SU1334085A1 - Способ диагностики синдрома гиперкоагул ции - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к иммунологии . Цель изобретени  - упрощение и повышение точности способа. Из венозной гепаринизированной крови выдел ют мононуклеарные .клетки и отмывают их. К лимфоцитам добавл ют эритроциты быка, сенсибилизированные к тромбину. Смесь инкубируют, центрифугируют и вьщерживают в холодильнике. .Подсчитывают ксхпичество лимфоцитов, образовавпшх розетки с эритроцитами быка, на 100 клеток. При содержании их более 2% диагностируют синдром гиперкоагул ции . Дл  идентификации лимфоцитов провод т дополнительно люминесцентную микроскопию. 00 со 4 о X

Description

1

Изобретение относитс  к медицине, а именно к иммунологии и коагулоло- гни.

Цель изобретени  - упрощение и повышение точности способа диагностики синдрома гиперкоагул ции.

Способ осуществл ют следующим образом .

Из венозной гепаринизированной крови (З-ЗдЗ мл) на градиенте платности фиколл-верографина (,077 г/м ВБщел ют мононуклеарные клетки с чистотой 85-90%. Выделенные клетки трижды отмывают от сывороточньпк; белков средой 199, Довод т до рабочей концентрации 2-3-10 /мл в среде 199 В реак1щи используют эритро1 ;иты быка сенсибилизированные к тромбину„ Их получают следующим образом.

Эритроциты быка отмывают трижды физиологическим раствором. Из отмытых эритроцитов готов т 10%-ную взвесь на физиологическом растворе, К 3,0 мл 10%-ной взвеси эритроцитов быка добавл ют 1,0 мл 051%-ного раствора ализаринового красного, приготовленного на физиологическом растворе , и тромбина очищенного,, без плазминогена (10 ед.)5 растворенного в физиологическом растворе (1,0 14л) „ Тщательно перемешивают и став т в термостат при 45 С на 1 ч. Затем эри трощ1ты быка вновь отмывают трилоды физиологическим раствором и готов т 2%-ную суспензию эритроцитов в физиологическом растворе. В последующем к 0,2 мл лимфоцитов в концентрации 2-3-10 /мл добавл ют 0,2 14П 2%-ного раствора эритрогщтов бьпса, сенсибилизированных тромбином. Смесь инкубируют при 37°С 10 мин, затем центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин-и выдерживают в холодильнике при 4 С 1 ч или оставл ют на ночь (18 ч), Далее подсчитывают количество лимфоцитов, образовавших розетки с эритроцитами быка (3 эритроцита и более), на 100 клеток.

Дл  исключени  неспецифического образовани  розеток ставили параллельно 3 пробы: отмытые эритроциты быка и ЛИМФОЦИТЫ эритроциты быкоц, сенсибилизированные 0,1%-ным раствором ализаринового красного, и лиг фоциты;; эритроциты быка, сенсибилизированные ализариновым красным и нагруженные тромбином, и лимфоциты.

3340852 ,

Обследовано 57 детей, из них 16 здоровых и 41 с OP3s бронхитом из различной формой пневмонии. I- Пример 1 . Проведено исследование здорового ребенка 2 лет

3,0 мл гепаринизированной крови (25 ед/кп) развод т физиологическим раствором в 2 раза и наслаивают на 10 3,0 кп фиколл-верографина (плотность 1j077 г/мл), Центрифугируют 40 мин при 1500 об/мин. Снимают с интерфазной поверхности взвесь лимфоцитов и отмывают средой 199 три раза при

0

5

0

5 1000 об/мин в течение 10 мин затем провер ют жизнеспособность выделени  лимфоцитов по суправитальной окраске с трипановым синим и осуществл ют подсчет лимфоцитов в 1 ил. Готов т рабочий раствор ( 10 /мл) лимфо- 1ЩТОВ в среде 199. Параллельно с описанной процедурой осуществл ют трехкратное отмывание эритроцитов быка,, готов т 10%-ную суспензию в физиологическом растворе, В 3 пробирки разливают по 3,0 мл 10%-ного раствора эритроцитов быка, В 1-ю пробирку добавл ют 2,0 мп физиологического раствора, во 2-ю - 1,0 мл 051%-ного раствора ализаринового красного и 15 О мл физиологического раствора5 в 3-ю 1,0 мл 0,1%- ного раствора гшизаринового красного и 1,0 мл тромбина в дозе 10 ед/мл. Тромбин очищенный, без плазминогена. Каунасского производства о Все три пробирки став т в термостат при 45 С на 1 4t Затем трижды отмывают эритроциты и готов т 2%-ную суспензию на физиологическом растворе,, Став т параллельно 3 пробы, ДЛЯ чего в 3 пробирки разл 1вают по 0,2 мп суспензии лимфоцитов и соответственно добавл ют по О,, 2 МП приготовленных предварительно эритроцитов быка. Пробы тщательно перемешивают и став т в термостат при 37 С на 10 мин, затем иентрифугир: ют при 1000 об/мин 10 мин и инкубируют при в течение 18 ч. После инкубации все три пробы ресус- п.ензируют и подсчитывают количество ЛИМФОЦИТОВ; образовавших розетки не менее чем с трем  эритроцитами быка,

В 1-й пробирке розеток не обнаружено ., во второй Т41кже нет розеток, в третьей вы вггены 2 розеткообразую- шие клетки (из 100), к которым в одном случае прксоеди жпись 4 эритроцита быка, возле другой клетки образовалась полуморула,

0 i

5

5

313

Дл  идентификации лимфоцитов про- ведеио дополнительное исследование с помощью люминесцентной микроскопии Подтверждено наличие лимфоцита в центре розетки зеленым свечением  дра .

Таким образом, показана возможность наличи  рецепторов к тромбину на лимфоцитах у здорового ребенка. Всего обследовано 16 здоровых детей; сред   величина содержани  розеток - 1,1±0,2.

Пример 2. Ребенок Ч., бмес. Диагноз: остра  двухсторонн   очагова  пневмони , острый период. 3,0 мл гепаринизированной крови (25 ед/мп) развод т физиологическим раствором в

15

Пример 3. Ребенок И, 1г. 4 мес. Диагноз: двухсторонн   пневмони , справа полисегментарна , i-ir l Лимфоциты сенсибилизированные тромбином эритроцитов быка, получают аналогично описанному в примере 1. Количество лик оцитов, обра2 раза и наслаивают на 3,0 мл фиколл- 20 зовавших розетки - 14, что свидетель35

верографина (плотность раствора 1,077 г/мп). Последующа  процедура выделени  клеток и постановка проб аналогичны описанным в примере 1. В 1-й npo6jipKe розеток не обнаружено. 25 во 2-й - 2 розетки, в 3-й - 9 розеток . К лимфоцитам прикрепилось от 3 до 10 эритроцитов быка. Следовательно , в острый период пневмонии экспресси  рецепторов к тромбину более 30 выражена, что обусловлено активацией свертывающей системы, большим содержанием тромбина в кровотоке и возможной сенсибилизацией лимфоцитов, это свидетельствует о наличии у больного синдрома гиперкоагул ции. Дл  подтверждейи  этого известными дами необходимо провести р д исследований: определение тромботеста; определение времени рекальцификации; определение содержани  фибриногена; определение тромбинового времени; определение протромбинового индекса запись тромбоэластрограммы. Проведенные исследовани  показали, что врем  рекальцификации составл ло 115 с; концентраци  фибриногена 340 мг %; тромбиновое врем  23 сj протромбиновый индекс 97%. Данные тромбоэластограммы: Р - 4 мин, 30 ; К - 2 мин; мА - 50 мм. Только по одному из проведенных исследований судить о состо нии системы гемостаза не представл етс  возможным. Анализ коагулограммы (совокупности иссле- 55 дований) свидетельствует о тенденции к гиперкоагул ции, т.е. дл  обосновани  данного вьшода необходимо было провести шесть исследований.

ствует о значительной концентрации в периферическом кровотоке тромбина и, следовательно, о более выраженной гиперкоагул ции по сравнению с примером 2. Это св зано с более т желым и распространенным процессом в легких. Проведенные рутинные исследовани  системы гемостаза также свидетельствовали о значительно выраженном ги- перкоагул ционном синдроме. Так, врем  свертывани  крови по Ли-Уайту составл ло 3 мин, врем  рекальцификации 85, степень тромботеста VI, тромбиновое врем  19; протромбиновый индекс 95%j фибриноген 308 мг %.

Следовательно, по предлагаемому способу можно дать интегральную оценку состо ни  гемостаза в данный момент , не прибега  к многочисленным рутинным методам исследовани . . :

Всего обследован 41 больной, причем среднее содержание розеток при пневмонии составило 8,2±1,1.

Способ прост, не требует дорого- сто; щего оборудовани  и реактивов и может быть осуществлен, в любой лаборатории клинической иммунологии.

45

50

Claims (2)

1. Формула изобретени 

   Способ диагностики синдрома гиперкоагул ции у детей, больных острой пневмонией, путем исследовани  крови , отличающийс  тем, что, с целью упрощени  и повышени  точности способа, из исследуемой периферической крови выдел ют лимфоциты , определ ют в реакции розетко

   Таким обра ом, предлагаемый способ упрощает диагностику гиперкоагул ции . Поскольку способ отражает экспрессию рецепторов лимфоцитов к тромбину , то он обеспечивает повышение точности диагностики, так как отражает уровень циркулирующего в периферической крови фермента тромбина, который - вл етс  ключевым в системе гемостаза, и его содержание увеличиваетс  при гиперкоагул ции.

   Пример 3. Ребенок И, 1г. 4 мес. Диагноз: двухсторонн   пневмони , справа полисегментарна , i-ir l Лимфоциты сенсибилизированные тромбином эритроцитов быка, получают аналогично описанному в примере 1. Количество лик оцитов, обра

   ствует о значительной концентрации в периферическом кровотоке тромбина и, следовательно, о более выраженной гиперкоагул ции по сравнению с примером
2. 2. Это св зано с более т желым и распространенным процессом в легких. Проведенные рутинные исследовани  системы гемостаза также свидетельствовали о значительно выраженном ги- перкоагул ционном синдроме. Так, врем  свертывани  крови по Ли-Уайту составл ло 3 мин, врем  рекальцификации 85, степень тромботеста VI, тромбиновое врем  19; протромбиновый индекс 95%j фибриноген 308 мг %.

   25 30 55

   Следовательно, по предлагаемому способу можно дать интегральную оцеку состо ни  гемостаза в данный момент , не прибега  к многочисленным рутинным методам исследовани . . :

   Всего обследован 41 больной, причем среднее содержание розеток при пневмонии составило 8,2±1,1.

   Способ прост, не требует дорого- сто; щего оборудовани  и реактивов и может быть осуществлен, в любой лаборатории клинической иммунологии.

   45

   25 30 55

   50

   Формула изобретени 

   Способ диагностики синдрома гиперкоагул ции у детей, больных острой пневмонией, путем исследовани  крови , отличающийс  тем, что, с целью упрощени  и повышени  точности способа, из исследуемой периферической крови выдел ют лимфоциты , определ ют в реакции розетко513340858

   хэбразовани  количество клеток, несу держании их более 2% диагностируют щих рецепторы к тромбину, и при синдром гиперкоагул ции.