SU1429020A1

SU1429020A1 - Способ определени проницаемости мембраны эритроцитов и концентрации кальци в цитоплазме

Info

Publication number: SU1429020A1
Application number: SU853947900A
Authority: SU
Inventors: Сергей Николаевич Орлов; Николай Иванович Покудин; Ювеналий Васильевич Постнов
Priority date: 1985-07-04
Filing date: 1985-07-04
Publication date: 1988-10-07

Abstract

Изобретение может быть использовано дл оценки состо ни мембранных процессов при гипертонической болезни. Цель изобретени - повышение точности и упрощение способа. Суспензию эритроцитов инкубируют о и после добавлени раствора 9-аминодиметилкар- бокси-7-метокси-2-(3-окси-4-аминоме- тилкарбоксифенил)-хинолина в диметил- сульфоксиде. Затем в суспензию добавл ют изотоп Са в количестве 1,0 - 4,0 мкКи/мл. Регистрируют содержание кальци в эритроцитах через 15-20 и 2АО-260 мин инкубации. Определ ют удельную активность Са в среде инкубации и объем эритроцитов. Затем рассчитывают проницаемость мембраны и концентрацию свободного кальци в цитоплазме . При гипертонической болезни скорость входа кальци в эритроциты увеличена на 25%. 3 табл. (С (Л

Description

Изобретение относитс к медицине и ;«)жет быть использовано дл оценки состо ни мембранных процессов при гипертонической болезни.

I Целью изобретени вл етс повьше- нЦе точности при упрощении способа за сЦет применени изотопа Са в ,кон- ,ц«|нтрации t,0-4,0 мкКи/мп и регистра- цЦи его в эритроцитах через определен нфе сроки инкубации.

Способ осуществл ют следующим образом .

Из вз той дл биохимического анализа крови отбирают 5 мл и центрифу- гируют при 1000 g в течение 10 мин. Плазму и клетки белой крови удал ют. Отставшиес эритроциты трижды промывают при тех же услови х центрифугировани в среде следующего состава: 150 мл NaCl и 5 мм Na-фосфатнрго бу- iepa (рН 7,4). К 1 мл упакованных эритроцитов добавл ют 4 мл среды, содержащей 145 мМ NaCl, 5 шМ КС1, 1 тМ MgCl 1 мМСаС,, 10 мМ глюкозы, Ц мМ , 10 мМ трис-NCl .буфера 1рН 7,4), и 1 г на 100 мл среды сы- ророточного альбумина (V фракци ). Суспензию эритроцитов инкубируют в течение 20 мин при 37° G, после чего д Добавл ют, например, 50 мМ раствора |9-аминоДиметилкарбокси-7-метокси-2- (З-окси-4-аминометилкарбоксифенил)- хинолина в диметилсульфоксиде до конечной концентрации 150 мкМ. Суспен- зию эритроцитов инкубируют при 37 С в течение 90 мин. Нагруженна указанным соединением суспензи эритроцитов может непосредственно использоватьс дл дальнейшего анализа, а может и хранитьс при 0-2°С в течение 2 сут без изменени исследуемых параметров.

Суспензию в количестве 1,5 мл цен- |трифугируют при указанных услови х и (Дважды пpo ьюaют в среде, содержащей 145 мМ NaCl, 5 м КС1, 1 мМ MgCl,, 1 мМ CaCl, 10 мМ глюкозы, 1 мМ , 10 мМ трис-HCl буфера (рН 7,4), ресуспендируют в той же среде до конечного объема 1,5 мл и инкубируют при 37 С в течение 20 мин. В полученную суспензию добавл ют радиоактивный изотоп Са в количестве 1,0- 4,0 мкКи/мл. Уменьшение радиоактивности меньше 1,0 мкКи/мл приводит к снижению точности измерени , так как количество изотопа, накапливаемого в клетках, недостаточно дл достоверной регистрации на жидкостно-сцинцил цион

,

ном спектрометре. Увеличение концентрации более 4,0 мкКи/мл существенно не повышает точность измерени , но приводит к повьппению общего фона радиоактивности на рабочем месте и к повышению стоимости каждого ализа. Суспензию эритроцитов, содержащую Са, инкубируют при . Через 15 и 240 мин отбирают по 200 мкл суспензии , перенос т ее в 1 мл среды, содержащей 150 мМ NaCl, трис-HCl буфера (рН 7,4; и 0,1 мМ ЭДТА, и центрифугируют при указанных услови х. Полученный осадок эритроцитов вновь промывают при тех же услови х и обрабатывают путем добавлени 0,4 мл , 0,25%-ного раствора тритона X 100 и 0,5 мл 10%-ного раствора трихлорук- сусной кислоты. Белки осаждают при 2000 g в течение 10 мин, а 0,8 мл супериатанта перенос т в диоксановый сцинцил тор и определ ют радиоактивность . Указанные 15 и 240 мин вл ютс оптимальным временем выборки, так как кинетика аккумул ции эритроцитами носит линейный характер вплоть до 30 мий инкубации. Поэтому в процессе определени проницаемости мембраны эритроцитов дл кальци врем . инкубации ограничено 15 мин. Кинетика аккумул ции Са эритроцитами достигает насыщени к 240 мин (4 ч) инкубации . Количество радиоактивного кальци , наход щеес в клетках, к этому времени используют дл расчета концентрации свободного кальци в цитоплазме .

Дл определени проницаемости мембраны эритроцитов дл кальци используют формулу

5

где К - проницаемость мембраны эритроцитов , нмоль/л клеток в 1 мин;

- радиоактивность Са в эритроцитах через 15 мин инкубации , срт;

а - удельна радиоактивность Са в среде инкубации, срт/нмоль;

i V - объем эритроцитов в пробе,л; t - врем инкубации, мин. Дл определени концентрации каль-, ци в цитоплазме используют формулу

к вгг

1«

lav

240

Id

В

где концентраци кальци в

эритроцитах, iiM; К 115нМ -константа сродства кальци к 9-амин6диметилкар- бокси- 7-метокси-2-(3- окси-4-аминометилкарбок- сифенил) тсинолину; радиоактивность Са в эритроцитах через 240 мин инкубации, ерш; - концентраци 9-аминоди- метилкарбокси-7-метокси- 2-(3-окси-4-аминометил- карбоксифенил)-хинолина, нмоль/л клеток.

Полученные величины скорости аккумул ции и свободной концентрации кальци в цитоплазме эритр1оцитов используют дл оценки состо ни мемб- раны.

П р и м е р 1. Воспроизводимость метода показана в результате проведени следующих исследований. У одного пациента в течение мес ца делались заборы крови и определ лись величины проницаемости мембраны эритроцитов дл кальци и концентраци свободного кальци в цитоплазме.

В табл. 1 приведены результаты проницаемости мембр аЬы. эритроцитов дл кальци (К) и концентраци кальци ( ССа ) в цитоплазме эритроцитов ..

Таблица 1

1429020

дел етс с погрешностью не вьше fO% дл К и 15% дл ССа. Погрешность при определении величины К и с помощью известного метода составл ет 60-70 и 30-40% соответственно (1-3),

Пример 2. Использование предлагаемого метода дл оценки эффективности действи лекарственных препаратов (хинидина и трифторперазина) на состо ние мембраны.

В табл. 2 приведены результаты вли ни хинидина и трифторперазина на проницаемость мембраны эритроцитов дл 1 альци и концентрацию кальци в цитоплазме эритроцитов.

Таблица2

.5

+т

1052

890 953

965

950+30

96

45

103 87 50

93 93±3

55

Из анализа табл. 1 следует вывод о том, что статистически достоверно достигаемый результат измерени опре0

5

0

5

Из этих-результатов видно, что предлагаемый метод позвол ет вы вить вли ние лекарственных препаратов на состо ние мембраны при концентраци х 10 мкМ (хинидин) и 30 мкМ (трифтор- перазин). При использовании прототипа испытание этих веществ невозможно,так как они обладают собственной флуоресценцией .

Эффективность метода заключаетс в том, что его применение позвол ет выполн ть исследование проницаемости мембран с высокой точностью. Обследовано 35 больных гипертонической болезнью , 12 больных с вторичными формами артериальной гипертензии и 46 лиц контрольной группы, не имеющих симптомов артериальной гипертензии и указаний на наследственную от гщенность этим заболевание.

Результао-ы измерений приведены в табл. 3.

Таблица 3

46

980+41 98±5

35 1225+50 110+6

12 103Й+47 97+5

20

а б

V 0,001.

На основе статистического анализа дно, что скорость входа кальци в итроциты больных гипертонической лезнью увеличена по отношению к нтролю на 25% (р 0,00-1), что ука- цитоплазме определ ют по формуле

-радиоактивность Са в э роцитах через 15-20 мин кубации, ерш; j. удельна активность Са

среде инкубации, срт/нмол объем эритроцитов в проб

t - врем инкубации, мин, а Концентрацию свободного кальци

31|1вает на существование структурно- функциональных нарушений. Так как от- по этому параметру не обнаруже- у больных вторичными формами гиперл

Ф

нзии, то можно заключить, чте из- женные материалы могут быть исполь ваны дл диагностического теста на едмет разделени гипертонической |лезни и вторичных форм гипертензии

ормула изобретени

Способ определени проницаемости ;мбраны эритроцитов и концентрации

м

кальци в цитоплазме путем насыщени

leTOK высокоселективным хелатором кальци , отличающийс т ем, что, -С целью повышени точности

и упрощени способа, добавл ют изотоп Са в концентрации 1,0 - 4,0 мкКи/мл, регистрируют содержание его в эритроцитах через 15-20 мин и 240-260 мин инкубации, определ ют удельную активность в среде И1 кубации и объем эритроцитов, при этом проницаемость мембраны определ ют по формуле

где К

)У-2о

а V цитоплазме определ ют по формуле

-проницаемость мембраны эритроцитов, нмоль/л клеток в 1 мин:

4 Г

-радиоактивность Са в эритроцитах через 15-20 мин инкубации , ерш; j. удельна активность Са в

среде инкубации, срт/нмоль; объем эритроцитов в пробе, л;

цитоплазме определ ют по формуле

t - врем инкубации, мин, а Концентрацию свободного кальци в

где

0

нМ

5

0

Гг,1 - к А24о по Са J - К тг-7- ,

Са - концентраи 1Я свободного кальци в цитопл.азме,нМ; константа сродства кальци к 9-аминодиметилкарб- окси-7-метокси-2-(3-oкcи- 4-aминoмeтилкapбoкcифe- нил)-xинoлинy; радиоактивность Са в эритроцитах через 240 - 260 мин инкубации; - концентраци 9-аь1Инодиме- тилкарбокси-7-метокси-2- (З-окси-4-аминометилкарб- оксифенил)-хинолина, нмоль/л клеток в 1 мгн.

% -2йо

В

Claims

Способ мембраны эритроцитов и концентрации кальция в цитоплазме путем насыщения кпеток .высокоселективным хелатором кальция, о тли чающийся тем, что, с целью повышения точности • проницаемость мембраны эритроцитов, нмоль/л клеток в 1 мин;

⁹ 4$ • радиоактивность Са в эритроцитах через 15-20 мин инкубации, срш;

удельная активность Са в среде инкубации , срт/ нмоль

- объем

- время »

эритроцитов в пробе, л; инкубации, мин, свободного кальция в

У t а концентрацию цитоплазме определяют по формуле [Са¹*] - , ^Λ η А. . _Λ /«ν 240-260 где [Са¹*] - концентрация свободного кальция в цитопл.азме,нМ;

К^115нМ - константа сродства кальция к 9-аминодиметилкарбокси-7-метокси-2-(3-окси4-аминометилкарбоксифенил)-хинолину;

р радиоактивность ⁴ⁱCa в эритроцитах через 240 260 мин инкубации;

В - концентрация 9-аьтнодиметилкарбокси-7-метокси-2(З-окси-4-аминометилкарб• оксифенил)-хинолина, нмоль/л клеток в 1 мкн.