WO2007074730A1 - 癌罹病検定用データの収集方法及び該方法に使用される癌罹病検定用装置 - Google Patents

癌罹病検定用データの収集方法及び該方法に使用される癌罹病検定用装置 Download PDF

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Masahiro Kohno
Rie Yamada
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Tohoku Electronic Industrial Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method of collecting data for cancer disease assay which can be used for simple in vitro diagnosis of cancer disease, and a device for cancer disease assay suitable for carrying out the method, and more specifically, a cancer patient
  • the present invention relates to a method of collecting data for cancer disease assay including a technique of directly measuring the amount of hematoporphyrin bound to lymphocytes derived from the tumor, and a device for cancer disease assay capable of measuring the amount of hematoporphyrin with high accuracy. It is a thing.
  • HPD hematoporphyrin derivative
  • the HPD is excited by visible light to generate short-lived, highly toxic species such as singlet oxygen, superoxide, hydrogen peroxide, and hydroxy radicals.
  • HPD is administered to the body and accumulated in the tumor for a long time, research is ongoing to destroy cancer cells by the oxidation reaction due to active oxygen induced through the excited triplet state by light irradiation (eg, See Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 1 focuses on the fact that HPD is also taken up by cancer cells and lymphocytes taken out of the body, and uses an electron spin resonance device (ESR).
  • ESR electron spin resonance device
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-135765
  • Patent Document 2 Dougherty, TJ. Et al., Photodynamic Therapy. J. Natl. Cancer In st., 90, 889-905 (1998).
  • Non-patent literature 3 He, D., Soter, NA, & Lim. HW The late phase of hematopo rphyrin derivative-induced phototoxicity in mice: Release of histamine and mstogic changes. Photochem. Photobiol., 50, 91-(1989) ).
  • the present invention was developed in view of the above background art, and provides a highly reliable method for collecting cancer morbidity assay data that can be used for simple in vitro diagnosis of cancer morbidity.
  • An object of the present invention is to provide a device for cancer disease assay that can be performed with sensitivity and simplicity.
  • the difference between the amount of luminescence from lymphocytes bound to hematoporphyrin and the amount of luminescence from lymphocytes bound to hematoporphyrin is directly measured as the amount of hematoporphyrin accumulated, Since the difference appears as a significant value, it is possible to easily obtain reliable data for cancer morbidity assay. Furthermore, the present inventors have also completed a device for cancer disease assay that enables easy acquisition of highly sensitive data in the implementation of an intensive method.
  • a method of collecting data for use in testing for cancer morbidity comprising:
  • Such a method utilizes the property that hematoporphyrin and its derivative selectively bind to lymphocytes derived from a cancer patient, and is derived from a cancer patient who has incorporated hematoporphyrin and / or a derivative thereof.
  • the present invention is based on the fact that there is a significant difference in each of the light emission amounts due to lymphocytes of the following: and lymphocytes derived from normal healthy persons not incorporating hematoporphyrin and / or its derivative.
  • a method of quantifying hematoporphyrin bound to lymphocytes and z or a derivative thereof A step of treating lymphocytes with hematoporphyrin and z or a derivative thereof, and a step of irradiating the lymphocytes obtained in the above step with light of a specific wavelength to generate excitation light from the hematoporphyrin and Z or a derivative thereof
  • the powerful method utilizes the property of hematoporphyrin to selectively bind to lymphocytes derived from the cancer patient, and the amount of hematoporphyrin quantified using this method makes it possible to use the cancer patient. It becomes possible to detect lymphocytes of origin.
  • An apparatus for cancer disease assay used for detection / quantification of a derivative thereof comprising: a light irradiation means of a specific wavelength and a weak luminescence measurement means is provided.
  • a device for detecting a cancer disease which is used for detection / quantification of a derivative thereof, which irradiates light to a sample cell, a sample chamber accommodating the sample cell, and a sample to be accommodated in the sample cell.
  • a sample chamber accommodating the sample cell, and a sample to be accommodated in the sample cell.
  • a spectroscopic mechanism provided between the sample chamber and the emission intensity measurement means
  • a heating means is provided below the sample chamber.
  • an optical filter for transmitting light of 600 nm or more, or a spectroscope or a light receiving element for transmitting light of 600 nm or more is used as the spectral mechanism, and luminescence specific to hematoporphyrin is measured.
  • a spectroscope for example, a grating or the like is suitably used.
  • the sample cell and Z or the sample chamber are formed of a material that does not include a substance excited by light to be irradiated.
  • the sample chamber is provided with a gas inlet and a gas outlet for replacing the atmosphere of the sample to be stored in the sample cell with an inert gas atmosphere.
  • a laser light source is used as the light irradiation means, and the laser light source may be 300 to 450 nm.
  • a method of collecting data usable for simple in vitro diagnosis of cancer disease and a device for cancer disease assay which can easily obtain highly accurate data in the practice of the method. It leads to the early detection of cancer and can be used effectively for post-operative follow-up diagnosis and treatment for preventing cancer recurrence.
  • FIG. 1 is a view schematically showing an embodiment of the cancer disease determination apparatus of the present invention.
  • FIG. 2 is a view schematically showing another embodiment of the cancer disease determination apparatus of the present invention.
  • FIG. 3 is a view schematically showing another embodiment of the cancer disease determination apparatus of the present invention.
  • FIG. 4 is a view schematically showing another embodiment of the cancer disease determination apparatus of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the excitation emission spectrum of HPD.
  • Fig. 6 is a graph showing the relationship between the HPD concentration in saline solution and the amount of CL released from singlet oxygen.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measurement of the amount of CL in HPD staining of each of lymphocytes from a cancer patient and lymphocytes from a healthy person and without staining of HPD.
  • FIG. 8 is a graph comparing the HPD uptake amount of lymphocytes from cancer patients with the HPD uptake amount of lymphocytes from healthy individuals.
  • the method of collecting cancer disease assay data according to the present invention is not incorporated into lymphocytes derived from normal healthy persons (healthy persons), hematoporphyrin and derivatives thereof are not incorporated into lymphocytes derived from cancered persons. It utilizes the specific property of being selectively taken up, and in the present invention, any hematoporphyrin derivative which shows strong specific binding with lymphocytes derived from a cancered person can be used.
  • the present invention relates to a method for measuring the amount of luminescence from hematoporphyrin that is generated by irradiating hematoporphyrin with light of a specific wavelength, to thereby obtain hematophorophile bound to lymphocytes.
  • Cancer patients who incorporate hematoporphyrin and / or their derivatives (hereinafter collectively referred to as “hematoporphyrin derivatives” and abbreviated as “HPD”). It utilizes that there is a significant difference in each of the light emission amount due to lymphocytes derived from the human being and lymphocytes from normal healthy people not taking in HPD.
  • the light from hematoporphyrin is generated by irradiating light of specific wavelength before and after HPD staining for each of the lymphocytes collected from the cancer patient and the lymphocytes collected from the healthy person.
  • the luminous intensity of the HPD-stained lymphocytes derived from the cancerous person is the three other groups, ie, the lymphocytes derived from the HPD-stained healthy persons, the lymphocytes derived from the HPD-stained cancered persons, And it was confirmed that a significant difference was observed as compared to the light emission amount of each lymphocyte derived from healthy individuals not stained with HPD (see FIG. 7).
  • the present invention has been developed on the basis of such important characteristics. That is, the present invention relates to a method of collecting data used in a test for cancer disease, which data is obtained by the steps of: applying a hematoporphyrin derivative to lymphocytes collected by the subject; Irradiating the mixture having the specific wavelength with light of a specific wavelength to generate excitation light from the hematoporphyrin derivative, and measuring the amount of light generated in the step, wherein the amount of light obtained in the step is It is used in a test that determines that a subject is likely to suffer from cancer if the amount of luminescence obtained from the normal healthy person is greater than that obtained by the same process.
  • FIG. 1 shows one embodiment of the cancer disease detection apparatus of the present invention, in which a sample cell 1, a sample chamber 2 containing the sample cell, and a sample to be stored in the sample cell 1 are irradiated with light.
  • the sample chamber 2 is provided with a gas inlet 3 and a gas outlet 4 for replacing the atmosphere in the sample chamber with an inert gas atmosphere.
  • the optical filter 12 is an example of a spectral mechanism, and an optical filter that transmits light of 600 nm or more is used to measure emission specific to the HPD.
  • a spectroscope or a light receiving element which transmits light of 600 nm or more can be mentioned, and as a spectroscope, for example, a grating or the like is suitably used.
  • the sample cell 1 and / or the sample chamber 2 is formed of a material not containing a substance excited by light to be irradiated, ie, a high purity substance, for example,
  • Si ⁇ high purity glass, high purity quartz glass, stainless steel, Si, SiC, etc. are listed as specific examples.
  • a laser light source may be used as the light irradiation means 10, and the wavelength of the laser light is preferably 300 nm to 450 nm so as to induce light emission from HP D, preferably 330 nm to 420 nm. . Furthermore, if the irradiation output of the laser light is too high, a large amount of active oxygen is generated, which may cause cell death and induce autoluminescence. Therefore, it is necessary to adjust the irradiation output, and the upper limit thereof is preferably set to 10 mW or less in average output. Since the first laser is linear light, it is possible to diffuse the light and enlarge the irradiation area by passing it through a diffusion lens (aspheric surface). In addition, a pulse laser can be suitably used in the present invention as long as the above condition is satisfied. In the case of a pulsed laser, periodic amplification that synchronizes transmission and reception can be applied to the light receiving source, which can help reduce noise.
  • FIG. 1 Another embodiment different from that of Fig. 1 is schematically shown, in particular, of an embodiment constituted by the light irradiation means, the spectral mechanism, and the luminescence intensity measuring means in the cancer disease testing apparatus of the present invention. This will be described below with reference to the drawings.
  • FIG. 2 shows an embodiment of an apparatus using an optical filter that transmits light of a specific wavelength, and the optical filter 112 reflects light emitted from the light emitting means 100, while light with a wavelength of 600 nm or more is reflected.
  • the amount of light emission of the excitation light emission from hematoporferin and / or its derivative is measured by the light emission intensity measuring means 111 by passing through.
  • FIG. 3 shows an embodiment of an apparatus using a grating as a spectroscope which transmits light of a specific wavelength.
  • the light emitted from the light irradiating means 200 receives excitation light from the light emitted from the light irradiation means 200, and light of 600 nm or more is taken out by the grating 212 from excitation light also generated, thereby generating excitation light derived from hematoporferin and Z or its derivatives.
  • the light emission amount is measured by the light emission intensity measuring means 211.
  • a plurality of samples can be measured continuously. That is, a plurality of sample cells 301 are loaded on moving means 350 (for example, a turntable) provided in a sample chamber (not shown). In the case of the turn table, the sample cells 301 are arranged in a circle as shown in FIG.
  • moving means 350 for example, a turntable
  • the sample cells 301 are arranged in a circle as shown in FIG.
  • the moving means 305 and the sample cell 301 are made of a material that does not glow even when irradiated with light.
  • a solution of 6% dextran is added to 17 ml of whole blood (containing anticoagulant) in a concentration of 20% to the whole blood (mass), mixed by inversion, and left at room temperature for 1 hour. did. After leaving, the supernatant was collected, overlaid with a ficoll solution (Amersham Biosciences, Sweden), and the lymphocyte layer and the neutrophil layer were separated and collected by differential centrifugation.
  • the collection layer of lymphocytes is PBS (137 mM NaCL 8. Im mM Na HPO-12H 0, 2. 68
  • lymphocytes After washing twice with 10 ml of 2 4 2 mM KCl, 1. 47 mM KH 2 PO 4), lymphocytes with 5 mM HPD
  • the number of lymphocytes is 200 to 1 ⁇ 10 6 / ml.
  • the cells were suspended in saline so as to be ⁇ 1 and used as a sample.
  • Chemiluminescence detection (CL-detection)
  • the wavelength of the laser light is 408 nm
  • the irradiation output is 5 mW
  • the chemiluminescence measurement time is 2
  • this method of detecting chemiluminescence under irradiation of laser light non-specific luminescence is observed also from unstained lymphocytes (blanks), so the measured value of the amount of chemiluminescence by HPD is blank. It was calculated from the difference with the measured value.
  • FIG. 3 The relationship between the amount of chemiluminescence and the concentration of HPD by laser irradiation was examined, and the results are shown in FIG.
  • the figure shows the relationship between the HPD-derived CL emission and the HPD concentration observed when the laser was excited at 408 nm.
  • the horizontal axis in the figure represents the final concentration of the HPD, and the vertical axis represents the average light emission for 30 seconds. Indicates the quantity (count).
  • the luminous intensity of HPD aqueous solution night (200) adjusted to an HPD concentration of 0 to 20 pmol was 1400-2500 counts excluding the blank, and both showed a good relationship.
  • the apparatus used in this experiment was able to quantify HPD up to 2.5 pmol.
  • the results are shown in Table 1 and Figure 7.
  • the luminescence intensity (CL intensity) indicates the mean luminescence amount (count number) for 30 seconds, and is the average of the data of 7 healthy subjects and 7 patients with cancer.
  • HPD uptake amount HPD uptake amount

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Abstract

　癌罹病の検定に使用するデータを収集する方法であって、被検者から採取したリンパ球にヘマトポルフィリン及び／又はその誘導体を加える工程と、前記工程で得られた混合物に特定波長の光を照射してヘマトポルフィリン及び／又はその誘導体より励起発光を発生させる工程と、前記工程で発生した発光量を測定する工程と、を含み、前記工程で得られる発光量が正常健康者から同様の工程により得られた発光量より多い場合に被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断する検定において使用されるデータを収集する方法、並びに該方法に使用される癌罹病検定用装置。

Description

明 細 書
癌罹病検定用データの収集方法及び該方法に使用される癌罹病検定用 装置
技術分野
[0001] 本発明は、癌罹病の簡便な体外診断に使用可能な癌罹病検定用データの収集方 法及び該方法の実施に好適な癌罹病検定用装置に関するものであり、詳しくは、癌 患者由来のリンパ球と結合したへマトポルフィリン量を直接的に測定する技術を含む 癌罹病検定用データの収集方法、及び、該へマトポルフィリン量を高精度に測定可 能な癌罹病検定用装置に関するものである。
背景技術
[0002] 癌の診断 '治療方法として、光感受性物質であるへマトポルフィリン誘導体 (hemato porphyrin derivative： HPD)の腫瘍に対する親和性及び蓄積性を応用した技術の研 究'開発が進められてきた。 HPDは可視光によって励起され、一重項酸素、スーパ ーォキシド、過酸化水素、ヒドロキシラジカルなどの短寿命で毒性の高い分子種を生 成させる。 HPDを体内に投与し、長時間かけて腫瘍に蓄積させた後、光照射により 励起三重項状態を経て誘起される活性酸素による酸化反応によって癌細胞を破壊 する研究が進められている（例えば、非特許文献 1を参照。）。また、癌細胞のどこに HPDが集結するかは明らかではないが、 HPD染色した癌細胞が蛍光を発すること 力 癌組織の有無を判定する体内診断に応用することが行われている（例えば、非 特許文献 2を参照。）。し力しながら、これらはいずれも生体内測定であり、腫瘍に蓄 積するまでに 3日程度かかり、多くの手間がかかる上、患者の苦痛を伴うものであった 。また、活性酸素による癌細胞の破壊においては、活性酸素の過剰な生成により皮 膚ゃ目に対して様々な副作用を引き起こすという問題点も指摘されていた (例えば、 非特許文献 3、 4を参照。）。従って、非侵襲の癌の体外診断技術の開発が切望され ていた。
[0003] 癌の体外診断技術として、例えば特許文献 1には、 HPDが生体外に取り出した癌 細胞やリンパ球によっても摂取されることに着目し、電子スピン共鳴装置 (ESR)を用 レ、て癌診断への応用を図った技術が開示されている。しかし、かかる技術は、細胞分 離法が確立されておらず、また HPD染色などの前処理が煩雑であったこと、また細 胞の管理、保存技術が確立されていなかったこと、更に ESR装置を用いた観測では 、 HPDの選択的な測定をしていたものではなぐ光励起により HPDが生成する各種 活性酸素により生成したリンパ球表面酸化物量を見ていたにすぎない。故に診断判 定のための ESRスペクトルの解釈が難しレ、、などの理由により実用化に至っていない
[0004] [特許文献 1] 特開昭 60— 135765号公報
[非特許文献 1」 Poto, L. & Berki.T. Investigation on the free radical producin g effect of hematoporphyrin: aspin trapping study. Acta Physiol. Hung. 74, 285- (19 89).
[ 特許文献 2] Dougherty, TJ.等、 Photodynamic Therapy. J. Natl. Cancer In st., 90， 889-905 (1998).
[非特許文献 3] He, D.， Soter, N.A. , & Lim.H.W. The late phase of hematopo rphyrin derivative-induced phototoxicity in mice: Release of hisitamine and mstogic changes. Photochem. Photobiol., 50， 91- (1989).
[非特許文献 4] Hawkins, C.W. Bickkers, D.R.Mukhter, H. & Elemets, C.A. Cutaneour Photosensitization: murine ear swelling as a marker of acute response. J. Invest. Dermatol. 86， 638- (1986).
発明の開示
[0005] [発明が解決しょうとする課題]
本発明は、上記背景技術に鑑み開発されたものであり、癌罹病の簡便な体外診断 に使用し得る信頼性の高い癌罹病検定用データの収集方法を提供すること、更に、 該方法を高感度且つ簡便に実施することを可能とする癌罹病検定用装置を提供す ることを目的とする。
[0006] [課題を解決するための手段]
上記課題を解決すべく本発明者等が鋭意研究した結果、へマトポルフィリンカ^ン パ球に対して有する親和性及び蓄積性に関し新たな特質を見出し本発明を完成す るに至った。すなわち、へマトポルフィリンは正常健康者由来のリンパ球に対しては殆 ど摂取されることがなぐリンパ球への取り込みは、罹癌者由来のリンパ球に対し選択 的に行われるという、へマトポルフィリンが有する特異的な性質を見出し、該性質を利 用した癌罹病検定に使用するデータの収集方法を開発した。本方法では、へマトポ ルフィリンと結合したリンパ球からの発光量とへマトポルフィリンと結合してなレ、リンパ 球からの発光量との差がへマトポルフィリンの集積量として直接的に測定され、その 差は有意な値として現れるため、信頼性の高い癌罹病検定用データを簡便に得るこ とができる。更に、本発明者等は、力かる方法の実施において高感度なデータの簡 便な取得を可能ならしめる癌罹病検定用装置をも完成するに至った。
[0007] すなわち、本発明により、
癌罹病の検定に使用するデータを収集する方法であって、
被検者から採取したリンパ球にへマトポルフィリン及び/又はその誘導体を加える 工程と、
前記工程で得られた混合物に特定波長の光を照射してへマトポルフィリン及び/ 又はその誘導体より励起発光を発生させる工程と、
前記工程で発生した発光量を測定する工程と、
を含み、
前記工程で得られる発光量が正常健康者から同様の工程により得られた発光量より 多い場合に被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断する検定において使用 されるデータを収集する方法が提供される。
[0008] かかる方法は、へマトポルフィリン及びその誘導体が罹癌者由来のリンパ球に選択 的に結合する性質を利用したものであり、へマトポルフィリン及び/又はその誘導体 を取り込んだ罹癌者由来のリンパ球、およびへマトポルフィリン及び/又はその誘導 体を取り込んでいない正常健康者由来のリンパ球に起因する前記発光量各々に有 意な差があることを利用したものである。
[0009] また、本発明により、
リンパ球に結合したへマトポルフィリン及び z又はその誘導体を定量する方法であ つて、 リンパ球にへマトポルフィリン及び z又はその誘導体をカ卩える工程と、 前記工程で得られたリンパ球に特定波長の光を照射してへマトポルフィリン及び Z 又はその誘導体より励起発光を発生させる工程と、
前記工程で発生した発光量を測定する工程と、
を含む方法が提供される。
[0010] 力かる方法は、へマトポルフィリンが罹癌者由来のリンパ球に選択的に結合する性 質を利用したものであり、該方法を用いて定量されたへマトポルフィリン量から罹癌者 由来のリンパ球の検知が可能となる。
[0011] 更に、本発明により、前記方法においてリンパ球に結合したへマトポルフィリン及び
/又はその誘導体の検知 ·定量に使用される癌罹病検定用装置であって、特定波 長の光照射手段と、微弱発光測定手段と、を具備する癌罹病検定用装置が提供さ れる。
[0012] また、本発明により、前記方法においてリンパ球に結合したへマトポルフィリン及び
/又はその誘導体の検知 ·定量に使用される癌罹病検定用装置であって、試料セル と、前記試料セルを収容する試料室と、前記試料セルに収容されるべき試料に光を 照射するための光照射手段と、前記試料から発生する発光強度を測定する発光強 度測定手段と、前記試料室と前記発光強度測定手段との間に設けられた分光機構と 、を具備する癌罹病検定用装置が提供される。
[0013] この装置は、一態様において、前記試料室の下方に加熱手段が設けられている。
また、他の態様において、前記分光機構として 600nm以上の光を通す光学フィル ター、もしくは 600nm以上の光を通す分光器又は受光素子が用いられ、へマトポル フィリンに特異的な発光が測定される。分光器としては、例えばグレーティングなどが 好適に用いられる。
[0014] また、他の態様において、前記試料セル及び Z又は試料室が、照射される光により 励起される物質を含まなレ、材料から形成される。
[0015] また、他の態様において、前記試料室が、前記試料セル中に収容されるべき試料 の雰囲気を不活性ガス雰囲気に置換するためのガス入口及びガス出口を備えてレヽ る。 [0016] また、他の態様において、光照射手段としてレーザー光源が使用され、該レーザー 光原は 300〜450nmとされ得る。
[0017] [発明の効果]
本発明により、癌罹病の簡便な体外診断に使用可能なデータの収集方法、更には 該方法の実施において高精度なデータの取得を簡便に可能ならしめる癌罹病検定 用装置が提供されたことは、癌の早期発見につながり、更には術後の経過診断及び 癌再発防止のための治療にも有効に利用することができる。
図面の簡単な説明
[0018] [図 1]図 1は本発明の癌罹病検定用装置の一態様を模式的に示す図である。
[図 2]図 2は本発明の癌罹病検定用装置の他の態様を模式的に示す図である。
[図 3]図 3は本発明の癌罹病検定用装置の他の態様を模式的に示す図である。
[図 4]図 4は本発明の癌罹病検定用装置の他の態様を模式的に示す図である。
[図 5]図 5は HPDの励起発光スペクトルを示すグラフである。
[図 6]図 6は生理食塩水溶液中の HPD濃度と一重項酸素由来 CL放出量の関係を 示すグラフである。
[図 7]図 7は罹癌者由来のリンパ球及び健常人由来のリンパ球各々の HPD染色、及 び HPD未染色における CL量の測定結果を示すグラフである。
[図 8]図 8は罹癌者由来リンパ球の HPD取込み量と健常人由来リンパ球の HPD取込 み量とを比較したグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る癌罹病検定用データの収集方法は、へマトポルフィリン及びその誘 導体が正常健康者 (健常人）由来のリンパ球には取り込まれないが、罹癌者由来のリ ンパ球には選択的に取り込まれるという特異的な性質を利用したものであり、本発明 においては罹癌者由来のリンパ球と力かる特異的結合を示すすべてのへマトボルフ ィリン誘導体が用いられ得る。
[0020] 本発明は、へマトポルフィリンに特定波長の光を照射することにより発生するへマト ポルフィリン由来の発光量を測定することにより、リンパ球に結合したへマトボルフイリ ンを直接的に定量することを特徴とし、へマトポルフィリン及び/又はその誘導体 (以 下において、「へマトポルフィリン誘導体」と総称し、これを HPDと略記する。）を取り 込んだ罹癌者由来のリンパ球、および HPDを取り込んでいない正常健康者由来のリ ンパ球に起因する前記発光量各々に有意な差があることを利用している。詳細は後 掲の実施例で述べるが、罹癌者から採取したリンパ球と健常人から採取したリンパ球 各々について、 HPD染色した前後において特定波長の光を照射し発生するへマト ポルフィリン由来の発光量を測定した結果、罹癌者由来の HPD染色したリンパ球の 発光量が、他の 3群、すなわち、 HPD染色した健常人由来のリンパ球、 HPD未染色 の罹癌者由来のリンパ球、及び HPD未染色の健常人由来のリンパ球各々力 の発 光量に比べ有意な差が見られることが確認された（図 7を参照。）。また、 HPD染色前 後における罹癌者由来リンパ球の発光量の差と、同様に HPD染色前後における健 常人由来リンパ球の発光量の差とを比較した結果から、 HPDが健常人由来のリンパ 球には殆ど取り込まれず、罹癌者由来のリンパ球に選択的に取り込まれることも確認 された（図 8を参照。）。
[0021] 本発明は、このような重要な特性に基づき開発されたものである。すなわち、本発 明は、癌罹病の検定に使用するデータを収集する方法に係わり、該データは、被検 者力 採取したリンパ球にへマトポルフィリン誘導体をカ卩える工程と、前記工程で得ら れた混合物に特定波長の光を照射してへマトポルフィリン誘導体より励起発光を発 生させる工程と、前記工程で発生した発光量を測定する工程とを含み、前記工程で 得られる発光量が正常健康者から同様の工程により得られた発光量より多い場合に 被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断する検定において使用される。
[0022] 従って、本発明においてデータを収集するために使用し得る癌罹病検定用装置は 、特定波長の光照射手段と、低雑音で高感度に発光スペクトルを観測できる微弱発 光測定手段とを具備することが必要である。図 1は、本発明の癌罹病検定用装置の 一態様を示すものであり、試料セル 1と、試料セルを収容する試料室 2と、試料セル 1 に収容されるべき試料に光を照射するための光照射手段 10と、試料力 発生する発 光強度を測定する発光測定手段 11と、前記発光測定手段 11との間に設けられた光 学フィルター 12と、前記試料室の下方に設けられた加熱手段 13とを具備し、更に前 記試料室 2は、該試料室内の雰囲気を不活性ガス雰囲気に置換するためのガス入 口 3及びガス出口 4を備えている。
[0023] 前記光学フィルター 12は、分光機構の一例であり、 HPDに特異的な発光を測定す るために 600nm以上の光を通す光学フィルターが用いられる。また、分光機構の他 の例としては、 600nm以上の光を通す分光器又は受光素子が挙げられ、分光器とし ては例えばグレーティングなどが好適に用いられる。
[0024] また、前記試料セル 1及び/又は試料室 2は、照射される光により励起される物質 を含まない材料、すなわち、高純度物質から形成されていることが好ましぐ例えば、
Si〇、高純度ガラス、高純度石英ガラス、ステンレス、 Si、 SiCなどが具体例として挙
2
げられる。
[0025] また、光照射手段 10としてレーザー光源が使用され得、レーザー光の波長は、 HP D由来の発光を誘発すべく、 300nm〜450nmであること力 S好ましく、 330nm〜420 nmがより好ましい。更に、レーザー光の照射出力が高すぎると大量の活性酸素が生 成し、細胞死を招いて自己発光を誘起するおそれがある。このため、照射出力の調 整が必要であり、その上限は平均出力 10mW以下とすることが好ましい。なお、レー ザ一は直線光であるため、拡散レンズ (非球面）を通すことにより、光を拡散させ照射 面積を大きくすることもできる。また、ノ ルスレーザーでも前記条件を満たすものであ れば本発明において好適に使用することができる。パルスレーザーの場合、送信と 受信との同期をとる周期増幅方式を受光源にも適用でき、ノイズ軽減に役立てること ができる。
[0026] 本発明の癌罹病検定用装置における、特に光照射手段と、分光機構と、発光強度 測定手段とにより構成される態様について、図 1とは異なる他の態様を、模式的に示 した図を参照しながら以下に説明する。
[0027] 図 2は、特定波長の光を通す光学フィルターを用いた装置の一態様であり、光学フ ィルター 112により、光照射手段 100から照射された光が反射される一方、 600nm 以上の光を通すことにより、へマトポルフェリン及び/又はその誘導体由来の励起発 光の発光量が発光強度測定手段 111により測定される。
[0028] 図 3は、特定波長の光を通す分光器としてグレーティングを用いた装置の一態様で あり、光照射手段 200から照射された光を受けて試料力も発生した励起発光から、グ レーティング 212により 600nm以上の光が取り出されることにより、へマトポルフェリン 及び Z又はその誘導体由来の励起発光の発光量が発光強度測定手段 211により測 定される。
[0029] また、図 4に示すような構成（多検体測定装置）とすることにより、複数の試料を連続 的に測定することができる。すなわち、試料室（図示せず）内に設けられた移動手段 3 50 (例えば、ターンテーブル）の上に、複数の試料セル 301を載荷する。ターンテー ブルの場合、試料セル 301は図 4に示すように円状に配置する。このような構成を採 用した場合、光照射手段 300が光を試料 302に照射した後、移動手段 350を移動（ 回転)させることにより光照射後の試料 302を発光強度測定手段 311の下へ移動し、 600nm以上の光を通す分光機構 312を介した試料力 の励起発光を測定すること により、へマトポルフェリン及び/又はその誘導体由来の励起発光の発光量が測定 される。このような操作を繰り返すことにより、複数の試料を連続的に測定することが できる。ここで、移動手段 305及び試料セル 301は照射光が当たっても光らない素材 のものが用いられる。また、このような移動手段 350を用いることなく試料室内に置か れた複数の試料について一度に測定することも、照射が均一になるよう複数の光照 射手段を用いる、 CCDカメラのような受光素子を利用した発光強度測定、など工夫 次第で可能である。
[0030] [実施例]
(1)細胞分離と HPD処理
被検者から採取した全血 17ml (抗凝固液を含む。）に、 6%デキストラン溶液を全 血（質量）に対して 20%となるように加え、転倒混和して 1時間室温にて放置した。放 置後、上清を回収し、フイコール溶液（Amersham Biosciences, Sweden)に重層し、比 重遠心法によりリンパ球層及び好中球層を分離、回収した。
[0031] リンパ球の回収層を PBS (137mM NaCL 8. ImM Na HPO - 12H 0、 2. 68
2 4 2 mM KC1、 1. 47mM KH PO ) 10mlで 2回洗浄した後、 5mMの HPDをリンパ球
2 4
数 1 X 106個/ mlに対して 60 μ 1の割合で添加し、 37°Cで 10分間インキュベートした 。次いで、前記 PBSlOmlで 2回洗浄した後、リンパ球数 1 X 106個/ mlに対して 200 μ 1となるよう生理食塩水で細胞を懸濁し、これをサンプルとした。
[0032] (2)癌罹病検定用装置及び該装置を用いた化学発光量の測定条件
ィ匕学発光検出 (Chemiluminescence detection: CL-detection) ί 、 ¾温におレヽて、 図 1に示した低雑音で高感度に発光スペクトルを観測できる本発明の癌罹病検定用 装置（フィルター： NDフィルター 103 + 600High Pass (内蔵） +Gain=10、ステンレス微 量セル（20mm φ )を用いレーザ照射しながら測定した。レーザ光の波長は 408nm 、照射出力は 5mWとし、化学発光の測定時間は 2分間とした。レーザー光の照射下 で化学発光を検出する本方法では、未染色のリンパ球 (ブランク)からも非特異的な 発光が観測されるため、 HPDによる化学発光量の計測値はブランク測定値との差か ら求めた。
[0033] (3) HPDの発光スペクトルの観測
(3 - 1) 前記（1)で得られたサンプル 50 μ ΐ (リンパ球 2. 5 X 105個）に、前記（2) に示した装置及び測定条件にてレーザー光を照射し、励起することで観測された発 光スぺクトノレを図 5に示す。図 5に ίま、発光極大 ίま 560〜580nm、 620〜640nm、 及び 680〜700nmにあること力 S示されている。生理食塩水（0. 9%NaCl)の場合、 5 60〜580nmのみに発光極大力 Sあること力ら、 HPD由来の発光は 600nm以降に存 在することがわかる。従って、上述したように、 600nm以上の波長のみを通すハイパ スフィルターを使用することにより、リンパ球中の HPDを選択的に観測できることがわ かる。
[0034] (3— 2)レーザー照射による化学発光量と HPD濃度との関係を調べ、その結果を 図 6に示す。 408nmのレーザー励起した場合に観測された HPD由来の CL放出量 と HPD濃度との関係を示すものであり、図中の横軸は、 HPDの最終濃度を表し、縦 軸は 30秒間の平均発光量 (カウント数）を示す。 HPD濃度を 0_ 20pmolに調整した HPD水溶夜（200 )の発光量は、ブランクを除くと 1400— 2500カウントとなり、双 方は良好な関係を示した。なお、本実験に用いた装置では、 2. 5pmolまでの HPD 定量が可能であった。
[0035] (4) HPD染色したリンパ球のフオトン放出量
生理食塩水および健常人のリンパ球からは HPD由来でない非特異的な CL (500 0— 6000カウント）が観測されるため、罹癌者及び健常人のリンパ球（1. 25 X 105個 )を HPDで染色し、レーザー光（408nm)を照射したときに観測される CL放出量と、 生理食塩水にレーザー光を照射したときの CL放出量との差を求めた。結果を表 1及 び図 7に示す。表 1及び図 7において発光強度（CL強度）は 30秒間の平均発光量（ カウント数）を示し、健常人及び罹癌者各 7人のサンプノレのデータを平均したもので ある。
[0036] 図 7から、 HPD染色した罹癌者由来のリンパ球の CL放出量力 他の 3群、すなわ ち、 HPD染色した健常人由来のリンパ球、 HPD未染色の罹癌者由来のリンパ球、 及び HPD未染色の健常人由来のリンパ球各々からの CL放出量に比べ有意な差が 見られること力 Sわ力る。 HPD染色していない罹癌者由来のリンパ球の CL量との比較 では約 2〜2. 5倍多いことがわかる。この差は統計学的にも、 pく 0. 05で有意であつ た。罹癌者由来のリンパ球に結合した HPD濃度を図 6から求めると約 lOOpmol/1 X 106個であった。
[0037] また、上記データ (表 1)から、 HPD染色前後における罹癌者由来リンパ球の発光 量の差と、 HPD染色前後における健常人由来リンパ球の発光量の差とを比較した結 果を表 1及び図 8に示す。この結果から、 HPDが健常人由来のリンパ球には殆ど取り 込まれず、罹癌者由来のリンパ球に選択的に取り込まれることは明らである。
[表 1]
表 1
罹癌者 罹， Β3¾ 健常人 健常人 權 ¾33 健常人 HPD (+) HPD(-) HPD (+) HPD (-) HPD取込量 HPD取込量
CL強度
12540 5199 7673. 841 7878. 752 7340 (205) (平均)
sd 7074. 911 2704. 915 1141. 843 878. 5273 6990. 293 1209. 737

Claims

請求の範囲
[1] 癌罹病の検定に使用するデータを収集する方法であって、
被検者から採取したリンパ球にへマトポルフィリン及び/又はその誘導体を加える 工程と、
前記工程で得られた混合物に特定波長の光を照射してへマトポルフィリン及び/ 又はその誘導体より励起発光を発生させる工程と、
前記工程で発生した発光量を測定する工程と、
を含み、
前記工程で得られる発光量が正常健康者から同様の工程により得られた発光量より 多レ、場合に被検者が癌を罹患してレ、る可能性が高いと判断する検定にぉレ、て使用 されるデータを収集する方法。
[2] 前記方法が、へマトポルフィリン及びその誘導体が罹癌者由来のリンパ球に選択的 に結合する性質を利用したものであり、へマトポルフィリン及び/又はその誘導体を 取り込んだ罹癌者由来のリンパ球、およびへマトポルフィリン及び Z又はその誘導体 を取り込んでいない正常健康者由来のリンパ球に起因する前記発光量各々に有意 な差があることを利用した罹癌病の検定に使用される、請求項 1に記載のデータの収 集方法。
[3] リンパ球に結合したへマトポルフィリン及び Z又はその誘導体を定量する方法であ つて、
リンパ球にへマトポルフィリン及び z又はその誘導体をカ卩える工程と、
前記工程で得られたリンパ球に特定波長の光を照射してへマトポルフィリン及び/ 又はその誘導体より励起発光を発生させる工程と、
前記工程で発生した発光量を測定する工程と、
を含む方法。
[4] 請求項 3に記載の方法が、へマトポルフィリン及び/又はその誘導体が罹癌者由 来のリンパ球に選択的に結合する性質を利用したものであり、該方法を用いて定量さ れたへマトポルフィリン量から罹癌者由来のリンパ球を検知する方法。
[5] 請求項 1乃至 4のいずれか 1項に記載の方法において使用される癌罹病検定用装 置であって、特定波長の光照射手段と、微弱発光測定手段と、を具備する癌罹病検 定用装置。
[6] 請求項 1乃至 4のいずれか 1項に記載の方法において使用される癌罹病検定用装 置であって、試料セルと、前記試料セルを収容する試料室と、前記試料セルに収容 されるべき試料に光を照射するための光照射手段と、前記試料から発生する発光強 度を測定する発光強度測定手段と、前記試料室と前記発光強度測定手段との間に 設けられた分光機構と、を具備する癌罹病検定用装置。
[7] 前記試料室の下方に加熱手段が設けられている、請求項 6に記載の癌罹病検定 用装置。
[8] 前記分光機構として 600nm以上の光を通す、光学フィルター、分光器、又は受光 素子を具備し、これによりへマトポルフィリンに特異的な発光を測定する、請求項 6に 記載の癌罹病検定用装置。
[9] 前記試料セル及び/又は試料室が、照射される光により励起される物質を含まな い材料から形成されている、請求項 6に記載の癌罹病検定用装置。
[10] 前記試料室が、前記試料セル中に収容されるべき試料の雰囲気を不活性ガス雰 囲気に置換するためのガス入口及びガス出口を備えている、請求項 6に記載の癌罹 病検定用装置。
[11] 光照射手段としてレーザー光源を使用している、請求項 5に記載の癌罹病検定用 装置。
[12] 光照射手段としてレーザー光源を使用している、請求項 6に記載の癌罹病検定用 装置。
[13] レーザー光源を 300〜450nmとする、請求項 11に記載の癌罹病検定用装置。
[14] レーザー光源を 300〜450nmとする、請求項 12に記載の癌罹病検定用装置。
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