KR101325856B1 - 감열 응답성 고분자를 이용한 구멍 패턴 첨부막을 가지는칩 및 그 제조 방법 - Google Patents

감열 응답성 고분자를 이용한 구멍 패턴 첨부막을 가지는칩 및 그 제조 방법 Download PDF

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Abstract

구멍 패턴의 구멍의 크기를 임의로 변화시키는 것에 의해, 세포를 뿌릴 때 및 회수할 때는 세포가 구멍으로부터 출입이 쉽고, 세정시나 항원 자극시는 구멍으로부터 나오기 어려운 기구, 구조를 가지는 세포 등의 용도에 유용한 새로운 칩을 제공하는 것.
온도 응답성 고분자의 가교 생성물을 구성 성분으로 하는, 한편 구멍 패턴을 가지는 막을 기판 표면에 가지는 칩. 온도 응답성 고분자의 가교 생성물을 구성 성분으로 하여, 한편 구멍 패턴을 가지는 막을 기판 표면에 가지는 칩의 제조 방법. 가교 가능한 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물, 가교 가능한 온도 응답성 고분자 및 가교제를 함유하는 조성물, 또는 온도 응답성 고분자 및 가교제를 포함한 조성물을 기판 표면에 도포하여 도막을 형성하고, 상기 도막을 가교 시켜, 상기 가교 생성물을 생성하는 한편 상기 가교 생성물의 도막에 구멍 패턴을 형성하는 공정을 포함한다.
팁, 온도 응답, 감열성 고분자, 패턴, 기판

Description

감열 응답성 고분자를 이용한 구멍 패턴 첨부막을 가지는 칩 및 그 제조 방법{CHIP PROVIDED WITH FILM HAVING HOLE PATTERN WITH THE USE OF THERMORESPONSIVE POLYMER AND METHOD OF PRODUCING THE SAME}
본 발명은 감열(感熱) 응답성 고분자를 이용한 구멍 패턴을 가지는 막을 기판 표면에 가지는 칩 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
폴리(N-이소프로필 아크릴 아미드)(PNIPAAm)는 감열 응답성 고분자로 알려져 있다. PNIPAAm의 수용액은 온도 변화에 의해 상분리를 일으켜, 31 ℃이하에서는 물에 용해되고, 그 이상의 온도에서는 불용화되어 석출된다. N-이소프로필 아크릴 아미드(NIPAAm)는, 래디칼 개시제로 보다 용이하게 중합하여, PNIPAAm를 얻을 수 있다. 또한, NIPAAm는 다른 기능성 모노머와 공중합 하는 것도 알려져 있어, 얻을 수 있는 고분자는, 온도 변화뿐만 아니라, 빛, 전기장, pH변화, 용매 교환 등의 여러 가지 자극에 응답한다.
감열 응답성 고분자는, 생체 재료를 고정화하기 위한 재료로서 사용되는 경우도 알려져 있다(특개2003-102466호공보(특허 문헌 1), 특개평9-23876호공보(특허 문헌 2)).
한편, 세포를 1개 1개의 레벨로 특정하고, 선별하여, 선별된 세포를 이용하 는 시도가 되고 있다. 예를 들면, 1개 1개의 임파구의 항원 특이성을 개별적으로 검출하여, 한층 더 검출된 1개의 항원 특이적 임파구를 회수하고, 회수된 1개의 항원 특이적 임파구를 이용하여, 예를 들면, 항체를 제조하는 것이 검토되고 있다(민다니등, BIO INDUSTRY, p60-67, Vol. 20, No. 7, 2003 (비특허 문헌 1), 특개 2004－173681호 공보(특허 문헌 3)).
그러나, 통상의 PNIPAAm의 도포막은, 물이나 극성 유기용매에 매우 용해하기 쉽다. 따라서, PNIPAAm의 도포막을 이용해, 세포 등의 생체 재료를 고정화하려고 하면, 물에 접한 부분이 점점 분해되어 버리게 된다. 또한, PNIPAAm의 도포막을 미세 가공하기 위하여 레지스터를 PNIPAAm의 도포막의 상층에 덧칠하면, 레지스터 용매에 PNIPAAm가 녹아서, 양층이 혼합해 버린다.
이에 본 발명자들은, 먼저, 물이나 수용액, 또, 유기용매에 불용성이며, 한편 감열 응답성을 가지는 재료(NIPAAm)를 제공함과 함께, 이 감열 응답성을 가지는 재료의 재료가 가지는, 온도 변화에 응해 친수성으로부터 소수성으로 바뀌는 성질을 이용해, 세포에 대한 접착력이 변화하는 것을 이용한 칩을 개발해, 특허 출원을 하였다(WO2005/095510).
그러나, 친수성으로부터 소수성으로 바뀌는 온도 응답성(그 결과, 세포에 대한 접착력이 변화한다)을 이용한 칩으로는, 세정 공정에서 너무 강하게 씻으면 모든 임파구가 씻겨가 버리고, 너무 약하면 불필요한 요소에도 임파구가 남게 된다는 결점이 있다는 것이 판명되었다.
이에 본 발명의 목적은, 구멍 패턴의 구멍의 크기를 임의에 변화시키는 것에 의해, 세포를 뿌릴 때 및 회수할 때는 세포가 구멍으로부터 출입이 용이하고, 세정시나 항원 자극시는 구멍으로부터 나오기 어려운 기구, 구조를 가지는 새로운 세포용 등의 용도에 유용한 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명은 이하와 같다.
[1]온도 응답성 고분자의 가교 생성물을 구성 성분으로 하는 한편 구멍 패턴을 가지는 막을 기판 표면에 가지는 칩.
[2］상기 온도 응답성 고분자의 가교 생성물이, 온도 응답성 고분자 간의 가교 생성물 또는 가교제를 통한 가교 생성물인［1］의 기재의 칩.
[3］상기 온도 응답성 고분자의 가교 생성물은, 하기 화학식 1에서 나타나는 반복 단위를 가지는 한편 중량 평균 분자량이 500~5,000,000인 N－알킬(메타) 아크릴 아미드 공중합체와 가교제와의 가교 생성물인［1］또는［2］의 기재의 칩.
Figure 112008031020761-pct00001
(화학식 1에서, R1 및 R2는, 같거나 또는 다르게, 수소 원자 또는 탄소수 1에서 4의 알킬기를 나타내고, R3는, 수소 원자 또는 메틸기를 나타내며, R4는, 상기 가교제와 가교 가능한 관능기를 가지는 탄화수소 구조를 나타낸다. x 및 y는, 각각 x＋y=1, 0＜x＜1, 0＜y＜1을 만족하는 임의의 수이다.)
[4］구멍 패턴을 가지는 막의 두께는, 10 nm ∼ 1000μm의 범위인［1］~［3］중 어느 하나에 해당하는 기재의 칩.
[5］구멍 패턴의 구멍의 크기는, 내접 하는 원의 직경이 10 nm ∼ 1000μm의 범위인［1］~［4］의 어느 하나에 해당하는 기재의 칩.
[6］구멍 패턴의 구멍의 깊이가, 10 nm ∼ 100μm의 범위인［1］~［5］의 어느 하나에 해당하는 기재의 칩.
[7］구멍 패턴의 구멍은, 1 cm2 당 1개 ∼ 1,000,000,000개인［1］~［6]의 어느 하나에 해당하는 기재의 칩.
[8］기판은, 막을 가지는 표면의, 막이 가지는 적어도 일부의 구멍의 하부에 상당하는 부분에 요부를 가지는［1］~［7］의 어느 하나에 해당하는 기재의 칩.
[9］구멍 패턴의 구멍은, 그 중의 기판 표면상에, 막과는 독립한 상기 온도 응답성 고분자의 가교 생성물로 형성된 도트(dot)를 가지는［1］~［9］의 어느 하나에 해당하는 기재의 칩.
[10］막 온도의 일부분, 또는 전체를 변화시키는 것으로, 막의 일부분, 또는 전체를 팽윤 또는 수축시켜, 구멍 패턴의 구멍의 크기를 임의로 변화시킬 수가 있는［1］~［9］의 어느 하나에 해당하는 기재의 칩.
[11］전기구멍 패턴의 구멍에 격납된 생체 물질을, 막 온도의 변화에 의해, 구멍 패턴의 구멍에 있어, 포접한 상태로 하거나 또는 해방한 상태로 하는 ［10］의 기재의 칩.
[12］［1］~［9］의 어느 하나에 해당하는 기재의 칩의 막 온도를, 상기 칩이 가지는 구멍 패턴의 구멍의 지름을, 생체 물질이 격납 가능한 크기가 되는 온도로 제어하고,
상기 구멍 패턴의 구멍에 생체 물질을 격납하고, 그 다음
팁의 막 온도를, 상기 생체 물질을 격납한 구멍의 지름을, 생체 물질을 포접하는 온도로 제어하는 것을 포함한, 칩의 구멍 패턴에 생체 물질을 포접하는 방법.
[13］［12］에 기재의 방법으로 생체 물질을 포접한 칩의 막 온도를, 상기 칩이 가지는 구멍 패턴의 구멍의 지름을, 생체 물질을 해방 가능한 크기가 되는 온도로 제어하는 것을 포함한, 칩에 포접된 생체 물질을 해방하는 방법.
[14］온도 응답성 고분자의 가교 생성물을 구성 성분으로 하는 한편 구멍 패턴을 가지는 막을 기판 표면에 가지는 칩의 제조 방법으로서,
가교 가능한 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물, 가교 가능한 온도 응답성 고분자 및 가교제를 함유하는 조성물, 또는 온도 응답성 고분자 및 가교제를 포함한 조성물을 기판 표면에 도포해 도막을 형성하고,
상기 도막을 가교 시켜, 상기 가교 생성물을 생성하며, 또한
상기 가교 생성물의 도막에 구멍 패턴을 형성하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 제조 방법.
[15］상기 가교 가능한 온도 응답성 고분자 및 가교제를 함유하는 조성물, 또는 온도 응답성 고분자 및 가교제를 함유하는 조성물은, 화학식 1에서 나타나는 반복 단위를 가지며 또한 중량 평균 분자량이 500 ∼ 5,000,000인 N－알킬(메타) 아크릴 아미드 공중합체와 가교제를 함유하는 조성물;
[화학식 1]
Figure 112013039790736-pct00002
(화학식 1에 있어서, R1 및 R2는 같거나 또는 다르게, 수소 원자 또는 탄소수 1에서 4의 알킬기를 나타내고, R3는 수소 원자 또는 메틸기를 나타내며, R4는 상기 가교제와 가교 가능한 관능기를 가지는 탄화수소 구조를 나타낸다. x 및 y는, 각각 x＋y=1, 0＜x＜1, 0＜y＜1을 만족하는 임의의 수이다. 여기서, (메타) 아크릴 아미드란, 메타크릴 아미드와 아크릴 아미드의 양쪽 모두를 나타낸다.)인［14］의 기재에 따른 제조 방법.
[16］온도 응답성 고분자의 가교 생성물을 구성 성분으로 하고, 또한 구멍 패턴을 가지는 막을 기판 표면에 가지는 칩의 제조 방법으로서,
가교 가능한 온도 응답성 고분자 형성용 모노머를 함유하는 조성물, 가교 가 능한 온도 응답성 고분자 형성용 모노머 및 가교제를 함유하는 조성물, 또는 온도 응답성 고분자 형성용 모노머 및 가교제를 포함한 조성물을 기판 표면에 도포하여 도포막을 형성하고,
도막을 중합 및 가교 시켜, 상기 가교 생성물을 생성하며, 또한
상기 가교 생성물의 도막에 구멍 패턴을 형성하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 제조 방법.
[17］조성물을 도포하는 기판은, 실리콘 기판, 유리 기판, 플라스틱 기판, 마이카 기판, 세라믹 기판, 또는 금속 기판인［14］~［16］에 기재의 어느 하나에 해당하는 기재의 제조 방법.
[18］조성물의 기판에의 도포는, 조성물을 용제에 용해하는 공정, 얻을 수 있던 용액을 기판상에 적하하는 공정, 용매를 증발시키고 도막을 얻는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는［14］~［17］의 어느 하나에 해당하는 기재의 제조 방법.
[19］도막에의 구멍 패턴의 형성은, 포트리소그래피법에 의해 실시되는［14］~［18］의 어느 하나에 해당하는 기재의 제조 방법
[20］포트리소그래피법에 따르는 도막에의 구멍 패턴의 형성은, 상기 도막 형성용의 조성물에 한층 더 산(酸)발생제를 함유시켜, 도막 형성 후 도막에 구멍 패턴 형성용 마스크를 개입시켜 산 발생제를 활성화 시키는 방사선을 조사하여, 방사선이 조사된 부분의 도막을 가교시키고, 그 다음 상기 마스크를 제거한 후에, 미가교 부분의 도막을 제거하는 것에 의해 실시되는［19］기재의 제조 방법.
[21］산 발생제는, 오늄염, 슬포닐옥시이미드, 트리아진 및 설폰산 에스테르 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종인［20］기재의 제조 방법.
[22］방사선이, 수은 램프광, 전자선, 엑시머 레이져(excimer laser), X선, 또는 크세논 램프인［20］또는［21］기재의 제조 방법.
[23］도막에의 구멍 패턴의 형성은, 스크린 인쇄법, 잉크젯 법, 컨택트 프린트법 또는 엠보싱 가공법에 의해 실시하는,［14］~［18］의 어느 하나에 해당하는 기재의 제조 방법.
[24］스크린 인쇄법, 잉크젯 법, 컨택트 프린트법 또는 엠보싱 가공법에 따른 도막에의 구멍 패턴의 형성은, 가교 전 도막에 구멍 패턴을 형성하고, 그 다음에 구멍 패턴을 형성한 도막을 가교 시키는 것으로 실시하는,［23］ 기재의 제조 방법.
[25］상기 가교제와 가교 가능한 관능기를 가지는 탄화수소 구조는, 상기 가교제와 가교 가능한 관능기를 측쇄에 가지는 (메타) 아크릴레이트 구조 또는 (메타) 아크릴 아미드 구조(여기서, (메타) 아크릴레이트란, 메타크릴레이트와 아크릴레이트의 양쪽 모두를 나타낸다.)인 [15]~[24] 중의 어느 하나에 해당하는 기재에 따른 제조 방법.
[26］상기 가교제와 가교 가능한 관능기는, 히드록실기, 카르복시기, 에폭시기, 아미노기 또는 숙신이미드기인［15］~［25］중의 어느 하나에 해당하는 기재에 따른 제조 방법.
[27］가교제는, 에폭시계 가교제, 멜라민계 가교제, 그리코우릴계 가교제, 히드록실기, 카르보키실기, 아지드기 또는 비닐 에테르기를 2개 이상 가지는 화합 물인［15］~［26］의 어느 하나에 해당하는 기재에 따른 제조 방법.
[28］히드록실기, 카르복실기, 아지드기 또는 비닐 에테르기를 2개 이상 가지는 화합물은, 1, 2－디히드록시 나프타렌, 1, 3－디히드록시 나프타렌, 1, 4－디히드록시 나프타렌, 1, 5－디히드록시 나프타렌, 1, 6－디히드록시 나프타렌, 1, 7－디히드록시 나프타렌, 1, 8－디히드록시 나프타렌, 2, 3－디히드록시 나프타렌, 2, 6－디히드록시 나프타렌, 2, 7－디히드록시 나프타렌, 1, 3－시클로 펜 탄 디올, 2, 6－키놀린 디올, 2, 3－디히드록시퀴녹살린, 1, 4－디옥산 디올, 1, 4－시크로헥산디메탄올, 폴리비닐 알코올, 1, 2－나프타렌디카르본산, 1, 3－나프타렌디카르본산, 1, 4－나프타렌디카르본산, 1, 5－나프타렌디카르본산, 1, 6－나프타렌디카르본산, 1, 7－나프타렌디카르본산, 1, 8－나프타렌디카르본산, 2, 3－나프타렌디카르본산, 2, 6－나프타렌디카르본산, 시크로헥산디카르본산, 테레프탈산, 1, 2－시크로펜탄디카르본산, 2, 5－치오펜디카르본산, 2－메틸-3, 4－퀴놀린디카르본산, 9, 10－안트라센디카르본산, 디히드로안트라센 9, 10－디카르본산, 구연산, 호박산, 폴리 아크릴산, 폴리 메타크릴산, 2, 6－비스(4－아지드벤지리덴) 시클로헥사논, 비스(4－비닐옥시부틸) 테레프탈레이트 또는 비스(4－비닐옥시부틸) 아디페이트인［26］또는［27］ 기재에 따른 제조 방법.
(온도 응답성 고분자 조성물)
본 발명의 칩은, 온도 응답성 고분자의 가교 생성물을 구성 성분으로 하여, 한편 구멍 패턴을 가지는 막을 기판 표면에 가지는 것이며, 이 칩의 제조 방법은, 주로, 도막의 형성, 도막의 가교 및 구멍 패턴의 형성의 3개의 공정으로 이루어진다.
상기 도막의 형성은, (1) 가교 가능한 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물, 가교 가능한 온도 응답성 고분자 및 가교제를 함유하는 조성물, 또는 온도 응답성 고분자 및 가교제를 포함한 조성물을 기판 표면에 도포하여 도막을 형성하는 방법(청구항 14에 기재의 방법)과, (2) 가교 가능한 온도 응답성 고분자 형성용 모노머를 함유하는 조성물, 가교 가능한 온도 응답성 고분자 형성용 모노머 및 가교제를 함유하는 조성물, 또는 온도 응답성 고분자 형성용 모노머 및 가교제를 포함한 조성물을 기판 표면에 도포하여 도포막을 형성하는 방법(청구항 16에 기재의 방법)으로 대별된다. (1) 방법은 온도 응답성 고분자를 이용하는 방법이며, (2) 방법은 온도 응답성 고분자 형성용 모노머를 이용하는 방법이다. (1) 방법에서는 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물을 미리 조정하여, 도막 형성 후에 가교 반응을 실시함으로써 막을 얻을 수 있다. 이에 비해, (2) 방법에서는 온도 응답성 고분자 형성용 모노머를 함유하는 조성물을 기판상에 도포하여 온도 응답성 고분자를 얻기 위한 중합 반응과 가교 반응을 실시함으로써 막을 얻을 수 있다. (1) 방법이, 별도의 용기에서 대량으로 조성물을 합성·조정할 수 있다는 점에 의하여 바람직하다. 또한, 도막을 형성하기 쉽고, 미세한 구멍 형성을 할 수 있다는 점에서도 바람직하다.
우선(1) 방법에 대해 설명한다.
(1) 방법에서는, (a) 가교 가능한 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물, (b) 가교 가능한 온도 응답성 고분자 및 가교제를 함유하는 조성물, 또는 (c) 온도 응답성 고분자 및 가교제를 포함한 조성물의 몇 개의 온도 응답성 고분자를 함유 하는 조성물을 이용한다. (a)의 조성물에서는, 온도 응답성 고분자가 가교 가능한 고분자이며, 도막 형성 후의 가교는, 온도 응답성 고분자가 가지는 가교 가능한 기를 이용해 행해진다. 이 경우, 고분자 사슬끼리 서로 직접 가교 된다. (b)의 조성물에서는, 온도 응답성 고분자가 가교 가능한 고분자이며, 한편 가교제를 함유하므로, 도막 형성 후의 가교는, 온도 응답성 고분자가 가지는 가교 가능한 기 및 가교제의 양쪽 모두를 이용해 행해진다. 이 경우, 고분자 사슬끼리의 직접 가교 및 가교제의 사슬을 통한 가교가 형성된다. (c)의 조성물에서는, 온도 응답성 고분자는 가교 가능한 기를 갖지 않는 고분자이며, 그러나 가교제를 함유하므로, 도막 형성 후의 가교는, 가교별로 따라 행해진다. 이 경우, 가교제의 사슬을 통한 가교가 형성된다.
고분자 사슬끼리의 직접 가교보다는, 가교제의 사슬을 통한 가교가, 고분자사슬 간이, 유연한 가교제의 사슬로 연결되는 결과가 되어, 가교 후의 온도 응답성의 관점(팽윤·수축시의 체적 변화량, 응답 속도)에서 보다 바람직하다.
가교제와 반응 가능한 관능기를 가지는 온도 응답성 고분자로서는, 온도 응답성을 발현하는 부위와 가교제와 반응 가능한 관능기를 가지는 부위와의 공중합체일 수가 있다.
가교 가능한 기의 사이에 가교 가능한 온도 응답성 고분자로서는, 온도 응답성을 발현하는 부위와 고분자 사슬이 가지는 가교 가능한 기 끼리가 서로 가교 할 수 있는 가교 가능한 기를 가지는 부위와의 공중합체일 수가 있다.
가교 가능한 기를 갖지 않는 온도 응답성 고분자로서는, 온도 응답성을 발현하는 부위만으로부터 되는 호모폴리머여도 좋고, 또한, 다른 모노머와의 공중합체이여도 괜찮다. 이용할 수 있는 가교제로는, 라디칼 발생기를 2개 이상 가지고 있는 가교제를 들 수 있다. 가교제가 가지는 라디칼 발생기는, 그 높은 반응성에 의해, 온도 응답성 고분자를 구성하는 공유결합의 모든 부분에 가교제 자신을 결합할 수가 있다. 라디칼 발생기로서는, 아지드기를 들 수 있으며 가교제로서는, 2, 6－비스(아지드벤질리덴) 시클로헥사논, 4, 4‘－디아지드스틸벤 2, 2＇디슬폰산 이 나트륨을 들 수 있다.
온도 응답성을 발현하는 부위와 가교제와 반응 가능한 관능기를 가지는 부위와의 공중합체로서는, 화학식 1에서 나타나는 반복 단위를 가지며, 중량 평균 분자량이 500 ∼5,000,000인 N－알킬(메타) 아크릴 아미드 공중합체일 수가 있다. 상기 N－알킬(메타) 아크릴 아미드 공중합체의, 중량 평균 분자량은 바람직하게는, 도포 용액의 점성, 가교 후의 팽윤 성능의 관점으로부터, 5,000 ∼ 100,000의 범위이다.
[화학식 1]
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화학식 1에 대해, R1 및 R2는, 같거나 또는 다르게, 수소 원자 또는 탄소수 1에서 4의 알킬기를 나타내고, R3는 수소 원자 또는 메틸기를 나타내며, R4는 상기 가교제와 가교 가능한 관능기를 가지는 탄화수소 구조를 나타낸다. 탄소수 1에서 4의 알킬기는, 예를 들면, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기이다. x 및 y는, 각각 x＋y=1, 0＜x＜1, 0＜y＜1을 만족하는 임의의 수이다. 바람직하게는, 0.6＜x≤0.95, 0.05≤y＜0.4를 만족하는 임의의 수이다. x성분이 온도 응답성을 주관하는 화학 구조이며, y성분이 가교 반응을 주관하는 화학 구조이다. 0.6＜x의 범위이면, 온도 응답성을 충분히 유지할 수 있는 것으로부터 바람직하다. 또, 0.05≤y의 범위이면, 충분한 가교 밀도(내용제성)를 얻을 수 있는 것으로서 바람직하다. 또한 온도 응답성을 유지할 수 있으며 충분한 가교 밀도를 얻을 수 있는 범위라는 관점에서는, 0.6＜x≤0.95 및 0.05≤y＜0.4인 것이 바람직하다. 여기서, (메타) 아크릴 아미드란, 메타크릴 아미드와 아크릴 아미드의 양쪽 모두를 나타낸다.
온도 응답성을 발현하는 부위의 구조로서는, 특별히 제한은 없지만, 온도 응답 성능의 관점(팽윤·수축시의 체적 변화량, 응답 속도)에서, 화학식 1에 포함되는 N－알킬(메타) 아크릴 아미드 구조가 바람직하고, 또, N－이소프로필 아크릴 아미드 구조가 보다 바람직하다. 또한, 다른 기능성 모노머와의 공중합이 용이하기 때문에, 빛, 전기장, pH변화, 용매 교환, 항원 항체 인식 등의 여러 가지 자극에 응답하도록 변경할 수 있는 점에서도, N－알킬(메타) 아크릴 아미드 구조가 바람직하다.
온도 응답성을 발현하는 부위의 구체적인 구조로서는, 예를 들면, N－이소프로필(메타) 아크릴 아미드, N－에틸(메타) 아크릴 아미드, N－노말 프로필(메타) 아크릴 아미드, N－시클로 프로필(메타) 아크릴 아미드, N, N－디에틸(메타) 아크릴 아미드, N－아크릴로일피페리딘, N－아크릴로일피롤리딘, N－비닐 ISO 부틸 아미드, 2－카르복시이소프로필(메타) 아크릴 아미드, 폴리에틸렌 옥시드를 측쇄에 가지는 (메타) 아크릴 아미드, 폴리에틸렌 옥시드를 측쇄에 가지는 (메타) 아크릴레이트를 들 수 있다. 상기 구조를 이용한 온도 응답성 고분자는, 고유의 상전이를 일으키는 온도(하한 임계 온도；LCST)를 가지기 때문에, 의도하는 전이 온도에 맞추어 사용하는 구조를 선택할 수가 있다.
가교제와 반응 가능한 관능기를 가지는 부위의 구조로서는, 가교제와 반응 가능한 반응기(카르보키실기, 에폭시기, 아미노기, 숙신이미드기 등)를 측쇄에 가지는 (메타)아크릴레이트 구조 또는 (메타)아크릴 아미드 구조일 수가 있다. 구체적인 구조로서 예를 들면, 히드록시 에틸(메타)아크릴레이트, 히드록시 에틸(메타) 아크릴 아미드, (메타)아크릴산, 그리시딜(메타)아크릴레이트, 그리시딜(메타)아크릴 아미드, (메타)아크릴산 숙신이미드에스테르,γ―히드록시산 (메타)아크릴레이트,γ―히드록시산 (메타)아크릴 아미드, 2－카르복시이소프로필 (메타)아크릴 아미드 등을 들 수 있다. 가교제와 반응 가능한 관능기를 가지는 부위의 고분자 중에 있어서의 몰분율은, 고분자막의 가교 밀도, 팽윤도를 고려해 적당히 결정할 수 있으며, 예를 들어, 1~50 몰%의 범위로 할 수가 있다.
가교제와 반응 가능한 관능기를 가지는 온도 응답성 고분자로서는, 가교제와 반응 가능한 반응기(히드록실기, 카르보키실기, 아미노기, 에폭시기 등)를, 화학 구조안에 원래 가지는 온도 응답성 고분자는, 공중합 하지 않고 호모폴리머로서 그대로 이용할 수가 있다. 예를 들면, 폴리 히드록시 프로필 아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 메틸 셀룰로오스, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로오스, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 2－카르복시이소프로필(메타) 아크릴 아미드, 가용성 에라스틴 단백, 폴리펩티드인 Poly(VPGVG)(여기서, V는 발린, P는 프로린, G는 글리신을 나타낸다), 말단에 수산기를 가지는 폴리에틸렌 옥시드 등을 들 수 있다. 상기의 온도 응답성 고분자는, 고유의 상전이를 일으키는 온도(하한 임계 온도；LCST)를 가지기 때문에, 의도하는 전이 온도에 맞추어, 사용하는 고분자를 선택할 수가 있다. 또한, 생체 유래의 온도 응답성 고분자인 에라스틴, Poly(VPGVG), 셀룰로오스계 고분자는, 바이오 칩으로서 이용했을 때에는, 생체 적합성의 관점에서 바람직하다.
가교제는, 예를 들면, 에폭시계 가교제, 멜라민계 가교제, 그리코우릴계 가교제, 히드록시기, 카르복시기, 아지드기 또는 비닐 에테르기를 2개 이상 가지는 화합물일 수가 있다.
에폭시계 가교제는, 예를 들면, 트리메틸올프로판트리글리시딜에테르, 1, 2－시크로헥산디카르본산디글리시딜에스테르, 1, 2－나프타렌디카르본산디글리시딜에스테르, 1, 3－나프타렌디카르본산디글리시딜에스테르, 1, 4－나프타렌디카르본산디글리시딜에스테르, 1, 5－나프타렌디카르본산디글리시딜에스테르, 1, 6－나프타렌디카르본산디글리시딜에스테르, 1, 7－나프타렌디카르본산디글리시딜에스테르, 1, 8－나프타렌디카르본산디글리시딜에스테르, 2, 3－나프타렌디카르본산디글리시딜에스테르, 2, 6－나프타렌디카르본산디글리시딜에스테르, 2, 7－나프타렌디카르본산디글리시딜에스테르, 1, 4－시크로헥산디메탄올디글리시딜에테르, 비스페놀-A－디글리시딜에테르, 비스페놀-S－디글리시딜에테르, 비스［4－(2, 3－에폭시 프로필 티오) 페닐］설파이드, 또는 1, 4－비스(글리시딜옥시) 벤젠일 수가 있다.
멜라민계 가교제는, 예를 들면, 헥사 메톡시 메틸 멜라민, 헥사 에톡시 메틸 멜라민 또는 헥사프로폭시메틸멜라민일 수가 있다.
그리코우릴계 가교제는, 예를 들면, 1, 3, 4, 6－테트라키스(메톡시 메틸) 그리코우릴, 1, 3, 4, 6－테트라키스(에톡시 메틸) 그리코우릴, 또는 1, 3, 4, 6－테트라키스(프로폭시메틸) 그리코우릴일 수가 있다.
히드록실기, 카르보키실기, 아지드기 또는 비닐 에테르기를 2개 이상 가지는 화합물은, 예를 들면, 1, 2－디히드록시 나프타렌, 1, 3－디히드록시 나프타렌, 1, 4－디히드록시 나프타렌, 1, 5－디히드록시 나프타렌, 1, 6－디히드록시 나프타렌, 1, 7－디히드록시 나프타렌, 1, 8－디히드록시 나프타렌, 2, 3－디히드록시 나프타 렌, 2, 6－디히드록시 나프타렌, 2, 7－디히드록시 나프타렌, 1, 3－시클로 펜 탄 디올, 2, 6－키놀린 디올, 2, 3－디히드록시퀴녹살린, 1, 4－디옥산 디올, 1, 4－시크로헥산디메탄올, 폴리비닐 알코올, 1, 2－나프타렌디카르본산, 1, 3－나프타렌디카르본산, 1, 4－나프타렌디카르본산, 1, 5－나프타렌디카르본산, 1, 6－나프타렌디카르본산, 1, 7－나프타렌디카르본산, 1, 8－나프타렌디카르본산, 2, 3－나프타렌디카르본산, 2, 6－나프타렌디카르본산, 시크로헥산디카르본산, 테레프탈산, 1, 2－시크로펜탄디카르본산, 2, 5－치오펜디카르본산, 2－메틸-3, 4－퀴놀린디카르본산, 9, 10－안트라센디카르본산, 디히드로안트라센 9, 10－디카르본산, 구연산, 호박산, 폴리 아크릴산, 폴리 메타크릴산, 2, 6－비스(4－아지드벤질리덴) 시클로헥사논, 비스(4－비닐옥시부틸) 테레프탈레이트 또는 비스(4－비닐옥시부틸) 아디페이트일 수가 있다.
가교제의 함유량은, 온도 응답성 고분자막의 가교 밀도, 팽윤도를 고려해 적당 결정할 수 있으며, 예를 들면, 온도 응답성 고분자 100 중량부에 대해서, 0. 5~50 중량부의 범위로 할 수가 있다. 400 nm에서 600 nm의 빛에 대해서, 투명·무형광인 가교제가, 광학 현미경 관찰·형광 관찰을 방해하지 않기 때문에, 보다 바람직하다. 또한, 수용성의 가교제를 이용하면, 도포 용매에 물을 이용할 수가 있어 유기용매를 이용하는 것보다도 환경 부하의 관점에서 바람직하다. 또한, 내용제성이 낮은 기판 위에도 도포할 수 있게 되는 점에서도 바람직하다.
이상, (1) 방법［온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물을 이용하는 방법］에 대해 설명을 했지만, (2) 방법［온도 응답성 고분자 형성용 모노머를 함유하는 조성물을 이용하는 방법］에 대해 이용하는 온도 응답성 고분자 형성용 모노머는, 상기 고분자의 구성 성분으로 하고 있어 설명한 각 구조를 포함한 모노머일 수가 있다.
예를 들면, 온도 응답성을 발현하는 부위를 포함한 모노머로서는, N－이소프로필(메타) 아크릴 아미드 모노머, N－에틸(메타) 아크릴 아미드 모노머, N－노말 프로필(메타) 아크릴 아미드 모노머, N－시클로 프로필(메타) 아크릴 아미드 모노머, N, N－디에틸(메타) 아크릴 아미드 모노머, N－아크릴로일피페리딘 모노머, N－아크릴로일피롤리딘 모노머, N－비닐 ISO 부틸 아미드 모노머, 2－카르복시이소프로필(메타) 아크릴 아미드 모노머, 폴리에틸렌 옥시드를 측쇄에 가지는(메타) 아크릴 아미드 모노머, 폴리에틸렌 옥시드를 측쇄에 가지는(메타) 아크릴레이트 모노머를 들 수가 있다.
가교제와 반응 가능한 관능기를 가지는 부위를 포함한 모노머로서는, 히드록시 에틸(메타) 아크릴레이트 모노머, 히드록시 에틸(메타) 아크릴 아미드, (메타) 아크릴산 모노머, 그리시딜(메타) 아크릴레이트 모노머, 그리시딜(메타) 아크릴 아미드 모노머, (메타) 아크리르산숙신이미드에스테르모노머,γ－히드록시산(메타) 아크릴레이트 모노머,γ－히드록시산(메타) 아크릴 아미드 모노머, 2－카르복시이소프로필(메타) 아크릴 아미드 모노머를 들 수가 있다.
(2) 방법으로 이용하는 가교제는, (1) 방법에서 든 것과 같다. 또한, 2개 이상의 중합기를 가지고 있는 화합물을 가교제로써 이용할 수가 있다. 구체적으로는, 비스(메타) 아크릴 아미드 모노머, 비스(메타) 아크릴레이트 모노머를 들 수 있다. 또, 가교제의 함유량은, (1)의 고분자에 대한 설명을 기초에 적당하게 결정할 수 있다.
(도막의 형성)
도막의 형성은, (1) 방법에서는, 상기(a)~(c)의 어느 것이나 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물을 용제에 용해하여 이를 기판에 도포하는 것으로 행해진다. 또, (2) 방법에서는, 대응하는 모노머를 함유하는 조성물을 용제에 용해하고, 이것을 기판에 도포하는 것으로 행해진다. 단, 용매를 사용하지 않고 도막을 형성할 수가 있는 경우도 있다. 그 경우는, 용매를 사용하지 않고 도막을 형성해도 좋다.
조성물을 도포할 때에 용해하는 용제로서는, 예를 들면, 물, 메탄올, 에탄올, 1－메톡시-2－프로판올, 에틸렌글리콜 모노메틸 에테르, 메틸셀로솔브아세테이트, 톨루엔, 크실렌, 디아세톤알코올, 시클로헥사논, 2－히드록시 프로피온산 에틸, 2－히드록시-2－메틸 프로피온산 에틸, 에톡시 초산에틸, 히드록시 초산에틸, 2－히드록시-3－메틸 부탄산메틸, 3－메톡시프로비온산메틸, 3－메톡시프로비온산에틸, 3－에톡시나로비온산에틸, 3－에톡시 프로피온산 메틸, 피루빈(pyruvic)산메틸, 피루빈산에틸, 초산에틸, 초산 부틸, 락트산 에틸, 락트산 부틸을 이용할 수가 있다. 이러한 용제는 단독으로, 또는 2종 이상의 편성으로 사용할 수가 있다. 용매의 양은, 의도하는 용액 점도, 얻을 수 있는 도막 두께 등을 고려하여 적절히 결정할 수 있으며, 예를 들면, 온도 응답성 고분자 100 중량부에 대해서, 100 ∼ 5000 중량부의 범위로 할 수가 있다. 특히, 가교제가 수용성의 경우, 용제에 물을 이용 하면, 유기용매를 이용하는 것보다도 환경 부하의 관점에서 바람직하다. 또, 내용제성이 낮은 기판 위에도 도포할 수 있게 되는 점에서 바람직하다.
도막을 형성하는 기판은, 예를 들면, 실리콘 기판, 유리 기판, 플라스틱 기판, 마이카 기판, 세라믹 기판, 또는 금속 기판일 수 있다.
기판과 온도 응답성 고분자막 사이를 제대로 가교 반응에 의해 고정하기 위해서, 유리 기판, 실리콘 웨이퍼, 석영 기판의 경우는, 표면 처리제로서 히드록실기, 카르복실기, 에폭시기 또는 아미노기 등을 말단에 가지는 실란 커플링제를 이용하는 것이 바람직하다. 금 기판의 경우는, 히드록실기 또는 카르복실기 또는 에폭시기 또는 아미노기 등을 말단에 가지는 티올(thiol) 화합물을 이용하는 것이 바람직하다. 마이카 기판, 플라스틱 기판의 경우는, 표면 처리제 대신에, 산소 플라스마 처리, 또는 UV처리, 또는 오존 처리를 실시하는 것에 의해, 기판 표면에 히드록실기나 카르복실기를 형성하는 처리를 하는 것이 바람직하다.
(가교 및 구멍 패턴 형성)
기판에 형성된 도막을 가교((2)의 경우는 모노머의 중합 및 가교) 및 구멍 패턴 형성은, 구멍 패턴의 형성 방법에 따라, 순서가 일부 다르다.
구멍 패턴 형성은, 예를 들면, 포트리소그래피법, 엠보싱 가공법, 스크린 인쇄법, 컨택트 프린트법 또는 잉크젯법에 의해 실시할 수가 있다.
포트리소그라피 법에서는, 도막 형성 후, 마스크를 개입시켜 포트리소그래피를 실시하는 것에 의해 행해진다. 또한, 잉크젯 인쇄나, 마스크를 통한 스크린 인쇄에 의해서도 행해진다. 이들 이외에도, 요철을 가지는 스탬프의 볼록부에 상기 도포 용액을 바르며, 기판에 꽉 눌러, 용액을 전사하는 컨택트 프린트법이나, 도막을 기판상에 형성 후, 요철을 가지는 스탬프를 꽉 눌러, 요철 패턴을 전사하는 엠보싱 가공법에 따라서도 행해진다. 또한, 상기 공정에 의해 형성되는 구멍은, 도막을 완전하게 관통하고 있어도, 관통하고 있지 않아도 좋다.
포트리소그래피법을 이용한 구멍 패턴 형성 공정
이하, 산(酸)발생제를 사용한 포트리소그래피법에 대해 설명한다. 이 방법에서는, 도막의 형성을, 상기 감열 응답성 고분자 함유 조성물 또는 감열 응답성 고분자 형성용 모노머 함유 조성물 및 산 발생제를 용제에 용해한 용액을 기판상에 도포하여 얻을 수 있던 도막에 마스크를 개입시켜 산 발생제를 활성화 시키는 방사선을 조사하여, 산촉매가 발생한 부분의 가교 반응을 가열에 의해 진행시켜, 현상에 의해 미가교 부분을 용해 제거하는 것에 의하여, 구멍 패턴을 형성한다.
산 발생제는, 활성 방사선 조사에 의해 산을 발생하는 것이면 좋고, 상기 활성 방사선은, 예를 들면, 수은 램프광, 전자선, 엑시머 레이져(excimer laser), X선, 또는 크세논램프일 수 있다.
산 발생제는, 활성 방사선 조사에 의해 산을 발생하는 것이면 좋고, 예를 들면, 트리페닐술포늄트리플레이트, 트리페닐술포늄노나플레이트, 페닐디메틸술포늄트리플레이트, 트리메틸술포늄트리플레이트, 디히드로나프틸디메틸술포늄트리플레이트, 디페닐요오듐트리플레이트, 트리페닐슬포늄캄포어술폰산염 등의 오늄염, N－트리플로로메탄술포닐옥시나프틸이미드, N－메탄술포닐옥시나프틸이미드 등의 술포닐옥시이미드, 2, 4, 6－트리스(트리 클로로 메틸)－1, 3, 5－트리아진, 또한 설폰 산 에스테르등을 들 수가 있다. 400 nm에서 600 nm의 빛에 대해서, 투명·무형광인 산 발생제가, 광학 현미경 관찰·형광 관찰을 방해하지 않기 때문에, 보다 바람직하다. 또, 수용성의 산 발생제를 이용하면, 도포 용매에 물을 이용할 수가 있어 유기용매를 이용하는 것보다도 환경 부하의 관점으로부터 바람직하다. 또, 내용제성이 낮은 기판 위에도 도포할 수 있게 되는 점으로써 바람직하다. 산 발생제의 함유량은, 패턴 형성에 필요한 노광 감도를 고려해 적당 결정할 수 있어 예를 들면, 감열 응답성 고분자 100 중량부에 대해서, 0.1 중량부로부터 20 중량부의 범위로 할 수가 있다.
조성물 및 산 발생제를 용해하는 용제는, 상기 도막의 형성으로 설명한 것과 같은 물건을 이용할 수가 있다. 특히, 가교제와 산 발생제를 모두 수용성의 것을 이용해, 용제에 물을 이용하면, 유기용매를 이용하는 것보다도 환경 부하의 관점으로부터 바람직하다. 또, 내용제성이 낮은 기판 위에도 도포할 수 있게 되는 점에서 바람직하다.
현상에 이용하는 현상액으로서는, 미가교 부분의 온도 응답성 고분자를 용해할 수 있는 것이면, 특별한 제한은 없으며, 예를 들면, LCST 이하의 온도의 물, 메타놀, 에탄올, l－메톡시-2－프로파놀, 에틸렌글리콜 모노메틸 에테르, 메틸셀로솔브아세테이트, 톨루엔, 크실렌, 디아세톤알코올, 시클로헥사논, 2－히드록시 프로피온산 에틸, 2－히드록시-2－메틸 프로피온산 에틸, 에톡시 초산에틸, 히드록시 초산에틸, 2－히드록시-3－메틸 부탄산메틸, 3－메톡시프로비온산메틸, 3－메톡시프로비온산에틸, 3－에톡시나로비온산에틸, 3－에톡시 프로피온산 메틸, 피루빈산 메틸, 피루빈산에틸, 초산에틸, 초산 부틸, 락트산 에틸, 락트산 부틸, 또는 테트라 메틸 암모늄 하이드로 옥시드 수용액을 이용할 수가 있다. 이러한 용제는 단독으로, 또는 2종 이상의 편성으로 사용할 수가 있다. 현상 시간은, 10초부터 30분의 범위로 할 수가 있다.
도막의 형성은, 상기 감열 응답성 고분자 조성물 및 산 발생제를 용제에 용해한 용액을 기판상에 도포함으로써 용액을 적하시킨 기판은, 회전에 의해 용매를 증발시켜 도막을 얻는다. 회전에 의한 용매의 증발은, 예를 들면, 회전에 의해 생기는 기류에 의해, 또한, 외부로부터 히터로 가열하는 것에 의하여 실시할 수가 있다.
스핀 코터의 회전 속도는, 의도한 도막 두께를 고려해 적절히 결정할 수 있으며, 예를 들면, 500~8000 rpm의 범위로 할 수가 있다. 또한, 여기서 얻을 수 있던 도막 두께가, 포트리소그래피에 의해 얻을 수 있을 때 응답성 고분자의 구멍 패턴의 깊이가 되기 때문에, 도막 두께를 컨트롤 하는 것에 의해, 임의의 구멍 패턴의 깊이를 가진 칩을 제작할 수가 있다.
현상액에 물을 이용하면, 유기용매를 이용하는 것보다도 환경 부하의 관점에서 바람직하다. 또한, 내용제성이 낮은 기판에서도 사용할 수 있게 되는 점으로써 바람직하다. 또, 해상성의 향상을 위해서도 바람직하다. 통상, 현상 후에는, 가교 해 불용화한 부분에도 현상액이 침투해, 팽윤 상태가 된다. 그 상태에서 현상액을 제거하면, 패턴 형상이 무너지거나 패턴끼리 들러붙어 있기도 하여, 높은 해상성을 얻을 수 없다. 그러나, 현상시에 물을 이용했을 경우는, 현상 후에 물을 제거하는 시점에서, 일단 물의 온도를 LCST 이상으로 하면, 팽윤하고 있던 패턴 내부로부터 물이 추출되어 수축해 딱딱해진다. 그 때문에, 패턴 붕괴를 막을 수가 있어 높은 해상성을 얻을 수 있다.
스크린 인쇄법, 잉크젯법, 컨택트 프린트법 또는 엠보싱 가공법을 이용한 구멍 패턴 형성 공정
이하, 스크린 인쇄법, 잉크젯법, 컨택트 프린트법 또는 엠보싱 가공법을 이용한 구멍 패턴 형성 공정에 대해 설명한다. 이 방법에서는, 도막의 형성을, 상기 감열 응답성 고분자 조성물을 용제에 용해한 용액을 기판상에 도포하여, 구멍 패턴을 형성한 후, 가교 반응을 진행시킨다.
스크린 인쇄법에서는, 마스크를 개입시켜 상기 용액을 기판에 스크린 인쇄해, 구멍 패턴을 가지는 도막을 형성한다. 잉크젯법에서는, 구멍 패턴 이외의 부분에 용액을 사출하여, 구멍 패턴을 가지는 도막을 형성한다. 컨택트 프린트법에서는, 요철을 가지는 스탬프의 볼록부에 상기 도포 용액을 발라, 기판에 꽉 눌러 용액을 전사하여, 구멍 패턴을 가지는 도막을 형성한다. 엠보싱 가공법에서는, 상기 용액을 스핀 도포해 도막을 기판상에 형성 후, 요철을 가지는 스탬프를 꽉 눌러, 요철 패턴을 전사하여, 구멍 패턴을 가지는 도막을 형성한다.
구멍 패턴을 가지는 도막의 가열에 의한 가교는, 도막이 산 촉매를 포함하지 않는 경우에는, 예를 들면, 핫 플레이트 혹은 베이크 로(爐)를 이용해, 170℃이상 300℃이하의 온도 범위에서, 30분 이상 24시간 이내에서 실시할 수가 있다. 또한, 도막이 산촉매를 포함한 경우에는, 구멍 패턴의 가열에 의한 가교는, 핫 플레이트 또는 베이크 로를 이용해, 90℃이상 170℃미만으로 10초 이상 30분 미만으로 실시할 수가 있다. 여기서, 산촉매란, 도포 용액 중에 산을 직접 첨가해 둔 것이라도 좋고, 상기 산 발생제를 포함한 도막에의 방사선의 조사에 의해 발생하는 산이라도 좋다. 이와 같이 해 구멍 패턴 첨부 도막을 가지는 기판을 얻을 수 있다.
모노머를 사용하는 경우는, 도포 용액 중에 중합 개시제를 포함하게 한다. 중합 개시별로 따라, 가교 반응과 동시에 중합 반응을 진행시킬 수가 있다. 중합 개시제로서는, 아조이소부틸로니트릴, 아조이소부틸로 낙산(酪酸), 과산화 벤조일을 들 수 있다.
(칩)
본 발명의 칩은, 온도 응답성 고분자의 가교 생성물을 구성 성분으로 하며, 구멍 패턴을 가지는 막을 기판 표면에 가지는 칩이며, 상기 본 발명의 제조 방법에 의해 얻을 수 있다. 이 칩은, 도막 온도를 제어하는 것에 의하여, 구멍 패턴의 구멍의 크기를, 개폐하는 것으로, 구멍 내에, 예를 들어, 생체 물질 등을 포접하거나, 또는 구멍으로부터 생체 물질 등을 해방하기 위해서 이용된다. 구멍 패턴을 가지는 막의 두께, 구멍의 크기, 깊이, 형상, 밀도, 배치(패턴의 형상) 등은, 목적에 따라, 기판상으로 유지하고 싶은 의도된 대상물에 맞추어, 적절히 결정할 수 있다. 구멍 패턴을 가지는 막의 두께는, 예를 들면, 10nm ∼ 100μm의 범위일 수가 있다. 구멍 패턴의 구멍의 형상은 원형 또는 구형(예를 들면, 정방형, 직사각형, 육각형), 표주박형, 성형일 수가 있어 구멍의 밀도는, 예를 들면, 1 cm2 당 1개 ∼ 1,000, 000,000개로 할 수가 있다. 구멍의 면적으로서는, 1 nm2 이상 1 cm2 이하를 들 수 있다. 구멍의 크기는, 내접하는 원의 직경이 10 nm~1000μm의 범위로 할 수가 있으며, 구멍의 형상이 원인 경우는 직경을, 예를 들면, 10 nm~1000μm의 범위로 할 수가 있다. 이러한 범위는, 바람직하게는, 100 nm ∼ 20μm의 범위이다. 구멍 패턴의 구멍의 깊이는, 예를 들면, 10 nm~100μm의 범위이다.
본 발명의 칩에 대해서는, 조성물을 도포하는 기판은, 조성물이 도포되는 표면의, 도막이 가지게 되는 적어도 일부의 구멍의 하부에 상당하는 부분에 요(凹)부를 가지는 것일 수가 있다(그림 11). 또는, 도막을 기판에 도포한 후, 도막이 가지는 적어도 일부의 구멍의 하부에 상당하는 기판 부분에, 나중에 요부를 형성할 수도 있다. 이러한 칩으로는, 도막의 구멍의 하부에 기판의 요부가 있어, 도막의 구멍과 기판의 요부로, 하나의 웰을 형성한다. 그리고, 온도 변화에 의해 구멍의 지름이 작아졌을 때에, 웰내에 보관 유지된 물질이, 기판의 요부로 보관 유지될 수도 있다. 도막의 구멍과 기판의 요부의 단면 형상은 동일해도 차이가 나도 좋다. 또한, 도막의 구멍과 기판의 요부의 지름도, 동일해도 차이가 나도 좋다. 기판의 요부의 깊이는, 보관 유지해야 할 물질에 응해 적절히 결정할 수 있어 예를 들면, 0. 1~100μm의 범위로 할 수가 있다. 또한, 기판의 요부의 저부는, 수평에서 만나도, 반구상 또는 저부의 중심을 축으로 한 회전 형상(예를 들면, 삼각뿔상) 등이어도 좋다. 혹은, 기판의 요부는, 기판의 반대면까지 통하는 관통공을 가질 수도 있다. 관통공은 개폐 자재의 마개 또는 뚜껑을 가질 수도 있어 관통공의 단면은, 기판의 요부의 단면보다 작거나, 동일하거나, 또는 커도 좋다.
상기의 도막의 구멍의 하부에 기판의 요부가 있어, 도막의 구멍과 기판의 요부로, 하나의 웰을 형성하는 본 발명의 칩은, 이하와 같이 형성할 수가 있다.
상기 감열 응답성 고분자 조성물 및 산 발생제를 용제에 용해한 용액을 평평한 기판상에 도포하여, 상기 포트리소그래피에 의해 구멍 패턴을 형성한다. 다음에, 구멍 패턴을 형성한 도막을, 에칭 마스크로서 이용하여, 구멍의 하부에 노출하고 있는 기판 부분을 웨트 에칭, 또는 드라이 에칭 등으로 의도하는 깊이까지 에칭 한다. 이 방법은, 기판에 요부를 형성한 후, 도막의 구멍 부분을 그 위치에 맞추어 작성하는 방법보다, 위치 맞춤이 용이하게 고(高) 정밀도로 실시할 수 있는 점에서 바람직하다.
본 발명의 칩에 있어서는, 구멍 패턴의 구멍은, 그 중의 기판 표면상에, 도막과는 독립한 상기 조성물로 형성된 도트를 가질 수도 있다(그림 12). 구멍 패턴을 가지는 도막을 형성하는 가교 생성물과 도트를 형성하는 가교 생성물이란, 동일 조성이어도, 다른 조성이어도 괜찮다. 구멍 안에 도트를 가지는 본 발명의 칩은, 이하와 같이 형성할 수가 있다.
상기 감열 응답성 고분자 조성물 및 산발생제를 용제에 용해한 용액을 평평한 기판상에 도포하여, 상기 포트리소그래피에 의해 구멍 패턴을 형성한다. 다음에, 구멍 패턴을 형성한 도막에 대해, 잉크젯법에 의해, 구멍 패턴 위치에 감열 응답성 고분자 조성물을 사출하고, 구멍 내부에 도트를 형성시킨 후, 열가교 시킨다. 구멍 패턴의 구멍 안의 기판 표면상에 도트를 가지는 칩으로는, 도 10에 나타난 바 와 같이, 가교 생성물이 팽창하여, 구멍의 지름이 작아지는 것과 동시에, 도트를 형성하는 가교 생성물도 팽창하여, 구멍의 깊이가 얕아진다.
본 발명의 칩에 대해 취급하는 물질은, 예를 들면, 생체 물질일 수가 있으며, 생체 물질로서는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들면, 임파구, 표피 세포, 간세포, 신경세포, 간세포 등의 세포, 단백질, 염색체, DNA등을 들 수 있다. 또, 이것들 생체 물질을, 비즈 입자 등의 담체에 고정화한 것일 수도 있다.
본 발명의 칩은, 막온도의 일부분, 또는 전체를 변화시키는 것으로, 막의 일부분, 또는 전체를 팽윤 또는 수축시켜, 구멍 패턴의 구멍의 크기를 임의로 변화시킬 수가 있다. 이것에 의해, 상기 구멍 패턴의 구멍에 격납된 생체 물질을, 막온도의 변화에 의해, 구멍 패턴의 구멍에 있어, 포접한 상태로 하든지, 또는 해방한 상태로 할 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 칩의 막온도를, 상기 칩이 가지는 구멍 패턴의 구멍의 지름을, 생체 물질이 격납 가능한 크기가 되는 온도로 제어하고, 상기 구멍 패턴의 구멍에 생체 물질을 격납하고, 그 다음에 칩의 막온도를 상기 생체 물질을 격납한 구멍의 지름을, 생체 물질을 포접하는 온도로 제어하는 것을 포함한, 칩의 구멍 패턴에 생체 물질을 포접하는 방법을 포함한다. 또한 본 발명은, 이 방법으로 생체 물질을 포접한 칩의 막온도를, 상기 칩이 가지는 구멍 패턴의 구멍의 지름을, 생체 물질을 해방 가능한 크기가 되는 온도로 제어하는 것을 포함한, 칩에 포접된 생체 물질을 해방하는 방법을 포함한다.
미가교의 온도 응답성 고분자는, 각각의 화학 구조 고유의 하한 임계점 온 도(LCST)를 가지고 있다. 하한 임계점 온도 이하의 온도에서는 분자 표면이 친수성 혹은 수용성을 나타내 물에 녹지만, 임계점 온도 이상의 온도에서는 분자 표면이 소수성을 나타내므로 수중에 석출한다. 상기 본 발명의 칩에 이용한 온도 응답성 고분자를 가교 시킨 도막(塗膜)도, 도막 형성에 이용한 감열 응답성 고분자의 화학 구조에 대응한 상기의 LCST를 가진다. LCST 이상의 온도 환경으로 하면, 도막이 소수성을 나타내 막 내부로부터 물이 축출되는 것에 의해, 도막은 수축 상태가 된다. 또한, 상기 LCST보다 낮은 온도 환경으로 하면, 막표면이 친수성을 나타내고, 막내부에 물을 수중에 넣는 것에 의하여, 도막은 팽윤 상태가 되어, 체적은 증대한다.
예를 들면, N－이소프로필 아크릴 아미드 고분자의 하한 임계점 온도는 약 32℃이며, N－이소프로필 아크릴 아미드 구조를 가지는 감열 응답성 고분자를 이용한 본 칩을, LCST 이상의 35℃부근으로 유지하는 것으로, 도막은 수축하여, 구멍 패턴은 확대된 상태가 된다. 구멍 패턴보다 작은 생체 물질을 칩 상에 파종하면, 생체 물질을 용이하게 구멍 안에 넣을 수가 있다. 또한, 구멍 안에 들어가 있던 생체 물질을 용이하게 꺼낼 수도 있다.
이에 대해, 본 칩을 LCST보다 낮은 20℃부근으로 유지하면, 도막은 팽윤하여, 구멍 패턴은 좁아진 상태, 또는, 완전하게 닫힌 상태가 된다. 구멍 안에 들어가 있던 생체 물질을 직접 잡거나 구멍으로부터 나오기 어려울 수 있다. 또한, 생체 물질을 구멍 안에 넣지 못할 수 있다.
본 칩을 LCST 이상으로 유지하는 수단으로서는, LCST 이상의 항온조에 기판을 넣거나, 또는 LCST 이상의 플레이트 상에 기판을 두는 방법을 들 수 있다. 또 한, 칩 전체를 LCST 이상으로 유지할 필요는 없고, 구멍 패턴을 넓히고 싶은 부분의 주변의 도막만, 적외선 레이저의 조사나 소형의 히터로 국소적으로 가열하여, LCST 이상으로 하는 것도 가능하다.
본 칩을 LCST보다 낮은 온도로 하는 수단으로서는, LCST보다 낮은 온도의 항온조에 기판을 넣거나, 또는 LCST보다 낮은 온도의 플레이트 상에 기판을 두는 방법을 들 수 있다. 또한, 칩 전체를 LCST보다 낮은 온도로 할 필요는 없고, 구멍 패턴을 좁은 싶은 부분의 주변의 도막만, LCST보다 낮은 온도의 액체를 피펫트나 시린지 등의 선단으로부터 흘려 넣어 접촉시키는 방법이나, 소형의 펠티에소자(peltier device)를 이용해 국소적으로 냉각하는 방법도 가능하다.
도 1은 실시예 5에 대해, 포트리소그라피법에 따라 작성한 구멍 패턴을 가지는 칩상에 물을 적하한 후, 여러 가지의 온도에 칩을 유지하면서, 구멍의 크기의 변화를 관찰한 결과이다.
도 2는 실시예 6에 대해, 포트리소그라피법에 따라 작성한 구멍 패턴을 가지는 칩을 이용하여 직경 10μm의 폴리스티렌 비즈의 보관 유지 실험을 실시한 결과이다.
도 3은 실시예 7에 대해, 포트리소그라피법에 따라 작성한 구멍 패턴을 가지는 칩을 이용해 임파구(B세포, 직경 약 6μm)의 보관 유지 실험을 실시한 결과이다.
도 4는 실시예 9에 대해, 도포 용액의 고분자 농도를 변경하여, 스핀 코터의 회전 속도를 3000 rpm로 했을 때에 얻을 수 있는 도막의 막후를 나타낸다.
도 5는 실시예 9에 대해, 도포 용액의 고분자 농도를 33 wt%로 하여, 스핀 코터의 회전 속도를 변경했을 때에 얻을 수 있는 도막의 막후를 나타낸다.
도 6은 실시예 11에 있어서의 임파구의 보관 유지 실험의 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 12에 있어서의 임파구의 보관 유지 실험의 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 13에 있어서의 임파구의 보관 유지 실험의 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 14의 공정의 개략 설명도이다.
도 10은 본 발명의 칩의 한 종류의 설명도이다.
도 11은 본 발명의 칩의 한 종류의 설명도이다.
도 12는 본 발명의 칩의 한 종류의 설명도이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 한층 더 상세하게 설명한다.
실시예 1
가교제와 반응 가능한 반응기를 가지는 온도 응답성 고분자의 합성
N－이소프로필 아크릴 아미드 0.91 g(8.0×10－3 몰)과 히드록시 에틸 아크릴레이트 0.23 g(2.0×10－3 몰)을 테트라 히드로 퓨란 30 ml에 용해하여, 10분간 질소 버블링을 실시했다. 계속하여, 중합 개시제로서 2,2＇－아조비스(이소부티로니트릴) 0.04 g를 첨가하여 질소 분위기 하에서, 70℃으로 가열 환류시키고, 6시간 동안 중합을 실시하였다. 중합 후, n－헥산 300 ml에 용액을 주입하고, 고분자를 석출시켜, 여과 분리, 건조하여 백색의 고분자를 수득하였다. 수득된 고분자의 구조는, 여러 가지의 분석법으로부터 N－이소프로필 아크릴 아미드 구조의 몰분율 80%, 히드록시 에틸 아크릴레이트 구조의 몰분율 20%의 하기 화학식 2의 고분자(1)인 것을 알 수 있었다. 겔퍼미에이션크로마트그라피(GPC)에 의해 테트라히드로퓨란 중에서, 이 고분자의 폴리스티렌 환산의 분자량을 조사한 결과, 중량 평균 분자량이 63,000, 수평균 분자량이 45,000이었다.
Figure 112008031020761-pct00004
실시예 2
감광성을 가지는 온도 응답성 고분자 도포 용액의 제작
상기와 같이 합성한 온도 응답성 고분자(1) 100 중량부와, 가교제로서 헥사 메톡시 메틸 멜라민 30 중량부와, 광산발생제로서 트리페니르스르호니움트리후레이트 10 중량부를, 용매인 디아세톤알코올 250 중량부에 용해하여, 이것을 구멍 지름 0.40μm의 테플론 필터를 이용해 여과하여, 도포 용액으로 했다.
실시예 3
온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴 형성(1)… 포트리소그래피법
히드록실기를 말단에 가지는 실란 커플링제로 표면 처리한 유리 기판상에, 상기의 도포 용액을 스핀 코터의 회전 속도 3000 rpm로 스핀 도포하였다. 도포 후 120℃로 5분간 가열 처리해 용매를 휘발시켜, 막후 2μm의 도막을 얻었다. 고압 수은 램프를 광원으로 하는 마스크 얼라이너를 이용해, 마스크를 개입시켜 이 도막에 노광을 실시했다. 노광 후 120℃으로 5분간 가열 처리를 실시하여, 노광에 의해 산이 발생한 부분만, 산촉매 반응에 의한 가교 반응을 진행시켰다. 그 후, 15℃의 물을 이용하여, 미가교 부분을 용해 제거하는 현상 처리를 2분간 시행하였다. 이어서, 현상액의 온도를 하한 임계 온도 이상의 35℃에 올려 도막으로부터 물을 축출하여 수축시킨 상태로 현상을 종료하고, 기판을 120℃로 30분간 가열 건조하였다. 그 결과, 직경 10μm, 깊이 2μm의 온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴을 250,000개/cm2의 밀도로 기판상에 제작했다.
실시예 4
온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴 형성(2)···스크린 인쇄법
상기에서 합성한 온도 응답성 고분자(1) 100 중량부와, 가교제로서 헥사 메톡시 메틸 멜라민 30 중량부와, 광 산발생제로서 트리페닐술포늄트리플레이트 10 중량부를, 용매인 디아세톤알코올 900 중량부에 용해하여, 이것을 구멍 지름 0.40μm의 테플론 필터를 이용해 여과하여, 도포 용액으로 하였다. 히드록실기를 말단에 가지는 실란커플링제로 표면 처리한 유리 기판상에, 잉크젯프린터를 이용하여 상기의 도포 용액을 구멍 패턴 상에 분무하여 인쇄하였다. 분무 후, 크세논 수은 램프에 의해 전면을 노광해, 120℃으로 5분간 가열 처리를 하였다. 그 결과, 인쇄된 온도 응답성 고분자는 가교 반응에 의해 제대로 기판에 고정되어 직경 100μm, 깊이 0.5μm의 구멍 패턴을 2,500개/cm2의 밀도로 기판상에 제작할 수 있었다.
실시예 5
온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴 형성(3)…스크린 인쇄법
상기로 합성한 온도 응답성 고분자(1) 100 중량부와, 가교제로서 헥사 메톡시 메틸 멜라민 30 중량부와, 광 산발생제로서 트리페니르스르호니움트리후레이트 1 중량부를, 용매인 디아세톤알코올 100 중량부에 용해하여, 이것을 구멍 지름 0.40μm의 테플론 필터를 이용해 여과하여, 도포 용액으로 하였다.
히드록실기를 말단에 가지는 실란커플링제로 표면 처리한 유리 기판상에, 스크린 인쇄용 마스크를 개입시켜, 상기의 도포 용액을 이용해 구멍 패턴 상에 스크린 인쇄를 실시했다. 인쇄 후, 크세논 수은 램프에 의해 전면을 노광해, 120℃으로 5분간 가열 처리하였다. 그 결과, 인쇄된 온도 응답성 고분자는 가교 반응에 의해 제대로 기판에 고정되어 직경 100μm, 깊이 2μm의 구멍 패턴을 2,500개/cm2의 밀도로 기판상에 제작할 수 있었다.
제작한 칩의 온도 응답성의 평가
상기 포트리소그라피법에 따라 작성한 구멍 패턴을 가지는 칩 상에 물을 물방울 내린 후, 여러 가지의 온도에 칩을 유지하면서, 구멍의 크기의 변화를 관찰하 였다. 그 결과를 그림 1에 나타낸다. 칩 온도를 LCST보다 고온측(약35℃)으로 하면, 온도 응답성 고분자는 수축하여, 구멍 패턴의 직경은 약 10μm, 깊이는 2μm가 되었다. 칩 온도를 LCST보다 저온측(약15℃)으로 하면, 온도 응답성 고분자가 세로·횡방향 모두 팽윤하기 시작하여 약 10초 후에는, 구멍 패턴의 직경은 6μm로 줄어들어, 깊이는 6μm가 되었다. 또, 이 수축·팽윤 거동은, 칩 온도의 변화에 수반하여, 몇 번이나 반복해 실시할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 6
폴리스티렌 비즈를 이용한 실험
상기 포트리소그라피법에 따라 작성한 구멍 패턴을 가지는 칩을 이용해 미소한 물체의 보관 유지 실험을 실시하였다. 여기에서는, 직경 10μm의 폴리스티렌 비즈를 이용해 비즈 1 개씩을 각각 분리해 칩 상에 고정화·배열하는 것을 검토하였다. 그 결과를 도 2에 나타낸다. 처음에, 칩 온도를 고온(약 35℃)으로 유지한 상태로, 비즈 현탁액을 적하하여, 비즈의 자연 침강을 5분간 기다렸다. 다음으로, 칩 온도를 저온(약 15℃)에 내리는 것에 의하여, 온도 응답성 고분자를 팽윤시켜,구멍 안에 들어온 비즈만을 단단히 포집하였다. 그 후, 비커에 넣은 15℃의 물로 칩을 세정하여, 포집되지 않은 여분의 비즈를 씻어 흘렸다. 세정시에, 칩을 저온으로 유지해 두면, 구멍 안의 비즈는 팽윤 한 온도 응답성 고분자에 의해 제대로 포집되고 있으므로, 강하게 씻어도 흘러나가는 것이 없었다. 그 결과, 구멍 패턴 부분에만 1 개씩의 비즈를 각각 분리해 고정화할 수가 있었다. 또한, 칩 온도를 고온(약 35℃)에 되돌리면, 온도 응답성 고분자는 수축해, 다시 비즈를 해방할 수가 있었다.
또한 캐필러리에 의한 흡인에 의해, 칩 상으로부터 임의의 비즈 1개만을 회수하는 것을 시도하였다. 회수시에는, 칩 온도를 고온으로 하는 것으로, 구멍의 직경이 확대되어 높이도 낮아지는 것에 의해, 회수용 캐필러리의 선단을 비즈에 용이하게 접근시킬 수가 있어 확실히 비즈를 회수할 수가 있었다.
여기에서는, 직경 10μm의 폴리스티렌 비즈를 이용했지만, 구멍 패턴의 사이즈를 변경하는 것으로, 임의의 사이즈의 비즈나 미립자를 보관 유지·배열·회수할 수가 있다. 또한, 조합(combinatorial) 합성에 의해 제작한, 다종의 펩티드·당쇄·올리고 DNA를 결합시킨 복수의 비즈, 미립자도 보관 유지·배열·회수할 수가 있다.
실시예 7
면역 세포를 이용한 보관 유지 실험
상기 포트리소그라피법에 따라 작성한 구멍 패턴을 가지는 칩을 이용해 미소한 생체 재료의 보관 유지 실험을 실시하였다. 여기에서는, 마우스로부터 추출한 임파구(B세포···직경 약 6μm)를 이용해 임파구 1 개씩을 각각 분리해 칩 상으로 유지하는 것을 검토했다. 처음에, 칩 온도를 고온(약 35℃)으로 유지한 상태로, 임파구 현탁액을 적하하여, 임파구의 자연 침강을 5분간 기다렸다. 다음에, 칩 온도를 저온( 약 15℃)에 내리는 것으로, 온도 응답성 고분자를 팽윤시켜,구멍 안에 들어온 임파구만을 포집하였다. 그 후, 비커에 넣은 15℃의 PBS 버퍼로 칩을 세정해, 포집되지 않은 여분의 임파구를 씻어 흘렸다. 그 결과, 구멍 패턴 부분에만 1 개씩의 임파구를 각각 분리해 고정화할 수가 있었다. 이때의 세포 보관 유지율은, 약 16%였다. 여기서 말하는 세포 보관 유지율이란, 칩상의 구멍 안에 보관 유지되고 있는 세포의 수/팁 상의 구멍의 수×100으로 나타난다. 또, 칩 온도를 고온(약 35℃)에 되돌리면, 온도 응답성 고분자는 수축해, 다시 임파구를 해방할 수가 있었다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.
게다가 캐필러리에 의한 흡인에 의해, 칩 상으로부터 임의의 임파구 1개만을 회수하는 것을 시도했다. 회수시에는, 칩 온도를 고온으로 하는 것으로, 구멍의 직경이 확대되어 높이도 낮아지는 것으로부터, 회수용 캐필러리의 선단을 임파구에 용이하게 접근시킬 수가 있어 확실히 임파구를 회수할 수가 있었다.
여기에서는, 생체 재료로서 임파구를 이용했지만, 구멍 패턴의 사이즈·형상을 변경하는 것으로, 그 외의 혈구 세포, 대장균, 염색체 등을 보관 유지·배열·회수할 수가 있었다. 또, 형광 염색이나 자기 라벨 한 생체 재료도 보관 유지·배열·회수할 수가 있었다.
실시예 8
전이 온도의 제어 실험
상기 포트리소그라피법에 따라 작성한 구멍 패턴을 가지는 칩의 전이 온도(팁상에 고정된 온도 응답성 고분자가 팽윤 상태로부터 수축 상태로, 또는 수축 상태로부터 팽윤 상태로 변화하는 온도)를, 칩 온도를 변화시키면서 팽윤·수축의 모습을 현미경으로 관찰하는 것에 의해 상세하게 조사하였다. 그 결과, 온도 응답성 고분자(1)를 이용해 작성한 칩의 전이 온도는, 약 28℃인 것을 알 수 있었다.
그에 대해, N－이소프로필 아크릴 아미드 대신에, N－이소프로필 메타크릴 아미드를 이용해 합성한 온도 응답성 고분자(합성 방법은, 온도 응답성 고분자(1)의 N－이소프로필 아크릴 아미드를 N－이소프로필 메타크릴 아미드에 대신한 것을 제외하고는, 같은 합성 방법을 반복하였다)를 이용해 작성한 칩의 전이 온도는, 약 39℃인 것을 알 수 있었다.
또한, N－이소프로필 아크릴 아미드 대신에, N－노말 프로필 아크릴 아미드를 이용해 합성한 온도 응답성 고분자(합성 방법은, 온도 응답성 고분자(1)의 N－이소프로필 아크릴 아미드를 N－노말 프로필 아크릴 아미드에 대신한 것을 제외하고는, 같은 합성 방법을 반복하였다)를 이용해 작성한 칩의 전이 온도는, 약 16℃인 것을 알 수 있었다.
온도 응답성 고분자를 변경하는 것으로, 의도하는 전이 온도를 가지는 칩을 얻을 수 있지만, 세포나 단백질과 같은 생체 재료를 취급하는 경우는, 사멸이나 변성을 일으키지 않게, 전이 온도가, 0℃보다 높고 45℃보다 낮은 범위에 존재하는 것이 바람직하였다.
실시예 9
구멍 패턴의 깊이의 제어 실험
상기 포트리소그라피법에 따라 형성되는 구멍 패턴의 깊이는, 스핀 도포시의 온도 응답성 고분자의 막후에 상당하기 때문에, 도막 형성시의 막후를 컨트롤 하는 것만으로, 용이하게 구멍의 깊이를 제어할 수 있다. 도포 용액의 고분자 농도를 변경해, 스핀 코터의 회전 속도를 3000 rpm로 했을 때에 얻을 수 있는 도막의 막후를 그림 4에 나타낸다. 또, 도포 용액의 고분자 농도를 33 wt%로 하여, 스핀 코터의 회전 속도를 변경했을 때에 얻을 수 있는 도막의 막후를 도 5에 나타낸다.
실시예 10
막후에 의한 체적 증가량의 제어 실험
상기 포트리소그라피법에 따라 형성되는 구멍 패턴의 깊이(온도 응답성 고분자의 막후에 상당)에 의해, 팽윤시의 체적 변화량을 제어할 수가 있어 거기에 따라, 팽윤시의 구멍 패턴의 직계(直系)나 깊이를 제어할 수가 있다. 온도 응답성 고분자의 막후가 두꺼운 만큼 체적 증가량은 커지고, 얇은 만큼 작아진다. 직경 10μm, 깊이(막후) 2μm, 피치 20μm의 온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴을 작성했을 경우, 팽윤시에는, 온도 응답성 고분자의 체적 증가에 의해 구멍 패턴이 줄어들어, 직경 6μm, 깊이(막후) 6μm의 구멍 패턴이 되었다. 이에 대해, 직경 10μm, 깊이(막후) 5.5μm, 피치 20μm의 온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴을 작성했을 경우는, 팽윤시에는, 온도 응답성 고분자의 큰 체적 증가에 의해, 막후가 16μm가 되어, 한층 더 구멍 패턴을 완전하게 닫을 수가 있었다.
실시예 11
구멍 패턴의 깊이의 제어에 의한 세포 보관 유지율의 향상 실험
상기 포트리소그래피법으로 작성한 직경 10μm, 깊이(막후) 2μm의 온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴을 가지는 칩을 이용한 면역 세포의 보관 유지 실험에서는, 세포 보관 유지율이 약 16%였다. 세포나 염색체 등의 생체 재료는, 폴리스티렌 비즈나 금속 미립자 등과 비교하여, 부드럽게 변형하기 쉽다. 그 때문에, 구멍 패턴의 깊이가 얕으면 세포를 잡는 과정이나 세정 과정 등으로, 세포가 약간 변 형해 구멍으로부터 빠져 나와 버릴 가능성이 있다. 여기서, 구멍의 깊이를 변경(온도 응답성 고분자의 막후를 변경)하는 것으로, 세포 보관 유지율의 향상을 시도했다.
직경 10μm, 깊이(막후)를 2μm에서 3.5μm로 변경한 온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴을 가지는 칩을 상기 포트리소그래피법으로 작성하였다. 구멍의 깊이(막후)의 변경은, 스핀 도막 형성시의 도포 용액의 고분자 농도를 28 wt%로부터 33 wt%로 변경하는 것으로 하였다.
다음으로, 마우스로부터 꺼낸 임파구(B세포···직경 약 6μm)를 이용하여 임파구 1 개씩을 각각 분리해 칩 상으로 유지하는 것을 검토하였다. 처음에, 칩 온도를 고온(약 35℃)으로 유지한 상태로, 임파구 현탁액을 적하하여, 임파구의 자연 침강을 5분간 기다렸다. 다음에, 칩 온도를 저온(약 15℃)에 내리는 것으로, NIPAAm를 팽윤시켜,구멍 안에 들어온 임파구만을 잡았다. 이때, 깊이(막후) 2μm의 구멍 패턴의 칩에 비해, 3.5μm의 구멍 패턴의 칩은, 온도 응답성 고분자의 막후가 두껍기 때문에, 큰 체적 증가를 얻을 수 있어 면역 세포가 팽윤 한 온도 응답성 고분자에 완전하게 싸여 게다가 구멍도 완전하게 닫은 상태가 되었다(도 6).
또한, 본 실험에서 이용한 온도 응답성 고분자(1), 가교제(헥사 메톡시 메틸 멜라민), 산발생제(트리페닐술포늄트리플레이트)는, 모두 400 nm에서 600 nm의 빛에 대해서 투명·무형광이기 때문에, 온도 응답성 고분자에 매립된 세포에서도, 포커스 위치를, 파묻혀 있는 세포에 맞추면, 광학 현미경 관찰·형광 관찰이 용이하게 실시할 수 있었다.
실시예 12
그 후, 비커에 넣은 15℃의 PBS 버퍼로 칩을 세정해, 싸여 있지 않은 여분의 임파구를 씻어 흘렸다. 갇혀 있는 세포는, 플라스크 중에서 격렬하게 씻어도, 제대로 구멍 안에 보관 유지되고 있었다. 그 결과, 구멍 패턴 부분에만 1 개씩의 임파구를 각각 분리해 확실히 보관 유지할 수가 있었다(도 7). 이때의 세포 보관 유지율은, 약 87%에 향상했다. 또한, 팽윤 상태의 온도 응답성 고분자는 겔상으로 충분히 부드러워, 갇힌 세포를 훼손해 버리지도 않았다.
또한, 칩 온도를 고온( 약 35℃)에 되돌리면, 온도 응답성 고분자는 수축하여, 다시 임파구를 해방할 수가 있었다. 게다가 캐필러리에 의한 흡인에 의해, 칩 상으로부터 임의의 임파구 1개만을 회수하는 것을 시도하였다. 회수시에는, 칩 온도를 고온으로 하는 것으로, 구멍이 다시 넓어져서, 구멍의 높이도 낮아지는 것으로부터, 회수용 캐필러리의 선단을 임파구에 용이하게 접근시킬 수가 있어 확실히 임파구를 회수할 수가 있었다.
다음에, 직경 10μm, 깊이(막후)를 10μm로 변경한 온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴을 가지는 칩을 상기 포트리소그래피법으로 작성했다. 면역 세포의 보관 유지 실험에서는, 1개의 구멍에 임파구가 2개 들어가 버려서, 구멍 패턴 부분에만 1 개씩의 임파구를 각각 분리해 보관 유지할 수가 없었다.
직경 6μm의 면역 세포(B임파구)를 구멍 패턴 부분에만 1 개씩 각각 분리해 보관 유지하려면, 구멍의 깊이가 1.5μm이상 9μm이하인 것이 바람직하였다. 또한, 높은 세포 보관 유지율을 얻기 위해서, 3μm이상 9μm이하인 것이 보다 바람직하였 다.
실시예 13
구멍 패턴의 직경의 제어에 의한 세포 보관 유지의 검토
직경 5μm, 깊이(막후) 3.5μm의 온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴을 가지는 칩을 상기 포트리소그래피법으로 작성하였다. 구멍의 직경의 변경은, 포트리소그래피 공정으로 이용하는 마스크 패턴을 변경하는 것으로 행하였다. 면역 세포의 보관 유지 실험에서는, 구멍의 직경이 너무 작아 임파구가 들어가지 않아서, 구멍 패턴 부분에 1 개씩의 임파구를 각각 분리해 보관 유지할 수가 없었다.
직경 15μm, 깊이(막후) 3.5μm의 온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴을 가지는 칩을 상기 포트리소그래피법으로 작성하였다. 구멍의 직경의 변경은, 포트리소그래피 공정으로 이용하는 마스크 패턴을 변경하는 것으로 행하였다. 면역 세포의 보관 유지 실험에서는, 1개의 구멍에 임파구가 3개 들어가 버려서, 구멍 패턴 부분에만 1 개씩의 임파구를 각각 분리해 보관 유지할 수가 없었다.
직경 6μm의 면역 세포(B임파구)를 구멍 패턴 부분에만 1 개씩 각각 분리해 지키려면 , 구멍의 직경이 6μm이상 12μm이하인 것이 바람직하였다.
임의의 복수 개의 세포 보관 유지의 검토
온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴의 크기나 형상, 깊이를 제어하는 것으로, 임의의 수의 면역 세포나 비즈를 1개의 구멍 안으로 유지할 수가 있다. 구멍의 크기나 형상은, 포트리소그래피 공정으로 이용하는 마스크 패턴을 변경하는 것으로 실시하여, 구멍의 깊이(막후)의 변경은, 스핀 도포 조건을 변경하는 것으로 용이하 게 실시할 수 있다.
온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴의 형상을, 장변 15μm, 단변 8μ의 직사각형, 깊이(막후) 3. 5μm로 한 칩을 상기 포트리소그래피법으로 작성하였다. 면역 세포의 보관 유지 실험에서는, 1개의 구멍에 임파구를 확실히 2개 보관 유지할 수가 있었다(도 8).
1개의 구멍 안에 임의의 수의 면역 세포를 가두는 것에 의해, 복수 세포 간의 상호작용의 해석, 복수 세포 간의 세포 융합 등을, 기판상의 임의의 위치에서, 효율적이고 선택적으로, 관찰하면서 용이하게 실시할 수가 있었다.
실시예 14
구멍 구조의 뚜껑으로서의 검토
직경 10μm, 깊이(막후) 3μm의 온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴을, 실리콘 웨이퍼 상에 상기 포트리소그래피법으로 작성했다. 다음에, DeepRIE를 이용하여, 온도 응답성 고분자의 구멍 패턴을 통해 노출하고 있는 실리콘부를 수직 방향으로 7μm드라이 에칭했다. 이때, 온도 응답성 고분자 자체는 드라이 에칭 처리에 의해 1μm수직 방향으로 깎아져 막후는 2μm가 되었다. 이 공정을 도 9에 나타낸다.
상기 공정에 의해 작성한, 온도 응답성 고분자를 구멍 구조의 뚜껑으로서 가지는 칩을 이용해 세포의 보관 유지 실험을 실시했다. 처음에, 칩 온도를 고온( 약 35℃)으로 유지해, 온도 응답성 고분자에 의한 뚜껑이 개방되어 있는 상태로, 임파구 현탁액을 적하하여, 임파구의 자연 침강을 5분간 기다렸다. 다음에, 칩 온도를 저온( 약 15℃)으로 내리는 것으로, 온도 응답성 고분자를 팽윤시켜, 온도 응답성 고분자에 의한 뚜껑이 닫혀 있는 상태로 하였다. 그 후, 비커에 넣은 15℃의 PBS 버퍼로 칩을 세정해, 구멍에 들어가 있지 않은 여분의 임파구를 씻어 흘렸다. 그 결과, 구멍 패턴 부분에만 1 개씩의 임파구를 각각 분리해 보관 유지할 수가 있었다. 이때의 세포 보관 유지율은, 약 85%였다. 또, 칩 온도를 고온( 약 35℃)에 되돌리면, 온도 응답성 고분자에 의한 뚜껑은 개방된 상태가 되어, 캐필러리에 의해 임파구를 흡인 회수할 수가 있었다.
실시예 15
감광성을 가지는 온도 응답성 고분자 도포 수용액의 제작(유기용제를 사용하지 않음)
상기로 합성한 온도 응답성 고분자(1) 100 중량부와 가교제로서 헥사 메톡시 메틸 멜라민 10 중량부와 광산발생제로서 트리메틸술포늄트리플레이트 1 중량부를, 용매로서 15℃의 물 250 중량부에 용해시키고, 이것을 구멍 지름 0.40μm의 필터를 이용해 여과하여, 도포 용액으로 하였다.
산소 플라스마로 표면 처리한 폴리 메틸 메타크릴레이트 기판상에, 상기의 도포 용액을 스핀 코터의 회전 속도 500 rpm로 스핀 도포하였다. 도포 후 90℃으로 30분간 가열 처리해 용매를 휘발시키고 도막을 얻었다. 고압 수은 램프를 광원으로 하는 마스크얼라이너를 이용해, 마스크를 개입시켜 이 도막에 노광을 실시하였다. 노광 후의 가열에 의한 가교 반응 후, 15℃의 물을 이용하여, 미가교 부분을 용해 제거하는 현상 처리를 1분간 행하였다. 그 결과, 직경 10μm의 온도 응답성 고분자 에 의한 구멍 패턴을 250,000개/cm2의 밀도로 기판상에 제작하였다. 도포 용매에 물을 사용하기 때문에, 스핀 도포시에, 플라스틱 소재인 폴리 메틸 메타크릴레이트 기판이 용매에 의해 침범되는 것이 없었다. 또한, 물에 의한 현상시에도, 모든 구성 성분이 수용성인 이유로, 찌꺼기 없이 양호하게 실시할 수가 있었다.
실시예 16
생체 유래의 온도 응답성 고분자를 이용한 칩의 제작
생체 유래의 온도 응답성 고분자인 가용성 에라스틴(소(牛) 유래) 100 중량부와, 광가교제로서 수용성 비스아지드 화합물인 4,4＇－디아조스틸벤 2, 2＇디슬폰산디나트륨염 10 중량부를, 용매인 증류수 1000 중량부에 용해하여, 이것을 구멍 지름 0.40μm의 필터를 이용해 여과하여, 도포 용액으로 하였다.
히드록실기를 말단에 가지는 실란커플링제로 표면 처리한 유리 기판상에, 상기의 도포 용액을 스핀 코터의 회전 속도 500 rpm로 스핀 도포했다. 도포 후 80℃으로 10분간 가열 처리해 용매를 휘발시키고 도막을 얻었다. 고압 수은 램프를 광원으로 하는 마스크얼라이너를 이용해, 마스크를 개입시켜 이 도막에 노광을 실시하였다. 노광에 의한 가교 반응의 뒤, 15℃의 물을 이용하여, 미가교 부분을 용해 제거하는 현상 처리를 2분간 행하였다. 그 결과, 직경 10μm의 생체 유래의 온도 응답성 고분자에 의한 구멍 패턴이 250, 000개/cm2의 밀도로 기판상에 제작되었다.
상기 포트리소그라피법에 따라 작성한 구멍 패턴을 가지는 칩 상에 물을 적하한 후, 여러 가지의 온도로 칩을 유지하면서, 구멍의 크기의 변화를 관찰했다. 칩 온도를 38℃으로 하면, 온도 응답성 고분자는 수축하여, 구멍 패턴의 직경은 약 10μm가 되었다. 칩 온도를 15℃로 하면, 온도 응답성 고분자가 팽윤하기 시작해 약 10초 후에는, 구멍 패턴의 직경은 8μm로 줄어들었다. 또한 이 수축·팽윤 거동은, 칩 온도의 변화에 수반하여, 몇 번이나 반복해 실시할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 의하면, 감열 응답성을 가지는 재료를 이용하여, 세포를 뿌릴 때 및 회수할 때는 세포가 구멍으로부터 출입이 용이하고, 세정시나 항원 자극시는 구멍으로부터 나오기 어려운 기구, 구조를 가지는 새로운 세포용의 칩을 제공할 수가 있다.
본 발명에 따른 칩은, 생체 재료를 일시적으로 고정화할 필요가 있는, 여러 가지의 기술 분야, 예를 들면, 다수의 임파구로부터 특정의 항원 특이적인 임파구를 선택하여, 항체를 작성하는 방법 등에, 유용하다.

Claims (28)

  1. 온도 응답성 고분자의 가교 생성물을 구성 성분으로 하며, 구멍 패턴을 가지는 막을 기판 표면에 가지는 칩.
  2. 제1항에 있어서, 상기 온도 응답성 고분자의 가교 생성물이, 온도 응답성 고분자 간의 가교 생성물 또는 가교제를 통한 가교 생성물인 것을 특징으로 하는 칩.
  3. 제1항에 있어서, 상기 온도 응답성 고분자의 가교 생성물은, 하기 화학식 1에서 나타나는 반복 단위를 가지며, 중량 평균 분자량이 500 ∼ 5,000,000인 N－알킬(메타) 아크릴 아미드 공중합체와 가교제와의 가교 생성물인 것을 특징으로 하는 칩;
    [화학식 1]
    Figure 112013039790736-pct00005
    상기 화학식 1에 있어서, R1 및 R2는, 같거나 또는 다르게, 수소 원자 또는 탄소수 1에서 4의 알킬기를 나타내고, R3는 수소 원자 또는 메틸기를 나타내며, R4는 상기 가교제와 가교 가능한 관능기를 가지는 탄화수소 구조를 나타내고, x 및 y는, 각각 x＋y=1, 0＜x＜1, 0＜y＜1을 만족하는 임의의 수이다.
  4. 제1항에 있어서, 상기 구멍 패턴을 가지는 막의 두께는, 10 nm ∼ 100μm의 범위인 것을 특징으로 하는 칩.
  5. 제1항 있어서, 상기 구멍 패턴의 구멍의 크기는, 내접 하는 원의 직경이 10 nm ∼ 1000μm의 범위인 것을 특징으로 하는 칩.
  6. 제1항에 있어서, 상기 구멍 패턴의 구멍의 깊이가, 10 nm ∼ 100μm의 범위인 것을 특징으로 하는 칩.
  7. 제1항에 있어서, 상기 구멍 패턴의 구멍은, 1 cm2 당 1개 ∼1,000,000,000개인 것을 특징으로 하는 칩.
  8. 제1항에 있어서, 상기 기판은, 막을 가지는 표면에 막이 가지는 적어도 일부의 구멍의 하부에 상당하는 부분에 요(凹)부를 가지는 것을 특징으로 하는 칩.
  9. 제1항에 있어서, 상기 구멍 패턴의 구멍은, 그 중의 기판 표면상에, 막과는 독립한 상기 온도 응답성 고분자의 가교 생성물로 형성된 도트를 가지는 것을 특징으로 하는 칩.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 막온도의 일부분, 또는 전체를 변화시키는 것으로, 막의 일부분, 또는 전체를 팽윤 또는 수축시켜, 구멍 패턴의 구멍의 크기를 임의로 변화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 칩.
  11. 제10항에 있어서, 상기 구멍 패턴의 구멍에 격납된 생체 물질을, 막온도의 변화에 의해, 구멍 패턴의 구멍에 관하여 포접한 상태로 하거나, 해방한 상태로 하는 것을 특징으로 하는 칩.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나에 따른 칩의 막온도를, 상기 칩이 가지는 구멍 패턴의 구멍의 지름이 생체 물질이 격납 가능한 크기가 되는 온도로 제어하고,
    상기 구멍 패턴의 구멍에 생체 물질을 격납하고, 그 다음
    상기 칩의 막온도를, 상기 생체 물질을 격납한 구멍의 지름을 생체 물질이 포접되는 온도로 제어함을 포함하는 것을 특징으로 하는, 칩의 구멍 패턴에 생체 물질을 포접하는 방법.
  13. 제12항에 따른 방법으로 생체 물질을 포접한 칩의 막온도를, 상기 칩이 가지는 구멍 패턴의 구멍의 지름이, 생체 물질을 해방 가능한 크기가 되는 온도로 제어함을 포함하는 것을 특징으로 하는, 칩에 포접된 생체 물질을 해방시키는 방법.
  14. 온도 응답성 고분자의 가교 생성물을 구성 성분으로 하며, 구멍 패턴을 가지는 막을 기판 표면에 가지는 칩의 제조 방법으로서,
    가교 가능한 온도 응답성 고분자를 함유하는 조성물, 가교 가능한 온도 응답성 고분자 및 가교제를 함유하는 조성물, 또는 온도 응답성 고분자 및 가교제를 포함한 조성물을 기판 표면에 도포하여 도막을 형성하고,
    상기 도막을 가교 시켜, 상기 가교 생성물을 생성하며, 및
    상기 가교 생성물의 도막에 구멍 패턴을 형성하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 가교 가능한 온도 응답성 고분자 및 가교제를 함유 하는 조성물, 또는 온도 응답성 고분자 및 가교제를 함유하는 조성물은, 하기 화학식 1에서 나타나는 반복 단위를 가지며, 중량 평균 분자량이 500 ∼ 5,000,000인 N－알킬(메타) 아크릴 아미드 공중합체와 가교제를 함유하는 조성물인 것을 특징으로 하는 제조방법;
    [화학식 1]
    Figure 112013039790736-pct00006
    상기 화학식 1에 있어서, R1 및 R2는, 같거나 또는 다르게, 수소 원자 또는 탄소수 1에서 4의 알킬기를 나타내며, R3는 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고, R4는, 상기 가교제와 가교 가능한 관능기를 가지는 탄화수소 구조를 나타내며, x 및 y는, 각각 x＋y=1, 0＜x＜1, 0＜y＜1을 만족하는 임의의 수이고, 여기서, (메타) 아크릴 아미드란, 메타크릴 아미드와 아크릴 아미드의 양쪽 모두를 나타낸다.
  16. 온도 응답성 고분자의 가교 생성물을 구성 성분으로 하고, 또한 구멍 패턴을 가지는 막을 기판 표면에 가지는 칩의 제조 방법으로서,
    가교 가능한 온도 응답성 고분자 형성용 모노머를 함유하는 조성물, 가교 가능한 온도 응답성 고분자 형성용 모노머 및 가교제를 함유하는 조성물, 또는 온도 응답성 고분자 형성용 모노머 및 가교제를 포함한 조성물을 기판 표면에 도포하여 도포막을 형성하고,
    도막을 중합 및 가교 시켜, 상기 가교 생성물을 생성하며, 및
    상기 가교 생성물의 도막에 구멍 패턴을 형성하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물을 도포하는 기판은, 실리콘 기판, 유리 기판, 플라스틱 기판, 마이카 기판, 세라믹 기판, 또는 금속 기판인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  18. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물의 기판에의 도포는, 조성물을 용제에 용해하는 공정, 수득된 용액을 기판상에 적하하는 공정, 및 용매를 증발시키고 도막을 얻는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  19. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 도막에의 구멍 패턴의 형성은, 포트리소그래피법에 의해 실시하는 것을 특징으로 하는 제조 방법
  20. 제19항에 있어서, 상기 포트리소그래피법에 따르는 도막에의 구멍 패턴의 형성은, 상기 도막 형성용의 조성물에 한층 더 산 발생제를 함유시켜, 도막 형성 후, 도막에 구멍 패턴 형성용 마스크를 개입시키고, 산 발생제를 활성화 시키는 방사선을 조사하여, 방사선이 조사된 부분의 도막을 가교시키고, 그 다음, 상기 마스크를 제거한 후에, 미가교 부분의 도막을 제거하는 것에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 산발생제는, 오늄염, 술포닐옥시이미드, 트리아진 및 설폰산 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 방사선이, 수은 램프광, 전자선, 엑시머 레이져(excimer laser), X선, 또는 크세논램프인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  23. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 도막에의 구멍 패턴의 형성은, 스크린 인쇄법, 잉크젯법, 컨택트 프린트법 또는 엠보싱 가공법에 의해 실시하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 스크린 인쇄법, 잉크젯법, 컨택트 프린트법 또는 엠보싱 가공법에 따르는 도막에의 구멍 패턴의 형성은, 가교 전의 도막에 구멍 패턴을 형성하고, 그 다음에 구멍 패턴을 형성한 도막을 가교 시키는 것으로 실시되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  25. 제15항에 있어서, 상기 가교제와 가교 가능한 관능기를 가지는 탄화수소 구조는, 상기 가교제와 가교 가능한 관능기를 측쇄에 가지는(메타) 아크릴레이트 구조 또는(메타) 아크릴 아미드 구조(여기서, (메타) 아크릴레이트란, 메타크릴레이트와 아크릴레이트의 양쪽 모두를 나타낸다)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  26. 제15항 또는 제25항에 있어서, 상기 가교제와 가교 가능한 관능기는, 히드록실기, 카르복시기, 에폭시기, 아미노기 또는 숙신이미드기인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  27. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 가교제는, 에폭시계 가교제, 멜라민계 가교제, 그리코우릴계 가교제, 히드록실기, 카르복실기, 아지드기 또는 비닐 에테르기를 2개 이상 가지는 화합물인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서 상기 히드록실기, 카르보키실기, 아지드기 또는 비닐 에테르기를 2개 이상 가지는 화합물은,
    1, 2－디히드록시 나프타렌, 1, 3－디히드록시 나프타렌, 1, 4－디히드록시 나프타렌, 1, 5－디히드록시 나프타렌, 1, 6－디히드록시 나프타렌, 1, 7－디히드록시 나프타렌, 1, 8－디히드록시 나프타렌, 2, 3－디히드록시 나프타렌, 2, 6－디히드록시 나프타렌, 2, 7－디히드록시 나프타렌, 1, 3－시클로 펜 탄 디올, 2, 6－키놀린 디올, 2, 3－디히드록시퀴녹살린, 1, 4－디옥산 디올, 1, 4－시크로헥산디메탄올, 폴리비닐 알코올, 1, 2－나프타렌디카르본산, 1, 3－나프타렌디카르본산, 1, 4－나프타렌디카르본산, 1, 5－나프타렌디카르본산, 1, 6－나프타렌디카르본산, 1, 7－나프타렌디카르본산, 1, 8－나프타렌디카르본산, 2, 3－나프타렌디카르본산, 2, 6－나프타렌디카르본산, 시크로헥산디카르본산, 테레프탈산, 1, 2－시크로펜탄디카르본산, 2, 5－치오펜디카르본산, 2－메틸-3, 4－퀴놀린디카르본산, 9, 10－안트라센디카르본산, 디히드로안트라센 9, 10－디카르본산, 구연산, 호박산, 폴리 아크릴산, 폴리 메타크릴산, 2, 6－비스(4－아지드벤지리덴) 시클로헥사논, 비스(4－비닐옥시부틸) 테레프탈레이트 또는 비스(4－비닐옥시부틸) 아디페이트인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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