JPH0347093A - 標的細胞の生残もしくは死滅細胞数を測定する方法及びそのための試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫担当細胞等の攻撃細胞との混合培養後の生
残もしくは死滅標的細胞（例えば腫瘍細胞）の数を測定
する方法に関する。本発明によって例えば標的細胞に対
する攻撃細胞の抗細胞活性を測定・評価することができ
、従って本発明は例えばいわゆる「細胞障害性試験」等
に適用できる。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕免疫担
当細胞等の攻撃細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌ）の
腫瘍細胞等の標的細胞（ｔａｒｇｅｔ　ｃｅｌｌ）に対
する抗細胞活性を評価するために、両細胞を混合培養し
、ついで細胞と培地とを分離し、細胞もしくは分離培地
中の標的細胞数を測定する方法が従来行われている。こ
の際、標的細胞数の測定は通常標的細胞に予め付した標
的物質を測定することによって行われてきた。

かかる標的物質としてＳＩＣ，などの放射性プローブを
用いる場合には、これで標的細胞を予め標識し、混合培
養し、遠心分離により生細胞を沈澱させ、上清の放射線
量を測定して死滅標識細胞数を求める方法が一般に行わ
れている。

近年、主として放射性物質によるバイオハザードを避け
ようとする機運から他のプローブを用いる試みがなされ
ているＣ　Ｍ、Ｂｒｅｎａｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　、ｒ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、且２　１２１　（１９８
８））。Ｂｒｅｎａｎは例えばＨｏｅｃｈｓｔ　３３３
４２（またはＨ，３３２５８）と呼ばれる２−［２−（
４−ヒドロキシフェニル）−６−ベンズイミダゾール］
−６−（１−メチル−４−ピペラジル）−ベンズイミダ
ゾール三塩酸（Ｃ，Ｆ、Ｃｅ５ａｒｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ
、、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、　　Ｌｏｏｔ　１８８　（１９７７
）、　Ｍ、　Ｂｒｅｎａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　ｌｍ１ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、　７４．３１　（
１９８４）　）を放射性プローブの代わりに使う方法を
発表している。

放射性プローブを使う方法では（１）人体にとって極め
て有害なＳＩＣ，等の放射性物質を使用する、（２）こ
のプローブは非密封線源であるため実験室内（大気を含
む）の汚染の可能性がある、（３）放射性同位元素専用
の施設を要し、法のもとに管理されねばならない、（４
）試薬、廃棄物処理などのランニングコストが著しく高
い、など実験室側からの問題点があり、細胞の面からも
（１）放射線によるダメージを受けるため実験系に好ま
しくない影響因子を与える、（２）放射線感受性の細胞
が含まれる系には使えない、（３）（１）の理由から長
時間の混合培養を要する系には不適当であり、細胞間の
反応が経時的遅延型である場合には使えない、など数多
くの問題点を含んでいる。

一方Ｂｒｅｎａｎらの発表した方法では上記方法に比べ
細胞に対するダメージははるかに少な（、ケイ先決で測
定するため簡易である。しかしながら、Ｂｒｅｎａｎら
の使用しているＨ３３３４２は細胞内のＤＮＡに結合す
るため高濃度でまたは長時間標識すると細胞に対し毒性
を示して、混合培養中に攻撃細胞によるだけでなく　Ｈ
３３３４２によってもかなりの量死滅するので攻撃細胞
の抗細胞活性の正しい評価を妨げる結果となる。逆にＨ
３３３４２の低濃度での処理または短時間処理による場
合には標的細胞ごとの標識量が不均一となり測定の精度
が低下する欠点があった。さらにＨ３３３４２はＤＮＡ
をラベルするため細胞膜を攻撃するＮＫ細胞のような攻
撃細胞の評価には使えないという欠点があった。

本発明は攻撃細胞との混合培養後の生残もしくは死滅標
的細胞数を従来法に比し精度よくかつ安全に測定する方
法を提供することを一番の目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは従来のプローブに代わるプローブを種々検
索−、プローブとしてポルフィリン系ケイ光色素を用い
ることにより上記目的を達成できることを見い出した。

すなわち本発明はポルフィリン系ケイ光色素で標識した
標的細胞と攻撃細胞とを液体培地中で混合培養し、つい
で全細胞と培地とを分離し、分離した細胞もしくは培地
中の該ケイ光色素のケイ光強度を測定することにより標
的細胞の生残もしくは死滅細胞数を測定する方法及びこ
れに用いる試薬に関する。

以下、本発明を詳説する。

本発明にいう攻撃細胞は主としてヒトをはじめとする哺
乳類の免疫担当細胞を意味し、肺臓由来細胞（肺細胞）
、腹腔マクロファージ、胸腺由来細胞、血清中のリンパ
球などが包含される。これらは大きくＢ細胞、Ｔ細胞、
マクロファージに区別され、さらに細かくはＮＫ細胞（
ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒ　ｃａｌｌ）、Ｋ細胞（ｋ
ｉｌｌｅｒ　ｃｅｌｌ）、マクロファージ、ＣＴＬ（キ
ラーＴ細胞）　、ＬＡＫ　（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ　ｋｉｌｌｅｒ）等に区別される。

本発明にいう標的細胞はこれらの攻撃細胞の抗細胞作用
を受ける細胞または受けると予想されるかもしくは受け
るかどうか調べたい細胞、通常動物細胞を意味する。代
表的には各種ガン細胞、各種株化細胞が包含され、具体
例としてマウス胎児由来株化細胞Ｂａ１ｂ−３Ｔ／１２
−３　、ヒト子宮頚部ガン由来ＨｅＬａ細胞、チャイニ
ーズハムスター肺由来細胞ｖ−７９、マウスリンパ球系
腫瘍細胞Ｙａｃ−１等をはじめに５６２　、ＰＢＬ５、
Ｌ９２９、ＰＢＬ　５ＤＡＵＤＩ等の株が挙げられる。

ポルフィリン系ケイ光色素としてはへマドポルフィリン
が代表的であるが、スルホン化テトラフェニルポルフィ
リン及び金属ポルフィリンの使用も好ましい。その他メ
ソポルフィリン （ｍｅｓｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）　−ＩＸ、デユーテロ
ポルフィリン（ｄｅｕｔｅｒｏｐｏｒｐｈｒｉｎ）　−
ＩＸ、ピロポルフィリン（ｐｙｒｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉ
ｎ）−ＸＶ　、フエオボルフイリン（ｐｈｅｏｐｏｒｐ
ｈｙｒｉｎ）　、デスオキソフィロエリスリン（ｄｅｓ
ｏｘｏｐｈｙｌｌｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、フェロエリス
リン（ｐｈｙｌｌｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、プロトポルフ
ィリン（ｐｒｏ　ｔｏｐｏｒｐｈｙｒ　ｉｎ）等も使用
可能である。

以下、主としてケイ光色素としてヘマトポルフィリンを
用いる場合を例にとって本発明の測定方法を説明するが
、他のポルフィリン系ケイ光色素を用いた場合も、例え
ばその光吸収域に発光スペクトルが重なる光源を用いる
等のそのケイ光色素の特性を考慮した選択をすることを
前提として、ヘマトポルフィリン使用の場合に準じて行
うことができる。

標的細胞のヘマトポルフィリンによる標識化は標的細胞
をヘマトポルフィリンを含有する液体培地中で培養して
、ヘマトポルフィリンを標的細胞内に取り込ませタンパ
ク質に吸着させるか（以下、この方法を自然的標識化と
いう）、またはへマドポルフィリンを予めイミド系化合
物と反応させて活性化し、ついで標的細胞と化学的に結
合する（以下、この方法を人為的標識化という）ことに
よって行うことができる。

自然的標識化の場合ポルフィリン系ケイ光色素は標的細
胞内のタンパク質に吸着することが必要とされる。上記
に例示したポルフィリン系ケイ光色素はいずれもタンパ
ク質に吸着する性質を有する。特にヘマトポルフィリン
は一般に標的細胞、特に腫瘍細胞との親和性が高（細胞
内に取り込まれた後、タンパク質に吸着し細胞外に排泄
され難いという特性を有する。

なお、標的細胞とタンパク質に吸着するケイ光色素の間
には適性に差があり、この適性は細胞の■ケイ光色素の
膜透過性、■ケイ光色素排出速度■ケイ光色素に対する
耐性に大きく影響される。

標的細胞としてはあるケイ光色素との関係で■〉■でか
つ■の耐性が大である細胞が好ましいといえる。

自然的標識化の場合の標的細胞のヘマトポルフィリンに
よる標識化は標的細胞をヘマトポルフィリンを含有する
液体培地中で培養することにより行う、液体培地として
は通常動物の細胞培養に用いられる液体培地であればい
ずれの液体培地でもよい。具体的にはＭＥＭ、ＤＥＭ　
、ｌ５ｃｏｖｅ、　１９９、ＦＩＯ、Ｆ１２　、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０等の培地、好ましくはＲＰ旧−１６４０培
地が用いられる。この液体培地は血清（例えば牛胎児血
清（ＦＢＳ）　）を含んでいなくてもよいが、血清は細
胞の生存率に影響を与えるので特に長時間の標識化には
血清添加培地を使用するのが好ましい。血清添加の場合
、ヘマトポルフィリンは血清成分にも吸着するので、培
地中の血清含量は必要最小限、例えば１０％（ｗ／ｉｙ
）以下、好ましくは０．１〜５％（ｗ八）程度、例えば
１％（阿／−）程度であるのが適当である。

液体培地中におけるヘマトポルフィリンの濃度は、細胞
に対するその低毒性ゆえにかなり広範囲に変化させ得る
。通常１〜２０μｇｅｒｄ、好ましくは５〜１０μｇ／
ｒｄ程度が適当である。液体培地中における標的細胞の
濃度は特に限定ないが、あまり高くなりすぎるといわゆ
る細胞同士の接触阻害（ｃｏｎｔａｃｔ　１ｎｈｉｂｉ
ｔｉｏｎ）が生じるので、１０３〜１０ａｃｅｌｌｓ／
ｄ、好ましくは１０’〜１０’　ｃｅｌｌｓ／ｄ程度が
適当である。

標識化の温度は細胞の生育至適ｐＨ付近で行うのが好ま
しく、通常３７．０±０．５°Ｃである。ｐＨは細胞の
生育至適ｐＨ付近で行うのが好ましく、通常６．８〜７
．８程度である。通気は通常空気−炭酸ガス混合ガスに
より行うが、混合ガス中ＣＯ□濃度は２〜１０％、好ま
しくは２〜５％（ｖ／ｖ）程度である。

標識化の時間は標的細胞の種類、ヘマトポルフィリンの
濃度等によって異なるが、通常３０分〜６時間程度が適
当である。

なお、細胞内に取り込まれたヘマトポルフィリンはそれ
だけでは毒性を示さないが、光照射により光増感反応を
示し、細胞にとって有害な活性酸素を発生させるので標
識化及びその後の混合培養をはじめとする、混合細胞と
培地との分離操作までの操作は遮光下に行う。

標識化後、細胞と培地とを遠心分離、濾過等の公知の分
離手段により分離し、細胞に付着している培地をリン酸
緩衝液、生理食塩水、ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液、前記液
体培地等で洗浄除去する。この洗浄は通常懸濁及び遠心
分離等の分離を２〜３回繰り返すこ′とにより行う。次
にこの細胞を前述の如き液体培地に分散させた後、標識
化における諸条件と同様の条件下に培養して主として細
胞膜に吸着しているヘマトポルフィリンを培地中に移行
させる。

これに要する時間は標的細胞によって異なるが通常１０
分〜４時間で１２時間後にはほぼ全て排出される。つい
で細胞を培地から分離し、前記と同様に洗浄する。

次に人為的標識化について述べる。人為的標識化に使用
するポルフィリン系ケイ光色素はカルボキシル基を有す
ることが必要であり、前記例示のポルフィリン系ケイ光
色素はいずれもこの条件を満足する。以下、ヘマトポル
フィリンを使用する場合を代表例として示すが、前述の
如くその他のポルフィリン系色素の使用も可能なことは
いうまでもない。人為的標識化においてはますへマドポ
ルフィリンとイミド系化合物とを有機溶媒中で反応させ
る。イミド系化合物としては通常カルボジイミド系化合
物単独、またはカルボジイミド系化合物とサクシンイミ
ド系化合物の混合系を用いる。

カルボジイミド系化合物、サクシンイミド系化合物とし
ては特に限定されないが、入手容易性等から前者として
は通常（ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド、後者としては通常Ｎ−ヒドロキシ
スルホサクシンイミド・Ｎａ塩を用いる。有機溶媒とし
ては種々のもの、例えばジメチルスルホキシド、メタノ
ール、エタノール、プロパツール、ブタノール、アセト
ン、ジエチルエーテル等を用いることができる。次のス
テップである標的細胞の標識化をそのまま溶媒交換をせ
ずに行えるもの（細胞にとって毒性が低いもの）という
意味ではジメチルスルホキシドがもっとも好ましい。ヘ
マトポルフィリンの濃度は通常０．５〜１０ｍｇ／　ｍ
ｌ程度、好ましくは１〜５ｍｇ／ｍ程度が適当である。

イミド系化合物の濃度は単独系の場合、及び混合系の各
成分について通常１０〜２００ｍｇ／ａｌ程度、好まし
くはＩＱ〜５０ｍｇ／、　ｒｒｄｌ程度が適当であり、
混合系では通常各成分を同じモル濃度で用いる０反応層
度は特に制限はないが、通常室温で十分である。反応は
通常常圧下に行えばよい。

カルボジイミド系化合物は反応性が高いので反応は窒素
雰囲気下に行うのが好ましい。反応時間は１０分〜１時
間程度である。

次に上記で得られるイミド系化合物を結合させたヘマト
ポルフィリンと標的細胞上のアミノ基とを反応させて標
的細胞をヘマトポルフィリン標識する。上記イミド系化
合物の結合と標的細胞の標識化は以下の化学反応によっ
て進行するものと考えられる： カルポジイミド系化合物単独使用の場合尿素系化合物 （上記式中、Ｒ，はヘマトポルフィリンの本体部分、Ｒ
，、Ｒ，はカルボジイミドの置換基、Ｒ４は標的細胞本
体部分である） カルボジイミド系化合物＋サクシンイミド系化合物併用
の場合 ＋Ｒ＊−Ｎ≠Ｃ＝Ｎ−Ｒ，−−÷ ＋　Ｒｔ　　　Ｎ　ＨＣ−Ｎ　Ｈ−Ｒ：１（１ 標的細肥 Ｏ −〉Ｒ、−Ｎ　Ｈ−と−Ｒ，＋ 上記で標的細胞上のアミノ基には細胞内タンパク質のア
ミン基、細胞膜の成分であるリン脂質（ホスファチジル
アミン等）に含有されるアミノ基が包含される。

標的細胞は標識する前に培養培地由来のタンパク質を除
く目的でリン酸緩衝液、生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液
等で洗浄する。この洗浄は通常懸濁及び遠心分離等の分
離を１〜２回繰り返すことにより行う。次にこの細胞を
上記の如き緩衝液または血清もしくはＢＳＡ　（牛血清
アルブミン）を含有しない液体培地に懸濁しく懸濁濃度
は自然的標識化の場合と同様でよい）、上記で得たイミ
ド系化合物を結合させたヘマトポルフィンの溶液を加え
、自然的標識化の場合と同様の理由から遮光下で標識す
る。上記で液体培地は前記自然的標識化で用いる液体培
地と同様でよい。また、加えるイミド系化合物結合へマ
ドポルフィリン溶液の量は細胞懸濁液の０．５〜５％（
ｖ／ｖ）　、好ましくは１％（Ｖ／Ｖ）が適当である。

標識化の温度、ｐＨ１通気条件は自然的標識化の場合と
同様でよい。標識時間は０．５〜５分、好ましくは０．
５〜２分が適当である。

標識化後ただちに牛胎児血清（ＦＢＳ）などの血清を含
む液体培地を通常５〜１００倍容量、好ましくはｌＯ倍
容量程度加え洗浄する。この洗浄は通常懸濁及び遠心分
離等の分離を２〜３回繰り返すことにより行う、液体培
地としては自然的標識化において使用するものと同様の
ものを用いることができる。標的細胞にＹａｃ−１株を
用いる場合にはＲＰＭＩ−１６４０培地が好ましい。血
清は標識化反応を止める役割をし、その濃度は通常５〜
２０％（ｖ／ｖ）　、好ましくは１０％（ｖ／ｖ）程度
が適当である。血清の代わりにＢＳＡ等のタンパク質を
加えてもよい。

洗浄後の人為的標識化標的細胞は使用時まで遮光上前述
の如き液体培地に懸濁しておく。

自然的標識化の場合も人為的標識化の場合も標識化によ
る標的細胞の生残率の低下は殆ど認められないかごく僅
かでしかなく、一方、人為的標識化の場合には自然的標
識化の場合よりはるかに短時間で標識化できるのでこの
点において有利である。

上記自然的標識化または人為的標識化によって得られた
ヘマトポルフィリンで標識した標的細胞（すなわち、タ
ンパク質にヘマトポルフィリンが吸着した標的細胞また
はへマドポルフィリンが化学的に結合した標的細胞）と
その標的細胞に対する抗細胞活性を測定したい攻撃細胞
とを標識化におけると同様な液体培地中で混合培養する
。混合培養における標的細胞、攻撃細胞の濃度はそれぞ
れ１０４〜１０６／戚及び１０６〜１０”／ｄ程度が適
当であり、標的細胞数Ｔに対する攻撃細胞数Ｅの割合は
Ｅ／Ｔ・１〜１００が適当である。培地には通常血清を
含有させるが、その濃度は１〜１０％（ｗ／ｗ）程度が
適当である。

攻撃細胞の標的細胞に対する抗細胞活性は免疫賦活剤の
存在下に高められる場合があるので、共同による抗細胞
活性をみたい場合には免疫賦活剤の存在下に混合培養す
ることができる。免疫賦活剤としてはその作用を有する
ものであればいずれでもよく例えばリポ多Ｐｉ類、０Ｋ
４３２　（ビシバニール）、レンチナン、エンドトキシ
ン、ＰＫ−５６５，６叶、アジメクソ７　（ＡＺＩＭＥ
ＸＯＮ）、ＡＬＩ’　、　ヘア！、クチン、Ｎ−１３７
等が使用され得る。免疫賦活剤を使用する場合には通常
培地中リポ多Ｅｌｆもしくはエンドトキシン：　１ｎｇ
〜５０μｇ／ｍｊ！、　Ｏに４３２；０．１ｍＫＥ〜５
ＫＥ／ｍ。

レンチナン；０．１〜１００　μｇ／戚、ＭＤＰ；　３
〜３００ｐｇ／ｒｄ、、ＦＫ−５６５；０．１ｎｇ〜１
００　ｕ　ｇ／ｍｌ、アジメクソン、　ｏ、ｏｉ〜１６
００μｇ／ｄ、ベスタチン；　０．０１〜５００μｇ／
ｄｌ、　ＡＬＰ；１０ｐｇ〜１μｇ／ｄ、　Ｎ−１３７
；　１〜５００μｇ／ｉｄの濃度で使用する。

混合培養の温度、ｐ）Ｉは両細胞の生育至適温度、ｐＨ
を考慮して適宜窓めればよいが、一般には温度３７°Ｃ
±０．５°Ｃ，ｐ）Ｉ　６．８〜７．８が適当である。

混合培養中の通気は通常空気−炭酸ガス混合ガスにより
行う−が、混合ガス中のＣＯ２濃度は通常２〜ｌＯ％、
好ましくは２〜５％（ｖ／ｖ）である。

混合培養の時間は主として攻撃細胞の性格により、攻撃
性が速やかに現れる場合は短時間でよいが、いわゆる遅
延型発現細胞の効果を見たい場合には数日を要する場合
もある。これらの観点から混合培養の時間は前者の場合
通常３０分〜４時間程度、後者の場合通常６時間〜５日
程度、特に１２２時間〜２日程であるのが適当である。

なお、培養中の標的細胞の増殖は測定精度に影響を与え
るが、標的細胞の世代時間は速くても１日ぐらい要する
ので短時間培養には実質上影響を与えない。また長時間
培養の場合にはコントロールを置くことにより抗細胞活
性を比較できる。

混合培養後、全細胞と培地を遠心分離、濾過等の通常の
分離手段を用いて分離し、測定の精度を上げるため通常
細胞を標識化のところで述べたようにして洗浄し、洗液
を分離培地に加える。

次に細胞または分離培地中のヘマトポルフィリン由来の
ケイ光強度を測定する。攻撃細胞によって細胞膜を破壊
された標的細胞は培地に細胞質が流出し死滅する。従っ
て分離した標的細胞または分離した培地中のへマドポル
フィリン由来のケイ光強度を測定することによって標的
細胞の生残もしくは死滅数を求めることができ、さらに
はそれによって攻撃細胞の標的細胞に対する抗細胞活性
を測定・評価することができる。

なお、混合培養中種的細胞の死滅により培地中に放出さ
れたヘマトポルフィリンが生残標的細胞及び攻撃細胞の
いずれに取り込まれても測定誤差を生ずるが、実際には
かかる取り込みは殆ど起こらない。これは培地中に放出
されるヘマトポルフィリンの量が十分に少なくすべて血
清成分に吸着されてしまうため、及び／または放出後も
標的細胞由来のタンパク質等と吸着・結合していて再取
り込みされにくい形態となっているためと考えられる。

ヘマトポルフィリンの光の吸収域、ケイ光の発生域はそ
の状態によって多少変化する。すなわちタンパク質等に
吸着もしくは結合したヘマトポルフィリンは３５０〜４
１０ｎｍに吸収域、４０５ｎｍに吸収ピークを示し、こ
の領域の励起でケイ光スペクトルを発する。ケイ光スペ
クトルのピークは例えばマウスリンパ球系腫瘍細胞Ｙａ
ｃ−１に取り込まれたもしくは結合したヘマトポルフィ
リンでは６３０ｎｎ。

ヒト由来上皮細胞のＨｅＬａ細胞に取り込まれたもしく
は結合したヘマトポルフィリンでは６３５ｎｍであるが
、培地中に放出されたヘマトポルフィリンでは６１５ｎ
ｍである。また単に水や生理食塩水、リン酸緩衝液に溶
解したヘマトポルフィリンは３８０〜４０５ｎｍ付近に
吸収帯を持ち、この波長の光励起により６１５ｔ＋ｎ＋
にケイ光を発する。これに牛胎児血清（ＦＢＳ）などの
血清を加えると６２０ｎｍにピークがシフトする。一方
正常マウスの肺細胞をへ・マドポルフィリンで標識する
と６３０ｎｍにケイ光を発する。

このようにケイ光ピーク位置により、それがどういう状
態のへマドポルフィリンであるか、およその見当がつく
。

ケイ光量の測定に用いる光源は従って上記吸収域に発光
スペクトルが重なる光源であればいずれの光源でもよく
、Ｘｅ−ランプ、ハロゲン（タングステン）−ランプ、
Ｄ２（デュウトリウム）−ランプ等が例示される。分離
した細胞のケイ光強度を測定するには上記光源で十分で
あるが、分離した培地例えば遠心上清中のヘマトポルフ
ィリン量は微量なため励起光源はＸｅ−ランプ等の光の
強度では不十分である。そのための光源としては前記吸
収域に発振波長を示す連続発振のレーザーを用いる。

レーザーは色素レーザーまたは窒素レーザーが適してい
る。

ヘマトポルフィリンでは標識した標的細胞数とケイ光強
度との間の検量線を混合培養と同時に作成し細胞のケイ
光強度から生残標的細胞数、生残率（もしくは死滅率）
ひいては攻撃細胞の抗細胞活性を測定・評価することが
できる。混合培養後の分離培地のケイ光強度の測定によ
っても同様な測定・評価が可能である。

なお、従来法ｐｌにｒ放出法）では、免疫賦活剤の効果
が有意な差となって測定できるためには、標的細胞数（
Ｔ）に対する攻撃細胞数（Ｅ）の比率（Ｅ／Ｔ比）カ５
０〜１００、もしくは１００以上であることが必要であ
るが、ヘマトポルフィリンをプローブとした場合Ｅ／Ｔ
比は５〜２０でも十分有意な差を測定できる。

また、本発明方法に用いる試薬としてはヘマトポルフィ
リン等のポルフィリン系色素単独あるいは混合物、例え
ば溶液であることができる。

〔実施例〕

次に本発明の実施例を示す。

尖ＩＬ上　（自然的標識化による本発明方法）標的細胞
としてマウスリンパ球腫瘍細胞Ｙａｃ−１（大日本製薬
（株）製）、攻撃細胞としてマウス肺臓細胞、ヘマトポ
ルフィリンとしてヘマトポルフィリン混合物（和光純薬
（株）へマドポルフィリン）を使用した。

ＣＯｚインキュベーター（ヒラサヮ（株）ＣＰＤ−１７
０Ｈ型）中の１０％（ｗ／ｈ）の牛胎児血清ＣＦＢＳ）
を含む培地ＲＰＭＩ−１６４０（日永製薬（株））　（
ｐＨ７，１〜７．４に遮光上最終濃度が１０μｇｏｄと
なるようにヘマトポルフィリンを溶解し、この溶液にＹ
ａｃ−１を１０６コ／Ｉｄとなるように懸濁した。つい
で懸濁液を遮光下及び空気９５％−Ｃ０２５％の通気条
件下３７°Ｃで２時間培養した。

標識化後、細胞と培地とを遠心分離し１２０ｇ、５分）
、細胞をリン酸緩衝液ＣＰＢＳ（−）　、ｐＨ７，２）
１０−への懸濁及び遠心分離を３回繰り返すことにより
洗浄した。ついで細胞を前記培地に１０ｈコ／戚になる
ように分散し、前記と同じ条件下に２０分培養した。２
０分の培養の後、細胞と培地を遠心分離しく１２０ｇ、
　５分）、再度、前記１０％（−／噴ＦＢＳ含有ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地に細胞濃度が４Ｘ１０６コ／戚となる
ように懸濁し、表１条件でマイクロウェルに分注し、Ｃ
Ｏ□インキュベーター中遮光下及び空気９５％−〇０□
５％の通気条件下３７°Ｃで４ｈｒ混合培養した。

混合培養後、生細胞と死細胞破片を分離するために遠心
分離（１２０ｇ、　５分）を行い、上清を捨て、５００
ｕｉ、のＰＢＳ　（−’）に懸濁し、ケイ光分光器（日
立製、Ｆ−３０００）でそれぞれのケイ光を測定した。

なお、マウス牌細胞懸濁液は以下の手順で調製した。す
なわち、Ｂａ１ｂ／ｃマウス４週齢より肺臓を摘出し、
メツシュで培地１ｍ中に細胞を分散させる。トリス−Ｎ
Ｈ４ＣＩ溶液を１０倍量加え、赤血球を除去し、遠心分
離（１２０ｇ　、５分）とＰＢＳ（−）１０　ｄへの懸
濁を３回繰り返すことによりトリス〜ＮＨ４Ｃｌを除き
、１０％（ｗ／１４）　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０
培地にｌＸｌ０’　］／ｍｌとなるように肺細胞を懸濁
させる。

表１ ＊ＩＬＰＳ（リボ多糖類）は２μｇ／ｎｉｌとるとなる
ようＰＢＳ　（−）に溶けている。

＊２１０％（ｗ／ｗ）　ＦＢＳ含有ＲＰ旧−１６４０培
地に懸濁市３１０％（ｗ／ｗ）　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−
１６４０培地Ｎｏ３〜７より検量線を作成した（図１）
。測定したケイ光強度と検量線から求めた標的細胞数は
Ｎｏ、２の場合８Ｘ１０’コ／ｍｌ、　Ｎｏ、１の場合
４Ｘ１０’コ／ｉであった。この実験よりマウス肺臓細
胞は単独ではマウスリンパ球腫瘍細胞Ｙａｃ−１に抗細
胞活性を示さなかったが（Ｎｏ、３との比較におけるＮ
ｏ、２）、リボ多糖添加により抗細胞活性を示した（Ｎ
ｏ、　１）ことが明らかである。さらにＮ００２に対す
るＮｏ、１の比較より混合培養開始時の標的細胞数（Ｔ
）に対する攻撃細胞数（Ｅ）の比率（Ｅ／Ｔ比）が２．
５でも免疫賦活剤リボ多糖の効果が顕著に現れているこ
とが分かる。

此１ｄ口支桝 １１３３３４２での標識化とヘマトポルフィリンでの標
識化の比較（自然的標識化での比較） 牛胎児血清１０％（ｗ／ｗ）を含むＲＰＭｒ−１６４０
培地にＨ３３３４２（ＣＡＬＢＴＯＣＨＥＭ社）を最終
濃度が１９μｇ／成になるように加え、標的細胞（Ｙａ
ｃ−１）を１ｏ６ｃａｌｌｓ／−になるように加え、遮
光下及びＣＯ□５％の通気条件下３７°Ｃで１５分培養
した。標識化後、細胞を遠心分離しく１２０ｇ　５分）
、リン酸緩衝液（ＰＢＳ（＝）ｐＨ７，２）　１０ｍへ
の懸濁及び遠心分離を３回繰り返すことにより洗浄した
。ついで細胞を牛胎児血清１０％（−／すを含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地に分散させ、上記と同じ条件下に培養
した。分散直後の生残率は６５％、−夜培養後の生残率
は１７％以下であった。

他方、［３３３４２の代わりにヘマトポルフィリンを４
０μｇ／−になるように加える以外は同様に操作して２
時間標識した後、同様に洗浄、培養したところ、分散直
後の生残率は９５％以上、−夜培養後の生残率は９０％
以上であった。

従って本発明方法で測定される生残標的細胞数の方が攻
撃細胞の抗細胞活性をより精度よく反映するであろうこ
とが明らかである。

３（人為的標識化による本発明方法） 実施例１では標的細胞の標識に長時間かかるため、人為
的に標的細胞を標識する方法を示す。

標的細胞、攻撃細胞、ヘマトポルフィリン、ＣＯ□イン
キュベーター、ＲＰ旧−１６４０培地は実施例１と同じ
ものを用いた。予めヘマトポルフィリンのカルボキシル
基にカルボジイミドを結合させる。

カルボジイミドとしては（１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド（シグマ社製）を
用いた。

ヘマトポルフィリン１ｍｇと（１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド２０ｍｇをジ
メチルスルホキシド（メルク社製）１戚に溶かし常温、
常圧、窒素雰囲気下で３０分反応させた。

標的細胞とするマウスリンパ球腫瘍細胞Ｙａｃ−１は遠
心分離（１２０ｇ　、　５分）し、リン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ（−）　、ｐＨ７，２）に懸濁した後再度遠心分離を
行うことにより、培養培地に含まれる血清を除去した。

Ｙａｃ−１をＰＢＳ（−）に再懸濁しく懸濁濃度１．０
６：７／ｌｌ１１）、前述のカルボジイミドを結合した
ヘマトポルフィリン溶液全量を加え、遮光下で１分標識
した。添加量はＰＢＳ（−）　　１Ｉｎ１につきヘマト
ポルフィリン溶液１０μｌの割合であった。反応後、直
ちに１０倍量のＲＰＭＩ−１６４０培地（ＦＢＳを１０
％含む）を加えて標識を止めた。遠心分離後細胞を同上
培地に再懸濁し、再び遠心分離に付し、これにより余剰
のカルボジイミド結合ヘマトポルフィリン及び細胞上の
アミノ基とカルボジイミド結合へマドポルフィリンとの
カップリングによって生じた尿素誘導体を除いた。つい
でＲＰＭＩ−１６４０培地（ＦＢＳＩＯ％含有）に細胞
濃度が４Ｘ１０’コ／戚となるように再懸濁し、実施例
１と同様の方法で攻撃細胞の調製を行い、実施例１の表
１と同じ条件でマイクロウェルに分注し、混合培養、遠
心分離、ケイ光の測定を行った。

実施例１の場合と同様にして検量線を作成した。

測定したケイ光強度と検量線から求めた標的細胞数は表
１のＮｏ、２と同じ条件の場合８Ｘ１０’コ／ｄ。

Ｎｏ、１と同じ条件の場合４Ｘ１０’コ／Ｉｄであった
。この実験よりマウス肺臓細胞は単独ではマウスリンパ
球腫瘍細胞Ｙａｃ−１に抗細胞活性を示さないがリボ多
糖添加により抗細胞活性を示すことが明らかとなった。

さらに実施例１の場合と同様混合培養開始時の標的細胞
数（Ｔ）に対する攻撃細胞数（Ｅ）の比率（Ｂ／Ｔ比）
が２．５でも免疫賦活剤リボ多糖の効果が現れることが
明らかとなった。

奎考貫　　人為的標識化によりヘマトポルフィリン標識
した細胞（Ｙａｃ−１）中のへマドポルフィリンの残留
度とそのときのＹａｃ−１の生存率実施例２の方法でＹ
ａｃ−１をヘマトポルフィリン標識した後、牛胎児血清
１０％（ｖ／ｖ）を含むＲＰ？１Ｉ−１６４０培地に４
Ｘ１０６ゴ／戚となるように懸濁し、ＣＯ□インキュベ
ーター中で培養した。経時的に一定量（２ｄ）取り出し
、ＰＢＳ（−）を８成加え、遠心操作（１９０ｇ、５ｍ
１ｎ）により細胞を沈澱させた後、２成のＰＢＳ（−）
に再懸濁した。そのうち１００μ！を取り出し細胞数と
生存率をトリパンブルー法にて計測した。残りの懸濁液
を用いケイ光分光器にてケイ光強度を測定し、懸濁開始
時を１００とした場合のケイ光強度の相対値（ヘマトポ
ルフィリン残留度）を算出した。

結果を表２に示す。

表２

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の測定方法を実施するための検量線の１例
である（実施例１）。 ＊　各時点での生細胞の割合を示す。 表２から明らかな如く、ヘマトポルフィリンの細胞から
の解離も細胞生存率の低下も実質上貼どない。 〔発明の効果〕 本発明によれば攻撃細胞との混合培養後の生残もしくは
死滅標的細胞数を従来法に比し精度よく、かつ安全に測
定することができる。 また本発明によれば従来法に比べ、より少ない攻撃細胞
数で上記測定をすることができる。 さらに本発明によれば採用し得る攻撃細胞の種類が従来
法に比べ拡がっている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ポルフィリン系ケイ光色素で標識した標的細胞と攻
   撃細胞とを液体培地中で混合培養し、ついで全細胞と培
   地とを分離し、分離した細胞もしくは培地中の該ケイ光
   色素のケイ光強度を測定することにより標的細胞の生残
   もしくは死滅細胞数を測定する方法。 ２、ケイ光波長がシフトするポルフィリン系ケイ光色素
   を使用する請求項１記載の方法 ３、ポルフィリン系ケイ光色素からなるか、またはこれ
   を含有してなる請求項１記載の方法に用いるための試薬