CN109627324A - 一种低电负性明胶及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药的技术领域，具体涉及一种低电负性明胶及其制备方法和用途。本发明的目的在于，提供一种低电负性明胶及其制备方法和用途，本发明的低电负性的明胶，等电点应在7.5以上，使原本成分复杂、组成不均一的明胶纯化为电负性较低且相对均一的组分，可以采用传统的离子交换层析技术替代昂贵的、应用受限的明胶亲和层析技术，应用于生物料液中纤维结合蛋白杂质的去除。
Description
技术领域
本发明属于生物制药的技术领域，具体涉及一种低电负性明胶及其制备方法和用途。
背景技术
明胶是由动物皮肤、骨、肌膜、肌魅等结缔组织中的胶原降解而成的不均一的多肽。降解方法分为酸解法和碱解法。明胶是胶原蛋白变性、降解的产物，没有固定的结构和相对分子量，其相对分子量分布在几万到几十万(<300KD)。明胶为白色或淡黄色、半透明、微带光泽的薄片或粉粒；是一种无色无味，无挥发性、透明坚硬的非晶体物质。明胶也没有固定的等电点。
明胶常用于食品工业，是优良的食品添加剂。在制药领域，明胶也常用作胶囊壳的制作原料，还可以用作注射剂的原辅料。
明胶还有一个特殊的生物学性质：能够与纤维结合蛋白特异性结合。因此，可以通过化学偶联的方式将明胶分子通过共价键连接在层析凝胶填料的基质(如交联琼脂糖凝胶)上，制成明胶亲和层析填料。在生物制药领域，这种明胶亲和层析填料可以从各种生物料液中特异性捕获纤维结合蛋白，用于纤维结合蛋白的高效分离纯化，或者从生物料液中除去纤维结合蛋白(作为杂质)以提高药品的纯度。虽然明胶是一种非常廉价的原料，但是明胶亲和层析凝胶却因生产工艺复杂而非常昂贵。另一方面，由于明胶分子对酸、碱的耐受性较差，容易发生降解和配基脱落，造成对药物的污染，以及层析填料性能下降。因此明胶亲和层析凝胶适用的pH(3～10)非常狭窄。在生物制药工艺中，层析柱和填料的再生和消毒是防止批间交叉污染的必需流程。再生和消毒工艺通常使用强酸或强碱进行清洗，而狭窄的pH耐受范围严重限制了明胶亲和层析填料在生物制药领域的应用。
因此，当明胶亲和层析填料用于去除药品中的纤维结合蛋白(杂质)时，这种填料通常只能作为一次性使用的耗材，进一步增加了生产成本。
由于明胶是一种组成不均一的多肽混合物，分子量和等电点范围很宽，在生物制药工艺中，游离的、未经固化的明胶对于纤维结合蛋白的纯化并无益处，明胶本身反而会成为一种引入的污染物。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种低电负性明胶及其制备方法和用途，用来替代昂贵的、应用范围受限的明胶亲和层析填料，以及以明胶亲和层析填料为基础的亲和层析技术，以简单、快捷、低成本的方式达到从生物料液中去除纤维结合蛋白的目的。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种低电负性的明胶，其特征为，等电点应在7.5以上。
本发明的另一目的在于提供一种低电负性明胶的制备方法，其特征为，采用离子交换层析技术对明胶分子进行分离纯化和筛选，选择与阴离子交换层析柱结合力较强的组分。
本发明的一种低电负性明胶的制备方法，其具体的制备步骤为：
(1)选用阴离子交换层析凝胶装填层析柱，使用pH6.0～9.5、氯化钠10～200mmol/L的平衡缓冲液平衡层析柱3～5个柱体积；
(2)将明胶用步骤(1)中的平衡缓冲液溶解，浓度为1-8g/L(3)使步骤(2)中的明胶溶液通过步骤(1)中平衡过的层析柱，收集流穿液，并用超滤法脱盐、浓缩、减压干燥或冻干，即为低电负性明胶。
本发明的特点还有：
作为优选，步骤(1)中，所述的阴离子交换层析凝胶，优先选用EMD TMAE(Merck)。
作为优选，步骤(2)中，明胶优选使用酸解法生产的A型明胶。
为防止本发明低电负性明胶的制备方法在制备过程中明胶溶液凝固，本发明的操作环境温度为在30～60℃条件下实施，优选为35～60℃。
本发明提供的一种低电负性的明胶，其用途为作为一种纤维结合蛋白亲和分子改性剂。具体应用方法为，将该低电负性的明胶与待纯化的生物料液混合，完全溶解并混匀，然后过层析柱，经过常规的操作，即可得到需要的产品；该应用方法的原理为，通过本发明的低电负性的明胶与待纯化的生物料液混合，能够与纤维结合蛋白分子结合，形成复合物后，以自身的低电负性特征，使复合物的整体电负性降低，从而增加纤维结合蛋白与生物料液中待纯化的目标蛋白在离子交换层析中的分离度，在不使用明胶亲和层析技术的前提下，有效去除生物料液中的纤维结合蛋白杂质。
进一步的，本发明的低电负性的明胶可以作为纯化制备人血管性血友病因子(vWF)的纤维结合蛋白亲和分子改性剂。
本发明的技术原理如下：
当生物料液中有纤维结合蛋白作为杂质需要去除时，之所以传统的离子交换层析无法达到足够的分离效果，通常都是由于待纯化的目标蛋白质的电负性与纤维结合蛋白非常相似，等电点也非常相似。如果向料液中加入一种电负性足够低的明胶，当这种明胶分子与纤维结合蛋白特异性结合后，就改变了纤维结合蛋白-明胶复合物分子的整体电负性，与目标蛋白之间的差异增大，从而提高纤维结合蛋白-明胶复合物分子与目标蛋白在离子交换层析工艺中的分离度，可以实现纤维结合蛋白与目标蛋白的高效分离。由于这种低电负性明胶的电负性本来就与目标蛋白差异较大，因此过量的明胶分子也极易与目标蛋白分离，不会导致明胶作为杂质引入新的污染物。
本发明的有益效果为：
本发明通过采用离子交换层析技术，根据分子的电负性对明胶分子进行筛选分离，获得了低电负性的明胶组分，使原本成分复杂、组成不均一的明胶纯化为电负性较低且相对均一的组分，可以采用传统的离子交换层析技术替代昂贵的、应用受限的明胶亲和层析技术，应用于生物料液中纤维结合蛋白杂质的去除。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。
实施例1：
(1)阴离子交换凝胶EMD TMAE(Merck)10L装填层析柱，并用含10mmol/L氯化钠的PBS(10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0)平衡5个柱体积，待用。
(2)称取A型明胶500g，溶于100L步骤(1)中的平衡液中，混匀，0.5微米滤膜过滤澄清，通过步骤(1)中平衡好的层析柱，线流速120cm/h，收集流穿液，超滤浓缩脱盐，冻干，制得低电负性明胶385.5g。
(3)凝胶层析柱的再生处理：2mol/L氯化钠溶液洗脱4个柱体积后，用0.3mol/L氢氧化钠溶液循环清洗层析柱1小时，用纯水清洗层析柱至中性，用20％乙醇保存层析柱。
实施例2：
(1)阴离子交换凝胶EMD TMAE(Merck)10L装填层析柱，并用含100mmol/L氯化钠的PBS(10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 8.0)平衡5个柱体积，待用。
(2)称取A型明胶500g，溶于100L步骤(1)中的平衡液中，混匀，0.5微米滤膜过滤澄清，通过步骤(1)中平衡好的层析柱，线流速120cm/h，收集流穿液，超滤浓缩脱盐，冻干，制得低电负性明胶305.8g。
(3)同实施例1的步骤(3)。
实施例3：
(1)阴离子交换凝胶EMD TMAE(Merck)10L装填层析柱，并用含200mmol/L氯化钠的PBS(10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 9.0)平衡5个柱体积，待用。
(2)称取A型明胶500g，溶于100L步骤(1)中的平衡液中，混匀，0.5微米滤膜过滤澄清，通过步骤(1)中平衡好的层析柱，线流速120cm/h，收集流穿液，超滤浓缩脱盐，冻干，制得低电负性明胶202.4g。
(3)同实施例1的步骤(3)。
实施例4：
明胶等电点测定：分别取A型明胶(原料)，以及实施例1、2、3中制备得到的低电负性明胶10g，按照等点聚焦电泳法测定等电点，见表1。
表1.A型明胶(原料)及实施例1、2、3中制备得到的低电负性明胶的等电点分布
| 样品名称 | 等电点分布 |
| A型明胶(原料) | 4.5～9.8 |
| 实施例1制备的低电负性明胶 | 7.5～9.7 |
| 实施例2制备的低电负性明胶 | 8.3～9.7 |
| 实施例3制备的低电负性明胶 | 9.2～9.8 |
实施例5：
人凝血因子Ⅷ生产工艺中离子交换层析步骤的流穿液和洗涤液，富含人血管性血友病因子(vWF)。纯化制备得到的vWF可以制成注射剂，用于治疗人血管性血友病。但是，上述洗涤液和流穿液中还含有纤维结合蛋白。纤维结合蛋白与vWF分子的电负性相似，在纯化vWF的过程中很难通过离子交换层析将纤维结合蛋白去除干净。
向上述流穿液和洗涤液中加入实施例1中制备的低电负性明胶(每升料液添加量为0.6g)，完全溶解并混匀。
阴离子交换凝胶EMD TMAE(Merck)10L装填层析柱，用平衡液(磷酸钠10mmol/L、氯化钠210mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8～7.6)平衡5个柱体积。使上步中混匀的料液经过平衡好的层析柱，再用平衡液洗涤层析柱6个柱体积，再用洗脱液(磷酸钠10mmol/L、氯化钠400mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8～7.6)洗脱层析柱上吸附的vWF，并收集。平衡、上样、洗涤、洗脱的线流速为120cm/h。
实施例6：
向人凝血因子Ⅷ生产工艺中离子交换层析步骤的流穿液和洗涤液中加入实施例2中制备的低电负性明胶(每升料液添加量为0.6g)，完全溶解并混匀。
阴离子交换凝胶EMD TMAE(Merck)10L装填层析柱，用平衡液(磷酸钠10mmol/L、氯化钠210mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8～7.6)平衡5个柱体积。使上步中混匀的料液经过平衡好的层析柱，再用平衡液洗涤层析柱6个柱体积，再用洗脱液(磷酸钠10mmol/L、氯化钠400mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8～7.6)洗脱层析柱上吸附的vWF，并收集。平衡、上样、洗涤、洗脱的线流速为120cm/h。
实施例7：
向人凝血因子Ⅷ生产工艺中离子交换层析步骤的流穿液和洗涤液中加入实施例3中制备的低电负性明胶(每升料液添加量为0.6g)，完全溶解并混匀。
阴离子交换凝胶EMD TMAE(Merck)10L装填层析柱，用平衡液(磷酸钠10mmol/L、氯化钠210mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8～7.6)平衡5个柱体积。使上步中混匀的料液经过平衡好的层析柱，再用平衡液洗涤层析柱6个柱体积，再用洗脱液(磷酸钠10mmol/L、氯化钠400mmol/L、氯化钙1mmol/L，pH6.8～7.6)洗脱层析柱上吸附的vWF，并收集。平衡、上样、洗涤、洗脱的线流速为120cm/h。
实施例8：
实施例5、6、7中经过纯化的vWF制品与未加入低电负性明胶情况下纯化得到的vWF制品中纤维结合蛋白含量比较，见表2。
表2.不同方法制备的vWF制品中纤维结合蛋白含量比较
从表2可以看出，使用本发明提供的低电负性明胶之后，制备的VWF产品中的纤维结合蛋白残留量显著降低。
Claims (10)
1.一种低电负性的明胶，其特征为，等电点应在7.5以上。
2.如权利要求1所述的一种低电负性明胶的制备方法，其特征为，采用离子交换层析技术对明胶分子进行分离纯化和筛选，选择与阴离子交换层析柱结合力较强的组分。
3.根据权利要求2所述的一种低电负性明胶的制备方法，其特征为，其具体的制备步骤为：
（1）选用阴离子交换层析凝胶装填层析柱，使用pH6.0~9.5、氯化钠10~200mmol/L的平衡缓冲液平衡层析柱3~5个柱体积；
（2）将明胶用步骤（1）中的平衡缓冲液溶解，浓度为1-8g/L（3）使步骤（2）中的明胶溶液通过步骤（1）中平衡过的层析柱，收集流穿液，并用超滤法脱盐、浓缩、减压干燥或冻干，即为低电负性明胶。
4. 根据权利要求2所述的一种低电负性明胶的制备方法，其特征为，步骤（1）中，所述的阴离子交换层析凝胶，为Fractogel® EMD TMAE (Merck)。
5.根据权利要求2所述的一种低电负性明胶的制备方法，其特征为，步骤（2）中，明胶为酸解法生产的A型明胶。
6.根据权利要求2所述的一种低电负性明胶的制备方法，其特征为，该制备方法操作环境温度为在30~60℃条件下实施。
7.根据权利要求2所述的一种低电负性明胶的制备方法，其特征为，该制备方法操作环境温度为35~60℃。
8.如权利要求1所述的一种低电负性明胶的用途，作为一种纤维结合蛋白亲和分子改性剂。
9.如权利要求8所述的一种低电负性明胶的用途，其特征是，具体应用方法为，将该低电负性的明胶与待纯化的生物料液混合，完全溶解并混匀，然后过层析柱，经洗涤、洗脱操作，即可得到需要的产品。
10.如权利要求8所述的一种低电负性明胶的用途，其特征是，作为纯化制备人血管性血友病因子（vWF）的纤维结合蛋白亲和分子改性剂。
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