JP2003102466A - 温度応答性高分子化合物を用いた培養細胞の選別方法および装置並びに培養容器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 顕微鏡下で細胞または細胞塊の選別回収を確
実に効率的に行なう技術を提供する。 【解決手段】 培地に温度応答性高分子化合物を用いて
細胞を培養した培養容器８を銅板の薄板１に載置させそ
の底面を加熱する箔状のヒータ２と、薄板１とヒータ２
の中心部に開設した小範囲透光用の孔３と、孔３に臨む
培養容器の底面に向けて冷却用空気を吹き付ける空気噴
出用穴５とを備え、薄板１とヒータ２は顕微鏡のステー
ジに設置して使用可能な薄板状に形成され、培養容器が
０．１〜０．２ｍｍ厚の平坦な底部を有している構成。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、培養した各種動物
細胞やヒト細胞から、所望の細胞または細胞群のみを顕
微鏡作業下で選別操作可能とした温度応答性高分子化合
物を用いた培養細胞の選別方法および装置並びにその装
置に適した培養容器に関する。

【０００２】

【従来の技術】多くの細胞はガラスやプラスチックの培
養容器、またはその表面にゼラチンなどの細胞培養基材
をコーティングした培養容器で培養される。種々の細胞
が混じった培養細胞の中から、ある種の細胞または細胞
群のみを選別するには、一旦、全部の細胞を培養容器か
ら分離した後、液体中に浮遊または液体とともに流動す
る細胞から必要な細胞だけを識別し回収する必要があっ
た。この場合、培養細胞を培養容器から分離回収するた
めには、細胞と培養容器表面との生物的な結合を切断す
る酵素であるトリプシンや、ゼラチンを分解する酵素で
あるコラゲナーゼなどの剥離材を用いるのが一般的であ
る。この方法では、酵素が細胞表面に作用するため細胞
機能に障害を与えるという欠点がある。また、酵素が細
胞と基材の間だけでなく細胞間の接着にも作用するた
め、目的とする細胞層や細胞塊のまま回収することは不
可能であった。

【０００３】一方、特開平１１−３４９６４３号公報に
は、培養細胞の分離回収に酵素を用いない方法として、
温度応答性の高分子化合物を培養基材として用いる方法
が開示されている。この方法は、臨界点以下では水溶性
を示し、その温度以上では水中に析出するという温度応
答性の相分離特性を有する高分子化合物、例えば、ゼラ
チンにＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマーがグラ
フト重合されてなる高分子化合物を培養基材として細胞
の培養と離脱を行う方法である。この温度応答性高分子
化合物を塗布した培養皿で細胞を培養し、それを臨界点
温度（約３１℃）以下に下げると細胞が培養皿から離脱
すると説明されている。また、前記培養皿の底面に、低
温に冷却されたガラス棒などの冷却体を接触させ、接触
箇所付近の低温部から一つの細胞コロニー（集団）だけ
を離脱する方法も提案されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前記公報に開示してあ
る方法を用いると、細胞機能の障害を生じる可能性があ
る、または細胞塊の離脱が不可能である、という酵素を
用いる一般的手法が有する前記の欠点を克服できる。し
かしながら、冷却体を接触させて任意の細胞またはコロ
ニーを離脱する方法は、実際の顕微鏡下での作業の場
合、明視野や位相差などの透過光を用いた顕微鏡観察の
場合には適用できない、動作距離の短い対物レンズやコ
ンデンサの場合には適用できない、液体窒素などの冷却
源が必要となるし手作業でしか冷却できないから効率が
悪い、狭い範囲のみを冷却するのが困難であるし精度が
悪くなる、などの欠点を有する。

【０００５】本発明は、これらの欠点を克服し、顕微鏡
下で細胞または細胞塊の選別回収を確実に効率的に行な
う方法およびその装置並びにこの装置に適した培養容器
を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決するため
に本発明請求項１記載の温度応答性高分子化合物を用い
た培養細胞の選別方法にあっては、温度応答性高分子化
合物を細胞培養基材とする培養容器に培養した細胞を、
前記温度応答性高分子化合物が水中から析出し始める臨
界点より高い温度にして顕微鏡で観測しながら、透過光
の透過面積の範囲内において、かつ光路を遮断せずに前
記培養容器底面を温度応答性高分子化合物が臨界点より
低い温度となるまで冷却を行なうことにより、所望の細
胞または細胞塊のみを選別し、容器から離脱回収するこ
とを特徴とする。

【０００７】具体的には以下に説明する。細胞培養基材
として底面に温度応答性高分子化合物を塗布した培養容
器（ペトリ皿、シャーレなど）に細胞を比較的疎に培養
する。その培養容器を、高分子化合物の接着性を呈する
臨界点温度より高く、例えば、恒温動物の細胞の場合、
望ましくは生理的温度の３７℃に保たれた顕微鏡ステー
ジに置く。このステージの中心部分、すなわち観察視野
の中心部分が臨界点温度以下に冷却できるようにする。
ステージに取付けられたＸ−Ｙステージにより、培養容
器の所望の位置をその中心部に精確に移動する。そし
て、中心部を冷却しながらマイクロピペットを用いて中
心部の細胞を吸引し、目的の細胞または細胞塊のみを回
収する。回収は、ピペットの先端に吸い付けたまま別の
回収部分まで移動させた後、陽圧を印加して細胞を離脱
する方法、または、細胞より大きなピペット内に吸引し
てしまう方法のいずれでもよい。細胞の識別は、位相差
観察や微分干渉観察を用いて細胞の形態に基づいて判定
する方法、または、蛍光色素でラベルした細胞を蛍光観
察を用いて判定する方法などにより行なう。前記の方法
を実現するには、（１）冷却箇所すなわち観察箇所が透
明である、（２）ステージ中央部分の厚さが可能な限り
薄く、顕微鏡の対物レンズおよびコンデンサの動作距離
以下である、（３）培養容器底面のできるだけ狭い部分
のみの温度を下げることができる、（４）培養容器底面
の低温部分とその周辺の部分との温度勾配ができるだけ
急峻である、などの条件を満足する程、確実で効率的な
作業が達成できる。

【０００８】本発明請求項２〜請求項５の方法および装
置は、前記（１）〜（４）の条件をを解決する。請求項
２に記載の培養細胞の選別方法では、前記光路を介し培
養容器底面側に冷却用流体を吹き付けて前記温度応答性
高分子化合物を局所冷却することを特徴としている。請
求項３に記載の温度応答性高分子化合物を用いた培養細
胞の選別装置では、請求項１または請求項２に記載の温
度応答性高分子化合物を用いた培養細胞の選別方法に使
用する装置であって、培養容器を載置させその底面を加
熱する加熱面と、加熱面の中心部に開設した小範囲透光
用の孔と、該孔に臨む前記培養容器の底面に向けて冷却
流体を吹き付ける吐出口と、を備えていることを特徴と
する。請求項４に記載の温度応答性高分子化合物を用い
た培養細胞の選別装置では、請求項３に記載の温度応答
性高分子化合物を用いた培養細胞の選別装置において、
顕微鏡のステージに設置して使用可能な薄板状に形成さ
れていることを特徴としている。請求項５に記載の培養
容器では、請求項１ないし請求項４の内いずれかの項に
記載の培養容器が０．１〜０．２ｍｍ厚の平坦な底部を
有していることを特徴としている。

【０００９】具体的には以下に説明する。まず、温度を
臨界点温度以上に維持しておくためには、熱伝導性の高
い銅板に箔状のヒータを張り付ける、表面に電気絶縁処
理を施した金属やガラス表面に発熱パターンを形成す
る、導電性ガラスを用いる、などの方法で厚さが薄く熱
伝導性の良好なステージを作製し、その上に培養容器を
のせる。そして、そのステージ中央に小さな孔を設けて
おき、その孔を通して空気などの気体を培養容器底面に
吹き付けて冷却する。冷却気体を孔の直下ではなく斜め
下方から噴出すれば顕微鏡の光路を遮ることがないた
め、透過光による観察が可能である。ステージ下方から
の冷却気体の供給は、ステージ内部に設けた流路または
ステージ下面に沿って設けた直径の小さな管を用いて行
なう。

【００１０】できるだけ狭い範囲のみを冷却するために
は、孔の直径を小さくする必要がある。しかし、細胞が
付着している培養容器底面の高分子化合物層の温度を下
げるために冷却できるのはその下側裏面であるため、細
胞付着面の温度は培養容器の底板の熱伝導に支配され
る。従って、冷却箇所が小さく、そして冷却箇所とその
周囲の部分の間の温度勾配が急峻であっても、底板が厚
かったり底板材質の熱伝導性が悪い場合には、細胞付着
面の温度分布はなめらかになり、低温になる部分が広が
ってしまう。これを防ぐためには、底板をできるだけ薄
く、そして熱伝導性の比較的良い材質にすることが重要
である。また、臨界点温度以上に保つのは、温度を調節
されたステージ上に培養容器を置くことで達成されるの
であるから、ステージと容器底面とがしっかりと接触し
ていることが不可欠である。細胞培養容器はこのような
条件を満足するものでなければならない。

【００１１】一般の培養容器の場合、底面が縁よりやや
底上げされているので、底面とステージとの接触が保て
ずこれを本発明の方法に用いるのは不適切である。ま
た、培養容器に適する素材はガラスやプラスチック等が
あるが、プラスチックに比べて熱伝導率が約１０倍であ
るガラスのほうが好ましい。従って、培養容器の底面が
ステージとの接触を保たれる形状で、しかも底板の厚さ
がカバーガラス程度（０．１〜０．２ｍｍ）のガラス製
の培養容器が本発明の方法に最も適している。しかし、
用途によっては厚さが好ましくは１ｍｍ以下のプラスチ
ック容器であっても、底面がステージとの接触を保持で
きる形状であれば使用することができる。

【００１２】本発明の方法を用いると、顕微鏡を用いた
目視観察により細胞の選別、回収を一つずつ行なうこと
ができる。しかし、これは、必ずしも人が全ての操作を
行なわなければならないことを意味していない。ある細
胞集団から目的の細胞を識別する基準がはっきりし、そ
の後の回収操作も決まっている場合には、細胞の選別か
ら回収まで全ての操作を自動で行なうことも可能であ
る。

【００１３】

【発明の作用および効果】本発明は、いくつかの種類の
細胞から欲しい細胞のみを選別し、酵素などにより細胞
に障害を与えることなく細胞機能を完全に維持したまま
回収しようとするものである。しかも、観察しながらそ
の場で回収できるため、確実であり、かつ効率的であ
る。多種の細胞群からある種の細胞を選別回収する例と
しては、動物やヒトの細胞から幹細胞を見つけ出す場
合、それらの細胞を必要な数だけ回収して新たに培養す
る場合などがある。これらの幹細胞を用いた医療に関す
る研究は盛んになってきており、幹細胞の識別、回収、
増殖が効率的にできるようになると、ますます進歩する
と考えられる。また、幹細胞だけでなく、必要な細胞ま
たは細胞群のみを回収するのは、医学研究上重要な操作
である。例えば、数個の細胞がくっついたコロニーのみ
を回収し実験に用いることもできる。以上、要するに本
発明の方法、装置は、今後の医学研究、生物研究、医工
学研究および医療の発展に多大に寄与することが可能で
ある。

【００１４】

【発明の実施の形態】次に、本発明の実施の形態１を説
明する。図１は培養容器を上に載せてその底面を面状に
加熱した中で、その底面を局所的に冷やすことができる
ステージを示しており、（イ）は平面図、（ロ）は縦断
面図、（ハ）は底面図を示す。

【００１５】前記ステージは、銅製の薄板１の裏面に箔
状のヒータ２が貼り付けられ全体の中心に透過光用の孔
３が上下貫通して設けてある。そのヒータ２の下で孔３
をちょうど挟むように２本のステンレス細管４が通って
おり、これらは全てステンレス製の支持板７に薄板１の
上面を一致させてその他は板厚内に埋め込むように取付
けてある。

【００１６】前記２本の細管４の一端は、支持板７の端
部に立設した空気導入管６につながれ一端は閉じてあ
る。そして、この細管４同士には、前記透過光用の孔３
の下側位置であって約４５度上向きの方向に冷却用の吐
出口５がそれぞれ一つずつ設けてある。

【００１７】次に、本実施の形態の作用を説明する。前
記ヒータ２は、図外の直流電源を用いて加熱される。そ
して、ヒータ裏面に貼り付けられた図示しない微小温度
センサと温度調節計により、銅板１を所望の温度に保つ
ことができる。前記空気導入管６へは、図外の空気ボン
ベから流量調節弁を介して空気が供給できるようになっ
ている。その空気は、細管４を通って冷却用の吐出口５
から噴出し、透過光用の孔３を介して銅板の孔３の上に
ある培養容器８の底面を吐出口５の大きさの範囲で局所
的に冷却する。

【００１８】このステージを顕微鏡ステージに載せる
と、孔３の部分は光を透過するのでその部分は透過光に
よる顕微鏡観察が可能である。また、このステージの中
央部分は厚さが全体で約３ミリ程度に製作されているの
で、倒立顕微鏡で高倍率の対物レンズを用いても細胞付
着面が観察できる。また、正立顕微鏡を用いる場合でも
細胞付着面はコンデンサの動作範囲内にある。培養細胞
の選別時においては、前記ヒータ２でステージを高分子
化合物、例えば、ゼラチンにＮ−イソプロピルアクリル
アミドポリマーがグラフト重合されてなる高分子化合物
の臨界点温度３１℃より高く保持する。また、前記高分
子化合物をコーティングして細胞を培養した培養容器８
の所望の位置を、前記ステージに取付けられたＸ−Ｙス
テージにより、透過光用の孔３の中心部に精確に移動す
る。この後、前記細管４の吐出口５から冷風を孔３内に
吹き付けてステージの中心部分、すなわち、透過光用の
孔３に臨む培養容器の底面を介して、観察視野の中心部
分を冷却する。このようにして培養容器８の内底面中心
部のみの高分子化合物温度が臨界点温度３１℃より低く
なり接着力がなくなった状態となったとき、マイクロピ
ペットを用いて中心部の細胞を吸引することにより、目
的の細胞または細胞塊のみを回収することができる。

【００１９】以下は、前記ステージの性能試験要領と結
果を示す。図１のステージ上に、片面に黒体塗料を塗布
したカバーガラス（厚さ０．１〜０．２ｍｍ）を載せ、
赤外線温度計を用いて表面の温度分布を測定した。図２
は中心線に沿った温度分布を示す。表面の大部分はほぼ
一様な温度に保たれており、中心部分のみ最大で約３℃
の温度低下が観察される。周囲より２℃以上温度が低い
部分の直径は１ｍｍである。この例の場合、ステージ中
心の透過光用の孔３の直径は１ｍｍであるので、その孔
の直径に相当する部分だけが２℃以上低温になったこと
になる。２℃〜３℃の温度差があれば、周囲を温度応答
性高分子化合物の臨界点温度以上に、中心部のみを臨界
点温度以下にすることは十分可能である。また、温度降
下部と周囲の間の温度勾配は急峻であり、極めて良好な
温度分布が実現できている。この例示した図では、空気
の流量を１Ｌ／ｍｉｎとした場合の結果であるが、空気
流量を０．５〜１．５Ｌ／ｍｉｎの間で変化させると最
大の温度変化を与えることができる。

【００２０】次に、図３は本発明実施の形態２の培養細
胞の選別装置に適した培養容器９を示しており、底面１
０がステージとの接触を保たれる平坦な形状で、しかも
底板１１の厚さ１２がカバーガラス程度（０．１〜０．
２ｍｍ）のガラス製であり、高分子化合物のできるだけ
狭い部分のみの温度を下げることができる、低温部分と
その周辺の部分との温度勾配を急峻にできる、など確実
で効率的な作業を行なう効果が得られる。

【００２１】以上、本発明の実施の形態を説明したが、
具体的な構成は前記実施の形態に限定されるものではな
く、発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更などがあっ
ても本発明に含まれる。例えば、実施の形態では、透過
光の光路を介し培養容器の底面側に冷却用空気を吹き付
けるとしたが、これに限らず、条件が許せば培養容器の
上面側から観測視野内に冷却用空気を吹き付けるように
してもよい。細管４の代わりに支持板７に細い穴を穿設
し透過光用の孔３の内周面に吐出口を設けてもよい。支
持板７の材質、形状は任意に設定できるものであり、ス
テンレスの他、アルミニウム、銅、真鍮などの金属、あ
るいは耐熱性の樹脂、ガラス、それらを混用したもので
も良い。培養容器９はガラス製で説明したが、プラスチ
ック、あるいはその混用したものでも良い。底部の厚さ
も孔３の大きさ、冷却用流体の温度などの条件を考慮し
局所冷却が可能な範囲で任意に設定することができる。
冷却用流体は空気にて説明したが、氷やドライアイスに
接した空気、水などでも良い。ペルチェ素子などを組み
合わせて冷却や加熱などを行なうこともできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明実施の形態１の培養容器を載置してその
底面の一部のみを冷やすことができるステージを示して
おり、（イ）は平面図、（ロ）は横断面図、（ハ）は底
面図である。

【図２】実施の形態１の片面に黒体塗料を塗布してステ
ージに載置したカバーガラスのステージ中心線に沿った
温度分布を示すグラフである。

【図３】実施の形態２の培養容器を示す断面図である。

【符号の説明】

１ 銅板の薄板 ２ 銅板の薄板裏面に貼り付けた箔状のヒータ ３ 銅板に設けた孔 ４ 細管 ５ 細管の空気噴出用孔 ６ 空気導入管 ７ 支持板 ８ 培養容器

フロントページの続き (72)発明者 住本 英樹 福岡市早良区百道浜３丁目５−３−902 Ｆターム(参考） 4B029 AA02 CC01 DB11 DD06 DF01 DG08 4B065 AA90X BA30 BC03

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 温度応答性高分子化合物を細胞培養基材
   とする培養容器に培養した細胞を、前記温度応答性高分
   子化合物が水中から析出し始める臨界点より高い温度に
   して顕微鏡で観測しながら、透過光の光路を遮断せずに
   前記観測視野の温度応答性高分子化合物が臨界点より低
   い温度となるまで冷却用流体を吹き付けて冷却を行なう
   ことにより、所望の細胞または細胞塊のみを選別し、容
   器から離脱回収することを特徴とする温度応答性高分子
   化合物を用いた培養細胞の選別方法。
2. 【請求項２】 前記光路を介し培養容器底面側に冷却用
   流体を吹き付けて前記温度応答性高分子化合物を局所冷
   却することを特徴とする請求項１に記載の温度応答性高
   分子化合物を用いた培養細胞の選別方法。
3. 【請求項３】 請求項１または請求項２に記載の温度応
   答性高分子化合物を用いた培養細胞の選別方法に使用す
   る装置であって、培養容器を載置させその底面を加熱す
   る加熱面と、加熱面の中心部に開設した小範囲透光用の
   孔と、該孔に臨む前記培養容器の底面に向けて冷却流体
   を吹き付ける吐出口と、を備えていることを特徴とする
   温度応答性高分子化合物を用いた培養細胞の選別装置。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の温度応答性高分子化合
   物を用いた培養細胞の選別装置が、顕微鏡のステージに
   設置して使用可能な薄板状に形成されていることを特徴
   とする温度応答性高分子化合物を用いた培養細胞の選別
   装置。
5. 【請求項５】 請求項１ないし請求項４の内いずれかの
   項に記載した培養容器が０．１〜０．２ｍｍ厚の平坦な
   底部を有していることを特徴とする培養容器。