JPS60178355A - リンパ球の測定方法 - Google Patents
リンパ球の測定方法Info
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- JPS60178355A JPS60178355A JP59033774A JP3377484A JPS60178355A JP S60178355 A JPS60178355 A JP S60178355A JP 59033774 A JP59033774 A JP 59033774A JP 3377484 A JP3377484 A JP 3377484A JP S60178355 A JPS60178355 A JP S60178355A
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- Japan
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- lymphocytes
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
を有する化合物を用いて検体中のリン・ぐ球とｉｎｖｉ
ｔｒｏで反応せしめ、反応した化合物の螢光強度を測定
する方法に関するものであり、従って、この方法は癌疾
患の診断方法として有用である。
ｔｒｏで反応せしめ、反応した化合物の螢光強度を測定
する方法に関するものであり、従って、この方法は癌疾
患の診断方法として有用である。
急増しつつある癌疾患の診断方法のうち、巾近脚光を浴
びてきたものの一つに光感受性物質とレーザ光線を用い
る方法がある。この方法は、腫瘍細胞に親．和性を有す
る光感受性物質を静脈内：！９ＡＬ、長時間かけて腫瘍
に蓄積させた後レーザ光線を患部に照射して、光感受性
物質が発する螢光を観察することによって腫瘍を判別す
′る方法である。
びてきたものの一つに光感受性物質とレーザ光線を用い
る方法がある。この方法は、腫瘍細胞に親．和性を有す
る光感受性物質を静脈内：！９ＡＬ、長時間かけて腫瘍
に蓄積させた後レーザ光線を患部に照射して、光感受性
物質が発する螢光を観察することによって腫瘍を判別す
′る方法である。
しかし、該方法は生体内（ ｉｎ ｖｉｖｏ）での測定
であるため、患者に多大の苦痛を与えかつ多くの労力を
要していた。
であるため、患者に多大の苦痛を与えかつ多くの労力を
要していた。
本発明者らはこれらの点を改善すべく研究を進め、先に
ヘマトポルフィリンあるいはヘマトボルフィリン誘導体
が生体外に取り出した癌患者のリン・ｅ球や癌細胞に対
して反応することを見出し、このリン・２球や癌細胞と
反応したヘマトポルフィリン等の量を電子スピン共鳴（
ＥＳＲ ）装置を用いて測定することによる癌疾患を
検定する技術を完成して、この内容を特許出願した（４
？願昭５８− ８ ３，６ ５ １号および特願昭５８
−２４：’．．４５３号）。その後、本発明者らはさら
に研究を重ね、同様に良好な結果が螢光強度の測定によ
っても得られることを見出し、この知見に基いて本発明
を完成するに至った。
ヘマトポルフィリンあるいはヘマトボルフィリン誘導体
が生体外に取り出した癌患者のリン・ｅ球や癌細胞に対
して反応することを見出し、このリン・２球や癌細胞と
反応したヘマトポルフィリン等の量を電子スピン共鳴（
ＥＳＲ ）装置を用いて測定することによる癌疾患を
検定する技術を完成して、この内容を特許出願した（４
？願昭５８− ８ ３，６ ５ １号および特願昭５８
−２４：’．．４５３号）。その後、本発明者らはさら
に研究を重ね、同様に良好な結果が螢光強度の測定によ
っても得られることを見出し、この知見に基いて本発明
を完成するに至った。
すなわち、本発明は、特定のリン・ｅ球に対して親和性
を有しかつ螢光を発する能力を有する化合物を、測定対
象のリンパ球と接触せしめ、その後螢光強度を測定する
ことを特徴とする特定のリン・９球の測定方法に関する
ものである。
を有しかつ螢光を発する能力を有する化合物を、測定対
象のリンパ球と接触せしめ、その後螢光強度を測定する
ことを特徴とする特定のリン・９球の測定方法に関する
ものである。
以下、本発明の内容を罹癌患渚のリン・９球を測定する
場合を例として説明する。
場合を例として説明する。
罹癌患者のリンパ球に対して親和性を有しかつ螢光を発
する能力を有する化合物（以下、螢、元化合物という。
する能力を有する化合物（以下、螢、元化合物という。
）はポルフィリン環を廟する化合物および多環性化合物
などから選ばれる。ポルフィリン環を廟し７上記の性質
を具有する化合物の例としてハ、ヘマトポルフィリン、
１０−ヒドロキシフエオフオルパイドａ１フェオフォル
バイトａ１ピロクロロフィライトａ１これらの誘導体及
びこれらの類似物質を挙げることができ、上記の性質を
具廟する会辛魂多環性化合物の例としてはテトラサイク
リン、アクリノンオレンジ、これらの誘導体及びこれら
の類似物質を挙げることができる。。
などから選ばれる。ポルフィリン環を廟し７上記の性質
を具有する化合物の例としてハ、ヘマトポルフィリン、
１０−ヒドロキシフエオフオルパイドａ１フェオフォル
バイトａ１ピロクロロフィライトａ１これらの誘導体及
びこれらの類似物質を挙げることができ、上記の性質を
具廟する会辛魂多環性化合物の例としてはテトラサイク
リン、アクリノンオレンジ、これらの誘導体及びこれら
の類似物質を挙げることができる。。
誘導体の例をヘマトポルフィリンについて挙げると、
ヘマトポルフィリン
Ｍ ： −ＣＨ５
Ｅ’： −ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ。
Ｐ ： −ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ
ヘマトポルフィリン防２４俸
（Ｒ，、Ｒ２，Ｒ５，Ｒ４’＋ Ｒ５，Ｒ７，は−ＣＨ
３゜−ＣＩ４２ＣＨ３，−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３のいずれ
かであり、Ｒ６゜Ｒ７は−（Ｃ■■２）。Ｃ００Ｈ（ｎ
＝２〜４）である。２はＦｅ ＋ Ｃｏ ＋ Ｍｎ な
どの２価の金属原子又は水素原子である。） などである。
３゜−ＣＩ４２ＣＨ３，−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３のいずれ
かであり、Ｒ６゜Ｒ７は−（Ｃ■■２）。Ｃ００Ｈ（ｎ
＝２〜４）である。２はＦｅ ＋ Ｃｏ ＋ Ｍｎ な
どの２価の金属原子又は水素原子である。） などである。
測定対象のリンパ球は被検者から採取したものである。
この採取は例えばヘパリン採血によって行なわれる。リ
ンパ球は測定精度を高めるために血液などの検体から分
離してから前記の螢光化合物に接触させるのがよく、ま
た、特にマクロファージはフォールス、］？ノティブの
原因になるのでこれを予め除去しておくことが好ましい
。マクロファージの除去方法としては、単球除去剤ある
いはセフアゾ、クスなどに吸着させる方法が一般的であ
る。例えば、単球除去剤を全血に対し８〜１２％（ｖ／
ｖ ）程度になるように添加し、３５〜３８°Ｇで数分
ないし３０分間程度必要に応じて攪拌しながら放置して
マクロファージを吸着させ、これにセミ４レートＬ、パ
ーコールなどよく知られた分離液を重層して遠心分離す
ることによってマクロファージを除去するとともにリン
パ球を分離することができる。セファデックスを用いる
場合には、比重遠心法で調製した白血球（顆粒球、好中
球、マクロファージ、リン・ぞ球等を含ム。）をセフア
ゾ、クス力ラムに投入するとリンパ球以外の細胞がセフ
ァデックスに吸着されるのでカラムから流出する素通シ
分画を集めればよい。
ンパ球は測定精度を高めるために血液などの検体から分
離してから前記の螢光化合物に接触させるのがよく、ま
た、特にマクロファージはフォールス、］？ノティブの
原因になるのでこれを予め除去しておくことが好ましい
。マクロファージの除去方法としては、単球除去剤ある
いはセフアゾ、クスなどに吸着させる方法が一般的であ
る。例えば、単球除去剤を全血に対し８〜１２％（ｖ／
ｖ ）程度になるように添加し、３５〜３８°Ｇで数分
ないし３０分間程度必要に応じて攪拌しながら放置して
マクロファージを吸着させ、これにセミ４レートＬ、パ
ーコールなどよく知られた分離液を重層して遠心分離す
ることによってマクロファージを除去するとともにリン
パ球を分離することができる。セファデックスを用いる
場合には、比重遠心法で調製した白血球（顆粒球、好中
球、マクロファージ、リン・ぞ球等を含ム。）をセフア
ゾ、クス力ラムに投入するとリンパ球以外の細胞がセフ
ァデックスに吸着されるのでカラムから流出する素通シ
分画を集めればよい。
このようにして分離したリンパ球を必要に応じてリン酸
緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ溶液）などで洗浄するととも
に所定の濃度にＰＢＳ溶液などで調整する。この濃度の
適当な範囲は螢光測定装置や検体の種類あるいは使用す
る螢光化合物などによって定まることはいうまでもない
。
緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ溶液）などで洗浄するととも
に所定の濃度にＰＢＳ溶液などで調整する。この濃度の
適当な範囲は螢光測定装置や検体の種類あるいは使用す
る螢光化合物などによって定まることはいうまでもない
。
螢光化合物ヲリン・９球と接触きせる方法としては、要
は両者の混合溶液状態をつくり出せばよく、ヘマトポル
フィリン類を用いた場合を例に述べると、例えばヘマト
ポルフィリン類溶液をリンパ球浮遊液に加え、室温ない
しは３７℃前後で５〜２０分間程度インキュベートすれ
ばよい。
は両者の混合溶液状態をつくり出せばよく、ヘマトポル
フィリン類を用いた場合を例に述べると、例えばヘマト
ポルフィリン類溶液をリンパ球浮遊液に加え、室温ない
しは３７℃前後で５〜２０分間程度インキュベートすれ
ばよい。
反応後は、通常は遠心洗浄などによって未反応の螢光化
合物を除去してから螢光強度を測定する。
合物を除去してから螢光強度を測定する。
しかしながら、後述のフロー・サイトメーターを用いた
場合には、リンパ球を個別に測定できるところから、未
反応の螢光化合物を除去しなくても螢光化合物と反応し
たリン・８球をカウントすることが可能である。しかし
、その場合でも、識別性を高める点で未反応の螢光化合
物を除去したほうが好ましい。
場合には、リンパ球を個別に測定できるところから、未
反応の螢光化合物を除去しなくても螢光化合物と反応し
たリン・８球をカウントすることが可能である。しかし
、その場合でも、識別性を高める点で未反応の螢光化合
物を除去したほうが好ましい。
螢光強度は公知の螢光測定装置を用いればよく、例えば
螢光光度側によって測定することも可能であるが、その
場合にはリンパ球相互の干渉によって測定精度が劣ると
いう問題点がある。本発明者らは上記の事実を見出し、
フロー・サイトメーター （、ＦＣＭ ）を用いること
によってこの問題点を解決し測定精度を向上させること
ができた。
螢光光度側によって測定することも可能であるが、その
場合にはリンパ球相互の干渉によって測定精度が劣ると
いう問題点がある。本発明者らは上記の事実を見出し、
フロー・サイトメーター （、ＦＣＭ ）を用いること
によってこの問題点を解決し測定精度を向上させること
ができた。
とのＦＣＭは細胞浮遊液を流体力学的焦点法によシ細胞
がほぼ、−列にかつ等速で流れるようにし、このサンプ
ル流にレーザ光を照射して各細胞ごとの散乱光と螢光を
測定する装置であり、螢光を発する細胞数の同時計測が
可能である点が特に有効である。レーザ光には、例えば
アルゴンレーザ光、クリプトンレーザ光などを用いれば
よい。
がほぼ、−列にかつ等速で流れるようにし、このサンプ
ル流にレーザ光を照射して各細胞ごとの散乱光と螢光を
測定する装置であり、螢光を発する細胞数の同時計測が
可能である点が特に有効である。レーザ光には、例えば
アルゴンレーザ光、クリプトンレーザ光などを用いれば
よい。
本発明の方法は、以上述べた如く、被検者に肉体的苦痛
を与えることなく、癌の診断を容易にかつ迅速に行なう
ことができる。
を与えることなく、癌の診断を容易にかつ迅速に行なう
ことができる。
以上、癌の診断方法を中心に述べたが、本発明の方法は
これに限定されるものではなく、その原理を応用して種
々の検査、診断等に活用することが可能である。
これに限定されるものではなく、その原理を応用して種
々の検査、診断等に活用することが可能である。
以下、実施例を示す。
実施例１
本実施例では、癌患者検体２５例、良性疾患患者検体１
５例及び正常者検体２０例について測定した。
５例及び正常者検体２０例について測定した。
リンノｆ球はヘパリン採血による全血５〜１０ ｍｌか
ら調製した。すなわち、全血に５％シリカを含む単球除
去試薬（ＩＢＬ社製）を５００〜１０００ ／Ｊ添加し
、３７°Ｇで３０分間転倒混和した。これをセパレート
Ｌ （Ｍｏｔｏ Ｒｏｉｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
製）に重層し、遠心分離してリンパ球を採取した。こ
のリンパ球をＰＢＳ溶液（ｏ、ｏｏｓモル、Ｐ！４７．
４．０８％ＮａＣ１）で遠心洗浄後、最終的に約１０個
／ ｍｌ）になるようにＰＢＳ溶液を用いて浮遊させた
。
ら調製した。すなわち、全血に５％シリカを含む単球除
去試薬（ＩＢＬ社製）を５００〜１０００ ／Ｊ添加し
、３７°Ｇで３０分間転倒混和した。これをセパレート
Ｌ （Ｍｏｔｏ Ｒｏｉｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
製）に重層し、遠心分離してリンパ球を採取した。こ
のリンパ球をＰＢＳ溶液（ｏ、ｏｏｓモル、Ｐ！４７．
４．０８％ＮａＣ１）で遠心洗浄後、最終的に約１０個
／ ｍｌ）になるようにＰＢＳ溶液を用いて浮遊させた
。
このリンパ球浮遊液に０．００５Ｍヘマトポルフィリン
溶液５０μｌを添加し、３７℃で１０分間インキ−ベー
トした。続いて、リンパ球４ｐＢｓ溶液で３回洗浄して
から約１０６個／ ｍｅに濃度調整し、ＦＣＭによって
螢光強度を測定した。
溶液５０μｌを添加し、３７℃で１０分間インキ−ベー
トした。続いて、リンパ球４ｐＢｓ溶液で３回洗浄して
から約１０６個／ ｍｅに濃度調整し、ＦＣＭによって
螢光強度を測定した。
ＦＣＭにはＣｏｕｌｔｅｒ社製のＥＰＩＣ８Ｖ を用い
、ヘマト４？ルフイリンの励起にはアルゴンレーザ光を
用いて５９０ ｎｍの赤色光を測定し／ζ。
、ヘマト４？ルフイリンの励起にはアルゴンレーザ光を
用いて５９０ ｎｍの赤色光を測定し／ζ。
正常者１例（ａ）及び癌患者２例（ｂ）及び（Ｃ）につ
いて得られた螢光強度と細胞数の関係を第１図に示す。
いて得られた螢光強度と細胞数の関係を第１図に示す。
図示の如く、癌患者のリン・ぞ球にはヘマｌ−、ｔ？ル
ンイリンに陽性のものが多く存在している。
ンイリンに陽性のものが多く存在している。
全検体の測定結果では、癌患者のリンパ球のうちヘマト
ポルフィリン陽性細胞数の比率は５．７１±２．５９％
（平均値±ｌ５Ｄ）であり、これは良性疾患患者の１８
９＋０．４７幅及び正常者の１６６±０５６チに比して
有意に高いものであった。この分布を第２図に示す。
ポルフィリン陽性細胞数の比率は５．７１±２．５９％
（平均値±ｌ５Ｄ）であり、これは良性疾患患者の１８
９＋０．４７幅及び正常者の１６６±０５６チに比して
有意に高いものであった。この分布を第２図に示す。
なお、一般式（Ｂ）に例示しだ各ヘマトポルフィリンに
ついても上記と同様の結果が得られた。
ついても上記と同様の結果が得られた。
実施例２
ヘマトポルフィリンのかわりにアクリジンオレンジ又は
フェオフォルバイトａを用い、実施例１とほぼ同じ条件
で測定したところ、以下に示す結果が得られた。
フェオフォルバイトａを用い、実施例１とほぼ同じ条件
で測定したところ、以下に示す結果が得られた。
螢光化合物 正常者（ｎ＝２０）癌患者（ｎ＝２５）ア
クリジンオレンジ １７８±０６３％ ４．２５±２．
３２％フェオフォルバイト”ａ １．７４±０．６１チ
４．３９±２．１７％
クリジンオレンジ １７８±０６３％ ４．２５±２．
３２％フェオフォルバイト”ａ １．７４±０．６１チ
４．３９±２．１７％
第１図はヘマト、Ｉ？ルフィリンを反応させたリン・ぐ
球の螢光強度をフロー・サイトメーターで測定した結果
の例示であり、縦軸は細胞数そして横軸は螢光強度を示
している。 第２図は正常者、良性疾患患者及び癌患者について陽性
リンパ球率を測定して得られたそれぞれの分布状態を示
すものである。 第１図 咳兜５９、友 頃六、鍬魁 域先弾創 第２図
球の螢光強度をフロー・サイトメーターで測定した結果
の例示であり、縦軸は細胞数そして横軸は螢光強度を示
している。 第２図は正常者、良性疾患患者及び癌患者について陽性
リンパ球率を測定して得られたそれぞれの分布状態を示
すものである。 第１図 咳兜５９、友 頃六、鍬魁 域先弾創 第２図
Claims (1)
- （１）特定のリン・９球に対して親和性を有しかつ螢光
を発する能力を有する化合物を、測定対象のリンパ球と
接触せしめ、その後螢光強度を測定することを特徴とす
る特定のリン・９球の測定方法（２） 特定のリン・２
球が罹癌患者のリンパ球である特許請求の範囲第１項記
載の測定方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59033774A JPS60178355A (ja) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | リンパ球の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59033774A JPS60178355A (ja) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | リンパ球の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60178355A true JPS60178355A (ja) | 1985-09-12 |
| JPH0249664B2 JPH0249664B2 (ja) | 1990-10-30 |
Family
ID=12395794
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59033774A Granted JPS60178355A (ja) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | リンパ球の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60178355A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007074730A1 (ja) * | 2005-12-27 | 2007-07-05 | Tohoku Electronic Industrial Co., Ltd. | 癌罹病検定用データの収集方法及び該方法に使用される癌罹病検定用装置 |
| JP2010054305A (ja) * | 2008-08-27 | 2010-03-11 | Tohoku Denshi Sangyo Kk | 癌罹病の検定に使用するデータの収集方法 |
-
1984
- 1984-02-24 JP JP59033774A patent/JPS60178355A/ja active Granted
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007074730A1 (ja) * | 2005-12-27 | 2007-07-05 | Tohoku Electronic Industrial Co., Ltd. | 癌罹病検定用データの収集方法及び該方法に使用される癌罹病検定用装置 |
| JP2007178237A (ja) * | 2005-12-27 | 2007-07-12 | Tohoku Denshi Sangyo Kk | 癌罹病検定用データの収集方法及び該方法に使用される癌罹病検定用装置 |
| JP4509927B2 (ja) * | 2005-12-27 | 2010-07-21 | 東北電子産業株式会社 | 癌罹病検定用データの収集方法及び該方法に使用される癌罹病検定用装置 |
| JP2010054305A (ja) * | 2008-08-27 | 2010-03-11 | Tohoku Denshi Sangyo Kk | 癌罹病の検定に使用するデータの収集方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0249664B2 (ja) | 1990-10-30 |
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