上 記感熱応答性高分子組成物を溶剤に溶解した溶液を基板上に塗布し、穴パタンを 形成した後、架橋反応を進行させる。
[0049] スクリーン印刷法では、マスクを介して上記溶液を基板にスクリーン印刷し、穴パタ ンを有する塗膜を形成する。インクジェット法では、穴パタン以外の部分に溶液を射 出し、穴パタンを有する塗膜を形成する。コンタクトプリント法では、凹凸を有するスタ ンパーの凸部に上記塗布溶液を塗り、基板に押し当てて溶液を転写し、穴パタンを 有する塗膜を形成する。エンボス加工法では、上記溶液をスピン塗布し塗膜を基板 上に形成後、凹凸を有するスタンパーを押し当てて、凹凸パタンを転写し、穴パタン を有する塗膜を形成する。
[0050] 穴パタンを有する塗膜の加熱による架橋は、塗膜が酸触媒を含まない場合には、 例えば、ホットプレートもしくはベーク炉を用いて、 170°C以上 300°C以下の温度範 囲で、 30分以上 24時間以内で行うことができる。また、塗膜が酸触媒を含む場合に は、穴パタンの加熱による架橋は、ホットプレートまたはべ一ク炉を用いて、 90°C以 上 170°C未満で 10秒以上 30分未満の間行うことができる。ここで、酸触媒とは、塗布 溶液中に酸を直接添加しておいたものでも良ぐ前記酸発生剤を含む塗膜への放射 線の照射によって発生する酸でも良い。このようにして穴パタン付き塗膜を有する基 板を得ることができる。
[0051] モノマーを使用する場合は、塗布溶液中に重合開始剤を含ませる。重合開始剤に よって、架橋反応と同時に重合反応を進行させることができる。重合開始剤としては、 ァゾイソブチ口-トリル、ァゾイソブチロ酪酸、過酸化ベンゾィルが挙げられる。
[0052] (チップ）
本発明のチップは、温度応答性高分子の架橋生成物を構成成分とし、かつ穴バタ ンを有する膜を基板表面に有するチップであり、上記本発明の製造方法により得られ る。このチップは、塗膜温度を制御することにより、穴パタンの穴の大きさを、開閉する ことで、穴内に、たとえば、生体物質等を包接し、または穴力 生体物質等を解放す るために用いられる。穴パタンを有する膜の厚み、穴の大きさ、深さ、形状、密度、配 置 (パタンの形状)等は、目的に応じて、基板上に保持したい所望の対象物に合わせ て、適宜決定できる。穴パタンを有する膜の厚みは、例えば、 ΙΟηπ！〜 100 mの範 囲であることができる。穴パタンの穴の形状は円形または矩形 (例えば、正方形、長 方形、六角形）、ひょうたん型、星型であることができ、穴の密度は、例えば、 1cm2当 たり 1個〜 1, 000, 000, 000個とすること力できる。穴の面積としては、 lnm2以上 1 cm2以下が挙げられる。穴の大きさは、内接する円の直径が1011111〜1000 111の範 囲とすることができ、穴の形状が円の場合は、直径を、例えば、 ΙΟηπ！〜 1000 mの 範囲とすることができる。これらの範囲は、好ましくは、 ΙΟΟηπ！〜 20 mの範囲であ る。穴パタンの穴の深さは、例えば、 10nm〜100 mの範囲である。
[0053] 本発明のチップにぉ ヽては、組成物を塗布する基板は、組成物が塗布される表面 の、塗膜が有することになる少なくとも一部の穴の下部に相当する部分に凹部を有す るものであることができる（図 11)。または、塗膜を基板に塗布した後、塗膜が有する 少なくとも一部の穴の下部に相当する基板部分に、後から凹部を形成することもでき る。このようなチップでは、塗膜の穴の下部に基板の凹部があり、塗膜の穴と基板の 凹部とで、ひとつのゥエルを形成する。そして、温度変化により穴の径が小さくなつた ときに、ゥエル内に保持された物質が、基板の凹部で保持されることもできる。塗膜の 穴と基板の凹部の断面形状は同一であっても異なっていても良い。また、塗膜の穴と 基板の凹部の径も、同一であっても異なっていても良い。基板の凹部の深さは、保持 すべき物質に応じて適宜決定でき、例えば、 0. 1〜： LOO /z mの範囲とすることができ る。また、基板の凹部の底部は、水平であっても、半球状または底部の中心を軸とし た回転形状 (例えば、三角錐状)等であっても良い。あるいは、基板の凹部は、基板 の反対面まで通じる貫通孔を有することもできる。貫通孔は開閉自在の栓または蓋を 有することもでき、貫通孔の断面は、基板の凹部の断面より小さいか、同一であるか、 または大きくてもよい。
[0054] 上記の塗膜の穴の下部に基板の凹部があり、塗膜の穴と基板の凹部とで、ひとつ のゥエルを形成する本発明のチップは、以下のように形成することができる。
上記感熱応答性高分子組成物及び酸発生剤を溶剤に溶解した溶液を平らな基板 上に塗布し、上記フォトリソグラフィ一によつて穴パタンを形成する。次に、穴パタンを 形成した塗膜を、エッチングマスクとして利用し、穴の下部に露出している基板部分 をウエットエッチング、またはドライエッチング等で所望の深さまでエッチングする。こ の方法は、基板に凹部を形成した後、塗膜の穴部をその位置に合わせて作成する 方法より、位置合わせが容易に高精度に行える点好ま 、。
[0055] 本発明のチップにおいては、穴パタンの穴は、その中の基板表面上に、塗膜とは 独立した前記組成物で形成されたドットを有することもできる（図 12)。穴パタンを有 する塗膜を形成する架橋生成物と、ドットを形成する架橋生成物とは、同一組成であ つても、異なる組成であってもよい。穴の中にドットを有する本発明のチップは、以下 のように形成することができる。
[0056] 上記感熱応答性高分子組成物及び酸発生剤を溶剤に溶解した溶液を平らな基板 上に塗布し、上記フォトリソグラフィ一によつて穴パタンを形成する。次に、穴パタンを 形成した塗膜に対し、インクジェット法により、穴パタン位置に感熱応答性高分子組 成物を射出し、穴内部にドットを形成させた後、熱架橋させる。穴パタンの穴の中の 基板表面上にドットを有するチップでは、図 10に示すように、架橋生成物が膨張して
、穴の径が小さくなると同時に、ドットを形成する架橋生成物も膨張して、穴の深さが 浅くなる。
[0057] 本発明のチップにおいて扱う物質は、例えば、生体物質であることができ、生体物 質としては、特に制限はないが、例えば、リンパ球、表皮細胞、肝細胞、神経細胞、 幹細胞等の細胞、タンパク質、染色体、 DNA等が挙げられる。また、これら生体物質 を、ビーズ粒子等の担体に固定ィ匕したものであることもできる。
[0058] 本発明のチップは、膜温度の一部分、または全体を変化させることにより、膜の一 部分、または全体を膨潤または収縮させて、穴パタンの穴の大きさを任意に変化させ ることができる。これにより、前記穴パタンの穴に格納された生体物質を、膜温度の変 化により、穴パタンの穴において、包接した状態にする力、または解放した状態にす ることがでさる。
[0059] 本発明は、本発明のチップの膜温度を、前記チップが有する穴パタンの穴の径を、 生体物質が格納可能な大きさになる温度に制御し、前記穴パタンの穴に生体物質を 格納し、次いでチップの膜温度を、前記生体物質を格納した穴の径を、生体物質を 包接する温度に制御することを含む、チップの穴パタンに生体物質を包接する方法 を包含する。さらに本発明は、この方法で生体物質を包接したチップの膜温度を、前 記チップが有する穴パタンの穴の径を、生体物質を解放可能な大きさになる温度に 制御することを含む、チップに包接された生体物質を解放する方法を包含する。
[0060] 未架橋の温度応答性高分子は、それぞれの化学構造固有の下限臨界点温度 (LC ST)を有して 、る。下限臨界点温度以下の温度では分子表面が親水性あるいは水 溶性を呈して水に溶けるが、臨界点温度以上の温度では分子表面が疎水性を示す ので水中に析出する。上記本発明のチップに用いた温度応答性高分子を架橋させ た塗膜も、塗膜形成に用いた感熱応答性高分子の化学構造に対応した上記の LCS Tを有する。 LCST以上の温度環境にすると、塗膜が疎水性を示し膜内部から水を 追い出すことによって、塗膜は収縮状態となる。また、上記 LCSTより低い温度環境 にすると、膜表面が親水性を示し、膜内部に水を取り込むことによって、塗膜は膨潤 状態となり、体積は増大する。
[0061] 例えば、 N—イソプロピルアクリルアミド高分子の下限臨界点温度は約 32°Cであり、 N—イソプロピルアクリルアミド構造を有する感熱応答性高分子を用いた本チップを、 LCST以上の 35°C付近に保持するとことで、塗膜は収縮し、穴パタンは広がった状 態となる。穴パタンより小さい生体物質をチップ上に播種すると、生体物質を容易に 穴の中に入れることができる。また、穴の中に入っていた生体物質を容易に取り出す ことちでさる。
[0062] それに対し、本チップを LCSTよりも低い 20°C付近に保持すると、塗膜は膨潤し、 穴パタンは狭まった状態、または、完全に閉じた状態となる。穴の中に入っていた生 体物質を直接掴んだり、穴力も出に《したりすることができる。また、生体物質を穴の 中に入れな 、ようにすることができる。
[0063] 本チップを LCST以上に保持する手段としては、 LCST以上の恒温槽に基板を入 れる、または LCST以上のプレート上に基板を置く方法が挙げられる。また、チップ全 体を LCST以上に保持する必要はなぐ穴パタンを広げたい部分の周辺の塗膜のみ 、赤外線レーザーの照射や小型のヒーターで局所的に加熱し、 LCST以上にするこ とも可能である。
[0064] 本チップを LCSTより低 、温度にする手段としては、 LCSTより低 、温度の恒温槽 に基板を入れる、または LCSTより低い温度のプレート上に基板を置く方法が挙げら れる。また、チップ全体を LCSTより低い温度にする必要はなぐ穴パタンを狭めたい 部分の周辺の塗膜のみ、 LCSTより低 、温度の液体をピペットやシリンジ等の先端か ら流し込み接触させる方法や、小型のペルチェ素子を用いて局所的に冷却する方法 も可能である。
実施例
[0065] 以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例 1
橋剤 ] ^ τ な ] ^ 有する淄 > の )^ N—イソプロピルアクリルアミド 0. 91g (8. 0 X 10 モル）と、ヒドロキシェチルアタリ レート 0. 23g (2. 0 X 10— 3モル）をテトラヒドロフラン 30mlに溶解し、 10分間窒素パブ リングを行った。続いて、重合開始剤として 2, 2'—ァゾビス (イソブチ口-トリル) 0. 0 4gを加え、窒素雰囲気下、 70°Cで加熱還流して、 6時間重合を行った。重合後、 n —へキサン 300mlに溶液を注ぎ、高分子を析出させ、濾別、乾燥して、白色の高分 子を得た。得られた高分子の構造は、種々の分析法力 N—イソプロピルアクリルァ ミド構造のモル分率 80%、ヒドロキシェチルアタリレート構造のモル分率 20%の高分 子（1)であることがわかった。ゲルパーミエーシヨンクロマトグラフィー（GPC)によりテ トラヒドロフラン中で、この高分子のポリスチレン換算の分子量を調べたところ、重量平 均分子量が 63, 000、数平均分子量が 45, 000であった。
[0066] [化 4]
Figure imgf000024_0001
[0067] 実施例 2
i¾ を する溻. ^ 7 、塗 溶液のィ乍 上記で合成した温度応答性高分子（1) 100重量部と、架橋剤としてへキサメトキシ メチルメラミン 30重量部と、光酸発生剤としてトリフエ-ルスルホ -ゥムトリフレート 10 重量部を、溶媒としてジアセトンアルコール 250重量部に溶解し、これを孔径 0. 40 μ mのテフロンフィルターを用いて濾過し、塗布溶液とした。
[0068] 実施例 3
淄 >早による パタン开^ …フォトリソグラフィー
ヒドロキシル基を末端に有するシランカップリング剤で表面処理したガラス基板上に
、上記の塗布溶液をスピンコーターの回転速度 3000rpmでスピン塗布した。塗布後 120°Cで 5分間加熱処理して溶媒を揮発させ、膜厚 2 mの塗膜を得た。高圧水銀 ランプを光源とするマスクァライナを用いて、マスクを介してこの塗膜への露光を行つ た。露光後 120°Cで 5分間加熱処理を行い、露光によって酸が発生した部分のみ、 酸触媒反応による架橋反応を進行させた。その後、 15°Cの水を用いて、未架橋部分 を溶解除去する現像処理を 2分間行った。続いて、現像液の温度を下限臨界温度以 上の 35°Cに上げ、塗膜から水を追い出し収縮させた状態で現像を終了し、基板を 1
20°Cで 30分加熱乾燥した。その結果、直径 m、深さ 2 mの温度応答性高分 子による穴パタンを 250, 000個/ cm2の密度で基板上に作製した。
[0069] 実施例 4
淄 >早による パタン开 (2) . . ·インクジェット
上記で合成した温度応答性高分子（1) 100重量部と、架橋剤としてへキサメトキシ メチルメラミン 30重量部と、光酸発生剤としてトリフエ-ルスルホ -ゥムトリフレート 10 重量部を、溶媒としてジアセトンアルコール 900重量部に溶解し、これを孔径 0. 40 /z mのテフロンフィルターを用いて濾過し、塗布溶液とした。ヒドロキシル基を末端に 有するシランカップリング剤で表面処理したガラス基板上に、インクジェットプリンタを 用いて上記の塗布溶液を穴パタン状に拭きつけた。吹き付け後、キセノン水銀ランプ によって全面を露光し、 120°Cで 5分間加熱処理を行った。その結果、吹き付けられ た温度応答性高分子は架橋反応によってしつかりと基板に固定され、直径 100 m 、深さ 0. 5 mの穴パタンを 2, 500個/ cm2の密度で基板上に作製できた。
[0070] 実施例 5
温度 答件高分子による穴パタン形成 (3) · · ·スクリーン印膽去
上記で合成した温度応答性高分子（1) 100重量部と、架橋剤としてへキサメトキシ メチルメラミン 30重量部と、光酸発生剤としてトリフエ-ルスルホ -ゥムトリフレート 1重 量部を、溶媒としてジアセトンアルコール 100重量部に溶解し、これを孔径 0. 40 μ mのテフロンフィルターを用いて濾過し、塗布溶液とした。
ヒドロキシル基を末端に有するシランカップリング剤で表面処理したガラス基板上に 、スクリーン印刷用マスクを介し、上記の塗布溶液を用いて穴パタン状にスクリーン印 刷を行った。印刷後、キセノン水銀ランプによって全面を露光し、 120°Cで 5分間加 熱処理を行った。その結果、印刷された温度応答性高分子は架橋反応によってしつ 力りと基板に固定され、直径 100 μ m、深さ 2 μ mの穴パタンを 2, 500個/ cm2の密 度で基板上に作製できた。
[0071] 作製したチップの温度 答件の評価
上記フォトリソフグラフィ一法によって作成した穴パタンを有するチップ上に水を滴 下した後、種々の温度にチップを保ちながら、穴の大きさの変化を観察した。その結 果を図 1に示す。チップ温度を LCSTより高温側 (約 35°C)にすると、温度応答性高 分子は収縮し、穴パタンの直径は約 10 /z m 深さは 2 /z mとなった。チップ温度を LC STより低温側 (約 15°C)にすると、温度応答性高分子が縦'横方向ともに膨潤しはじ め、約 10秒後には、穴パタンの直径は 6 /z mへと縮まり、深さは 6 /z mとなった。また、 この収縮'膨潤挙動は、チップ温度の変化に伴って、何度も繰り返し行えることがわ かった。
[0072] 実施例 6
ポリスチレンビーズ 用いた ,験
上記フォトリソフグラフィ一法によって作成した穴パタンを有するチップを用い、微小 な物体の保持実験を行った。ここでは、直径 10 mのポリスチレンビーズを用い、ビ ーズ 1個ずつをそれぞれ分離してチップ上に固定化'配列することを検討した。その 結果を図 2に示す。はじめに、チップ温度を高温 (約 35°C)に保持した状態で、ビー ズ懸濁液を滴下し、ビーズの自然沈降を 5分間待った。次に、チップ温度を低温 (約 15°C)に下げることにより、温度応答性高分子を膨潤させ、穴の中に入ったビーズの みをしつかりと掴んだ。その後、ビーカーに入れた 15°Cの水でチップを洗浄し、掴ま れていない余分なビーズを洗い流した。洗浄時に、チップを低温に保持しておくと、 穴の中のビーズは膨潤した温度応答性高分子によってしつ力りと掴まれているので、 強く洗っても流れ去ることがな力つた。その結果、穴パタン部分のみに 1個ずつのビ ーズをそれぞれ分離して固定ィ匕することができた。また、チップ温度を高温 (約 35°C) に戻すと、温度応答性高分子は収縮し、再びビーズを解放することができた。
[0073] さらに、キヤビラリ一による吸引によって、チップ上から任意のビーズ 1個のみを回収 することを試みた。回収時には、チップ温度を高温にすることで、穴の直径が拡がり 高さも低くなることから、回収用キヤビラリ一の先端をビーズに容易に接近させること ができ、確実にビーズを回収することができた。
ここでは、直径 10 mのポリスチレンビーズを用いた力 穴パタンのサイズを変更す ることで、任意のサイズのビーズや微粒子を保持 '配列'回収することができる。また、 コンビナトリアル合成によって作製した、多種のペプチド ·糖鎖 ·オリゴ DNAを結合さ せた複数のビーズ、微粒子も保持 ·配列 ·回収することができる。
[0074] 実施例 7
免疫細朐を用いた保持 験
上記フォトリソフグラフィ一法によって作成した穴パタンを有するチップを用い、微小 な生体材料の保持実験を行った。ここでは、マウスカゝら取り出したリンパ球 (B細胞' · · 直径約 6 μ m)を用い、リンパ球 1個ずつをそれぞれ分離してチップ上に保持すること を検討した。はじめに、チップ温度を高温 (約 35°C)に保持した状態で、リンパ球懸濁 液を滴下し、リンパ球の自然沈降を 5分間待った。次に、チップ温度を低温 (約 15°C) に下げることにより、温度応答性高分子を膨潤させ、穴の中に入ったリンパ球のみを 掴んだ。その後、ビーカーに入れた 15°Cの PBSバッファーでチップを洗浄し、掴まれ ていない余分なリンパ球を洗い流した。その結果、穴パタン部分のみに 1個ずつのリ ンパ球をそれぞれ分離して固定ィ匕することができた。この時の細胞保持率は、約 16 %であった。ここでいう細胞保持率とは、チップ上の穴の中に保持されている細胞の 数 Zチップ上の穴の数 X 100であらわされる。また、チップ温度を高温 (約 35°C)に 戻すと、温度応答性高分子は収縮し、再びリンパ球を解放することができた。その結 果を図 3に示す。
[0075] さらに、キヤビラリ一による吸引によって、チップ上から任意のリンパ球 1個のみを回 収することを試みた。回収時には、チップ温度を高温にすることで、穴の直径が拡が り高さも低くなることから、回収用キヤビラリ一の先端をリンパ球に容易に接近させるこ とができ、確実にリンパ球を回収することができた。
ここでは、生体材料としてリンパ球を用いた力 穴パタンのサイズ'形状を変更する ことで、その他の血球細胞、大腸菌、染色体等を保持 ·配列 ·回収することができた。 また、蛍光染色や磁気ラベルした生体材料も保持 ·配列 ·回収することができた。 [0076] 実施例 8
転移温度の制御 験
上記フォトリソフグラフィ一法によって作成した穴パタンを有するチップの転移温度（ チップ上に固定された温度応答性高分子が膨潤状態から収縮状態へ、または収縮 状態力 膨潤状態へ変化する温度)を、チップ温度を変化させながら膨潤 ·収縮の様 子を顕微鏡で観察することによって詳細に調べた。その結果、温度応答性高分子（1 )を用いて作成したチップの転移温度は、約 28°Cであることがわ力つた。
[0077] それに対して、 N—イソプロピルアクリルアミドの代わりに、 N—イソプロピルメタタリ ルアミドを用いて合成した温度応答性高分子 (合成方法は、温度応答性高分子（1) の N—イソプロピルアクリルアミドを N—イソプロピルメタクリルアミドに代えたことを除 いて、同じ合成方法を反復した)を用いて作成したチップの転移温度は、約 39°Cで あることがわかった。
[0078] また、 N—イソプロピルアクリルアミドの代わりに、 N—ノルマルプロピルアクリルアミ ドを用いて合成した温度応答性高分子 (合成方法は、温度応答性高分子（1)の N— イソプロピルアクリルアミドを N—ノルマルプロピルアクリルアミドに代えたことを除いて 、同じ合成方法を反復した)を用いて作成したチップの転移温度は、約 16°Cであるこ とがわかった。
[0079] 温度応答性高分子を変更することで、所望の転移温度を有するチップが得られる 力 細胞やタンパク質のような生体材料を扱う場合は、死滅や変性を起こさないように 、転移温度が、 0°Cより高く 45°Cより低い範囲に存在することが好ましかった。
[0080] 実施例 9
穴パタンの深さの制御実験
上記フォトリソフグラフィ一法によって形成される穴パタンの深さは、スピン塗布時の 温度応答性高分子の膜厚に相当するため、塗膜形成時の膜厚をコントロールするだ けで、容易に穴の深さを制御できる。塗布溶液の高分子濃度を変更し、スピンコータ 一の回転速度を 3000rpmとした時に得られる塗膜の膜厚を図 4に示す。また、塗布 溶液の高分子濃度を 33wt%とし、スピンコーターの回転速度を変更した時に得られ る塗膜の膜厚を図 5に示す。 [0081] 実施例 10
膜厚による体穑增加量の制御 験
上記フォトリソフグラフィ一法によって形成される穴パタンの深さ（温度応答性高分 子の膜厚に相当）によって、膨潤時の体積変化量を制御することができ、それによつ て、膨潤時の穴パタンの直系や深さを制御することができる。温度応答性高分子の 膜厚が厚いほど体積増加量は大きくなり、薄いほど小さくなる。直径 10 ;ζ ΐη、深さ (膜 厚） 2 m、ピッチ 20 μ mの温度応答性高分子による穴パタンを作成した場合、膨潤 時には、温度応答性高分子の体積増加によって穴パタンが縮まり、直径 6 ;ζ ΐη、深さ (膜厚） 6 μ mの穴パタンとなった。それに対して、直径 10 m、深さ（膜厚） 5. 5 m 、ピッチ 20 mの温度応答性高分子による穴パタンを作成した場合は、膨潤時には 、温度応答性高分子の大きな体積増加によって、膜厚が 16 mになり、さらに穴バタ ンを完全に閉じることができた。
[0082] 実施例 11
パタンの'深さの吿 II御による糸田 保持 の .
上記フォトリソグラフィ一法で作成した直径 10 μ m、深さ（膜厚） 2 μ mの温度応答 性高分子による穴パタンを有するチップを用いて行った免疫細胞の保持実験では、 細胞保持率が約 16%であった。細胞や染色体といった生体材料は、ポリスチレンビ ーズゃ金属微粒子などと比べて、柔らかく変形しやすい。そのため、穴パタンの深さ が浅いと、細胞を掴む過程や洗浄過程などで、細胞が若干変形して穴力 抜け出て しまう可能性がある。そこで、穴の深さを変更 (温度応答性高分子の膜厚を変更)する ことで、細胞保持率の向上を試みた。
直径 10 ;ζ ΐη、深さ (膜厚)を 2 m力も 3. 5 mに変更した温度応答性高分子によ る穴パタンを有するチップを上記フォトリソグラフィ一法で作成した。穴の深さ (膜厚） の変更は、スピン塗膜形成時の塗布溶液の高分子濃度を 28wt%から 33wt%に変 更することで行った。
[0083] 次に、マウス力 取り出したリンパ球 (B細胞 · · ·直径約 6 m)を用い、リンパ球 1個 ずつをそれぞれ分離してチップ上に保持することを検討した。はじめに、チップ温度 を高温 (約 35°C)に保持した状態で、リンパ球懸濁液を滴下し、リンパ球の自然沈降 を 5分間待った。次に、チップ温度を低温 (約 15°C)に下げることにより、 NIPAAmを 膨潤させ、穴の中に入ったリンパ球のみを掴んだ。この時、深さ（膜厚） 2 /z mの穴パ タンのチップに比べ、 3. 5 mの穴パタンのチップは、温度応答性高分子の膜厚が 厚いため、大きな体積増加が得られ、免疫細胞が膨潤した温度応答性高分子に完 全に包まれ、さらに、穴も完全に閉じた状態となった（図 6)。
[0084] また、本実験に用いた温度応答性高分子（1)、架橋剤 (へキサメトキシメチルメラミ ン）、酸発生剤（トリフエ-ルスルホ -ゥムトリフレート）は、全て 400nm力ら 600nmの 光に対して透明 *無蛍光であるために、温度応答性高分子に埋もれている細胞でも、 フォーカス位置を埋め込まれている細胞に合わせると、光学顕微鏡観察'蛍光観察 が容易に行えた。
[0085] 実施例 12
その後、ビーカーに入れた 15°Cの PBSバッファーでチップを洗浄し、包まれていな い余分なリンパ球を洗い流した。閉じ込められている細胞は、フラスコ中で激しく洗つ ても、しっかりと穴の中に保持されていた。その結果、穴パタン部分のみに 1個ずつの リンパ球をそれぞれ分離して確実に保持することができた（図 7)。この時の細胞保持 率は、約 87%に向上した。また、膨潤状態の温度応答性高分子はゲル状で充分柔 らかぐ閉じ込められた細胞を潰してしまうこともなカゝつた。
[0086] また、チップ温度を高温 (約 35°C)に戻すと、温度応答性高分子は収縮し、再びリ ンパ球を解放することができた。さらに、キヤビラリ一による吸引によって、チップ上か ら任意のリンパ球 1個のみを回収することを試みた。回収時には、チップ温度を高温 にすることで、穴が再び拡がり、穴の高さも低くなることから、回収用キヤビラリ一の先 端をリンパ球に容易に接近させることができ、確実にリンパ球を回収することができた
[0087] 次に、直径 10 ;ζ ΐη、深さ (膜厚)を 10 mに変更した温度応答性高分子による穴パ タンを有するチップを上記フォトリソグラフィ一法で作成した。免疫細胞の保持実験で は、 1つの穴にリンパ球が 2個入ってしまい、穴パタン部分のみに 1個ずつのリンパ球 をそれぞれ分離して保持することができな力つた。
直径 6 μ mの免疫細胞 (Bリンパ球)を穴パタン部分のみに 1個ずつそれぞれ分離し て保持するには、穴の深さが 1. 5 m以上 9 m以下であることが好まし力つた。さら には、高い細胞保持率を得るために、 3 μ m以上 9 μ m以下であることがより好ましか つた o
[0088] 実施例 13
穴パタンの直径の制御による細朐保持の枪討
直径 5 μ m、深さ (膜厚） 3. 5 μ mの温度応答性高分子による穴パタンを有するチッ プを上記フォトリソグラフィ一法で作成した。穴の直径の変更は、フォトリソグラフィー 工程で用いるマスクパタンを変更することで行った。免疫細胞の保持実験では、穴の 直径が小さ過ぎてリンパ球が入らず、穴パタン部分に 1個ずつのリンパ球をそれぞれ 分離して保持することができな力つた。
直径 15 m、深さ (膜厚） 3. 5 μ mの温度応答性高分子による穴パタンを有するチ ップを上記フォトリソグラフィ一法で作成した。穴の直径の変更は、フォトリソグラフィー 工程で用いるマスクパタンを変更することで行った。免疫細胞の保持実験では、 1つ の穴にリンパ球が 3個入ってしまい、穴パタン部分のみに 1個ずつのリンパ球をそれ ぞれ分離して保持することができなかった。
直径 6 μ mの免疫細胞 (Bリンパ球)を穴パタン部分のみに 1個ずつそれぞれ分離し て持するには、穴の直径が 6 μ m以上 12 μ m以下であることが好ましかった。
[0089] 仵意の複数個の細朐保持の檢討
温度応答性高分子による穴パタンの大きさや形状、深さを制御することで、任意の 数の免疫細胞やビーズを 1つの穴の中に保持することができる。穴の大きさや形状は 、フォトリソグラフィー工程で用いるマスクパタンを変更することで行い、穴の深さ（膜 厚）の変更は、スピン塗布条件を変更することで容易に行える。
温度応答性高分子による穴パタンの形状を、長辺 m、短辺 8 の長方形、深 さ（膜厚） 3. 5 μ mとしたチップを上記フォトリソグラフィ一法で作成した。免疫細胞の 保持実験では、 1つの穴にリンパ球を確実に 2個保持することができた（図 8)。
1つの穴の中に任意の数の免疫細胞を閉じこめることによって、複数細胞間の相互 作用の解析、複数細胞間の細胞融合などを、基板上の任意の位置で、効率よぐ選 択的に、観察しながら容易に行うことができた。 [0090] 実施例 14
穴構； ί告の蓋 しての枪討
直径 10 μ m、深さ (膜厚） 3 μ mの温度応答性高分子による穴パタンを、シリコンゥ ェハ上に上記フォトリソグラフィ一法で作成した。次に、 DeepRIEを用いて、温度応 答性高分子の穴パタンを通して露出しているシリコン部を垂直方向に 7 mドライエツ チングした。この時、温度応答性高分子自体はドライエッチング処理により 1 m垂直 方向に削られ、膜厚は となった。この工程を図 9に示す。
[0091] 上記工程によって作成した、温度応答性高分子を穴構造の蓋として有するチップ を用い、細胞の保持実験を行った。はじめに、チップ温度を高温 (約 35°C)に保持し 、温度応答性高分子による蓋が解放している状態で、リンパ球懸濁液を滴下し、リン パ球の自然沈降を 5分間待った。次に、チップ温度を低温 (約 15°C)に下げることに より、温度応答性高分子を膨潤させ、温度応答性高分子による蓋が閉じている状態 とした。その後、ビーカーに入れた 15°Cの PBSバッファーでチップを洗浄し、穴に入 つていない余分なリンパ球を洗い流した。その結果、穴パタン部分のみに 1個ずつの リンパ球をそれぞれ分離して保持することができた。この時の細胞保持率は、約 85% であった。また、チップ温度を高温 (約 35°C)に戻すと、温度応答性高分子による蓋 は解放した状態となり、キヤビラリ一によつてリンパ球を吸引回収することができた。
施例 15
^光件 する温 件 分子、途 7k溶液のィ乍 (有機溶剤 使わな ヽ）
上記で合成した温度応答性高分子（1) 100重量部と、架橋剤としてへキサメトキシ メチルメラミン 10重量部と、光酸発生剤としてトリメチルスルホ -ゥムトリフレート 1重量 部を、溶媒として 15°Cの水 250重量部に溶解し、これを孔径 0. 40 /z mのフィルター を用いて濾過し、塗布溶液とした。
[0092] 酸素プラズマで表面処理したポリメチルメタタリレート基板上に、上記の塗布溶液を スピンコーターの回転速度 500rpmでスピン塗布した。塗布後 90°Cで 30分間加熱 処理して溶媒を揮発させ塗膜を得た。高圧水銀ランプを光源とするマスクァライナを 用いて、マスクを介してこの塗膜への露光を行った。露光後の加熱による架橋反応の 後、 15°Cの水を用いて、未架橋部分を溶解除去する現像処理を 1分間行った。その 結果、直径 10 /z mの温度応答性高分子による穴パタンを 250, 000個/ cm2の密度 で基板上に作製した。塗布溶媒に水を使っているため、スピン塗布時に、プラスチッ ク素材であるポリメチルメタタリレート基板が溶媒によって侵されることがな力つた。ま た、水による現像時も、全ての構成成分が水溶性なため、残渣なく良好に行うことが できた。
[0093] 実施例 16
牛.体由 の温度 答件高分子を用いたチップの作製
生体由来の温度応答性高分子である可溶性エラスチン (牛由来） 100重量部と、光 架橋剤として水溶性ビスアジド化合物である 4, 4' ジァゾスチルベン 2, 2'ジスル ホン酸ジナトリウム塩を 10重量部を、溶媒として蒸留水 1000重量部に溶解し、これを 孔径 0. 40 mのフィルターを用いて濾過し、塗布溶液とした。
ヒドロキシル基を末端に有するシランカップリング剤で表面処理したガラス基板上に
、上記の塗布溶液をスピンコーターの回転速度 500rpmでスピン塗布した。塗布後 8 0°Cで 10分間加熱処理して溶媒を揮発させ塗膜を得た。高圧水銀ランプを光源とす るマスクァライナを用いて、マスクを介してこの塗膜への露光を行った。露光による架 橋反応の後、 15°Cの水を用いて、未架橋部分を溶解除去する現像処理を 2分間行 つた。その結果、直径 10 mの生体由来の温度応答性高分子による穴パタンを 250 , 000個 /cm2の密度で基板上に作製した。
上記フォトリソフグラフィ一法によって作成した穴パタンを有するチップ上に水を滴 下した後、種々の温度にチップを保ちながら、穴の大きさの変化を観察した。チップ 温度を 38°Cにすると、温度応答性高分子は収縮し、穴パタンの直径は約 10 mとな つた。チップ温度を 15°Cにすると、温度応答性高分子が膨潤しはじめ、約 10秒後に は、穴パタンの直径は 8 mへと縮まった。また、この収縮'膨潤挙動は、チップ温度 の変化に伴って、何度も繰り返し行えることがわ力つた。
産業上の利用可能性
[0094] 本発明のチップは、生体材料を一時的に固定ィ匕する必要がある、種々の技術分野 、例えば、多数のリンパ球力 特定の抗原特異的なリンパ球を選択して、抗体を作成 する方法などに、有用である。 図面の簡単な説明
[図 1]実施例 5において、フォトリソフグラフィ一法によって作成した穴パタンを有する チップ上に水を滴下した後、種々の温度にチップを保ちながら、穴の大きさの変化を 観察した結果。
[図 2]実施例 6において、フォトリソフグラフィ一法によって作成した穴パタンを有する チップを用い、直径 10 mのポリスチレンビーズの保持実験を行った結果。
[図 3]実施例 7において、フォトリソフグラフィ一法によって作成した穴パタンを有する チップを用い、リンパ球 (B細胞、直径約 6 mの保持実験を行った結果。
[図 4]実施例 9において、塗布溶液の高分子濃度を変更し、スピンコーターの回転速 度を 3000rpmとした時に得られる塗膜の膜厚を示す。
[図 5]実施例 9において、塗布溶液の高分子濃度を 33wt%とし、スピンコーターの回 転速度を変更した時に得られる塗膜の膜厚を示す。
[図 6]実施例 11におけるリンパ球の保持実験の結果を示す。
[図 7]実施例 12におけるリンパ球の保持実験の結果を示す。
[図 8]実施例 13におけるリンパ球の保持実験の結果を示す。
[図 9]実施例 14の工程の概略説明図。
[図 10]本発明のチップの一態様の説明図。
[図 11]本発明のチップの一態様の説明図。
[図 12]本発明のチップの一態様の説明図。

Claims

請求の範囲
[1] 温度応答性高分子の架橋生成物を構成成分とし、かつ穴パタンを有する膜を基板 表面に有するチップ。
[2] 前記温度応答性高分子の架橋生成物が、温度応答性高分子間の架橋生成物また は架橋剤を介しての架橋生成物である請求項 1に記載のチップ。
[3] 前記温度応答性高分子の架橋生成物は、一般式（1)で示される繰り返し単位を持 ち、かつ重量平均分子量が 500〜5, 000, 000である N—アルキル (メタ）アクリルァ ミド共重合体と架橋剤との架橋生成物
[化 1]
Figure imgf000035_0001
(一般式（1)において、 R
1及び R
2は、同一または異なっても良ぐ水素原子または炭 素数 1から 4のアルキル基を表し、 Rは、水素原子またはメチル基を表し、 Rは、前記
3 4 架橋剤と架橋可能な官能基を有する炭化水素構造を表す。 X及び yは、それぞれ X
+y = l、 0く Xく 1、 0< y< lを満たす任意の数である。 )
である請求項 1または 2に記載のチップ。
[4] 穴パタンを有する膜の厚みは、 1011111〜100 111の範囲でぁる請求項1〜3のぃず れか 1項に記載のチップ。
[5] 穴パタンの穴の大きさは、内接する円の直径が 10nm〜 1000 mの範囲である請 求項 1〜4のいずれか 1項に記載のチップ。
[6] 穴パタンの穴の深さ力 1011111〜100 111の範囲でぁる請求項1〜5のぃずれか1 項に記載のチップ。
[7] 穴パタンの穴は、 1cm2当たり 1個〜 1, 000, 000, 000個である請求項 1〜6のい ずれか 1項に記載のチップ。
[8] 基板は、膜を有する表面の、膜が有する少なくとも一部の穴の下部に相当する部分 に凹部を有する請求項 1〜7のいずれか 1項に記載のチップ。
[9] 穴パタンの穴は、その中の基板表面上に、膜とは独立した前記温度応答性高分子 の架橋生成物で形成されたドットを有する請求項 1〜8のいずれ力 1項に記載のチッ プ。
[10] 膜温度の一部分、または全体を変化させることにより、膜の一部分、または全体を 膨潤または収縮させて、穴パタンの穴の大きさを任意に変化させることができる請求 項 1〜9のいずれ力 1項に記載のチップ。
[11] 前記穴パタンの穴に格納された生体物質を、膜温度の変化により、穴パタンの穴に おいて、包接した状態にする力、または解放した状態にする請求項 10に記載のチッ プ。
[12] 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載のチップの膜温度を、前記チップが有する穴パ タンの穴の径を、生体物質が格納可能な大きさになる温度に制御し、
前記穴パタンの穴に生体物質を格納し、次いで
チップの膜温度を、前記生体物質を格納した穴の径を、生体物質を包接する温度 に制御することを含む、チップの穴パタンに生体物質を包接する方法。
[13] 請求項 12に記載の方法で生体物質を包接したチップの膜温度を、前記チップが 有する穴パタンの穴の径を、生体物質を解放可能な大きさになる温度に制御するこ とを含む、チップに包接された生体物質を解放する方法。
[14] 温度応答性高分子の架橋生成物を構成成分とし、かつ穴パタンを有する膜を基板 表面に有するチップの製造方法であって、
架橋可能な温度応答性高分子を含有する組成物、架橋可能な温度応答性高分子 および架橋剤を含有する組成物、または温度応答性高分子および架橋剤を含む組 成物を基板表面に塗布して塗膜を形成し、
前記塗膜を架橋させて、前記架橋生成物を生成し、かつ
前記架橋生成物の塗膜に穴パタンを形成する工程を含むことを特徴とする、前記 製造方法。 前記架橋可能な温度応答性高分子および架橋剤を含有する組成物、または温度 応答性高分子および架橋剤を含有する組成物は、一般式（1)で示される繰り返し単 位を持ち、かつ重量平均分子量が 500〜5, 000, 000である N—アルキル (メタ）ァ クリルアミド共重合体と架橋剤とを含有する組成物
[化 2]
Figure imgf000037_0001
(一般式（1)において、 R及び Rは、同一または異なっても良ぐ水素原子または炭
1 2
素数 1から 4のアルキル基を表し、 Rは、水素原子またはメチル基を表し、 Rは、前記
3 4 架橋剤と架橋可能な官能基を有する炭化水素構造を表す。 X及び yは、それぞれ X +y = l、 0<χ< 1、 0< y< lを満たす任意の数である。ここで、（メタ）アクリルアミドと は、メタクリルアミドとアクリルアミドの両方を表す。 )
である請求項 14に記載の製造方法。
[16] 温度応答性高分子の架橋生成物を構成成分とし、かつ穴パタンを有する膜を基板 表面に有するチップの製造方法であって、
架橋可能な温度応答性高分子形成用モノマーを含有する組成物、架橋可能な温 度応答性高分子形成用モノマーおよび架橋剤を含有する組成物、または温度応答 性高分子形成用モノマーおよび架橋剤を含む組成物を基板表面に塗布して塗布膜 を形成し、
塗膜を重合および架橋させて、前記架橋生成物を生成し、かつ
前記架橋生成物の塗膜に穴パタンを形成する工程を含むことを特徴とする、前記 製造方法。
[17] 組成物を塗布する基板は、シリコン基板、ガラス基板、プラスチック基板、マイ力基 板、セラミック基板、または金属基板である請求項 14〜16に記載のいずれか 1項に 記載の製造方法。
[18] 組成物の基板への塗布は、組成物を溶剤に溶解する工程、得られた溶液を基板上 に滴下する工程、溶媒を蒸発させ塗膜を得る工程を含むことを特徴とする請求項 14
〜 17のいずれか 1項に記載の製造方法。
[19] 塗膜への穴パタンの形成は、フォトリソグラフィ一法により行う請求項 14〜 18のいず れか 1項に記載の製造方法
[20] フォトリソグラフィ一法による塗膜への穴パタンの形成は、前記塗膜形成用の組成 物にさらに酸発生剤を含有させ、塗膜形成後、塗膜に穴パタン形成用マスクを介して 酸発生剤を活性化させる放射線を照射して、放射線が照射された部分の塗膜を架 橋させ、次いで、前記マスクを除去した後に、未架橋部分の塗膜を除去することによ つて行う請求項 19に記載の製造方法。
[21] 酸発生剤は、ォ -ゥム塩、スルホ-ルォキシイミド、トリァジン及びスルホン酸エステル 力も成る群力も選ばれる少なくとも 1種である請求項 20に記載の製造方法。
[22] 放射線が、水銀ランプ光、電子線、エキシマレーザー、 X線、またはキセノンランプで ある請求項 20または 21に記載の製造方法。
[23] 塗膜への穴パタンの形成は、スクリーン印刷法、インクジェット法、コンタクトプリント 法またはエンボスカ卩工法により行う、請求項 14〜18のいずれか 1項に記載の製造方 法。
[24] スクリーン印刷法、インクジェット法、コンタクトプリント法またはエンボスカ卩工法による 塗膜への穴パタンの形成は、架橋前の塗膜に穴パタンを形成し、次いで穴パタンを 形成した塗膜を架橋させることで行う、請求項 23に記載の製造方法。
[25] 前記架橋剤と架橋可能な官能基を有する炭化水素構造は、前記架橋剤と架橋可 能な官能基を側鎖に持つ (メタ)アタリレート構造または (メタ)アクリルアミド構造 (ここ で、（メタ)アタリレートとは、メタタリレートとアタリレートの両方を表す。）である請求項 1 5〜24の 、ずれか 1項に記載の製造方法。
[26] 前記架橋剤と架橋可能な官能基は、ヒドロキシル基、カルボキシ基、エポキシ基、ァ ミノ基またはスクシンイミド基である請求項 15〜25のいずれ力 1項に記載の製造方法 [27] 架橋剤は、エポキシ系架橋剤、メラミン系架橋剤、グリコゥリル系架橋剤、ヒドロキシ ル基、カルボキシル基、アジド基またはビニルエーテル基を 2つ以上有する化合物で ある請求項 15〜26のいずれか 1項に記載の製造方法。
[28] ヒドロキシル基、カルボキシル基、アジド基またはビュルエーテル基を 2つ以上有す る化合物は、 1, 2 ジヒドロキシナフタレン、 1, 3 ジヒドロキシナフタレン、 1, 4ージ ヒドロキシナフタレン、 1, 5 ジヒドロキシナフタレン、 1, 6 ジヒドロキシナフタレン、 1 , 7 ジヒドロキシナフタレン、 1, 8 ジヒドロキシナフタレン、 2, 3 ジヒドロキシナフ タレン、 2, 6 ジヒドロキシナフタレン、 2, 7 ジヒドロキシナフタレン、 1, 3 シクロぺ ンタンジオール、 2, 6 キノリンジオール、 2, 3 ジヒドロキシキノキサリン、 1, 4ージ ォキサンジオール、 1, 4ーシクロへキサンジメタノール、ポリビニルアルコール、 1, 2 ナフタレンジカルボン酸、 1, 3 ナフタレンジカルボン酸、 1, 4 ナフタレンジカル ボン酸、 1, 5 ナフタレンジカルボン酸、 1, 6 ナフタレンジカルボン酸、 1, 7 ナ フタレンジカルボン酸、 1, 8 ナフタレンジカルボン酸、 2, 3 ナフタレンジカルボン 酸、 2, 6 ナフタレンジカルボン酸、シクロへキサンジカルボン酸、テレフタル酸、 1, 2 シクロペンタンジカルボン酸、 2, 5 チォフェンジカルボン酸、 2—メチル 3, 4 キノリンジカルボン酸、 9, 10 アントラセンジカルボン酸、ジヒドロアントラセン 9 , 10 ジカルボン酸、クェン酸、こはく酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、 2, 6 ビ ス（4 アジドベンジリデン）シクロへキサノン、ビス（4 ビ-ロキシブチル）テレフタレ ートまたはビス（4 ビ-ロキシブチル）アジペートである請求項 26または 27に記載の 製造方法。
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