TWI486450B - 神經移植體的製備方法 - Google Patents

Description

神經移植體的製備方法

本發明涉及一種神經移植體的製備方法，尤其係涉及一種可供生物體移植的神經移植體的製備方法。

神經系統主要由神經元(neurons)以及神經膠質細胞(neuron glial cells)構成一複雜且特異的溝通網域，用以與其他組織或器官建立連結以進行功能協調。神經系統中，係由神經元來執行接收刺激、通過傳導並輸出神經遞質(neuron transmitter)以進行組織或器官間訊息溝通，而神經膠質細胞則執行神經元物理性支援、營養提供以及調節溝通訊息速度等功能。每一神經元依據型態包含胞體(cell body)與神經突起(neurite)兩部分，神經突起自胞體延伸並朝向其他神經元或係其他細胞(例如：肌肉細胞)生長，其中神經突起又分為軸突(axon)與樹突(dendrite)兩種。一般來說，刺激由樹突接收並將衝動傳向胞體，衝動經過軸突傳導至軸突末端，並釋放傳導物質來觸動其他細胞。

由於神經系統扮演生物體內各組織與器官之間的協調作用，其重要性不言可喻。先前，因神經系統受損而導致的神經缺損係臨床常見的致殘性疾病。其中，通過植入神經移植體來修復受損的神經系統，係神經外科手術用來修復因各種情況引起的神經系統損傷的一種重要手段。先前的神經移植體通常為“橋接”在神經系 統受損部位兩端的神經管，該神經管由生物降解材料製成的管狀結構。神經系統受損部位一端的神經元沿所述神經管內壁生長出神經突起以到達所述神經系統受損部位的另一端。

通常，需要通過植入所述神經管的方式進行修復的的受損部位的長度較長，而所述神經突起的生長過程非常緩慢，故，利用所述神經管來修復受損的神經系統所需的修復時間較長。

有鑒於此，提供一種神經移植體的製備方法實為必要，由該製備方法製備的神經移植體能夠減少受損的神經系統的修復時間。

一種神經移植體的製備方法，其包括：提供一培育層，所述培育層包括一疏水性基底、一奈米碳管膜結構及一蛋白質層，所述奈米碳管膜結構設置在所述疏水性基底的一表面，所述蛋白質層設置在該奈米碳管膜結構遠離所述疏水性基底的表面；在該蛋白質層遠離所述疏水性基底的表面種植複數神經細胞；以及培育該複數神經細胞直到該複數神經細胞生長出複數神經突起連接在所述複數神經細胞之間形成一神經網路。

一種神經移植體的製備方法，其包括如下步驟：提供一疏水性基底；在該疏水性基底的一表面鋪設一奈米碳管膜結構；在該奈米碳管膜結構遠離所述疏水性基底的表面形成一蛋白質層從而形成一培育層；在該蛋白質層遠離所述疏水性基底的表面種植複數神經細胞；以及培育該複數神經細胞直到該複數神經細胞生長出複數神經突起連接在所述複數神經細胞之間形成一神經網路。

相較於先前技術，所述神經移植體的製備方法通過在該奈米碳管 膜結構表面設置蛋白質層形成培育層，並在所述培育層的表面形成所述神經網路。所述奈米碳管膜結構與疏水性基底均具有彈性佳與延展性良好等優點，故，所述神經移植體可根據受損神經系統的受損部位的形狀、大小進行裁剪、拉伸並植入受損部位。所述神經網路具有生物活性及信號傳遞能力，從而使得包括所述神經網路的神經移植體亦具有生物活性及信號傳遞能力。當所述神經移植體植入生物體中的受損部位時，由於所述神經植入體中的神經元與所述受損部位兩端或邊緣的神經元的距離非常近，故可通過直接縫合所述神經植入體中的神經元與受損部位邊緣的神經元的方式使所述受損部位的兩端建立起信號傳遞能力，完成受損部位的神經修復，從而節省所述神經突起的生長時間，減少受損的神經系統的修復時間。

100‧‧‧神經移植體

10‧‧‧培育層

11‧‧‧疏水性基底

12‧‧‧奈米碳管膜結構

14‧‧‧蛋白質層

20‧‧‧神經網路

22‧‧‧神經細胞

24‧‧‧神經突起

圖1為本發明實施例所提供的一神經移植體的製備方法的流程示意圖。

圖2為一奈米碳管絮化膜的掃描電鏡照片。

圖3為一奈米碳管碾壓膜的掃描電鏡照片。

圖4為一奈米碳管拉膜的掃描電鏡照片。

圖5為本發明實施例所提供的神經移植體的側視示意圖。

圖6為本發明實施例所提供的神經移植體的俯視示意圖。

圖7為本發明實施例所提供的奈米碳管膜結構的掃描電鏡照片。

圖8為本發明實施例所提供的奈米碳管膜結構的透射電鏡照片。

圖9為本發明實施例所提供的培育層的透射電鏡照片。

圖10為本發明實施例所提供的種植在所述培育層上的神經細胞分化出多個神經突起時的掃描電鏡照片。

圖11為本發明實施例所提供的未經染色的神經移植體的掃描電鏡照片。

圖12為本發明實施例所提供的神經移植體染色後的掃描電鏡照片。

請參閱圖1，本發明提供一種神經移植體的製備方法，其包括：S10，提供一培育層，所述培育層包括一疏水性基底、一奈米碳管膜結構及一蛋白質層，所述奈米碳管膜結構設置在所述矽膠基底，所述蛋白質層設置在該奈米碳管膜結構表面；S20，在該蛋白質層表面種植複數神經細胞；以及S30，培育該複數神經細胞直到該複數神經細胞生長出複數神經突起連接在所述複數神經細胞之間形成一神經網路。

在所述步驟S10中，所述奈米碳管膜結構由複數奈米碳管組成。所述複數奈米碳管的延伸方向可基本平行於所述奈米碳管膜結構的表面。優選地，所述複數奈米碳管之間通過凡得瓦力(Van der Waals attractive force)連接，從而形成一自支撐結構。所謂“自支撐”即該奈米碳管膜結構無需通過設置於一基體表面，亦能保持自身特定的形狀。由於該自支撐的奈米碳管膜結構中大量的奈米碳管通過凡得瓦力相互吸引，從而使該奈米碳管膜結 構具有特定的形狀，形成一自支撐結構。所述奈米碳管膜結構為自支撐結構時，該奈米碳管膜結構可為由至少一奈米碳管膜形成的膜狀結構，當所述奈米碳管膜結構包括複數奈米碳管膜時，該複數奈米碳管膜層疊設置，相鄰的奈米碳管膜之間通過凡得瓦力相結合。由於所述奈米碳管膜基本由奈米碳管組成且奈米碳管之間通過凡得瓦力連接，故所述奈米碳管膜結構具有彈性佳、延展性良好及密度低等優點，便於裁剪和拉伸。

請參閱圖2，所述奈米碳管膜可為一奈米碳管絮化膜，該奈米碳管絮化膜為將一奈米碳管原料絮化處理獲得的一自支撐的奈米碳管膜。該奈米碳管絮化膜包括相互纏繞且均勻分佈的奈米碳管。奈米碳管的長度大於10微米，優選為200微米到900微米，從而使奈米碳管相互纏繞在一起。所述奈米碳管之間通過凡得瓦力相互吸引、分佈，形成網路狀結構。由於該自支撐的奈米碳管絮化膜中大量的奈米碳管通過凡得瓦力相互吸引並相互纏繞，從而使該奈米碳管絮化膜具有特定的形狀，形成一自支撐結構。所述奈米碳管絮化膜各向同性。所述奈米碳管絮化膜中的奈米碳管為均勻分佈，無規則排列，形成大量尺寸在1奈米到500奈米之間的間隙或微孔。所述間隙或微孔能夠增加所述奈米碳管膜的比表面積及浸潤更多的蛋白質。

所述奈米碳管膜可為一奈米碳管碾壓膜，該奈米碳管碾壓膜為通過碾壓一奈米碳管陣列獲得的一種具有自支撐性的奈米碳管膜。該奈米碳管碾壓膜包括均勻分佈的奈米碳管，奈米碳管沿同一方向或不同方向擇優取向排列。所述奈米碳管碾壓膜中的奈米碳管相互部分交迭，並通過凡得瓦力相互吸引，緊密結合，使得該奈 米碳管膜具有很好的柔韌性，可彎曲折迭成任意形狀而不破裂。且由於奈米碳管碾壓膜中的奈米碳管之間通過凡得瓦力相互吸引，緊密結合，使奈米碳管碾壓膜為一自支撐的結構。所述奈米碳管碾壓膜中的奈米碳管與形成奈米碳管陣列的生長基底的表面形成一夾角β，其中，β大於等於0度且小於等於15度，該夾角β與施加在奈米碳管陣列上的壓力有關，壓力越大，該夾角越小，優選地，該奈米碳管碾壓膜中的奈米碳管平行於該生長基底排列。該奈米碳管碾壓膜為通過碾壓一奈米碳管陣列獲得，依據碾壓的方式不同，該奈米碳管碾壓膜中的奈米碳管具有不同的排列形式。具體地，奈米碳管可無序排列；請參閱圖3，當沿不同方向碾壓時，奈米碳管沿不同方向擇優取向排列；當沿同一方向碾壓時，奈米碳管沿一固定方向擇優取向排列。該奈米碳管碾壓膜中奈米碳管的長度大於50微米。

該奈米碳管碾壓膜的面積與奈米碳管陣列的尺寸基本相同。該奈米碳管碾壓膜厚度與奈米碳管陣列的高度以及碾壓的壓力有關，可為0.5奈米到100微米之間。可以理解，奈米碳管陣列的高度越大而施加的壓力越小，則製備的奈米碳管碾壓膜的厚度越大；反之，奈米碳管陣列的高度越小而施加的壓力越大，則製備的奈米碳管碾壓膜的厚度越小。所述奈米碳管碾壓膜之中的相鄰的奈米碳管之間具有一定間隙，從而在奈米碳管碾壓膜中形成複數尺寸在1奈米到500奈米之間的間隙或微孔。所述間隙或微孔能夠增加所述奈米碳管膜的比表面積及浸潤更多的蛋白質。

所述奈米碳管膜可為一奈米碳管拉膜，所述奈米碳管拉膜係由若干奈米碳管組成的自支撐結構。請參閱圖4，所述若干奈米碳管 為沿該奈米碳管拉膜的長度方向擇優取向排列。所述擇優取向係指在奈米碳管拉膜中大多數奈米碳管的整體延伸方向基本朝同一方向。而且，所述大多數奈米碳管的整體延伸方向基本平行於奈米碳管拉膜的表面。

進一步地，所述奈米碳管拉膜中多數奈米碳管係通過凡得瓦力首尾相連。具體地，所述奈米碳管拉膜中基本朝同一方向延伸的大多數奈米碳管中每一奈米碳管與在延伸方向上相鄰的奈米碳管通過凡得瓦力首尾相連。當然，所述奈米碳管拉膜中存在少數偏離該延伸方向的奈米碳管，這些奈米碳管不會對奈米碳管拉膜中大多數奈米碳管的整體取向排列構成明顯影響。所述自支撐為奈米碳管拉膜不需要大面積的載體支撐，而只要相對兩邊提供支撐力即能整體上懸空而保持自身膜狀狀態，即將該奈米碳管拉膜置於(或固定於)間隔一定距離設置的兩個支撐體上時，位於兩個支撐體之間的奈米碳管拉膜能夠懸空保持自身膜狀狀態。所述自支撐主要通過奈米碳管拉膜中存在連續的通過凡得瓦力首尾相連延伸排列的奈米碳管而實現。具體地，所述奈米碳管拉膜中基本朝同一方向延伸的多數奈米碳管，並非絕對的直線狀，可適當的彎曲；或者並非完全按照延伸方向上排列，可適當的偏離延伸方向。故，不能排除奈米碳管拉膜的基本朝同一方向延伸的多數奈米碳管中並列的奈米碳管之間可能存在部分接觸。具體地，該奈米碳管拉膜包括複數連續且定向排列的奈米碳管片段。該複數奈米碳管片段通過凡得瓦力首尾相連。每一奈米碳管片段由複數相互平行的奈米碳管組成。該奈米碳管片段具有任意的長度、厚度、均勻性及形狀。該奈米碳管拉膜具有較好的透光性，可見光透過率可達到75%以上。

當該奈米碳管膜結構包括複數奈米碳管拉膜時，所述複數奈米碳管拉膜層疊設置形成一層狀結構。該層狀結構的厚度不限，相鄰的奈米碳管拉膜通過凡得瓦力結合。優選地，所述層狀結構包括的奈米碳管膜的層數小於或等於10層，從而使單位面積內的奈米碳管數量較少，使該奈米碳管自身的拉曼光強保持在較小的範圍，從而減小拉曼光譜中奈米碳管的拉曼峰強。該層狀結構中相鄰的奈米碳管拉膜中的奈米碳管之間具有一交叉角度α，且該α大於0度且小於等於90度。當相鄰的奈米碳管拉膜中的奈米碳管之間具有一交叉角度α時，所述複數奈米碳管拉膜中的奈米碳管相互交織形成一神經移植體，使所述奈米碳管膜結構的機械性能增加。在本實施例中，所述奈米碳管膜結構包括複數層奈米碳管拉膜層疊設置，相鄰的奈米碳管膜中的奈米碳管之間的交叉角度α大致等於90度，即，相鄰奈米碳管拉膜中的奈米碳管的延伸方向大致平行。

所述疏水性基底用於承載該所述奈米碳管膜結構及蛋白質層。所述疏水性基底具有疏水性及良好的柔韌性。所述疏水性基底可由矽膠製成，或表面塗敷有矽膠。所述疏水性基底的形狀與厚度可根據所述奈米碳管膜結構的形狀與厚度設計。譬如，所述疏水性基底表面的面積及形狀可大致與所述奈米碳管膜結構的面積及形狀大致相當。可以理解，當所述奈米碳管膜結構的厚度較薄時，該奈米碳管膜結構具有較小機械強度及具有較大的比表面積，故，該奈米碳管膜結構溶液受外力產生破損或容易粘附在其他親水性物體上。將該奈米碳管膜結構設置在所述疏水性基底表面形成一生物基底時，該生物基底的機械強度較所述奈米碳管膜結構大，從而使該奈米碳管膜結構更難受外來作用而產生破損，同時便 於移動及防止該奈米碳管膜結構粘附在親水性物體上。

所述蛋白質層設置在所述奈米碳管膜結構的表面，用於使所述奈米碳管層具有親水性及生物相容性，從而使得所述培育層能夠為所述神經細胞的種植及生長提供一個合適的環境。具體地，所述蛋白質層設置在所述奈米碳管膜結構遠離所述疏水性基底的表面。優選地，所述蛋白質層中的蛋白質(protein)為可溶性蛋白質。所述蛋白質可選自纖維狀蛋白質、血漿蛋白質及酶蛋白質等。在本實施例中，所述蛋白質為哺乳動物的血清，如豬血清、牛血清或人血清。所述血清不僅能夠為所述神經細胞的種植及生長提供一個合適的環境，還能夠在所述神經細胞生長時，為所述神經細胞提供生長因數。

所述培育層的製備方法不限，只要能夠使蛋白質層與所述奈米碳管膜結構混合在一起即可。譬如，可通過將所述奈米碳管膜結構浸泡在一蛋白質溶液中，使所述蛋白質溶液浸潤所述奈米碳管膜結構，從而使得所述蛋白質溶液中的蛋白質附著在所述奈米碳管膜結構遠離所述疏水性基底的表面形成蛋白質層。亦可將所述蛋白質溶液噴塗在所述奈米碳管膜結構遠離所述疏水性基底的表面，使所述蛋白質層設置在該表面。還可將蛋白質溶液滴在所述奈米碳管膜結構遠離所述疏水性基底的表面，再採用甩膜的方式使所述蛋白質層設置在該表面。所述蛋白質溶液除所述蛋白質外，還可包括溶解所述蛋白質的生物媒介(biological media)，所述生物媒介的種類不限，可根據蛋白質的種類的不同而調製。通常，所述蛋白質溶液中的蛋白質的濃度大於等於50%小於等於100%。在本實施例中，所述蛋白質溶液中的蛋白質濃度為100%，即， 所述蛋白質溶液為純蛋白質，無需溶劑溶解。

由於所述奈米碳管膜結構包括複數奈米碳管且複數奈米碳管之間存在間隙形成複數微孔，當所述蛋白質溶液浸潤所述奈米碳管膜結構時，所述蛋白質溶液可滲透入所述奈米碳管膜結構內部浸潤所述複數奈米碳管的表面。當然，在所述培育層中，並不係所有奈米碳管的表面均可浸潤有蛋白質層，然，只需位於需培育神經細胞的奈米碳管膜結構的表面的部分奈米碳管浸潤有蛋白質溶液，即可在所述奈米碳管膜結構表面形成蛋白質層，使所述奈米碳管膜結構具有親水性及生物相容性，實現使培育層具有作為神經細胞生長的載體的功能。這係因為，由於奈米碳管具有疏水性，由奈米碳管組成的奈米碳管膜結構並不能為神經細胞生長提供適合的親水性環境。而當奈米碳管表面覆蓋有具有親水性及無毒性的蛋白質層後，由覆蓋有蛋白質的奈米碳管組成的結構即能為細胞生長提供適合的親水性環境。在本實施例中，所述培育層的製備方法可進一步包括如下步驟：在本實施例中，所述培育層的製備方法可進一步包括如下步驟：S11，提供所述疏水性基底；S12，將所述奈米碳管膜結構設置在所述疏水性基底表面；S13，使所述奈米碳管膜結構浸潤有蛋白質溶液；以及S14，對浸潤有蛋白質溶液的奈米碳管膜結構進行滅菌處理形成所述培育層。

在步驟S11中，所述疏水性基底由矽膠製成，或表面塗敷有矽膠。矽膠為生物體常用的植入材料，對生物體無毒性，且具有較好 的柔韌性。故，由該矽膠基底製備形成或者塗敷有矽膠的疏水性基底可直接植入人體。

在步驟S12中，為使所述奈米碳管膜結構與所述矽膠基底表面結合更緊密，可對所述奈米碳管膜結構進行有機溶劑處理。具體地，可在設置在所述矽膠基底表面的奈米碳管膜結構覆蓋或者滴上容易揮發的溶劑，如有機溶劑，再使所述溶劑揮發，從而可減小該奈米碳管膜結構的比表面及增加該奈米碳管膜結構與所述矽膠基底的附著力。

在步驟S13中，使所述奈米碳管膜結構浸潤有蛋白質溶液的方式不限，只要使蛋白質溶液中的蛋白質附著在奈米碳管膜結構表面形成一蛋白質層即可。譬如，可通過將所述奈米碳管膜結構浸泡在所述蛋白質溶液中，實現蛋白質溶液的浸潤。亦可通過在所述奈米碳管膜結構噴塗所述蛋白質溶液，實現蛋白質溶液的浸潤。在本實施例中，為實現蛋白質溶液的浸潤，選擇將所述奈米碳管膜結構浸泡在純蛋白質中。所述奈米碳管膜結構的浸泡時間依奈米碳管膜結構的具體結構及蛋白質溶液的具體組分而定，只要能使所述奈米碳管膜結構中的大部分奈米碳管浸潤有蛋白質溶液即可。通常，所述奈米碳管膜結構的浸泡時間在2小時以上。所述奈米碳管膜結構的浸泡的環境不限，只要不使所述蛋白質變質即可。通常，所述浸泡過程可在常溫、常壓環境下進行。

當所述奈米碳管膜結構浸泡在所述蛋白質溶液中時，所述蛋白質溶液可浸潤所述奈米碳管膜結構中的部分奈米碳管，亦可浸潤所述奈米碳管膜結構中的全部奈米碳管。通常地，當所述奈米碳管膜結構的厚度較薄時，譬如所述奈米碳管膜結構的厚度小於等於 10微米時，所述蛋白質溶液可浸潤所述奈米碳管膜結構中的全部奈米碳管。當所述奈米碳管膜結構的厚度較厚時，譬如所述奈米碳管膜結構的厚度大於等於10微米時，所述蛋白質溶液可浸潤所述奈米碳管膜結構中遠離所述疏水性基底部分的奈米碳管。需要指出的係，所述蛋白質溶液係否浸潤所述奈米碳管膜結構中的全部奈米碳管除了與奈米碳管膜結構的厚度有關外，還與浸潤時間與所述蛋白質溶液的濃度有關。譬如，當浸潤時間較短時，即便所述奈米碳管膜結構較薄，所述蛋白質溶液亦可能僅浸潤所述奈米碳管膜結構中的部分奈米碳管。

在步驟S14中，對浸潤有蛋白質溶液的奈米碳管膜結構進行滅菌處理的方式不限，只要能夠殺死蛋白質溶液中的大部分細菌即可。譬如可採用高溫滅菌或紫外光滅菌的方式對所述蛋白質溶液進行滅菌。在本實施例中，採用高溫殺菌的方式對該蛋白質溶液進行滅菌。當然，為使所述蛋白質溶液中的蛋白質不至於被破壞，高溫滅菌時的溫度不得超過220度。在本實施例中，所述高溫滅菌時的溫度大致為120度。可以理解，當所述蛋白質溶液中本身細菌較少，則該步驟S14則可省略。當對浸潤在奈米碳管膜結構中的蛋白質溶液進行滅菌處理時，所述蛋白質溶液中的溶劑或水分將減少。通常地，浸潤在所述奈米碳管膜結構中的蛋白質溶液隨著溶劑或水分的減少而固化，從而在所述奈米碳管膜結構的表面形成所述蛋白質層。

在步驟S10中，為增加該培育層對神經細胞的附著性及提供更適合神經細胞的生長環境，在形成蛋白質層後，該步驟S10還可進一步包括如下步驟：S15，在所述蛋白質層遠離所述疏水性基底 的表面形成一聚賴氨酸(Poly-D-lysine,PDL)層。具體地，可將所述培育層浸泡在一聚賴氨酸溶液中，所述聚賴氨酸溶液中聚賴氨酸的濃度大致為20微克每毫升。

在步驟S20中，所述神經細胞包括哺乳動物的神經細胞，優選地，所述神經細胞為海馬神經元。在該培育層表面種植複數神經細胞的方法不限，可採用在該培育層遠離所述疏水性基底的表面噴射或塗覆含有該神經細胞的溶液，亦可採用將該培育層浸泡在所述含神經細胞的神經細胞液中，只要使所述神經細胞液覆蓋所述培育層即可。為使所述神經細胞液覆蓋所述培育層，所述神經細胞液可盛放在一培養皿中。所述培育層可懸空設置在所述培養皿中。亦可設置在所述培養皿的一底面上，只要能使所述培養液覆蓋所述神經細胞即可。當所述培育層設置在所述培養皿的底面時，所述疏水性基底與所述底面接觸，從而使得所述神經細胞僅分佈在蛋白質層表面。

在步驟S30中，所述神經細胞的培育環境不限，只要能夠生長出神經突起即可。通常，所述神經細胞在常溫、常壓環境中即可生長。即，將所述神經細胞放置在室內環境中，所述神經細胞即可生長，而培育層中的蛋白質如牛血清可提供生長因數，促進該神經細胞生長。當然，亦可使該培育環境接近提供該神經細胞的生物體的體內生長環境亦可。譬如，當所述神經細胞為取自老鼠的海馬神經細胞時，可模擬所述老鼠體內的生長環境。

所述神經細胞在培育時，能夠長出複數神經突起(Neurite)。所述神經突起包括樹突(Dendrite)與軸突(Axon)。當所述培育層表面僅有一個神經細胞時，所述神經細胞的神經突起沿培育 層的表面朝各個方向隨機生長。然由於神經細胞本身會釋放出誘導神經突起定向生長的因數，故，當所述培育層表面設置有複數神經細胞時，該神經細胞的神經突起具有將沿向相鄰的神經細胞生長的趨勢，從而使相鄰的神經細胞得以連接溝通。故，控制神經細胞在所述培育層的分佈，即可控制所述神經突起的生長方向。譬如，如果所述神經細胞係隨機均勻分佈在所述培育層的表面，所述神經細胞將各自生長出神經突起與相鄰的細胞連接，當所述複數神經細胞的全部或大多數神經細胞均生長出連接在相鄰的神經細胞之間的神經突起時，所述複數神經細胞借由所述神經突起形成所述神經網路，使該複數神經細胞之間能相互溝通。相鄰的神經細胞的神經突起如果相遇，則會合為同一個神經突起。再譬如，當所述神經細胞在該培育層表面以線狀或者陣列的方式排列時，且沿縱向方向的神經細胞相距較近，而沿橫向方向的神經細胞相距較遠，此時，所述神經細胞所生長的神經細胞可基本沿所述縱向方向延伸。為使所述神經細胞能夠在所述培育層表面以線狀或者陣列的方式排列，可選擇使所述奈米碳管膜中的奈米碳管基本沿同一方向延伸。通過培育，彼此相鄰的神經細胞大多通過神經突起建立起連接，從而形成所述神經網路。所述神經網路與所述培育層一起形成所述神經移植體。

所述移植體的製備方法通過在該疏水性基底表面設置奈米碳管膜結構，再在該奈米碳管膜結構遠離所述疏水性基底表面設置蛋白質層形成培育層，從而能在該培育層中蛋白質層表面種植複數神經細胞，並使所述複數神經細胞生長出複數神經突起連接起複數神經細胞。所述矽膠基底具有疏水性，不能使所述神經細胞吸附其上，即不能提供供所述神經細胞生長的環境，故，所述神經細 胞將僅在所述設置有蛋白質層表面生長。

所述奈米碳管膜結構為一宏觀的膜狀結構，其面積一般都可達到15毫米×15毫米以上，具體地，該奈米碳管膜結構的長度可達300米以上，寬度可達0.5米以上。所述疏水性基底亦為一宏觀結構，其形狀與面積可根據所述奈米碳管膜結構的形狀與面積進行調整。且該奈米碳管膜結構與所述疏水性基底均具有彈性佳、延展性良好及不含金屬等優點，可直接植入生物體。故，由所述奈米碳管膜結構及疏水性基底做主要載體的神經移植體可根據受損神經系統的受損部位的形狀、大小進行裁剪、拉伸並植入受損部位。所述神經網路具有生物活性及信號傳遞能力，從而使得包括所述神經網路的神經移植體亦具有生物活性及信號傳遞能力。當所述神經移植體植入生物體中的受損部位時，由於所述神經植入體中的神經元與所述受損部位兩端或邊緣的神經元的距離較短，故可通過直接縫合所述神經植入體中的神經元與受損部位邊緣的神經元的方式使所述受損部位的兩端建立起信號傳遞能力，完成受損部位的神經修復，從而節省所述神經突起的生長時間，減少受損的神經系統的修復時間。可以理解，即便係在所述神經植入體植入受損部位時，不進行直接縫合，由於所述神經植入體中的神經元所述受損部位邊緣的神經元的距離小於所述受損部位兩端的神經元的距離，故，通過植入所述神經植入體，亦能減少神經突起的生長時間，從而減少受損的神經系統的修復時間。

需要指出的係，通常情況下，所述奈米碳管膜結構中的奈米碳管係指未經過化學或物理處理的奈米碳管，如未經過表面親水性處理的奈米碳管，即，所述奈米碳管為純奈米碳管。當然，奈米碳 管膜結構中的奈米碳管如果係經過改性的奈米碳管，只要係對神經細胞沒有毒性，亦應在在本發明的保護範圍之內，只係，所述奈米碳管的改性並不會對實現本發明有任何實質性貢獻，因為，當所述蛋白質層覆蓋該奈米碳管後，所述神經細胞與所述奈米碳管並不直接接觸，該奈米碳管的表面結構實際上係可忽略的。

本發明提供的神經移植體可包括由上述神經移植體的製備方法在包括奈米碳管膜結構及蛋白質層的培育層表面培養由複數神經細胞及神經突起形成的神經網路所得到產品。

請參閱圖5，所述神經移植體100包括一培育層10及分佈在該培育層10表面的一神經網路20。

所述培育層10包括一疏水性基底11、一奈米碳管膜結構12及一蛋白質層14。所述奈米碳管膜結構12設置在所述疏水性基底11的一個或者相對的兩個表面。所述蛋白質層14設置在所述奈米碳管膜結構12遠離所述疏水性基底11的表面。在本實施例中，所述奈米碳管膜結構12僅設置在所述疏水性基底11的一個表面。

所述疏水性基底11可由矽膠製成，或表面塗敷有矽膠。矽膠為生物體常用的植入材料，對生物體無毒性，且具有較好的柔韌性。故，由該矽膠製備形成或者塗敷有矽膠的疏水性基底11可直接植入人體。

所述奈米碳管膜結構12包括複數奈米碳管基本平行於所述奈米碳管膜結構的表面，且相鄰的奈米碳管之間通過凡得瓦力相互連接形成一自支撐結構。所述奈米碳管膜結構12包括至少一奈米碳管膜，該奈米碳管膜可為如圖2中的奈米碳管絮化膜、圖3中的奈米 碳管碾壓膜及圖4中的奈米碳管拉膜。在本實施例中，所述奈米碳管膜結構12包括複數層疊設置的拉膜，相鄰的拉膜通過凡得瓦力相互結合。在相鄰的拉膜中，奈米碳管的的延伸方向可具有一個交叉角度，優選地，所述交叉角度為90度。所述奈米碳管膜結構12的厚度可根據具體需求而設置。通常，所述奈米碳管膜結構12厚度大於0.3微米小於60微米。在本實施例中，所述奈米碳管膜結構12的厚度大致為0.6微米。

所述蛋白質層14為由可溶性蛋白質組成。所謂可溶性蛋白質即該蛋白質具有較好的親水性。所述蛋白質層14的厚度不限，只要能夠提供一個親水性環境即可。通常，所述蛋白質層14的厚度為0.3微米到2微米。在本實施例中，所述蛋白質層的厚度大致為0.5微米。在宏觀上，所述蛋白質層14可選擇僅設置在所述奈米碳管膜結構12遠離所述疏水性基底11的表面。在微觀上，所述蛋白質層14中的蛋白質容易滲透到所述奈米碳管膜結構12的內部，並包覆所述奈米碳管膜結構12中的部分或者全部奈米碳管，此時，所述蛋白質層14與該奈米碳管膜結構12之間並沒有明顯的分介面。通常，當所述奈米碳管膜結構12的厚度較薄時，譬如，所述奈米碳管膜結構12的厚度小於等於3微米時，所述蛋白質層14中的蛋白質容易滲透到所述奈米碳管膜結構12的內部，並基本包覆所述奈米碳管膜結構12中的所有的奈米碳管。而當所述奈米碳管膜結構12的厚度較厚時，譬如，所述奈米碳管膜結構12的厚度大於等於3微米時，所述蛋白質層14中的蛋白質雖然亦可滲透到所述奈米碳管膜結構12內部，然通常僅包覆所述奈米碳管膜結構12靠近所述神經網路20的奈米碳管。在本實施例中，所述蛋白質層14中的蛋白質基本包覆所述奈米碳管膜結構12中的所有的奈米碳 管。

所述神經網路20設置在所述蛋白質層14遠離所述奈米碳管膜結構12的一個表面。當所述神經移植體100僅包括一個奈米碳管膜結構12且該奈米碳管膜結構12遠離疏水性基底11的表面設置有一個蛋白質層14時，所述神經移植體100僅包括一個神經網路20設置在所述蛋白質層14表面。當所述神經移植體100包括兩個奈米碳管膜結構12分別設置在該疏水性基底11的兩個表面，且每一奈米碳管膜結構12遠離疏水性基底11的表面均設置有一個蛋白質層14時，所述神經移植體100可包括兩個神經網路20分別設置在所述兩個蛋白質層14的表面，亦可僅包括一個神經網路20設置在其中一個蛋白質層14的表面。在本實施例中，所述神經移植體100僅包括一個奈米碳管膜結構12、一個設置在所述奈米碳管膜結構12表面的蛋白質層14、及一個設在所述蛋白質層14表面的神經網路20。

可以理解，為提高所述生物移植體100的抑菌性，提高該神經移植體100的壽命，所述神經移植體100還可進一步包括一多聚賴氨酸層設置在所述神經網路20與所述蛋白質層14之間。

請參閱圖6，所述神經網路20包括複數神經細胞22及自所述複數神經細胞22延伸出來的複數神經突起24。每一個神經細胞22延伸出來的神經突起24的個數不限，只要能夠使所述複數神經細胞22之間建立起生物連接使所述複數神經細胞22能夠相互溝通即可。譬如，其中一個神經細胞22可延伸出複數神經突起24或不延伸出任何神經突起24。

本發明中的神經移植體100，具有修復生物體中神經系統中的神 經網路20設置在該培育層10表面。而所述培育層10中的疏水性基底11具有較好的，具有不含金屬、彈性佳、不易腐蝕及延展性良好等優點。所述培育層10中的奈米碳管膜結構12為基本由奈米碳管組成的自支撐結構，具有不含金屬、彈性佳、不易腐蝕、延展性良好及低密度等優點。故，該培育層10可隨同該由複數神經突起24連接的複數神經細胞22一起植入到生物體中，用於修復生物體中受損的神經系統，且可根據生物體中神經系統的創傷面積對所述神經移植體100進行裁剪或拉伸。

以下將結合附圖並以具體實施例方式詳細說明本發明的神經移植體的製備方法及神經移植體。

本發明提供一種神經移植體的製備方法，其包括如下步驟：

S210，提供一矽膠基底。

所述矽膠基底的尺寸與厚度可根據實際需求而確定。譬如，如果所需神經移植體的面積為3平方釐米，則所述矽膠基底的面積可大於等於3平方釐米。所述矽膠基底不含金屬，對生物體基本無毒性。

S220，將一奈米碳管膜結構鋪設在所述矽膠基底的一表面。

為使所述奈米碳管膜結構與所述矽膠基底表面結合更緊密，可對所述奈米碳管膜結構進行有機溶劑處理。具體地，可在設置在所述矽膠基底表面的奈米碳管膜結構覆蓋或者滴上容易揮發的溶劑，如有機溶劑，再使所述溶劑揮發，從而可減小該奈米碳管膜結構的比表面及增加該奈米碳管膜結構與所述矽膠基底的附著力。所述奈米碳管膜結構包括複數層奈米碳管拉膜，相鄰的奈米碳管 拉膜之間的奈米碳管的延伸方向具有一交叉角度。請參閱圖7及圖8，優選地，所述交叉角度大致等於90度。

S230，將鋪設有奈米碳管膜結構的矽膠基底浸泡在一蛋白質溶液中。

由於所述奈米碳管膜結構設置在所述矽膠基底表面，當所述奈米碳管膜結構連同矽膠基底一起浸泡到所述純蛋白質中時，所述奈米碳管膜結構受液體表面張力影響而產生破損的概率將大為降低。所述蛋白質溶液純牛血清溶液。請參見圖9，當所述奈米碳管膜結構從所述蛋白質溶液中浸泡1.5個小時左右，所述奈米碳管膜結構中的大部分奈米碳管表面可浸潤有蛋白質溶液。

S240，從所述蛋白質溶液中取出所述鋪設有奈米碳管膜結構的矽膠基底，在120攝氏度下進行高溫滅菌處理，形成一培育層。

將所述鋪設有奈米碳管膜結構的矽膠基底從所述蛋白質溶液中取出後，可在一乾燥箱中進行加熱滅菌處理。所述乾燥箱的滅菌溫度大致在120度左右，滅菌處理後後，所述蛋白質溶液中的蛋白質基本固化，在所述奈米碳管膜結構表面形成一蛋白質層，從而形成所述培育層。

S250，將所述培育層浸泡在一聚賴氨酸溶液中。

所述多聚賴氨酸溶液中的多聚賴氨酸的濃度大致為20微克每毫升。通過浸泡，所述培育層表面附著有多聚賴氨酸，並提供一個水性環境。

S260，在所述浸泡後的培育層滴加一神經細胞液直到該神經細胞液覆蓋該培育層。

由於所述培育層中具有矽膠基底，該培育層可直接設置在一容器如培養皿中，通過所述矽膠基底係所述奈米碳管膜結構不與所述容器的內表面接觸。

S270，培育所述附著在所述培育層的複數神經細胞，使該複數神經細胞生長出複數神經突起連接在所述複數神經細胞之間，從而在所述培育層形成一神經網路。

所述神經細胞的培育環境為普通的室內環境，培育時間可根據實際需求而定。故，在步驟S260的環境下，請參閱圖10，保持各種條件不變，在室內環境培養15天左右，即可使所述神經細胞分化出多個神經突起。所述神經細胞生長時，所述蛋白質如牛血清，能夠提供供所述神經細胞生長的生長因數。所述多個神經細胞上的多個神經突起相互連接後，形成所述神經網路及移植體，請參閱圖11及圖12，為所述神經移植體未經染色的掃描電鏡照片及經過染色後的透射電鏡照片。從上述投射電鏡照片可以清晰看出，所述神經移植體中的多個神經細胞通過神經突起連接在一起。同時，如圖11所示，部分神經細胞雖然延伸出多個神經突起，但並未通過該多個神經突起與其他神經細胞連接在一起，但這並不影響該神經移植體在整體上具有生物活性的性質。

需要指出的係，由於所述培育層中的矽膠基底將所述奈米碳管膜結構所述容器隔開，而該矽膠基底本身具有疏水性。故，所述神經細胞將僅吸附在設置在所述奈米碳管膜結構上蛋白質層表面且在該表面生長，而不會在所述矽膠基底表面或容器的內表面上生長。

綜上所述，本發明確已符合發明專利之要件，遂依法提出專利申 請。惟，以上所述者僅為本發明之較佳實施例，自不能以此限制本案之申請專利範圍。舉凡習知本案技藝之人士援依本發明之精神所作之等效修飾或變化，皆應涵蓋於以下申請專利範圍內。

20‧‧‧神經網路

22‧‧‧神經細胞

24‧‧‧神經突起

Claims (16)

1. 一種神經移植體的製備方法，其包括如下步驟：提供一培育層，所述培育層包括一疏水性基底、一奈米碳管膜結構及、一蛋白質層以及一聚賴氨酸層，所述奈米碳管膜結構設置在所述疏水性基底的一表面，所述蛋白質層設置在該奈米碳管膜結構遠離所述疏水性基底的表面，所述聚賴氨酸層形成在所述蛋白質層的表面，該奈米碳管膜結構中的複數奈米碳管通過凡得瓦力首尾相連且軸向沿同一方向擇優取向延伸；在該蛋白質層遠離所述疏水性基底的表面種植複數神經細胞，所述神經細胞以陣列方式排列，且沿縱向方向的神經細胞之間的距離小於沿橫向方向的神經細胞之間的距離；以及培育該複數神經細胞直到該複數神經細胞生長出複數神經突起連接在所述複數神經細胞之間形成一神經網路，且所述神經細胞中的神經突起基本沿所述縱向方向延伸。
2. 如請求項1所述的神經移植體的製備方法，其中，所述神經網路中的每一神經細胞均包括至少一個神經突起並通過該至少一個神經突起與相鄰的神經細胞連接。
3. 如請求項1所述的神經移植體的製備方法，其中，所述神經突起包括樹突及軸突。
4. 如請求項1所述的神經移植體的製備方法，其中，所述蛋白質層中的蛋白質為可溶性蛋白質。
5. 如請求項1所述的神經移植體的製備方法，其中，所述蛋白質層中的蛋白質包括哺乳動物的血清。
6. 如請求項1所述的神經移植體的製備方法，其中，所述培育層的製備方法進一步包括如下步驟：提供所述疏水性基底；將所述奈米碳管膜結構設置在所述疏水性基底表面；使所述奈米碳管膜結構浸潤有蛋白質溶液；以及對浸潤有蛋白質溶液的奈米碳管膜結構進行滅菌處理形成所述培育層。
7. 如請求項6所述的神經移植體的製備方法，其中，將所述奈米碳管膜結構設置在所述疏水性基底表面的步驟進一步包括如下步驟：對設置在所述的疏水性基底表面的奈米碳管膜結構進行有機溶劑處理。
8. 如請求項6所述的神經移植體的製備方法，其中，使所述奈米碳管膜結構浸潤有蛋白質溶液的步驟進一步包括如下步驟：將所述奈米碳管膜結構及承載該奈米碳管膜結構的疏水性基底浸泡在所述蛋白質溶液中。
9. 如請求項6所述的神經移植體的製備方法，其中，使所述奈米碳管膜結構浸潤有蛋白質溶液的步驟進一步包括如下步驟：在所述奈米碳管膜結構噴塗所述蛋白質溶液。
10. 如請求項6所述的神經移植體的製備方法，其中，所述蛋白質溶液中的蛋白質濃度大於等於50%小於等於100%。
11. 如請求項6所述的神經移植體的製備方法，其中，所述滅菌處理的方式包括高溫滅菌及紫外滅菌。
12. 如請求項1所述的神經移植體的製備方法，其中，所述奈米碳管膜結構包括至少一奈米碳管膜，所述奈米碳管膜包括奈米碳管絮化膜、奈米碳管碾壓膜或奈米碳管拉膜。
13. 如請求項12所述的神經移植體的製備方法，其中，所述奈米碳管膜結構包括複數奈米碳管膜層疊設置，相鄰的奈米碳管膜之間通過凡得瓦力連 接。
14. 如請求項1所述的神經移植體的製備方法，其中，所述奈米碳管膜結構由複數奈米碳管組成。
15. 如請求項1所述的神經移植體的製備方法，其中，所述疏水性基底由矽膠製成，或表面塗敷有矽膠。
16. 一種神經移植體的製備方法，其包括如下步驟：提供一疏水性基底；在該疏水性基底的一表面鋪設一奈米碳管膜結構，該奈米碳管膜結構中的複數奈米碳管通過凡得瓦力首尾相連且軸向沿同一方向擇優取向延伸；在該奈米碳管膜結構遠離所述疏水性基底的表面形成一蛋白質層從而形成一培育層；在所述蛋白質表面形成一多聚賴氨酸層；在該蛋白質層遠離所述疏水性基底的表面種植複數神經細胞，所述神經細胞以陣列方式排列，且沿縱向方向的神經細胞之間的距離小於沿橫向方向的神經細胞之間的距離；以及培育該複數神經細胞直到該複數神經細胞生長出複數神經突起連接在所述複數神經細胞之間形成一神經網路，且所述神經細胞中的神經突起基本沿所述縱向方向延伸。