CN102747028B - 培养层及其制备方法和应用该培养层制备移植体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种培养层，用于培养细胞。该培养层包括一碳纳米管结构以及设置于该碳纳米管结构表面的具有吸附细胞特性的生长因子层。所述培养层进一步包括一疏水性基底以及一蛋白质层。所述碳纳米管结构设置于所述疏水性基底的表面。所述蛋白质层层叠设置于所述碳纳米管结构的表面。本发明还涉及一种上述培养层的制备方法，以及一种使用上述培养层的移植体的制备方法。

Description

培养层及其制备方法和应用该培养层制备移植体的方法

技术领域

本发明涉及一种培养层及其制备方法和应用，尤其是涉及一种可用于培养细胞的培养层及其制备方法，以及应用该培养层制备可以植入生物体的移植体的方法。

背景技术

在社会生活中，各种事故或灾害会不可避免造成生物体损伤，尤其是会损伤皮肤或神经系统。

目前，临床上对于大面积深度皮肤缺损等患者的创面修复治疗，一般采用皮肤移植的方法治疗。其中，皮肤移植大都采用自体植皮、自体皮浆或异体供皮等方法，存在皮源较少、取皮植皮方法繁锁、患者痛苦较大等问题。

神经系统受损会引起神经缺损，神经缺损是临床常见的致残性疾病。通常采用神经管“桥接”神经系统受损部位两端，该神经管是神经系统受损部位的神经细胞的承载体，受损部位的神经细胞(neurons)的神经突起(neurite)受到损伤，通过该神经管的支撑，该神经系统受损部位一端的神经细胞的神经突起沿所述神经管内壁生长，从而通过受损神经细胞的自我修复来完成受损神经系统的修复。然，当受损部位的神经细胞是死亡时，通过植入上述神经管是不能修复受损的神经系统的。

发明内容

有鉴于此，确有必要提供一种培养层及其制备方法和应用该培养层的移植体的制备方法，所述培养层和由该培养层的制备方法制备出的培养层具有良好的弹性及延展性，可以用于培养细胞。由上述移植体的制备方法制备得到的移植体包括生物组织能够植入体内，完成受损部分的修复。

一种培养层，用于培养细胞，其包括：一碳纳米管结构以及一设置于该碳纳米管结构表面的具有吸附细胞特性的生长因子层。

一种培养层，用于培养细胞，其包括：一疏水性基底、一碳纳米管结构、一蛋白质层以及一生长因子层。所述疏水性基底为硅胶基底或表面涂覆有硅胶的柔性基底。所述碳纳米管结构设置于所述疏水性基底的表面。所述蛋白质层层叠设置于所述碳纳米管结构的表面。所述生长因子层具有吸附细胞的特性，且设置于所述蛋白质层的表面。

一种培养层的制备方法，该培养层用于培养细胞，其包括：提供一碳纳米管结构；以及在所述碳纳米管结构的表面形成一具有吸附细胞特性的生长因子层。

一种培养层的制备方法，该培养层用于培养细胞，其包括：提供一碳纳米管结构；采用蛋白质溶液浸润所述碳纳米管结构，从而在该碳纳米管结构的表面形成一蛋白质层；以及在所述蛋白质层的表面形成一具有吸附细胞特性的生长因子层。

一种移植体的制备方法，其包括如下步骤：提供一培养层，该培养层包括一碳纳米管结构及设置在该碳纳米管结构表面的一具有吸附细胞特性的生长因子层；在该生长因子层表面种植多个细胞；以及培养所述多个细胞直到该多个细胞生长形成一生物组织。

一种移植体的制备方法，其包括如下步骤：提供一碳纳米管结构；用蛋白质溶液浸润所述碳纳米管结构，从而在所述碳纳米管结构表面形成一蛋白质层；对该蛋白质层进行灭菌处理；用多聚赖氨酸溶液处理所述蛋白质层；采用层粘连蛋白溶液浸润所述蛋白质层，从而在所述蛋白质层的表面形成一层粘连蛋白层；在所述层粘连蛋白质层表面种植多个神经细胞；以及培养该多个神经细胞直到该多个神经细胞相互连接形成一神经网络。

与现有技术相比较，本发明提供的培养层以及由培养层的制备方法制备出的培养层包括碳纳米管结构以及具有吸附细胞特性的生长因子层。所述生长因子具有亲水性，可以吸附细胞，因此该培养层可以用来培养细胞，为细胞的生长提供一个良好的场所。所述碳纳米管结构具有弹性佳、延展性良好、质量轻等优点，因此，所述培养层可根据受损组织的受损部位的形状、大小进行裁剪、拉伸。由本发明提供的使用所述培养层制备移植体的方法制备的移植体可根据受损组织的受损部位的形状、大小进行裁剪、拉伸并植入受损部位。所述移植体包括生物组织，该生物组织中的细胞与所述受损部位两端或边缘的细胞的距离较近，因此该植入体中的细胞与受损部位边缘的细胞可以重新建立联系，完成受损部位的修复。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的移植体的制备方法的流程示意图。

图2为本发明实施例采用的一碳纳米管絮化膜的扫描电镜照片。

图3为本发明实施例采用的一碳纳米管碾压膜的扫描电镜照片。

图4为本发明实施例采用的一碳纳米管拉膜的扫描电镜照片。

图5为本发明实施例采用的多层层叠设置的碳纳米管拉膜的扫描电镜照片。

图6为本发明实施例所采用的多层层叠设置的碳纳米管拉膜的透射电镜照片。

图7为本发明实施例采用的一非扭转的碳纳米管线的扫描电镜照片。

图8为本发明实施例采用的一扭转的碳纳米管线的扫描电镜照片。

图9为采用本发明实施例所提供的移植体的方法制备的移植体的侧视示意图。

图10为图9中的移植体的俯视示意图。

图11为本发明实施例所提供的培养层的透射电镜照片。

图12为本发明实施例所采用的种植在培养层上的神经细胞分化出多个神经突起时的扫描电镜照片。

图13为本发明实施例所采用的种植在培养层上的神经细胞分化出多个神经突起时通过荧光染色后的光学显微镜照片。

图14为本发明实施例所提供的未经染色的移植体的扫描电镜照片。

图15为本发明实施例所提供的移植体通过荧光染色后的光学显微镜照片。

主要元件符号说明

移植体	100
		培养层	10
疏水性基底	11
		碳纳米管结构	12
蛋白质层	14
		生长因子层	16
生物组织	20
		神经细胞	21
胞体	22
		神经突起	24

如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。

具体实施方式

请参阅图1，本发明提供一种移植体的制备方法，其包括：

S10，提供一培养层，该培养层包括一碳纳米管结构及设置在该碳纳米管结构表面的一具有吸附细胞特性的生长因子层；

S20，在所述生长因子层表面种植多个细胞；以及

S30，培养所述多个细胞直到该多个细胞生长形成一生物组织。

在所述步骤S10中，所述碳纳米管结构由多个碳纳米管组成。优选地，所述多个碳纳米管之间通过范德华力连接，从而形成一自支撑结构。所谓“自支撑”即该碳纳米管结构不需要大面积的载体支撑，而只要相对两边提供支撑力即能整体上悬空而保持自身特定的形状，即将该碳纳米结构置于（或固定于）间隔设置的两个支撑体上时，位于两个支撑体之间的碳纳米管结构能够悬空保持自身特定的形状。由于该自支撑的碳纳米管结构中大量的碳纳米管通过范德华力相互吸引，从而使该碳纳米管结构具有特定的形状，形成一自支撑结构。由于所述碳纳米管结构基本由碳纳米管组成且碳纳米管之间通过范德华力连接，因此所述碳纳米管结构具有弹性佳、延展性良好及质量轻等优点，便于裁剪和拉伸。所述碳纳米管结构为自支撑结构时，该碳纳米管结构可以为碳纳米管膜状结构或碳纳米管线状结构。该碳纳米管膜结构可为由至少一碳纳米管膜形成的膜状结构或由至少一碳纳米管线通过弯折、相互交叉、编织或纺织等方式形成碳纳米管膜状结构。当所述碳纳米管膜结构包括多个碳纳米管膜时，该多个碳纳米管膜层叠设置，相邻的碳纳米管膜之间通过范德华力相结合。当该碳纳米管膜结构由碳纳米管膜组成时，该碳纳米管膜结构中的多个碳纳米管的延伸方向可基本平行于该碳纳米管膜结构的表面。所述碳纳米管线状结构可为由至少一碳纳米管线组成的线状结构，当所述碳纳米管线状结构包括多个碳纳米管线时，该多个碳纳米管线可以相互交叉或编织等方法形成该碳纳米管线状结构。

请参阅图2，所述碳纳米管膜可为一碳纳米管絮化膜，该碳纳米管絮化膜为将一碳纳米管原料絮化处理获得的一自支撑的碳纳米管膜。该碳纳米管絮化膜包括相互缠绕且均匀分布的碳纳米管。碳纳米管的长度大于10微米，优选为200微米到900微米，从而使碳纳米管相互缠绕在一起。所述碳纳米管之间通过范德华力相互吸引、分布，形成网络状结构。由于该自支撑的碳纳米管絮化膜中大量的碳纳米管通过范德华力相互吸引并相互缠绕，从而使该碳纳米管絮化膜具有特定的形状，形成一自支撑结构。所述碳纳米管絮化膜各向同性。所述碳纳米管絮化膜中的碳纳米管为均匀分布，无规则排列，形成大量尺寸在1纳米到450纳米之间的间隙或微孔。所述间隙或微孔能够增加所述碳纳米管膜的比表面积及浸润更多的蛋白质。所述碳纳米管絮化膜及其制备方法请参见申请人于2007年4月13日申请的，于2008年10月15日公开的第CN101284662A号中国专利申请“碳纳米管薄膜的制备方法”，申请人：清华大学，鸿富锦精密工业（深圳）有限公司。

所述碳纳米管膜可为一碳纳米管碾压膜，该碳纳米管碾压膜为通过碾压一碳纳米管阵列获得的一种具有自支撑性的碳纳米管膜。该碳纳米管碾压膜包括均匀分布的碳纳米管，碳纳米管沿同一方向或不同方向择优取向排列。所述碳纳米管碾压膜中的碳纳米管相互部分交迭，并通过范德华力相互吸引，紧密结合，使得该碳纳米管膜具有很好的柔韧性，可弯曲折迭成任意形状而不破裂。且由于碳纳米管碾压膜中的碳纳米管之间通过范德华力相互吸引，紧密结合，使碳纳米管碾压膜为一自支撑的结构。所述碳纳米管碾压膜中的碳纳米管与形成碳纳米管阵列的生长基底的表面形成一夹角β，其中，β至少为0度且小于等于15度，该夹角β与施加在碳纳米管阵列上的压力有关，压力越大，该夹角越小，优选地，该碳纳米管碾压膜中的碳纳米管平行于该生长基底排列。该碳纳米管碾压膜为通过碾压一碳纳米管阵列获得，依据碾压的方式不同，该碳纳米管碾压膜中的碳纳米管具有不同的排列形式。具体地，碳纳米管可无序排列；请参阅图3，当沿不同方向碾压时，碳纳米管沿不同方向择优取向排列；当沿同一方向碾压时，碳纳米管沿一固定方向择优取向排列。该碳纳米管碾压膜中碳纳米管的长度大于45微米。

该碳纳米管碾压膜的面积与碳纳米管阵列的尺寸基本相同。该碳纳米管碾压膜厚度与碳纳米管阵列的高度以及碾压的压力有关，可为0.5纳米到100微米之间。可以理解，碳纳米管阵列的高度越大而施加的压力越小，则制备的碳纳米管碾压膜的厚度越大；反之，碳纳米管阵列的高度越小而施加的压力越大，则制备的碳纳米管碾压膜的厚度越小。所述碳纳米管碾压膜之中的相邻的碳纳米管之间具有一定间隙，从而在碳纳米管碾压膜中形成多个尺寸在1纳米到450纳米之间的间隙或微孔。所述间隙或微孔能够增加所述碳纳米管膜的比表面积及浸润更多的蛋白质。所述碳纳米管碾压膜及其制备方法请参见申请人于2007年6月1日申请的，于2008年12月3日公开的第CN101314464A号中国专利申请“碳纳米管薄膜的制备方法”，申请人：清华大学，鸿富锦精密工业（深圳）有限公司。

所述碳纳米管膜可为一碳纳米管拉膜，所述碳纳米管拉膜是由若干碳纳米管组成的自支撑结构。请参阅图4，所述若干碳纳米管为沿该碳纳米管拉膜的长度方向择优取向排列。所述择优取向是指在碳纳米管拉膜中大多数碳纳米管的整体延伸方向基本朝同一方向。而且，所述大多数碳纳米管的整体延伸方向基本平行于碳纳米管拉膜的表面。

进一步地，所述碳纳米管拉膜中多数碳纳米管是通过范德华力首尾相连。具体地，所述碳纳米管拉膜中基本朝同一方向延伸的大多数碳纳米管中每一碳纳米管与在延伸方向上相邻的碳纳米管通过范德华力首尾相连。当然，所述碳纳米管拉膜中存在少数偏离该延伸方向的碳纳米管，这些碳纳米管不会对碳纳米管拉膜中大多数碳纳米管的整体取向排列构成明显影响。所述自支撑为碳纳米管拉膜不需要大面积的载体支撑，而只要相对两边提供支撑力即能整体上悬空而保持自身膜状状态，即将该碳纳米管拉膜置于（或固定于）间隔一定距离设置的两个支撑体上时，位于两个支撑体之间的碳纳米管拉膜能够悬空保持自身膜状状态。所述自支撑主要通过碳纳米管拉膜中存在连续的通过范德华力首尾相连延伸排列的碳纳米管而实现。具体地，所述碳纳米管拉膜中基本朝同一方向延伸的多数碳纳米管，并非绝对的直线状，可适当的弯曲；或者并非完全按照延伸方向上排列，可适当的偏离延伸方向。因此，不能排除碳纳米管拉膜的基本朝同一方向延伸的多数碳纳米管中并列的碳纳米管之间可能存在部分接触。具体地，该碳纳米管拉膜包括多个连续且定向排列的碳纳米管片段。该多个碳纳米管片段通过范德华力首尾相连。每一碳纳米管片段由多个相互平行的碳纳米管组成。该碳纳米管片段具有任意的长度、厚度、均匀性及形状。该碳纳米管拉膜具有较好的透光性，可见光透过率可达到75%以上。所述碳纳米管拉膜及其制备方法具体请参见申请人于2007年2月9日申请的，于2010年5月26日公告的第CN101239712B号中国公开专利“碳纳米管膜结构及其制备方法”。为节省篇幅，仅引用于此，但上述申请所有技术揭露也应视为本发明申请技术揭露的一部分。

请参阅图5及图6，当该碳纳米管结构包括多个碳纳米管拉膜时，所述多个碳纳米管拉膜层叠设置形成一层状结构。该层状结构的厚度不限，相邻的碳纳米管拉膜通过范德华力结合。优选地，所述层状结构包括的碳纳米管膜的层数小于或等于10层。该层状结构中相邻的碳纳米管拉膜中的碳纳米管之间具有一交叉角度α，且该α大于0度且小于等于90度。当相邻的碳纳米管拉膜中的碳纳米管之间具有所述交叉角度α时，所述多个碳纳米管拉膜中的碳纳米管相互交织形成一网状结构，使所述碳纳米管结构的机械性能增加。如，所述碳纳米管结构包括多层碳纳米管拉膜层叠设置，且相邻的碳纳米管拉膜中的碳纳米管之间的交叉角度α大致等于90度，即，相邻碳纳米管拉膜中的碳纳米管的延伸方向大致垂直。

所述碳纳米管线可以为非扭转的碳纳米管线。请参阅图7，该非扭转的碳纳米管线包括大多数沿该非扭转的碳纳米管线轴向方向平行排列的碳纳米管。非扭转的碳纳米管线可通过将碳纳米管膜通过有机溶剂处理得到。所述碳纳米管膜包括多个碳纳米管片段，该多个碳纳米管片段通过范德华力首尾相连，每一碳纳米管片段包括多个相互平行并通过范德华力紧密结合的碳纳米管。该碳纳米管片段具有任意的长度、厚度、均匀性及形状。该非扭转的碳纳米管线长度不限，直径为0.5纳米-1毫米。具体地，可将挥发性有机溶剂浸润所述碳纳米管膜的整个表面，在挥发性有机溶剂挥发时产生的表面张力的作用下，碳纳米管膜中的相互平行的多个碳纳米管通过范德华力紧密结合，从而使碳纳米管膜收缩为一非扭转的碳纳米管线。该挥发性有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、二氯乙烷或氯仿，本实施例中采用乙醇。通过挥发性有机溶剂处理的非扭转碳纳米管线与未经挥发性有机溶剂处理的碳纳米管膜相比，比表面积减小，粘性降低。

所述碳纳米管线可以为扭转的碳纳米管线。请参阅图8，该扭转的碳纳米管线包括大多数绕该扭转的碳纳米管线轴向螺旋排列的碳纳米管。该碳纳米管线可采用一机械力将所述碳纳米管膜两端沿相反方向扭转获得。进一步地，可采用一挥发性有机溶剂处理该扭转的碳纳米管线。在挥发性有机溶剂挥发时产生的表面张力的作用下，处理后的扭转的碳纳米管线中相邻的碳纳米管通过范德华力紧密结合，使扭转的碳纳米管线的比表面积减小，密度及强度增大。

所述碳纳米管线及其制备方法请参见范守善等人于2002年9月16日申请的，2008年8月20日公告的，公告号为CN100411979C的中国专利；以及于2005年12月16日申请的，2009年6月17日公告的，公告号为CN100500556C的中国专利。

所述生长因子层设置在所述碳纳米管结构的一个表面或两个相对设置的表面。该生长因子层不仅可以使得所述碳纳米管层具有亲水性及生物兼容性，还具有吸附细胞的特性，可以提高所述细胞与所述培养层的附着性，促进细胞的生长。所述生长因子可以为细胞外基质蛋白(Extracellular Matrixc Protein)，该细胞外基质蛋白具有粘着细胞的功能。其中，该细胞外基质蛋白可以为层粘连蛋白(Laminin)或纤连蛋白(Fibronectin)。

在所述培养层中，并不是所有碳纳米管的表面均要形成有所述生长因子层，但，只要位于需培养细胞的碳纳米管结构的表面的部分碳纳米管浸润有生长因子溶液，即可在所述碳纳米管结构表面形成生长因子层，使所述碳纳米管结构具有亲水性及生物兼容性，实现使培养层具有作为细胞生长的载体的功能。这是因为，由于碳纳米管具有疏水性，由碳纳米管组成的碳纳米管结构并不能为细胞生长提供适合的亲水性环境。而当碳纳米管表面覆盖有具有亲水性及无毒性的生长因子层后，由覆盖有生长因子的碳纳米管组成的结构即能为细胞生长提供适合的亲水性环境，而且可以增加对细胞的吸附性。由于碳纳米管结构具有弹性佳、延展性良好以及质量轻等优点，因此，所述培养层可根据受损组织的受损部位的形状、大小进行裁剪、拉伸，作为生物体的受损组织在受损部位的支撑体，直接植入生物体内部，使受损部位两端或边缘的细胞自我生长，重新建立联系，完成受损部位的修复。

本发明中的培养层的制备方法可进一步包括如下步骤：

S11，提供所述碳纳米管结构；以及

S12，于所述碳纳米管结构形成一具有吸附细胞特性的生长因子层。

其中，步骤S12可以包括以下分步骤：

S121，对所述碳纳米管结构进行灭菌处理；

S122，采用一多聚赖氨酸（Poly-D-lysine, PDL）溶液处理所述灭菌后的碳纳米管结构；以及

S123，在经过多聚赖氨酸溶液处理后的碳纳米管结构的表面形成所述生长因子层。

在步骤S121中，对所述碳纳米管结构进行灭菌处理的方式不限，只要能够杀死所述碳纳米管结构中的大部分细菌即可。譬如可采用高温灭菌或紫外光灭菌的方式对所述碳纳米管结构进行灭菌。当采用高温杀菌的方式对该碳纳米管结构进行灭菌时，所采用的温度一般为120度。该步骤S121优选地，先通过紫外光灭菌的方式对所述碳纳米管结构进行灭菌；然后再进行高温杀菌处理。

步骤S122包括如下步骤：将所述碳纳米管结构浸泡在所述多聚赖氨酸溶液中；以及用灭菌后去离子水清洗浸泡过的碳纳米管结构，以防止多聚赖氨酸影响细胞的培养。所述碳纳米管结构经过多聚赖氨酸溶液处理，可能使得该碳纳米管结构的表面具有与细胞相匹配的电荷极性，有利于细胞贴壁生长。

在步骤S123中，在所述碳纳米管结构表面形成所述生长因子层的方式不限，只要使所述碳纳米管结构待种植细胞的表面设置有所述生长因子层即可。该步骤S123可以为：采用生长因子溶液浸润所述碳纳米管结构的表面，使生长因子溶液中的生长因子附着在所述碳纳米管结构的表面形成所述生长因子层。譬如，可通过将所述碳纳米管结构浸泡在所述生长因子溶液中，使所述生长因子溶液浸润所述碳纳米管结构的表面。也可通过在所述碳纳米管结构表面喷涂所述生长因子溶液，实现生长因子溶液的浸润。所述生长因子溶液可以为细胞外基质蛋白溶液。优选地，采用层粘连蛋白溶液作为生长因子溶液，所述层粘连蛋白溶液中层粘连蛋白的浓度至少为30微克每毫升（μg/ml）。该层粘连蛋白溶液中的层粘连蛋白不仅可以使得所述碳纳米管结构的表面具有亲水性，还可以提高细胞与所述培养层的附着性，促进所述细胞的生长，如可以促进神经细胞的生长。

为了增加所述碳纳米管结构的亲水性，所述培养层可以进一步包括一蛋白质层，该蛋白质层设置于所述碳纳米管结构与所述生长因子层之间，用于使所述碳纳米管结构的表面具有亲水性及生物兼容性，从而使得所述培养层能够为所述细胞的种植及生长提供一个合适的环境。此时，培养层的制备方法可进一步包括如下步骤：

S101，提供所述碳纳米管结构；

S102，使所述碳纳米管结构浸润有蛋白质溶液从而在该碳纳米管结构表面形成蛋白质层；以及

S103，在所述蛋白质层的表面形成一生长因子层。

在步骤S102中，所述蛋白质层中的蛋白质(protein)为可溶性蛋白质。所述蛋白质选自纤维状蛋白质、血浆蛋白质及酶蛋白质等。优选地，所述蛋白质为哺乳动物的血清，如猪血清、牛血清或人血清等。

所述蛋白质层的形成方法不限，只要能够使蛋白质层与所述碳纳米管结构混合在一起即可。譬如，可通过将所述碳纳米管结构浸泡在一蛋白质溶液中，使所述蛋白质溶液浸润所述碳纳米管结构的一个表面或者两个相对设置的表面，从而使得所述蛋白质溶液中的蛋白质附着在所述碳纳米管结构的一个表面或者两个相对设置的表面形成所述蛋白质层。也可将所述蛋白质溶液喷涂在所述碳纳米管结构一个表面或者两个相对设置的表面，使所述蛋白质层设置在碳纳米管结构一个表面或者两个相对设置的表面形成蛋白质层。还可将蛋白质溶液滴在所述碳纳米管结构一个表面或者两个相对设置的表面，再采用甩膜的方式使所述蛋白质层设置在碳纳米管结构一个表面或者两个相对设置的表面来形成蛋白质层。所述蛋白质溶液除所述蛋白质外，还可包括溶解所述蛋白质的生物媒介(biological media)，所述生物媒介的种类不限，可根据蛋白质的种类的不同而调制。所述碳纳米管结构浸润时间依碳纳米管结构的具体结构及蛋白质溶液的具体组分而定，只要能使所述碳纳米管结构中的大部分碳纳米管浸润有蛋白质溶液即可。通常，在蛋白质不变性的情况下，所述碳纳米管结构在纯蛋白质中的浸泡时间在1.5小时以上。

步骤S103包括以下分步骤：

S1031，对所述蛋白质层进行灭菌处理；

S1032，采用多聚赖氨酸溶液处理形成有蛋白质层的碳纳米管结构；以及

S1033，在经过多聚赖氨酸溶液处理后的蛋白质层的表面形成所述生长因子层。

在步骤S1031中，对所述蛋白质层进行灭菌处理的方式不限，只要能够杀死所述蛋白质层中的大部分细菌即可。譬如可采用高温灭菌或紫外光灭菌的方式对所述蛋白质层进行灭菌。当采用高温杀菌的方式对该蛋白质层进行灭菌时，为使所述蛋白质层不至于被破坏，一般采用120摄氏度高温灭菌。通常，所述蛋白质层先通过紫外光灭菌的方式进行灭菌，照射时间大致为0.5小时；然后将形成有蛋白质层的碳纳米管结构置于一高温灭菌箱中，使该高温灭菌箱的温度从室温升到大约120度，并在120度恒温大约20分钟，最后再自然降到室温，从而实现对所述蛋白质层及碳纳米管结构进行高温灭菌。

为增加所述培养层的强度，所述培养层还可进一步包括一疏水性基底用于承载所述碳纳米管结构、蛋白质层及生长因子层。所述碳纳米管结构则设置在所述疏水性基底与所述蛋白质层之间。此时，所述培养层的制备方法可包括如下步骤：

S111，提供所述疏水性基底；

S112，将所述碳纳米管结构设置在所述疏水性基底的表面；

S113，在所述碳纳米管结构远离所述疏水性基底的表面形成一蛋白质层；

S114，对所述形成有蛋白质层的碳纳米管结构进行灭菌处理；

S115，采用多聚赖氨酸溶液处理所述灭菌后的蛋白质层；以及

S116，在经过多聚赖氨酸溶液处理的蛋白质层的表面形成所述生长因子层。

在步骤S111中，所述疏水性基底为硅胶基底或表面涂覆有硅胶的柔性基底。即，所述疏水性基底可以由硅胶制成或表面涂敷有硅胶的柔性材料组成。硅胶不含金属，为生物体常用的植入材料，对生物体无毒性，且具有较好的柔韧性。因此，由该硅胶基底制备形成或者涂敷有硅胶的疏水性基底可直接植入人体。所述疏水性基底的尺寸与厚度可根据实际需求而确定。譬如，如果所需神经移植体的面积为3平方厘米，则所述硅胶基底的面积可至少为3平方厘米。

在步骤S112中，为使所述碳纳米管结构与所述硅胶基底表面结合更紧密，可对所述碳纳米管结构进行有机溶剂处理。具体地，可将设置在所述硅胶基底表面的碳纳米管结构覆盖或者滴上容易挥发的溶剂，如有机溶剂，再使所述溶剂挥发，从而可减小该碳纳米管结构的比表面积及增加该碳纳米管结构与所述硅胶基底的附着力。

在步骤S116中，由于所述碳纳米管结构由所述疏水性基底承载，因此，通过采用将所述碳纳米管结构浸泡在所述生长因子溶液中的方式使所述碳纳米管结构浸润有生长因子溶液，能够减小所述碳纳米管结构浸泡在该生长因子溶液中时受液体表面张力影响而产生破损的概率。

可以理解，所述培养层可以依次包括疏水性基底、碳纳米管结构以及生长因子层，且该碳纳米管结构层叠设置在该疏水性基底与生长因子层的表面。

在步骤S20中，所述细胞主要是指神经细胞、肌细胞以及皮肤细胞等动物细胞。所述神经细胞可以是哺乳动物的神经细胞，优选地，所述神经细胞为海马神经细胞。在所述生长因子层表面种植所述多个细胞的方法不限，可采用在该生长因子层表面喷射或涂覆细胞液，也可采用将该生长因子层及承载该生长因子层的培养层浸泡在所述细胞液中，只要使所述细胞液覆盖所述生长因子层即可，其中，所述细胞液是指含有细胞并可以用于种植该细胞的溶液。为使所述细胞液覆盖所述生长因子层，所述细胞液可盛放在一培养皿中。所述培养层及其上的生长因子层可悬空设置在所述培养皿中，也可设置在所述培养皿的一底面上。当所述培养层设置在所述培养皿的底面上时，所述培养层与培养皿的底面之间必须设置有一疏水性基体上，以避免所述细胞在所述培养皿的底面生长。

在步骤S30中，所述细胞的培养环境应尽量模拟该细胞在生物体中的生存环境。所述细胞的具体培养环境应根据该细胞的类型来确定。所述生物组织可以为神经网络、肌肉组织或皮肤组织。

由本发明提供的使用上述方法制备的移植体包括碳纳米管结构及生长因子层，该碳纳米管结构具有弹性佳、延展性良好、质量轻等优点，因此，该移植体可根据受损组织的受损部位的形状、大小进行裁剪、拉伸并植入受损部位，由于所述植入体中的细胞与所述受损部位两端或边缘的细胞的距离较近，所以该植入体中的细胞与受损部位边缘的细胞可以重新建立联系，完成受损部位的修复，从而减少受损的生物组织的修复时间。

可以理解，当所述细胞为神经细胞时，所述移植体即为神经移植体。该神经移植体的制备方法可以包括以下步骤：

S110，提供一培养层，所述培养层包括一碳纳米管结构及设置于该碳纳米管结构的一具有吸附细胞特性的生长因子层；

S120，在该生长因子层表面种植多个神经细胞；以及

S130，培养该多个神经细胞直到该多个神经细胞相互连接形成一神经网络。

步骤S120可以为：在所述生长因子层的表面滴加一神经细胞液直到该神经细胞液覆盖该生长因子层，从而使神经细胞液中的神经细胞种植在所述生长因子层表面。

由于所述培养层具有硅胶基底，该培养层可直接设置在一容器如培养皿中，通过所述硅胶基底使所述碳纳米管结构不与所述容器的内表面接触。种植在所述生长因子层的神经细胞为未分化的神经细胞，所述神经细胞分散在一种植液中形成所述神经细胞液。

步骤S130一般采用模拟所述神经细胞在生物体中的生存环境的方式来培养该神经细胞。通常，所述神经细胞在二氧化碳含量大致为5%，温度大致为37摄氏度的环境中进行培养。在培养时，所述生长因子层中的生长因子可促进该神经细胞的吸附生长。

需要指出的是，由于所述培养层中的硅胶基底将所述碳纳米管结构与所述容器隔开，因此，所述神经细胞将仅吸附在所述碳纳米管结构上的生长因子层表面且在该表面生长，而不会在所述容器的内表面上生长。

所述神经细胞在培养时，能够长出多个神经突起。所述神经突起包括树突与轴突。当所述生长因子层表面仅有一个神经细胞时，所述神经细胞的神经突起沿生长因子层的表面朝各个方向随机生长。当所述生长因子层表面设置有多个神经细胞时，该神经细胞的神经突起具有将沿向相邻的神经细胞生长的趋势，当所述多个神经细胞的全部或大多数神经细胞均生长出连接在相邻的神经细胞之间的神经突起时，所述多个神经细胞通过所述神经突起形成所述神经网络，使该多个神经细胞之间能相互联系。

需要指出的是，通常情况下，所述碳纳米管结构中的碳纳米管是指未经过化学或物理处理的碳纳米管，如未经过表面亲水性处理的碳纳米管，即，所述碳纳米管为纯碳纳米管。当然，碳纳米管结构中的碳纳米管如果是经过改性的碳纳米管，也应在本发明的保护范围之内。

本发明提供的移植体可包括由上述移植体的制备方法在包括碳纳米管结构及生长因子层的培养层表面培养由多个细胞及形成的生物组织所得到产品。

以下将结合附图并以具体实施例方式详细说明本发明的培养层及其制备方法、使用该培养层的移植体的制备方法及移植体。请参阅图9，所述移植体100包括一培养层10及分布在该培养层10表面的一生物组织20。

所述培养层10包括一疏水性基底11、一碳纳米管结构12、一蛋白质层14及一生长因子层16。所述碳纳米管结构12设置在所述疏水性基底11的一个或者相对的两个表面。所述蛋白质层14设置在所述碳纳米管结构12远离所述疏水性基底11的表面，所述生长因子层16设置在所述蛋白质层14远离所述碳纳米管结构12的表面。

所述疏水性基底11可由硅胶制成，或表面涂敷有硅胶。硅胶为生物体常用的植入材料，对生物体无毒性，且具有较好的柔韧性。因此，由该硅胶制备形成或者涂敷有硅胶的疏水性基底11可直接植入人体。可以理解，由于碳纳米管结构12本身具有较好的自支撑性能，因此，该疏水性基底11在所述培养层10中为可选结构。

所述碳纳米管结构12包括多个碳纳米管，该碳纳米管结构12可以为一碳纳米管膜结构或碳纳米管线状结构。该碳纳米管膜结构中的碳纳米管基本平行于该碳纳米管膜结构的表面，且相邻的碳纳米管之间通过范德华力相互连接形成一自支撑结构。所述碳纳米管膜结构包括至少一碳纳米管膜，该碳纳米管膜可为如图2中的碳纳米管絮化膜、图3中的碳纳米管碾压膜及图4中的碳纳米管拉膜。所述碳纳米管线状结构包括至少一碳纳米管线，该碳纳米管线可为图7中的非扭转的碳纳米管线及图8中的扭转的碳纳米管线。所述碳纳米管结构12可以包括如图5及图6中的多个层叠设置的拉膜，相邻的拉膜通过范德华力相互结合。在相邻的拉膜中，碳纳米管的延伸方向可具有一个交叉角度，所述交叉角度大于等于0度，且小于等于90度。所述碳纳米管结构12的厚度可根据具体需求而设置。通常，所述碳纳米管结构12厚度大于0.3微米小于60微米。如，所述碳纳米管结构12的厚度可以大致为0.6微米。

所述蛋白质层14为由可溶性蛋白质组成。所谓可溶性蛋白质即该蛋白质具有较好的亲水性。该蛋白质层14用于使得所述碳纳米管结构12具有良好的亲水性能，为细胞提供生存环境。所述蛋白质层14的厚度不限，只要能够提供一个亲水性环境即可。通常，所述蛋白质层14的厚度为0.3微米到2微米。在本实施例中，所述蛋白质层的厚度大致为0.5微米。在宏观上，所述蛋白质层14可选择仅设置在所述碳纳米管结构12远离所述疏水性基底11的表面。在微观上，所述蛋白质层14中的蛋白质容易渗透到所述碳纳米管结构12的内部，并包覆所述碳纳米管结构12中的部分或者全部碳纳米管，此时，所述蛋白质层14与该碳纳米管结构12之间并没有明显的分界面。通常，当所述碳纳米管结构12的厚度较薄时，譬如，所述碳纳米管结构12的厚度小于等于3微米时，所述蛋白质层14中的蛋白质容易渗透到所述碳纳米管结构12的内部，并基本包覆所述碳纳米管结构12中的所有的碳纳米管。而当所述碳纳米管结构12的厚度较厚时，譬如，所述碳纳米管结构12的厚度至少为3微米时，所述蛋白质层14中的蛋白质虽然也可渗透到所述碳纳米管结构12内部，但通常仅包覆所述碳纳米管结构12靠近所述生物组织20的碳纳米管。

所述生长因子层16设置在所述蛋白质层14远离所述碳纳米管结构12的一个表面。当所述移植体100仅包括一个碳纳米管结构12且该碳纳米管结构12远离疏水性基底11的表面设置有一个蛋白质层14时，所述移植体100仅包括一个生长因子层16设置在所述蛋白质层14表面。当所述移植体100包括两个碳纳米管结构12分别设置在该疏水性基底11的两个表面，且每一碳纳米管结构12远离疏水性基底11的表面均设置有一个蛋白质层14时，所述移植体100可包括两个生长因子层16分别设置在所述两个蛋白质层14的表面，也可仅包括一个生长因子层16设置在其中一个蛋白质层14的表面。

本实施例中，所述疏水性基底11为硅胶基底。所述碳纳米管结构12为十层层叠设置的碳纳米管拉膜，相邻的碳纳米管拉膜通过范德华力相互结合，且在相邻的碳纳米管拉膜中，碳纳米管的延伸方向具有大约为90度的交叉角。该十层碳纳米管拉膜设置所述硅胶基底的表面。一个由牛血清组成的蛋白质层14设置在该十层碳纳米管拉膜远离所述硅胶基底的一个表面，且牛血清基本包覆该十层碳纳米管拉膜的碳纳米管的表面。由层粘连蛋白组成的生长因子层16设置在所述牛血清蛋白质层远离所述十层碳纳米管拉膜的表面。该层粘连蛋白不仅能够使得所述碳纳米管结构具有亲水性，能够促进细胞吸附生长，尤其是可以促进所述神经细胞的吸附及神经突起的生长。

所述生物组织20设置在所述生长因子层16的表面。该生物组织20包括多个细胞，该多个细胞相互连接。该生物组织20的形态与该多个细胞的类型有关。请参阅图10，本实施例中，所述生物组织20为神经网络，该神经网络包括多个神经细胞21，每个神经细胞21包括胞体(cell body)22及自该胞体22延伸出来的多个神经突起24，且相邻的神经细胞21之间的神经突起24相互连接形成网状结构。具体地，所述神经细胞21为海马神经细胞，且该海马神经细胞在培养层10的生长因子层层粘连蛋白层的表面生长。每一个神经细胞21的神经突起24的个数不限，只要能够使所述多个神经细胞21之间建立起生物连接使所述多个神经细胞21能够相互沟通即可。譬如，其中一个神经细胞21可延伸出多个神经突起24或不延伸出任何神经突起24。

本发明中的移植体100具有修复生物体受损部位的生物组织20设置在该生长因子层16表面，而用于承载所述生长因子层16的培养层10中的疏水性基底11具有具有不含金属、弹性佳及延展性良好等优点。所述培养层10中的碳纳米管结构12为基本由碳纳米管组成的自支撑结构，具有不含金属、弹性佳、延展性良好及质量轻等优点。因此，该培养层10可随同该生物组织20一起植入到生物体中，用于修复生物体的受损部位，甚至可以修复生物体中受损的神经系统，且可根据生物体的创伤面积对所述移植体100进行裁剪或拉伸。

本发明实施例提供一种神经移植体的制备方法，具体包括如下步骤：

提供一硅胶基底。将由十层层叠设置的碳纳米管拉膜组成的碳纳米管结构放置在该硅胶基底的表面，其中，相邻的碳纳米管拉膜中的碳纳米管的延伸方向具有一大致等于90度的交叉角；将无水乙醇滴在所述碳纳米管结构的表面；挥发无水乙醇，该碳纳米管结构紧密贴合在所述硅胶基底的表面。将所述碳纳米管结构置入纯牛血清中并浸泡1.5个小时左右，从纯牛血清中取出所述铺设有碳纳米管结构的硅胶基底，在该碳纳米管结构的表面形成牛血清层；此时，请参阅图11，该牛血清层中的碳纳米管结构中的大部分碳纳米管表面浸润有牛血清。在一紫外灭菌箱中对所述牛血清层进行紫外照射，大约照射0.5小时，然后将该形成有牛血清层的碳纳米管结构置于一高温灭菌箱中，使该高温灭菌箱的温度从室温升到120度，并在120度时恒温大约20分钟，在自然降到室温，从而实现对该牛血清层进行高温灭菌。将所述经过紫外照射的牛血清层浸泡在浓度大致为20微克每毫升（μg/ml）的多聚赖氨酸溶液中大致为20小时；将所述形成有牛血清层的碳纳米管结构从所述多聚赖氨酸溶液取出，并用灭菌后的去离子水进行清洗所述牛血清层表面的多聚赖氨酸溶液，以去掉牛血清层上的多聚赖氨酸，防止多聚赖氨酸影响神经细胞的生长。将经过多聚赖氨酸溶液处理后的形成有牛血清层的碳纳米管结构浸泡在浓度为45微克每毫升（μg/ml）的层粘连蛋白质溶液中大约2小时，然后，取出形成有牛血清层的碳纳米管结构，从而在该牛血清层表面形成一层粘连蛋白层。此时，可以得到一用来培养细胞的培养层。

将形成有层粘连蛋白层的培养层置于一培养皿中，培养层中的碳纳米管结构通过所述硅胶基底与该培养皿的内表面接触，在所述层粘连蛋白层的表面滴加一海马神经细胞液直到该海马神经细胞液覆盖该层粘连蛋白质层，从而使海马神经细胞液中的海马神经细胞种植在所述层粘连蛋白质层表面，其中该海马神经细胞液是将未分化的海马神经细胞分散在一种植液中而形成的，且该海马神经细胞是从胎鼠的脑部中提取的。

将培养有所述海马神经细胞的培养皿置于一二氧化碳培养箱中培养，并适时更换一饲养液。所述二氧化碳培养箱中的二氧化碳含量大致为5%，温度大致为37摄氏度。请参阅图12及图13，所述海马神经细胞在培养箱中，用饲养液培养15天左右，形成所述神经网络及神经移植体。请参阅图14及图15，图14及图15分别为所述神经移植体未经染色时的扫描电镜照片及经过荧光染色后的光学显微镜照片。从上述光学显微镜照片可清晰看出，所述神经移植体中的多个神经细胞通过神经突起连接在一起。同时，部分神经细胞虽然延伸出多个神经突起，但并未通过该多个神经突起与其他神经细胞连接在一起，但这并不影响该神经移植体在整体上具有生物活性的性质。

另外，本领域技术人员还可在本发明精神内做其它变化，当然，这些依据本发明精神所做的变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (19)

1.一种培养层，用于培养细胞，其包括：一碳纳米管结构，该碳纳米管结构由碳纳米管组成，该碳纳米管结构由至少一碳纳米管线通过弯折、相互交叉、编织或纺织方式形成碳纳米管膜状结构；一蛋白质层，该蛋白质层设置于该碳纳米管结构；采用多聚赖氨酸溶液处理形成有蛋白质层的碳纳米管结构；以及通过将设置有蛋白质层的碳纳米管结构浸泡在层粘连蛋白溶液或纤连蛋白溶液的方式使层粘连蛋白层或纤连蛋白层设置于该蛋白质层表面。

2.如权利要求1所述的培养层，其特征在于，所述碳纳米管线为至少一非扭转的碳纳米管线或至少一扭转的碳纳米管线。

3.如权利要求1所述的培养层，其特征在于，所述培养层进一步包括一疏水性基底，所述碳纳米管结构设置在所述疏水性基底与所述层粘连蛋白层或纤连蛋白层之间。

4.如权利要求3所述的培养层，其特征在于，所述疏水性基底为硅胶基底或表面涂覆有硅胶的柔性基底。

5.如权利要求1所述的培养层，其特征在于，所述蛋白质层中的蛋白质为可溶性蛋白质。

6.一种培养层的制备方法，该培养层用于培养细胞，其包括：

提供一碳纳米管结构，该碳纳米管结构由碳纳米管组成，该碳纳米管结构由至少一碳纳米管线通过弯折、相互交叉、编织或纺织方式形成碳纳米管膜状结构；

使所述碳纳米管结构浸润有蛋白质溶液从而在该碳纳米管结构表面形成蛋白质层，从而使得该蛋白质层形成在碳纳米管结构上；

采用多聚赖氨酸溶液处理所述形成有蛋白质层的碳纳米管结构；以及

通过将设置有蛋白质层的碳纳米管结构浸泡在层粘连蛋白溶液或纤连蛋白溶液的方式使粘连蛋白层或纤连蛋白层设置于该蛋白质层表面。

7.如权利要求6所述的培养层的制备方法，其特征在于，所述层粘连蛋白溶液中层粘连蛋白的浓度至少为30微克每毫升。

8.如权利要求6所述的培养层的制备方法，其特征在于，在采用多聚赖氨酸溶液处理所述形成有蛋白质层的碳纳米管结构的步骤之前对所述蛋白质层进行灭菌处理。

9.如权利要求8所述的培养层的制备方法，其特征在于，对所述蛋白质层进行灭菌处理的步骤包括以下步骤：采用紫外照射所述蛋白质层；以及采用高温处理经紫外照射的蛋白质层。

10.如权利要求8所述的培养层的制备方法，其特征在于，采用多聚赖氨酸溶液处理所述灭菌后的形成有蛋白质层的碳纳米管结构的步骤为：将灭菌后的形成有蛋白质层的碳纳米管结构浸泡在所述多聚赖氨酸溶液中；以及用灭菌后的去离子水清洗浸泡过的碳纳米管结构以去除形成在所述蛋白质层表面的多聚赖氨酸溶液。

11.如权利要求6所述的培养层的制备方法，其特征在于，提供所述碳纳米管结构的步骤进一步包括提供一疏水性基底；以及将所述碳纳米管结构置于所述疏水性基底表面的步骤。

12.一种移植体的制备方法，其包括如下步骤：

提供一培养层，该培养层包括一碳纳米管结构，该碳纳米管结构由碳纳米管组成，该碳纳米管结构由至少一碳纳米管线通过弯折、相互交叉、编织或纺织方式形成碳纳米管膜状结构；一蛋白质层，该蛋白质层设置于该碳纳米管结构；采用多聚赖氨酸溶液处理形成有蛋白质层的碳纳米管结构，及通过将设置有蛋白质层的碳纳米管结构浸泡在层粘连蛋白溶液或纤连蛋白溶液的方式使粘连蛋白层或纤连蛋白层设置于该蛋白质层表面；

在该粘连蛋白层或纤连蛋白层表面种植多个细胞；以及

培养所述多个细胞直到该多个细胞生长形成一生物组织。

13.如权利要求12所述移植体的制备方法，其特征在于，提供所述碳纳米管结构的步骤进一步包括提供一疏水性基底；以及将所述碳纳米管结构置于所述疏水性基底的表面的步骤。

14.如权利要求12所述移植体的制备方法，其特征在于，所述培养层的制备方法包括以下步骤：

提供所述碳纳米管结构；

采用蛋白质溶液浸润所述碳纳米管结构，从而在该碳纳米管结构表面形成蛋白质层；

对所述蛋白质层进行灭菌处理；以及

通过将设置有蛋白质层的碳纳米管结构浸泡在层粘连蛋白溶液或纤连蛋白溶液的方式使粘连蛋白层或纤连蛋白层设置于该蛋白质层表面。

15.如权利要求12所述移植体的制备方法，其特征在于，所述细胞为皮肤细胞、肌肉细胞或神经细胞。

16.如权利要求12所述移植体的制备方法，其特征在于，在所述粘连蛋白层或纤连蛋白层表面种植多个细胞的步骤为采用细胞液覆盖形成有所述粘连蛋白层或纤连蛋白层。

17.一种移植体的制备方法，其包括如下步骤：

提供一碳纳米管结构，该碳纳米管结构由碳纳米管组成，该碳纳米管结构由至少一碳纳米管线通过弯折、相互交叉、编织或纺织方式形成碳纳米管膜状结构；

用蛋白质溶液浸润所述碳纳米管结构，使该蛋白质溶液在所述碳纳米管结构表面形成一蛋白质层；

对该蛋白质层进行灭菌处理；

用多聚赖氨酸溶液处理所述蛋白质层；

采用层粘连蛋白溶液浸润所述蛋白质层，从而在所述蛋白质层的表面形成一层粘连蛋白层；

在所述层粘连蛋白质层表面种植多个神经细胞；以及

培养该多个神经细胞直到该多个神经细胞相互连接形成一神经网络。

18.如权利要求17所述的移植体的制备方法，其特征在于，所述神经网络中的每一神经细胞包括至少一个神经突起与相邻的神经细胞或者相邻的神经细胞的神经突起连接。

19.如权利要求17所述的移植体的制备方法，其特征在于，提供所述碳纳米管结构的步骤进一步包括提供一疏水性基底；以及将所述碳纳米管结构置于所述疏水性基底的表面。