KR20170005168A

KR20170005168A - 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포로 이루어지는 세포 구조체

Info

Publication number: KR20170005168A
Application number: KR1020167037078A
Authority: KR
Inventors: 켄타로 나카무라
Original assignee: 후지필름 가부시키가이샤
Priority date: 2010-03-01
Filing date: 2011-03-01
Publication date: 2017-01-11
Also published as: EP2543397A1; WO2011108517A1; KR101744040B1; KR20130005279A; JPWO2011108517A1; US20120329157A1; CN102858381A; US9597432B2; JP5762399B2; EP2543397A4; CN102858381B; EP2543397B1

Abstract

본 발명의 목적은 조직 재생에 충분한 두께를 갖고, 또한 구조체내에서 세포가 균일하게 존재하는 세포 3차원 구조체를 제공하는 것이다. 본 발명에 의하면 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포를 포함하고, 상기 복수개의 세포 사이의 간극에 복수개의 상기 고분자 블록이 배치되어 있는 세포 구조체가 제공된다.

Description

생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포로 이루어지는 세포 구조체{CELL STRUCTURE COMPRISING CELLS AND MACROMOLECULAR BLOCKS HAVING BIOCOMPATIBILITY}

본 발명은 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포를 포함하는 세포 구조체에 있어서 상기 복수개의 세포 사이의 간극에 복수개의 상기 고분자 블록이 모자이크상으로 배치되어 있는 세포 구조체, 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

현재, 기능 장해나 기능 부전에 빠진 생체조직·장기의 재생을 꾀하는 재생 의료의 실용화가 진행되고 있다. 재생 의료는 본래 생체가 갖고 있는 자연치유 능력만으로는 회복할 수 없게 된 생체조직을 세포, 발판, 성장 인자의 3인자를 사용해서 원래의 조직과 같은 형태나 기능을 다시 만들어 내는 새로운 의료기술이다. 최근에는 세포를 사용한 치료가 서서히 실현되기 시작해 왔다. 예를 들면, 자가세포를 사용한 배양 표피나, 자가연골세포를 사용한 연골치료, 간엽계 줄기세포를 사용한 뼈재생 치료, 근아세포를 사용한 심근세포 시트 치료, 각막상피 시트에 의한 각막 재생 치료, 신경 재생 치료 등을 들 수 있다. 이들 새로운 치료는 종래의 인공물에 의한 대체 의료(인공뼈 보충제나 히알루론산 주사)와는 달리 생체조직의 수복·재생을 꾀하기 위해서 높은 치료 효과를 얻을 수 있다. 실제로, 일부 자가세포를 사용한 배양 표피나 배양 연골이라는 제품이 시판되고 있었다.

그러나, 현재의 기술에서는 주로 이식하는 세포를 얇은 시트상으로 해서 이식하거나, 현탁액의 상태로 이식하므로 충분한 두께를 가진 조직을 제공할 수 없다. 생체조직은 원래 두께를 갖는 것이며, 두께를 갖지만 때문에 심장을 박동시키는 근력을 가능으로 하거나, 관절연골에 있어서 윤활한 움직임을 가능하게 하고 있다. 세포를 사용한 조직 재생의 전반에 있어서는 두께를 가진 조직을 제공할 수 없는 것이 큰 과제라고 여겨지고 있다.

예를 들면, 세포 시트를 사용한 심근의 재생에 있어서는 두께가 있는 조직을 재생하기 위해서는 세포 시트의 다층 구조체가 필요하다고 생각된다. 최근, 오카노들은 온도응답성 배양 접시를 사용한 세포 시트를 개발했다. 세포 시트는 트립신과 같은 효소처리가 필요하지 않기 때문에 세포와 세포의 결합 및 접착 단백이 유지된다(비특허문헌 1∼6). 이러한 세포 시트 제조 기술은 심근조직의 재생에 유용하다고 기대된다. 단, 지금까지의 세포 시트에서는 혈관망의 형성이 불가능하기 때문에 충분한 두께가 있는 조직의 재생은 곤란했다(비특허문헌 5 및 7). 그 이유는 세포 시트에 두께를 갖게 함으로써 중심부의 세포에의 영양공급이 끊어져 버려 세포가 사멸해 버리는 것에 있다. 실제로, 오카노들은 200㎛ 이상의 두께를 실현하는 것은 불가능하다고 생각해서 세포 시트에 혈관망을 형성하기 위해 혈관내피세포를 함께 도입한 세포 시트의 개발을 행하고 있다(비특허문헌 8). 그러나, 이것은 목적의 세포 이외에 혈관내피세포라는 다른 세포원을 준비하지 않으면 안되는 것이나, 세포 시트에 균일하게 혈관을 유도하는 것이 곤란한 것, 만일 이 수단으로 영양분의 송달 경로를 제공할 수 있다 해도 이 방법으로는 제작한 영양송달 경로를 외부의 영양송달 경로와 치밀하게 결합시키지 않으면 안되는 것 등 많은 문제를 안고 있어 현실적인 해결책으로는 되지 않는다.

또, 뼈재생에 있어서도 기재에 배양 세포를 부여한 뼈재생 시트가 개발되어 있다.

간엽계 줄기세포를 시트상으로 배양한 배양 세포 시트와 생분해성 물질을 시트상으로 형성한 생분해 시트를 적층해서 이루어지는 뼈재생 시트(특허문헌 1)가 제안되어 있다. 또한, 다공질 시트 상에 간엽계 세포로부터 분화시킨 간엽계 조직 전구체 세포와 세포외기질이 부착되어 있는 간엽계 조직 재생 유도용 시트도 있다(특허문헌 2). 이들 발명은 배양 골아세포가 부착된 시트를 체내에 넣고, 체내에서의 막성 골화에 의해 골아세포로부터 피질골을 형성시키는 방법이다. 그러나, 골아세포형 세포는 적층해서 배양할 수 없다고 하는 문제가 있으므로 골아세포층을 사용한 시트에서는 세포층의 두께가 100㎛를 초과하는 재생 시트를 제공할 수 없었다. 그 후, 특허문헌 3에서는 배양 방법의 개발·최적화에 의해 200㎛ 이상의 두께의 시트를 형성할 수 있지만, 실제로는 210㎛ 정도까지의 두께밖에 제공할 수 없다.

이상과 같이, 대부분의 조직 수복에 있어서 세포를 두께가 있는 조성물로서 제공하는 것은 곤란한 과제였다. 그 주된 원인은 세포로 구성된 3차원 구조체에는 영양분이 확산만으로는 충분히 침투해 가지 않는 것에 있다. 그것을 해결하는 수단으로서 하나에는 콜라겐을 사용한 겔 포매 배양이 고안되었다(비특허문헌 9). 그러나, 겔로 포매한 세포에서는 세포가 겔 중심부로부터 외측으로 이동해 버리기 때문에 겔 중에서 세포가 균일하게 존재하지 않고, 중심부의 세포밀도가 낮아지는 점에서 근본적으로 본 과제를 해결할 수 없다. 또한, 겔 포매로 제작한 세포 3차원 구조체에서는 3차원 구조체끼리를 결합·융합할 수 없어 세포 파종시에 제작한 사이즈 이상의 3차원 구조체를 형성시킬 수 없다. 따라서, 작은 겔을 제작하고 나서 겔끼리를 융합시킴으로써 균일하게 세포가 분포된 구조체를 제작한다라는 수단을 취할 수도 없다.

또, 특허문헌 4에서는 무기 세라믹스 비즈로 세포를 연결함으로써 3차원 배양이 가능하다고 서술되어 있다. 그러나, 무기 세라믹스에서는 수분의 유지·액교환·영양의 확산·완충능이 나빠 현실적으로 두께를 가진 세포 조성물을 제공할 수 없다. 실제로 특허문헌 4의 실시예에 있어서도 150∼460㎛의 입자에 세포를 접착시키고, 그 주위에 PLLA의 두꺼운 부직포(1cm)를 적층시켜서 겉보기의 두께를 늘리고 있는 것 뿐이며, 실제의 세포 함유층은 무기 세라믹스 비즈 표면 상의 기껏 수십㎛층밖에 없다. 만일 세포를 갖지 않는 1cm의 PLLA 부직포를 구조체로 간주했다 해도 현저하게 불균일한 세포 분포의 구조체밖에 없다. 이렇게, 현재까지는 구조체내의 세포 분포가 불균일한 세포 3차원 구조체, 실질의 세포층이 얇은 구조체밖에 제공할 수 없었다.

일본 특허 공개 2003-275294호 공보 일본 특허 공개 2006-116212호 공보 일본 특허 공개 2009-240766호 공보 일본 특허 공개 2004-267562호 공보

Shimizu, T. et al., Circ. Res.90, e40-48(2002) Kushida, A. et al., J. Biomed. Mater. Res.51, 216-223(2000) Kushida, A. et al., J. Biomed. Mater. Res.45, 355-362(1999) Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A.& Okano, T., Tissue Eng.7, 141-151(2001) Shimizu, T et al., J. Biomed. Mater. Res.60, 110-117(2002) Harimoto, M. et al., J. Biomed. Mater. Res.62, 464-470(2002) Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A.& Okano, T., Biomaterials 24, 2309-2316(2003) Inflammation and Regeneration vol.25 No.32005, p158-159. 제26회 일본 염증·재생 의학회-염증학과 재생 의학의 융합을 목표로 해서- 오카노 미쯔오 Sustained growth and three-dimensional organization of primary mammary tumor epithelial cells embedded in collagen gels. J Yang, J Richards, P Bowman, R Guzman, J Enami, K McCormick, S Hamamoto, D Pitelka, and S Nandi. PNAS July 1, 1979 vol.76 no.73401-3405

본 발명은 조직 재생에 충분한 두께를 갖고, 또한 구조체내에서 세포가 균일하게 존재하는 세포 구조체를 제공하는 것을 과제로 했다. 또한 본 발명은 목적 세포 이외의 세포를 사용하지 않고 제조 가능한 세포 구조체를 제공하는 것을 과제로 했다. 또한 본 발명은 세포 3차원 구조체끼리가 자연히 융합 가능한 세포 구조체를 제공하는 것을 과제로 했다.

본 발명자들은 생체 친화성을 갖는 고분자 블록(생체 친화성을 가진 고분자 재료로 이루어지는 덩어리)과 세포를 모자이크상으로 3차원 배치함으로써 외부로부터 세포 3차원 구조체의 내부로의 영양송달을 가능하게 하고, 충분한 두께를 갖고, 또한 구조체내에서 세포가 균일하게 존재하는 세포 3차원 구조체를 형성하는 것에 성공했다. 또한, 상기 세포 3차원 구조체의 외주부에 존재하는 세포의 작용에 의해 세포 3차원 구조체끼리의 자연융합이 가능한 것도 찾아냈다. 본 발명은 이들의 지견에 의거해서 완성된 것이다.

즉, 본 발명의 형태는 이하에 관한 것이다.

〔1〕생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포를 포함하고, 복수개의 세포 사이의 간극에 복수개의 상기 고분자 블록이 모자이크상으로 배치되어 있는 세포 구조체로서, 두께 또는 직경이 215㎛ 이상 3cm 이하이고, 상기 고분자 블록과 상기 세포의 비율이 세포 1개당 0.00001㎍ 이상 0.006㎍ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 구조체.

〔2〕〔1〕에 있어서, 상기 고분자 블록의 크기는 1㎛ 이상 700㎛ 이하인 세포 구조체.

〔3〕〔2〕에 있어서, 상기 고분자 블록의 크기는 10㎛ 이상 300㎛ 이하인 세포 구조체.

〔4〕〔1〕∼〔3〕중 어느 하나에 있어서, 두께 또는 직경이 400㎛ 이상 3cm 이하인 세포 구조체.

〔5〕〔1〕∼〔4〕중 어느 하나에 있어서, 두께 또는 직경이 720㎛ 이상 1cm 이하인 세포 구조체.

〔6〕〔1〕∼〔5〕중 어느 하나에 있어서, 상기 고분자 블록과 상기 세포의 비율이 세포 1개당 0.0000001㎍ 이상 1.0㎍ 이하인 세포 구조체.

〔7〕〔1〕∼〔6〕중 어느 하나에 있어서, 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅함으로써 제조되는 세포 구조체.

〔8〕〔1〕∼〔7〕중 어느 하나에 있어서, 생체 친화성을 갖는 고분자는 생분해성 재료인 세포 구조체.

〔9〕〔1〕∼〔8〕중 어느 하나에 있어서, 생체 친화성을 갖는 고분자는 폴리펩티드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, PLGA, 히알루론산, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 콘드로이틴, 셀룰로오스, 아가로스, 카르복시메틸셀룰로오스, 키틴, 또는 키토산인 세포 구조체.

〔10〕〔1〕∼〔9〕중 어느 하나에 있어서, 생체 친화성을 갖는 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 프로넥틴, 라미닌, 테나신, 피브린, 피브로인, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 또는 레트로넥틴인 세포 구조체.

〔11〕〔1〕∼〔10〕중 어느 하나에 있어서, 생체 친화성을 갖는 고분자가 가교되어 있는 세포 구조체.

〔12〕〔11〕에 있어서, 가교는 알데히드류, 축합제, 또는 효소에 의해 실시되는 세포 구조체.

〔13〕〔1〕∼〔12〕중 어느 하나에 있어서, 생체 친화성을 갖는 고분자는 유전자 재조합 젤라틴인 세포 구조체.

〔14〕〔13〕에 있어서, 상기 생체 친화성을 갖는 고분자는 세포 접착성 시그널을 1분자 중에 2개 이상 갖는 세포 구조체.

〔15〕〔13〕에 있어서, 유전자 재조합 젤라틴은

식:A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B

(식 중, A는 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열을 나타내고, B는 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열을 나타내고, n개의 X는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, n개의 Y는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, n은 3∼100의 정수를 나타내고, m은 2∼10의 정수를 나타낸다. 또한, n개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다)로 나타내어지는 세포 구조체.

〔16〕〔13〕 또는 〔15〕에 있어서, 유전자 재조합 젤라틴은

식:Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)₆₃]₃-Gly

(식 중, 63개의 X는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, 63 개의 Y는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다. 또한, 63개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다)로 나타내어지는 세포 구조체.

〔17〕〔13〕∼〔16〕중 어느 하나에 있어서, 유전자 재조합 젤라틴은 (1)서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열, 또는 (2)서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖고, 생체 친화성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 세포 구조체.

〔18〕〔1〕∼〔17〕중 어느 하나에 있어서, 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅하는 공정을 포함하는 세포 구조체의 제조 방법.

〔19〕〔18〕에 있어서, 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅하는 공정에 있어서 배지교환을 행하는 방법.

〔20〕〔19〕에 있어서, 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅하는 공정에 있어서 배지를 분화배지 또는 증식배지로 교환하는 방법.

〔21〕〔18〕∼〔20〕중 어느 하나에 있어서, 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅하는 공정에 있어서 생체 친화성을 갖는 고분자 블록을 더 첨가하는 방법.

〔22〕〔18〕∼〔21〕 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 제조되는 세포 구조체.

〔23〕〔1〕∼〔17〕 중 어느 하나에 기재된 세포 구조체의 복수개를 융합함으로써 얻어지는 세포 구조체.

〔24〕〔23〕에 있어서, 〔1〕∼〔17〕 중 어느 하나에 기재된 세포 구조체의 복수개를 융합하는 공정을 포함하는 세포 구조체의 제조 방법.

〔25〕생체 친화성을 갖는 복수개의 고분자 블록과 복수개의 세포를 포함하고, 상기 복수개의 세포에 의해 형성되는 복수개의 간극의 일부 또는 전부에 1개 또는 복수개의 상기 고분자 블록이 모자이크상으로 배치되어 있는 세포 구조체를 복수개 융합시키는 공정을 포함하는 세포 구조체의 제조 방법.

〔26〕〔25〕에 있어서, 상기 고분자 블록의 크기는 1㎛ 이상 700㎛ 이하인 세포 구조체의 제조 방법.

〔27〕〔25〕 또는 〔26〕에 있어서, 상기 융합 전의 각 세포 구조체의 두께 또는 직경이 10㎛ 이상 1cm 이하이며, 상기 융합 후의 두께 또는 직경이 400㎛ 이상 3cm 이하인 세포 구조체의 제조 방법.

〔28〕생체 친화성을 갖는 복수개의 제 1 고분자 블록과 복수개의 세포를 포함하고, 상기 복수개의 세포에 의해 형성되는 복수개의 간극의 일부 또는 전부에 1개 또는 복수개의 상기 고분자 블록이 모자이크상으로 배치되어 있는 세포 구조체에 제 2 고분자 블록을 더 첨가해서 인큐베이팅하는 공정을 포함하는 세포 구조체의 제조 방법.

*〔29〕〔28〕에 있어서, 상기 제 1 고분자 블록의 크기는 1㎛ 이상 700㎛ 이하인 세포 구조체의 제조 방법.

〔30〕〔28〕 또는 〔29〕에 있어서, 상기 제 2 고분자 블록의 크기는 1㎛ 이상 700㎛ 이하인 세포 구조체의 제조 방법.

〔31〕〔28〕∼〔30〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 제 2 고분자 블록을 첨가해서 인큐베이팅한 후의 두께 또는 직경이 400㎛ 이상 3cm 이하인 세포 구조체의 제조 방법.

〔32〕〔25〕∼〔31〕 중 어느 하나에 기재된 세포 구조체의 제조 방법에 의해 제조되는 세포 구조체.

〔33〕〔32〕에 있어서, 세포이식, 세포배양 또는 독성 평가 용도로 사용하는 세포 구조체.

본 발명의 세포 구조체는 조직 재생에 충분한 두께를 갖고, 또한 구조체내에서 세포가 균일하게 존재하고 있다. 또 본 발명의 세포 구조체는 목적 세포 이외의 세포를 사용하지 않고 제조 가능하다. 또한 본 발명의 세포 구조체는 세포 구조체끼리가 자연히 융합 가능하다. 본 발명의 세포 구조체는 기능 장해나 기능 부전에 빠진 생체조직·장기의 재생을 꾀하는 재생 의료에 유용하다.

도 1은 재조합 젤라틴 μ블록으로 제작한 모자이크 세포덩어리의 Day7(연골 분화 배지)의 실체 현미경 사진을 나타낸다.
도 2는 천연 젤라틴 μ블록으로 제작한 모자이크 세포덩어리의 Day7(연골 분화 배지)의 실체 현미경 사진을 나타낸다.
도 3은 재조합 젤라틴 μ블록을 사용한 모자이크 세포덩어리의 절편사진(HE염색×5배)을 나타낸다.
도 4는 재조합 젤라틴 μ블록을 사용한 모자이크 세포덩어리의 절편사진(HE염색×10배)을 나타낸다.
도 5는 재조합 젤라틴 μ블록을 사용한 모자이크 세포덩어리의 절편사진(HE염색×40배)을 나타낸다.
도 6은 모자이크 세포덩어리의 융합을 나타낸다.
도 7은 모자이크 세포덩어리의 융합(3개의 모자이크 세포덩어리를 융합)의 HE염색 절편사진(×5배)을 나타낸다.
도 8은 모자이크 세포덩어리의 융합(3개의 모자이크 세포덩어리를 융합)의 HE염색 절편사진(×10배)을 나타낸다.
도 9는 모자이크 세포덩어리의 융합(3개의 모자이크 세포덩어리를 융합)의 HE염색 절편사진(×20배)을 나타낸다.
도 10은 모자이크 세포덩어리의 융합(3개의 모자이크 세포덩어리를 융합)의 HE염색 절편사진(×5배)을 나타낸다.
도 11은 모자이크 세포덩어리의 융합(3개의 모자이크 세포덩어리를 융합)의 HE염색 절편사진(×10배)을 나타낸다.
도 12는 볼륨업한 모자이크 세포덩어리의 실체 현미경 사진(경시 변화)을 나타낸다.
도 13은 볼륨업한 모자이크 세포덩어리의 실체 현미경 사진으로부터의 직경의 경시 변화를 나타낸다.
도 14는 볼륨업한 모자이크 세포덩어리의 실체 현미경 사진으로부터의 면적의 경시 변화를 나타낸다.
도 15는 볼륨업한 모자이크 세포덩어리의 실체 현미경 사진으로부터 계산으로 산출한 체적(4/3πr³)의 경시 변화를 나타낸다.
도 16은 재조합 젤라틴 μ블록을 사용한 모자이크 세포덩어리의 절편(Day7(증식배지하)×5배)을 나타낸다.
도 17은 재조합 젤라틴 μ블록을 사용한 모자이크 세포덩어리의 절편(Day7(증식배지하)×10배)을 나타낸다.
도 18은 볼륨업한 Day21(증식배지하에서 재조합 젤라틴 블록을 추가)의 HE 절편사진(×5배)을 나타낸다.
도 19는 볼륨업한 Day21(증식배지하에서 재조합 젤라틴 블록을 추가)의 HE 절편사진(×40배)
도 20은 볼륨업한 Day21(연골 분화 배지하에서 재조합 젤라틴 블록을 추가)의 HE 절편사진(×5배×20배)을 나타낸다.
도 21은 GAG 스펙트럼 데이터를 나타낸다.
도 22는 모자이크 세포덩어리내의 GAG 산생량의 경시 변화를 나타낸다.
도 23은 모자이크 세포덩어리(Day7)내의 세포가 산생·유지하고 있는 ATP량을 나타낸다.
도 24는 PLGA μ블록으로 제작한 모자이크 세포덩어리의 Day2(증식배지)의 실체 현미경 사진을 나타낸다.
도 25는 심근세포와 재조합 젤라틴 μ블록을 사용한 모자이크 세포덩어리가 전체적으로 동기 박동하고 있는 모양을 나타낸다.
도 26은 GFP 발현 HUVEC와 재조합 젤라틴 μ블록을 사용한 모자이크 세포덩어리의 형광 현미경 사진, 및 현미경 사진을 나타낸다.(5만cells+0.03mg의 모자이크 세포덩어리와, 30만cells+0.2mg의 모자이크 세포덩어리)

이하, 본 발명의 실시형태에 대해서 상세하게 설명한다.

본 발명의 세포 구조체는 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포를 포함하고, 상기 복수개의 세포 사이의 간극에 복수개의 상기 고분자 블록이 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 것이다. 실시형태로서 생체 친화성을 갖는 복수개의 고분자 블록과 복수개의 세포를 포함하고, 상기 복수개의 세포에 의해 형성되는 복수개의 간극의 일부 또는 전부에 1개 또는 복수개의 상기 고분자 블록이 배치되어 있는 세포 구조체를 들 수 있다.

본 발명에 의한 고분자 블록의 형상은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 부정형, 구상, 입자상, 분말상, 다공질상, 섬유상, 방추상, 편평상 및 시트상이며, 바람직하게는 부정형, 구상, 입자상, 분말상 및 다공질상이며, 보다 바람직하게는 부정형이다. 부정형이란 표면형상이 균일하지 않는 것을 나타내고, 예를 들면, 바위와 같은 요철을 갖는 것을 나타낸다.

본 발명의 세포 구조체는 복수개의 세포 사이의 간극에 복수개의 상기 고분자 블록이 배치되어 있지만, 여기에서, 「세포 사이의 간극」이란 구성되는 세포에 의해 폐쇄된 공간일 필요는 없고 세포에 의해 끼워져 있으면 좋다. 또한, 모든 세포 사이에 간극이 있을 필요는 없고, 세포끼리가 접촉하고 있는 개소가 있어도 좋다. 고분자 블록을 개재한 세포 사이의 간극의 거리, 즉, 어떤 세포와 그 세포로부터 최단 거리에 존재하는 세포를 선택했을 때의 간극거리는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 고분자 블록의 크기인 것이 바람직하고, 바람직한 거리도 고분자 블록의 바람직한 크기의 범위이다.

또, 본 발명에 의한 고분자 블록은 세포에 의해 끼워진 구성으로 되지만, 모든 고분자 블록간에 세포가 있을 필요는 없고, 고분자 블록끼리가 접촉하고 있는 개소가 있어도 좋다. 세포를 개재한 고분자 블록간의 거리, 즉, 고분자 블록과 그 고분자 블록으로부터 최단 거리에 존재하는 고분자 블록을 선택했을 때의 거리는 특별히 제한되는 것이 아니지만, 사용되는 세포가 1개∼수개 모였을 때의 세포의 덩어리의 크기인 것이 바람직하고, 예를 들면, 10㎛ 이상 1000㎛ 이하이며, 바람직하게는 10㎛ 이상 100㎛ 이하이며, 보다 바람직하게는 10㎛ 이상 50㎛ 이하이다.

(1)생체 친화성을 갖는 고분자 재료

(1-1)고분자 재료

본 발명에서 사용하는 생체 친화성을 갖는 고분자는 생체에 친화성을 갖는 것이면 생체내에서 분해되는지의 여부는 특별히 한정되지 않지만, 생분해성 재료로 구성되는 것이 바람직하다. 비생분해성 재료로서 구체적으로는 PTFE, 폴리우레탄, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 염화비닐, 폴리카보네이트, 아크릴, 스테인레스, 티타늄, 실리콘, MPC로부터 선택되는 적어도 1개 이상으로 이루어지는 재료를 들 수 있다. 생분해성 재료로서는 구체적으로는 폴리펩티드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, PLGA, 히알루론산, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 콘드로이틴, 셀룰로오스, 아가로스, 카르복시메틸셀룰로오스, 키틴, 키토산으로부터 선택되는 적어도 1개 이상으로 이루어지는 재료를 들 수 있다. 상기 중에서도 폴리펩티드가 특히 바람직하다. 또한, 이들 고분자 재료에는 세포 접착성을 높이는 연구가 이루어져 있어도 좋고, 구체적인 방법으로서는 1. 「기재 표면에 대한 세포 접착 기질(피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌)이나 세포 접착 서열(아미노산한 문자표기로 나타내어지는 RGD서열, LDV서열, REDV서열, YIGSR서열, PDSGR서열, RYVVLPR서열, LGTIPG서열, RNIAEIIKDI서열, IKVAV서열, LRE서열, DGEA서열, 및 HAV서열) 펩티드에 의한 코팅」, 2. 「기재 표면의 아미노화, 양이온화」, 3. 「기재 표면의 플라즈마 처리, 코로나 방전에 의한 친수성 처리」라는 방법이 이용될 수 있다.

폴리펩티드의 종류는 생체 친화성을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 프로넥틴, 라미닌, 테나신, 피브린, 피브로인, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 레트로넥틴이 바람직하고, 가장 바람직하게는 젤라틴, 콜라겐, 아테로콜라겐이다. 본 발명에서 사용하기 위한 젤라틴으로서는 천연 젤라틴, 또는 유전자 재조합 젤라틴이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 유전자 재조합 젤라틴이다. 여기에서 말하는 천연 젤라틴이란 천연 유래의 콜라겐으로 제작된 젤라틴을 의미한다. 유전자 재조합 젤라틴에 대해서는 본 명세서에서 나중에 기재한다.

본 발명에서 사용하는 생체 친화성을 갖는 고분자의 친수성값 「1/IOB」값은 0∼1.0이 바람직하다. 보다 바람직하게는 0∼0.6이며, 더욱 바람직하게는 0∼0.4이다. IOB란 후지타 보쿠에 의해 제안된 유기 화합물의 극성/비극성을 나타내는 유기 개념도에 의거하는 친소수성의 지표이며, 그 상세는 예를 들면, "Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173(1954), 「화학의 영역」 vol.11, 10, pp.719-725(1957), 「fragrance 저널」, vol.50, pp.79-82(1981) 등에서 설명되고 있다. 간결하게 말하면 모든 유기 화합물의 근원을 메탄(CH₄)으로 하고, 다른 화합물은 모두 메탄의 유도체로 간주해서 그 탄소수, 치환기, 변태부, 환 등에 각각 일정한 수치를 설정하고, 그 스코어를 가산해서 유기성값(OV), 무기성값(IV)을 구하고, 이 값을 유기성값을 X축, 무기성값을 Y축에 취한 도면 상에 플롯해 나가는 것이다. 유기 개념도에 있어서의 IOB란 유기 개념도에 있어서의 유기성값(OV)에 대한 무기성값(IV)의 비, 즉 「무기성값(IV)/유기성값(OV)」을 말한다. 유기 개념도의 상세에 대해서는 「신판 유기 개념도 -기초와 응용-」(코우다 요시오 등 저, 미모토 슛판, 2008)을 참조하면 좋다. 본 명세서 중에서는 IOB의 역수를 취한 「1/IOB」값으로 친소수성을 나타내고 있다. 「1/IOB」값이 작을수록(0에 가까울수록) 친수성인 것을 나타내는 표기이다.

본 발명에서 사용하는 고분자의 「1/IOB」값을 상기 범위로 함으로써 친수성이 높고, 또한 흡수성이 높아지는 점에서 영양성분의 유지에 유효하게 작용하고, 결과적으로 본 발명의 세포 3차원 구조체(모자이크 세포덩어리)에 있어서의 세포의 안정화·생존하기 쉬움에 기여하는 것이라고 추정된다.

본 발명에서 사용하는 생체 친화성을 갖는 고분자가 폴리펩티드인 경우는 Grand average of hydropathicity(GRAVY)값으로 나타내어지는 친소수성 지표에 있어서 0.3 이하, -9.0 이상인 것이 바람직하고, 0.0 이하, -7.0 이상인 것이 더욱 바람직하다. Grand average of hydropathicity（GRAVY)값은 『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp.571-607』 및 『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res.31: 3784-3788(2003).』의 방법에 의해 얻을 수 있다.

본 발명에서 사용하는 고분자의 GRAVY값을 상기 범위로 함으로써 친수성이 높고, 또한 흡수성이 높아지는 점에서 영양성분의 유지에 유효하게 작용하고, 결과적으로 본 발명의 세포 3차원 구조체(모자이크 세포덩어리)에 있어서의 세포의 안정화·생존하기 쉬움에 기여하는 것이라고 추정된다.

(1-2)가교

본 발명에서 사용하는 생체 친화성을 갖는 고분자 재료는 가교되어 있는 것이라도 좋고, 가교되어 있지 않는 것이라도 좋지만, 가교되어 있는 것이 바람직하다. 가교 방법으로서는 열가교, 화학가교, 알데히드류(예를 들면, 포름알데히드, 글루탈알데히드 등)에 의한 가교, 축합제(카르보디이미드, 시아나미드 등)에 의한 가교, 효소가교, 광가교, UV가교, 소수성 상호작용, 수소결합, 이온성 상호작용 등 공지의 방법을 사용할 수 있지만, 글루탈알데히드를 사용한 가교법, 열가교법이 바람직하다.

광가교로서는 광반응성기를 도입한 고분자에의 광조사, 또는 광증감제의 존재화에서의 광조사에 의한 것을 들 수 있다. 광반응성기로서는 예를 들면, 신나밀기, 쿠마린기, 디티오카르바밀기, 크산텐 색소, 캠퍼퀴논을 들 수 있다.

효소에 의한 가교를 행할 경우 효소로서는 고분자 재료간의 가교 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 트랜스글루타미나아제 및 락카아제, 가장 바람직하게는 트랜스글루타미나아제를 사용해서 가교를 행할 수 있다. 트랜스글루타미나아제로 효소 가교하는 단백질의 구체예로서는 리신 잔기 및 글루타민 잔기를 갖는 단백질이면 특별히 제한되지 않는다. 트랜스글루타미나아제는 포유류 유래의 것이어도, 미생물 유래의 것이어도 좋고, 구체적으로는 아지노모토(주)제 액티바 시리즈, 시약으로서 발매되고 있는 포유류 유래의 트랜스글루타미나아제, 예를 들면, 오리엔탈 코우보 고교(주)제, Upstate USA Inc.제, Biodesign International제 등의 모르모트 간장 유래 트랜스글루타미나아제, 염소 유래 트랜스글루타미나아제, 토끼 유래 트랜스글루타미나아제 등, 인간 유래의 혈액 응고 인자(Factor XIIIa, Haematologic Technologies， Inc.사) 등을 들 수 있다.

고분자 재료의 가교에는 고분자 재료의 용액과 가교제를 혼합하는 과정과 이들 용액의 반응하는 과정 2개의 과정을 갖는다.

본 발명에 있어서 고분자 재료를 가교제로 처리할 때의 혼합 온도는 용액을 혼합할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 0℃∼100℃이며, 보다 바람직하게는 0℃∼40℃이며, 더욱 바람직하게는 0℃∼30℃이며, 더욱 바람직하게는 3℃∼25℃이며, 더욱 바람직하게는 3℃∼15℃이며, 더욱 바람직하게는 3℃∼10℃이며, 특히 바람직하게는 3℃∼7℃이다.

고분자 재료와 가교제의 반응 과정에서는 온도를 상승시킬 수 있다. 반응 온도로서는 가교가 진행되는 한은 특별히 한정은 없지만, 고분자 재료의 변성이나 분해를 고려하면 실질적으로는 -100℃∼200℃이며, 보다 바람직하게는 0℃∼60℃이며, 보다 바람직하게는 0℃∼40℃이며, 보다 바람직하게는 3℃∼25℃이며, 보다 바람직하게는 3℃∼15℃이며, 더욱 바람직하게는 3℃∼10℃이며, 특히 바람직하게는 3℃∼7℃이다.

또, 가교제를 사용하지 않아도 고분자 재료의 가교를 행할 수 있다. 상기 가교법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 구체적으로는 열가교법을 들 수 있다.

가교제를 사용하지 않는 가교법으로 할 때의 반응 온도는 가교를 할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 -100℃∼500℃이며, 보다 바람직하게는 0℃∼300℃이며, 더욱 바람직하게는 50℃∼300℃이며, 더욱 바람직하게는 100℃∼250℃이며, 더욱 바람직하게는 120℃∼200℃이다.

(1-3)유전자 재조합 젤라틴

본 발명에 의한 유전자 재조합 젤라틴이란 유전자 재조합 기술에 의해 제작된 젤라틴 유사의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 단백형 물질을 의미한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 유전자 재조합 젤라틴은 콜라겐에 특징적인 Gly-X-Y로 나타내어지는 서열(X 및 Y는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다)의 반복을 갖는 것이 바람직하다(복수개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다). 바람직하게는 세포 접착 시그널을 1분자 중에 2서열 이상 포함하고 있다. 본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴으로서는 콜라겐의 부분 아미노산 서열에 유래하는 아미노산 서열을 갖는 유전자 재조합 젤라틴을 사용할 수 있고, 예를 들면 EP1014176A2, US6992172, WO2004-85473, WO2008/103041 등에 기재된 것을 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴으로서 바람직한 것은 이하의 형태의 유전자 재조합 젤라틴이다.

본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴은 천연의 젤라틴 본래의 성능으로부터 생체 적합성이 우수하고, 또한 천연유래가 아닌 것에 의해 BSE 등의 우려가 없어 비감염성이 우수하다. 또한, 본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴은 천연의 것에 비해서 균일하며, 서열이 결정되어 있으므로 강도, 분해성에 있어서도 후술의 가교 등에 의해 변이를 적고 정밀하게 설계하는 것이 가능하다.

유전자 재조합 젤라틴의 분자량은 2KDa 이상 100KDa 이하인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 2.5KDa 이상 95KDa 이하이다. 보다 바람직하게는 5KDa 이상 90KDa 이하이다. 가장 바람직하게는 10KDa 이상 90KDa 이하이다.

유전자 재조합 젤라틴은 콜라겐에 특징적인 Gly-X-Y로 나타내어지는 서열의 반복을 갖는다. 여기에서, 복수개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다. Gly-X-Y에 있어서 Gly는 글리신, X 및 Y는 임의의 아미노산(바람직하게는 글리신 이외의 임의의 아미노산)을 나타낸다. 콜라겐에 특징적인 GXY 서열이란 젤라틴·콜라겐의 아미노산 조성 및 서열에 있어서의 다른 단백질과 비교해서 매우 특이적인 부분 구조이다. 이 부분에 있어서는 글리신이 전체의 약 3분의 1을 차지하고, 아미노산 서열에서는 3개에 1개의 반복으로 되어 있다. 글리신은 가장 간단한 아미노산이며, 분자쇄의 배치에의 속박도 적고, 겔화에 있어서의 헤릭스 구조의 재생에 크게 기여하고 있다. X, Y로 나타내어지는 아미노산은 이미노산(프롤린, 옥시프롤린)이 많이 포함되고, 전체의 10%∼45%를 차지하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 그 서열의 80% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 아미노산이 GXY의 반복 구조인 것이 바람직하다.

일반적인 젤라틴은 극성 아미노산 중 전하를 갖는 것과 무전하의 것이 1:1로 존재한다. 여기에서, 극성 아미노산이란 구체적으로 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘, 리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 아르기닌을 가리키고, 이 중 극성 무전하 아미노산이란 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신을 가리킨다. 본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴에 있어서는 구성하는 전체 아미노산 중 극성 아미노산의 비율이 10∼40%이며, 바람직하게는 20∼30%이다. 또한 상기 극성 아미노산 중의 무전하 아미노산의 비율이 5% 이상 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만인 것이 바람직하다. 또한, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 티로신, 시스테인 중 어느 하나의 아미노산, 바람직하게는 2 이상의 아미노산을 서열 상에 포함하지 않는 것이 바람직하다.

일반적으로 폴리펩티드에 있어서 세포 접착 시그널로서 작용하는 최소 아미노산 서열이 알려져 있다(예를 들면, 가부시키가이샤 나가이 출판 발행 「병태생리」Vol. 9, No. 7(1990년) 527페이지). 본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴은 이들의 세포 접착 시그널을 1분자 중에 2 이상 갖는 것이 바람직하다. 구체적인 서열로서는 접착하는 세포의 종류가 많다고 하는 점에서 아미노산 1문자 표기로 나타내어지는 RGD서열, LDV서열, REDV서열, YIGSR서열, PDSGR서열, RYVVLPR서열, LGTIPG서열, RNIAEIIKDI서열, IKVAV서열, LRE서열, DGEA서열, 및 HAV서열의 서열이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 RGD서열, YIGSR서열, PDSGR서열, LGTIPG서열, IKVAV서열 및 HAV서열, 특히 바람직하게는 RGD서열이다. RGD서열 중 바람직하게는 ERGD서열이다. 세포 접착 시그널을 갖는 유전자 재조합 젤라틴을 사용함으로써 세포의 기질 산생량을 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 세포로서 간엽계 줄기세포를 사용한 연골분화의 경우에는 글리코사미노글리칸(GAG)의 산생을 향상시킬 수 있다.

본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴에 있어서의 RGD서열의 배치로서 RGD간의 아미노산수가 0∼100 사이, 바람직하게는 25∼60 사이에서 균일하지 않은 것이 바람직하다.

이 최소 아미노산 서열의 함유량은 세포 접착·증식성의 관점에서 단백질 1분자 중 3∼50개가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 4∼30개, 특히 바람직하게는 5∼20개이다. 가장 바람직하게는 12개이다.

본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴에 있어서 아미노산 총수에 대한 RGD 모티프의 비율은 적어도 0.4%인 것이 바람직하고, 유전자 재조합 젤라틴이 350 이상의 아미노산을 포함하는 경우에 350의 아미노산의 각 스트레치가 적어도 1개의 RGD 모티프를 포함하는 것이 바람직하다. 아미노산 총수에 대한 RGD 모티프의 비율은 더욱 바람직하게는 적어도 0.6%이며, 더욱 바람직하게는 적어도 0.8%이며, 더욱 바람직하게는 적어도 1.0%이며, 더욱 바람직하게는 적어도 1.2%이며, 가장 바람직하게는 적어도 1.5%이다. 유전자 재조합 젤라틴내의 RGD 모티프의 수는 250의 아미노산당 바람직하게는 적어도 4, 더욱 바람직하게는 6, 더욱 바람직하게는 8, 더욱 바람직하게는 12 이상 16 이하이다. RGD 모티프의 0.4%라는 비율은 250의 아미노산당 적어도 1개의 RGD서열에 대응한다. RGD 모티프의 수는 정수이므로 0.4%의 특징을 충족시키기 위해서는 251의 아미노산으로 이루어지는 젤라틴은 적어도 2개의 RGD서열을 포함하지 않으면 안된다. 바람직하게는 본 발명의 유전자 재조합 젤라틴은 250의 아미노산당 적어도 2개의 RGD서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 250의 아미노산당 적어도 3개의 RGD서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 250의 아미노산당 적어도 4개의 RGD서열을 포함한다. 본 발명의 유전자 재조합 젤라틴의 새로운 형태로서는 적어도 4개의 RGD 모티프, 바람직하게는 6개, 보다 바람직하게는 8개, 더욱 바람직하게는 12 이상 16 이하의 RGD 모티프를 포함한다.

또, 유전자 재조합 젤라틴은 부분적으로 가수분해되어 있어도 좋다.

본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴은 A[(Gly-X-Y)n]mB의 반복 구조를 갖는 것이 바람직하다. m으로서 바람직하게는 2∼10, 바람직하게는 3∼5이다. n은 3∼100이 바람직하고, 15∼70이 더욱 바람직하고, 50∼65가 가장 바람직하다.

반복단위에는 천연에 존재하는 콜라겐의 서열 단위를 복수 결합하는 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 천연에 존재하는 콜라겐이란 천연에 존재하는 것이면 어느 것이어도 상관없지만, 바람직하게는 I형, II형, III형, IV형, 및 V형이다. 보다 바람직하게는 I형, II형, III형이다. 다른 형태에 의하면 상기 콜라겐의 유래는 바람직하게는 인간, 소, 돼지, 마우스, 래트이다. 보다 바람직하게는 인간이다.

본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴의 등전점은 바람직하게는 5∼10이며, 보다 바람직하게는 6∼10이며, 더욱 바람직하게는 7∼9.5이다.

바람직하게는 유전자 재조합 젤라틴은 탈아민화되어 있지 않다.

바람직하게는 유전자 재조합 젤라틴은 테로펩타이드를 갖지 않는다.

바람직하게는 유전자 재조합 젤라틴은 천연 콜라겐을 인코딩하는 핵산에 의해 조제된 실질적으로 순수한 콜라겐용 재료이다.

본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴으로서 특히 바람직하게는

(1)서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열; 또는

(2)서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상(더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상)의 상동성을 갖고, 생체 친화성을 갖는 아미노산 서열;

을 갖는 유전자 재조합 젤라틴이다.

본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴은 당업자에게 공지의 유전자 재조합 기술에 의해 제조할 수 있고, 예를 들면 EP1014176A2, US6992172, WO2004-85473, WO2008/103041 등에 기재된 방법에 준해서 제조할 수 있다. 구체적으로는 소정의 유전자 재조합 젤라틴의 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자를 취득하고, 이것을 발현 벡터에 포함하고, 재조합 발현 벡터를 제작하고, 이것을 적당한 숙주에 도입해서 형질 전환체를 제작한다. 얻어진 형질 전환체를 적당한 배지에서 배양함으로써 유전자 재조합 젤라틴이 산생되므로 배양물로부터 산생된 유전자 재조합 젤라틴을 회수함으로써 본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴을 조제할 수 있다.

(1-4)생체 친화성을 갖는 고분자 블록

본 발명에서는 상기한 생체 친화성을 갖는 고분자로 이루어지는 블록(덩어리)을 사용한다. 고분자 블록의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 고분자로 이루어지는 고형물을 분쇄기(뉴파워밀 등)를 사용해서 분쇄한 후에 체로 사이즈 분류함으로써 소망의 사이즈의 블록을 취득할 수 있다.

고분자 블록의 크기는 바람직하게는 1㎛ 이상 700㎛ 이하이며, 보다 바람직하게는 10㎛ 이상 700㎛ 이하이며, 더욱 바람직하게는 10㎛ 이상 300㎛ 이하이며, 더욱 바람직하게는 20㎛ 이상 150㎛ 이하이며, 특히 바람직하게는 25㎛ 이상 106㎛ 이하이다. 또한, 고분자 블록은 상기 사이즈를 굵기로 하는 700㎛ 이상의 긴 끈형상이어도 좋고, 또한 상기 사이즈를 두께로 하는 시트상, 겔상이어도 좋다. 상기 바람직한 범위로 함으로써 보다 구조체내에서 세포가 보다 균일하게 존재할 수 있다.

(2)세포

본 발명에서 사용하는 세포는 본 발명의 세포 구조체의 목적에 따라서 적당히 선택할 수 있고, 그 종류는 특별히 한정되지 않는다. 또한, 세포는 세포 구조체의 사용 목적에 따라서 1종이어도 복수종 조합해서 사용해도 좋다. 사용하는 세포로서 바람직하게는 동물세포이며, 보다 바람직하게는 척추동물 유래 세포, 특히 바람직하게는 인간 유래 세포이다. 척추동물 유래 세포(특히, 인간 유래 세포)의 종류는 만능세포, 체성 줄기세포, 전구세포, 또는 성숙세포 중 어느 것이라도 좋다. 만능세포로서는 예를 들면, ES세포, GS세포, 또는 iPS세포를 사용할 수 있다. 체성 줄기세포로서는 예를 들면, 간엽계 줄기세포(MSC), 조혈줄기세포, 양막세포, 제대혈세포, 골수 유래 세포, 심근줄기세포, 지방 유래 줄기세포, 또는 신경줄기세포를 사용할 수 있다. 전구세포 및 성숙세포로서는 예를 들면, 피부, 진피, 표피, 근육, 심근, 신경, 뼈, 연골, 내피, 뇌, 상피, 심장, 신장, 간장, 췌장, 비장, 구강내, 각막, 골수, 제대혈, 양막, 또는 털에 유래하는 세포를 사용할 수 있다. 인간 유래 세포로서는 예를 들면, ES세포, iPS세포, MSC, 연골세포, 골아세포, 골아전구세포, 간충직세포, 근아세포, 심근세포, 심근아세포, 신경세포, 간세포, 베타세포, 섬유아세포, 각막내피세포, 혈관내피세포, 각막상피세포, 양막세포, 제대혈세포, 골수 유래 세포, 또는 조혈줄기세포를 사용할 수 있다. 또한, 세포의 유래는 자가세포 또는 타가세포 중 어느 것이라도 상관없다. 복수종의 세포를 조합해서 사용할 경우에는 예를 들면, 혈관계의 세포와 다른 세포를 들 수 있다. 혈관계의 세포란 혈관내피세포, 혈관내피 전구세포, 조혈줄기세포 등이 있다. 혈관계의 세포와 다른 세포를 조합함으로써 혈관을 본 발명의 세포 구조체에 유도할 수 있어 영양, 산소 등을 공급할 수 있다.

(3)세포 구조체

본 발명에 있어서는 상기한 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 상기한 세포를 사용해서 복수개의 세포 사이의 간극에 복수개의 상기 고분자 블록을 모자이크상으로 3차원적으로 배치시킴으로써 외부로부터 세포 3차원 구조체의 내부에의 영양송달을 가능하게 하고, 충분한 두께를 가진 세포 3차원 구조체를 형성하는 것에 성공했다. 동시에 세포 3차원 구조체의 외주부에 존재하는 세포의 활동에 의해 세포 3차원 구조체끼리의 자연융합을 가능하게 했다.

본 발명의 세포 구조체의 두께 또는 직경은 본 명세서내에서 후기하는 방법에 의해 소망의 두께로 할 수 있지만, 하한으로서는 215㎛ 이상인 것이 바람직하고, 400㎛ 이상이 더욱 바람직하고, 730㎛ 이상인 것이 가장 바람직하다. 두께 또는 직경의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 사용상의 일반적인 범위로서는 3cm 이하가 바람직하고, 2cm 이하가 보다 바람직하고, 1cm 이하인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 세포 구조체의 두께 또는 직경의 범위로서 바람직하게는 400㎛ 이상 3cm 이하, 보다 바람직하게는 500㎛ 이상 2cm 이하, 더욱 바람직하게는 720㎛ 이상 1cm 이하이다. 또한, 실시예에서는 720㎛ 이상의 세포 구조체(도 3)를 제작한 후 융합시켜서 813㎛의 두께를 갖는 세포 구조체를 제작(도 10)했다. 본 발명의 세포 구조체는 고분자 블록으로 이루어지는 영역과 세포로 이루어지는 영역이 모자이크상으로 배치되어 있는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 명세서 중에 있어서의 「세포 구조체의 두께 또는 직경」이란 이하를 나타내는 것으로 한다. 세포 구조체내의 어느 한점 A를 선택했을 때에 그 점 A를 통과하는 직선 중에서 세포 구조체 외계로부터의 거리가 최단이 되도록 세포 구조체를 분단하는 선분의 길이를 선분 A로 한다. 세포 구조체내에서 그 선분 A가 최장이 되는 점 A를 선택하고, 그 때의 선분 A의 길이를 「세포 구조체의 두께 또는 직경」으로 한다.

본 발명의 세포 구조체는 충분한 두께를 가질 수 있고, 또한, 세포가 균일하게 존재할 수 있는 점에서 세포이식, 세포배양 및 독성 평가 등에 바람직하게 사용할 수 있다. 이들 용도로 본 발명의 세포 구조체를 사용할 때에는 본 발명의 세포 구조체의 두께 또는 직경은 상기 범위로 하는 것이 바람직하다.

또, 후술하는 본 발명의 세포 구조체의 제조 방법에서의 융합 전의 세포 구조체, 또는 제 2 고분자 블록 첨가전의 세포 구조체로서 본 발명의 세포 구조체를 사용하는 경우에는 세포 구조체의 두께 또는 직경의 범위로서 바람직하게는 10㎛ 이상 1cm 이하, 보다 바람직하게는 10㎛ 이상 2000㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 15㎛ 이상 1500㎛ 이하, 가장 바람직하게는 20㎛ 이상 1300㎛ 이하이다.

본 발명의 세포 구조체는 세포와 고분자 블록의 비율은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 세포 1개당 고분자 블록의 비율이 0.0000001㎍ 이상 1.0㎍ 이하인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.000001㎍ 이상 0.1㎍ 이하, 보다 바람직하게는 0.00001㎍ 이상 0.01㎍ 이하, 가장 바람직하게는 0.00002㎍ 이상 0.006㎍ 이하이다. 상기 범위로 함으로써 보다 세포를 균일하게 존재시킬 수 있다. 또한, 하한을 상기 범위로 함으로써 상기 용도로 사용했을 때에 세포의 효과를 발휘할 수 있고, 상한을 상기 범위로 함으로써 임의로 존재하는 고분자 블록 중의 성분을 세포에 공급할 수 있다. 여기에서, 고분자 블록 중의 성분은 특별히 제한되지 않지만, 후술하는 배지에 포함되는 성분을 들 수 있다.

(4)세포 구조체의 제조 방법

본 발명의 세포 구조체는 생체 친화성을 가진 고분자 재료로 이루어지는 덩어리(「블록」)와, 세포를 교대로 배치함으로써 제조할 수 있다. 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 고분자 블록을 형성한 후 세포를 파종하는 방법이다. 구체적으로는 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅함으로써 본 발명의 세포 구조체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 용기내 용기에 유지되는 액체 중에서 세포와, 미리 제작한 생체 친화성을 갖는 고분자 블록을 모자이크상으로 배치한다. 배치의 수단으로서는 자연응집, 자연낙하, 원심, 교반을 사용함으로써 세포와 생체 친화성 기재로 이루어지는 모자이크상의 서열 형성을 촉진, 제어하는 것이 바람직하다.

사용되는 용기로서는 세포 저접착성 재료, 세포 비접착성 재료로 이루어지는 용기가 바람직하고, 보다 바람직하게는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 유리, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트로 이루어지는 용기이다. 용기 저면의 형상은 평저형, U자형, V자형인 것이 바람직하다.

상기 방법으로 얻어진 모자이크상 세포 구조체는 예를 들면,

(1)따로따로 조정한 모자이크상 세포덩어리끼리를 융합시키거나, 또는

(2)분화배지 또는 증식배지하에서 볼륨업시킨다,

등의 방법에 의해 소망의 크기의 세포 구조체를 제조할 수 있다. 융합의 방법, 볼륨업의 방법은 특별히 한정되지 않는다.

예를 들면, 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅하는 공정에 있어서 배지를 분화배지 또는 증식배지로 교환함으로써 세포 구조체를 볼륨업시킬 수 있다. 바람직하게는 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅하는 공정에 있어서 생체 친화성을 갖는 고분자 블록을 더 첨가함으로써 소망의 크기의 세포 구조체이며, 세포 구조체내에 세포가 균일하게 존재하는 세포 구조체를 제조할 수 있다.

상기 따로따로 조정한 모자이크상 세포덩어리끼리를 융합시키는 방법이란 구체적으로는 생체 친화성을 갖는 복수개의 고분자 블록과, 복수개의 세포를 포함하고, 상기 복수의 세포에 의해 형성되는 복수개의 간극의 일부 또는 전부에 1개 또는 복수개의 상기 고분자 블록이 배치되어 있는 세포 구조체를 복수개 융합시키는 공정을 포함하는 세포 구조체의 제조 방법이다.

본 발명의 세포 구조체의 제조 방법에 의한 「생체 친화성을 갖는 고분자 블록(종류, 크기 등)」, 「세포」, 「세포 사이의 간극」, 「얻어지는 세포 구조체(크기 등)」, 「세포와 고분자 블록의 비율」 등의 바람직한 범위는 상기 본 발명의 세포 구조체에 관한 바람직한 범위와 동일하다.

또, 상기 융합 전의 각 세포 구조체의 두께 또는 직경이 10㎛ 이상 1cm 이하이며, 상기 융합 후의 두께 또는 직경이 400㎛ 이상 3cm 이하인 것이 바람직하다. 여기에서, 상기 융합 전의 각 세포 구조체의 두께 또는 직경으로서 보다 바람직하게는 10㎛ 이상 2000㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 15㎛ 이상 1500㎛ 이하, 가장 바람직하게는 20㎛ 이상 1300㎛ 이하이며, 또한, 상기 융합 후의 두께 또는 직경의 범위로서 보다 바람직하게는 500㎛ 이상 2cm 이하, 더욱 바람직하게는 720㎛ 이상 1cm 이하이다.

상술한 생체 친화성을 갖는 고분자 블록을 더 첨가함으로써 소망의 크기의 세포 구조체를 제조하는 방법이란 구체적으로는 생체 친화성을 갖는 복수개의 제 1 고분자 블록과, 복수개의 세포를 포함하고, 상기 복수의 세포에 의해 형성되는 복수개의 간극의 일부 또는 전부에 1개 또는 복수개의 상기 고분자 블록이 배치되어 있는 세포 구조체에 또한 제 2 고분자 블록을 첨가해서 인큐베이팅하는 공정을 포함하는 세포 구조체의 제조 방법이다. 여기에서, 「생체 친화성을 갖는 고분자 블록(종류, 크기 등)」, 「세포」, 「세포 사이의 간극」, 「얻어지는 세포 구조체(크기 등)」, 「세포와 고분자 블록의 비율」 등의 바람직한 범위는 상기 본 발명의 세포 구조체에 관한 바람직한 범위와 동일하다.

여기서, 융합시키고 싶은 세포 구조체끼리는 0 이상 50㎛ 이하의 거리로 설치하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0 이상 20㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 0 이상 5㎛ 이하의 거리이다. 세포 구조체끼리를 융합시킬 때 세포의 증식·신전에 의해 세포 또는 세포가 산생하는 기질이 접착제의 역활을 해서 접합시키는 것이 고려되며, 상기 범위로 함으로써 세포 구조체끼리의 접착이 용이하게 된다.

본 발명에 의한 제 1 고분자 블록의 크기는 바람직하게는 1㎛ 이상 700㎛ 이하이며, 보다 바람직하게는 10㎛ 이상 700㎛ 이하이며, 더욱 바람직하게는 10㎛ 이상 300㎛ 이하이며, 더욱 바람직하게는 20㎛ 이상 150㎛ 이하이며, 특히 바람직하게는 25㎛ 이상 106㎛ 이하이다. 또한, 본 발명에 의한 제 2 고분자 블록의 크기도 바람직하게는 1㎛ 이상 700㎛ 이하이며, 보다 바람직하게는 10㎛ 이상 700㎛ 이하이며, 더욱 바람직하게는 10㎛ 이상 300㎛ 이하이며, 더욱 바람직하게는 20㎛ 이상 150㎛ 이하이며, 특히 바람직하게는 25㎛ 이상 106㎛ 이하이다.

본 발명의 세포 구조체의 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 구조체의 두께 또는 직경의 범위로서 바람직하게는 400㎛ 이상 3cm 이하, 보다 바람직하게는 500㎛ 이상 2cm 이하, 더욱 바람직하게는 720㎛ 이상 1cm 이하이다.

세포 구조체에 또한 제 2 고분자 블록을 첨가해서 인큐베이팅할 때의 제 2 고분자 블록의 첨가하는 페이스는 사용하는 세포의 증식의 속도에 맞춰 적당히 선택하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 제 2 고분자 블록을 첨가하는 페이스가 빠르면 세포가 세포 구조체의 외측으로 이동하고, 세포의 균일성이 낮아지고, 첨가의 페이스가 느리면 세포의 비율이 많아지는 개소가 생겨 세포의 균일성이 낮아지기 때문에 사용하는 세포의 증식 속도를 고려해서 선택한다.

상기 본 발명의 세포 구조체의 제조 방법에 의해 제조된 세포 구조체는 소망의 형상·사이즈를 형성시킬 수 있고, 충분한 두께를 가질 수 있고, 또한, 세포가 균일하게 존재할 수 있는 점에서 세포이식, 세포배양 및 독성 평가 등에 바람직하게 사용할 수 있다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1:유전자 재조합 젤라틴

유전자 재조합 젤라틴(재조합 젤라틴)으로서 이하에 기재된 CBE3을 준비했다(WO2008-103041에 기재).

CBE3

분자량:51.6kD

구조:GAP[(GXY)63]3G

아미노산수:571개

RGD서열:12개

이미노산 함량:33%

거의 100%의 아미노산이 GXY의 반복 구조이다. CBE3의 아미노산 서열에는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 티로신 및 시스테인은 포함되어 있지 않다. CBE3은 ERGD서열을 갖고 있다.

등전점:9.34, GRAVY값:-0.682, 1/IOB값:0.323

아미노산 서열(서열표의 서열 번호 1)(WO2008/103041호 공보의 서열 번호 3과 같다. 단 말미의 X는 「P」로 수정)

GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAA GLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G

실시예 2:재조합 젤라틴 μ블록의 제작

기재 블록으로서 재조합 젤라틴 CBE3을 사용해서 부정형의 μ블록을 제작했다. 1000mg의 재조합 젤라틴을 9448μL의 초순수에 용해하고, 1N HCl을 152μL 첨가 후, 최종농도 1.0%가 되도록 25% 글루탈알데히드를 400μL 첨가하고, 50℃에서 3시간 반응시켜 가교 젤라틴 겔을 제작했다. 이 가교 젤라틴 겔을 1L의 0.2M 글리신 용액에 침지하고, 40℃ 2시간 진탕시켰다. 그 후, 가교 젤라틴 겔을 5L의 초순수내에서 1시간 진탕 세정하고, 초순수를 새로운 물로 치환하고, 다시 세정 1시간을 반복해서 총 6회 세정했다. 세정후의 가교 젤라틴 겔을 -80℃에서 5시간 동결시킨 후, 동결 건조기(EYELA, FDU-1000)로 동결 건조를 행했다. 얻어진 동결 건조체를 뉴파워밀(오사카 케미칼, 뉴파워밀 PM-2005)로 분쇄했다. 분쇄는 최대 회전수로 1분간×5회, 계 5분간의 분쇄로 행했다. 얻어진 분쇄물에 대해서 스테인레스제 체로 사이즈 분별하여 25∼53㎛ 및 53∼106㎛의 재조합 젤라틴 μ블록을 얻었다.

실시예 3:천연 젤라틴 μ블록의 제작

기재 블록으로서 천연 젤라틴(Nippi, 닛삐 젤라틴 ·하이그레이드 젤라틴 APAT)을 사용해서 부정형의 μ블록을 제작했다. 1000mg의 천연 젤라틴을 9448μL의 초순수에 용해하고, 1N HCl을 152μL 첨가후, 최종농도 1.0%가 되도록 25% 글루탈알데히드를 400μL 첨가하고, 50℃에서 3시간 반응시켜 가교 젤라틴 겔을 제작했다. 이 가교 젤라틴 겔을 1L의 0.2M 글리신 용액에 침지하고, 40℃에서 2시간 진탕시켰다. 그 후, 가교 젤라틴 겔을 5L의 초순수중에서 1시간 진탕 세정하고, 초순수를 새로운 물로 치환하고, 다시 세정 1시간을 반복해서 총 6회 세정했다. 세정후의 가교 젤라틴 겔을 -80℃에서 5시간 동결시킨 후, 동결 건조기(EYELA, FDU-1000)로 동결 건조를 행했다. 얻어진 동결 건조체를 뉴파워밀(오사카 케미칼, 뉴파워밀 PM-2005)로 분쇄했다. 분쇄는 최대 회전수로 1분간×5회, 총 5분간의 분쇄로 행했다. 얻어진 분쇄물에 대해서 스테인레스제 체로 사이즈 분별하여 25∼53㎛ 및 53∼106㎛의 천연 젤라틴 μ블록을 얻었다.

실시예 4:재조합 젤라틴 μ블록을 사용한 모자이크 세포덩어리의 제작

인간 골수 유래 간엽계 줄기세포(hMSC)를 증식배지(다카라 바이오:MSCGM-CD^TM BulletKit^TM)로 50만cells/mL로 조정하고, 실시예 2에서 제작한 재조합 젤라틴 μ블록을 1.0mg/mL가 되도록 첨가한 후, 100μL를 스미론셀타이트 X96U 플레이트(스미토모 베이크라이트, 바닥이 U자형)에 파종하고, 18시간 정치하고, 직경 1mm정도의 구상의 재조합 젤라틴 μ블록과 hMSC세포로 이루어지는 모자이크 세포덩어리를 제작했다(세포 1개당 0.002㎍의 고분자 블록). 그 후, 배지를 연골 분화 배지(다카라 바이오:hMSC Differentiation BulletKit^TM, Chondrogenic, TGF-β3)(200μL)로 치환했다. Day7에서 직경(=두께)이 1.54mm인 구상으로 모자이크 세포덩어리가 형성되었다(도 1). 또한, 본 모자이크 세포덩어리는 U자형의 플레이트내에서 제작하므로 구상으로 제작되었다. 배지교환은 Day3, 7, 10, 14, 17, 21에 행한다.

실시예 5:천연 젤라틴 μ블록을 사용한 모자이크 세포덩어리의 제작

인간 골수 유래 간엽계 줄기세포(hMSC)를 증식배지(다카라 바이오:MSCGM-CDTMBulletKit^TM)로 50만cells/mL로 조정하고, 실시예 3에서 제작한 천연 젤라틴 μ블록을 1.0mg/mL가 되도록 첨가한 후 100μL를 스미론셀타이트 X96U 플레이트에 파종하고, 18시간 정치하고, 직경 1mm 정도의 구상의 천연 젤라틴 μ블록과 hMSC세포로 이루어지는 모자이크 세포덩어리를 제작했다(세포 1개당 0.002㎍의 고분자 블록). 그 후, 배지를 연골 분화 배지(다카라 바이오:hMSC Differentiation BulletKit^TM, Chondrogenic, TGF-β3)(200μL)로 치환했다. Day7에서 직경(=두께) 1.34mm의 구상으로 모자이크 세포덩어리가 형성되었다(도 2). 또한, 본 모자이크 세포덩어리는 U자형의 플레이트내에서 제작하므로 구상으로 제작되었다.

인간 골수 유래 간엽계 줄기세포(hMSC)를 증식배지(다카라 바이오:MSCGM-CDTMBulletKit^TM)로 50만cells/mL로 조정하고, 실시예 3에서 제작한 천연 젤라틴 μ블록을 최종농도로 0.005mg/mL, 0.01mg/mL, 0.1mg/mL, 0.2mg/mL, 1.0mg/mL, 2.0mg/mL가 되도록 조건을 바꾸어 작성했다) 후, 100μL를 스미론셀타이트 X96U 플레이트에 파종하고, 18시간 정치하고, 직경 1mm 약·구상의 모자이크 세포덩어리를 제작할 수 있었다(세포 1개당 0.00001, 0.0002, 0.0004, 0.002, 0.004㎍의 고분자 블록).

실시예 6:표본해석

실시예 4에서 제작한 재조합 젤라틴 μ블록을 사용한 모자이크 세포덩어리에 대해서 조직 절편을 제작했다. 실시예 4에서 제작한 배지내의 모자이크 세포덩어리에 대하여 배지를 제거후 200μL의 PBS를 첨가하여 세정하고, PBS를 제거했다. 이 세정 공정을 2회 반복한 후, 세정한 모자이크 세포덩어리를 10% 포르말린에 침지하고, 2일간 포르말린 고정을 행했다. 그 후, 파라핀으로 포매하고, 조직 절편을 제작했다. 절편은 HE염색(헤마토크실린·에오신 염색)하고, 세포와 젤라틴 μ블록의 상태를 해석했다. 결과를 도 3, 도 4 및 도 5에 나타낸다. 이것에 의해, 젤라틴 μ블록과 세포가 모자이크상으로 배치된 3차원 구조체가 제작되어 있는 것, 또한 세포가 정상인 상태로 모자이크 세포덩어리내에 존재하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이 단면절편으로부터 적어도 두께 720㎛ 이상의 모자이크 세포덩어리를 제작할 수 있는 것이 나타내어졌다.

실시예 7:모자이크 세포덩어리의 융합

실시예 4에서 제작한 모자이크 세포덩어리가 융합 가능한지, 즉 모자이크 세포덩어리를 늘어놓음으로써 자연융합해서 보다 큰 3차 구조체를 형성할 수 있는지에 대해서 실시했다. 실시예 4에서 제작한 6일째의 모자이크 세포덩어리 2개, 3개, 및 4개를 스미론셀타이트 X96U 플레이트내에서 늘어놓고, 5일간 배양을 행했다. 그 결과, 모자이크 세포덩어리끼리의 사이를 외주부에 배치된 세포가 결합시킴으로써 모자이크 세포덩어리가 자연히 융합되는 것이 밝혀졌다. 도 6에 실체 현미경으로 촬상한 사진을 나타낸다. 융합 개시일(Day6이라고 기재)의 모자이크 세포덩어리에서는 모자이크 세포덩어리끼리가 인접해서 배치되어 있는 것 뿐이지만, 융합 개시부터 5일째(Dya11이라고 기재)에는 모자이크 세포덩어리 사이에 새로운 층이 형성되어 융합되어 있는 모양을 알 수 있다. 또한, 도 7, 8, 9, 10, 11에는 상기 융합 모자이크 세포덩어리의 단면에 대해서 조직 절편을 제작하고, HE염색한 결과를 나타낸다(고정은 10% 포르말린, 포매는 파라핀 포매). 세포와, 세포에 의해 산생된 세포외기질에서 모자이크 세포덩어리간에 융합층이 형성되어 있고, 모자이크 세포덩어리끼리를 융합, 결합하고 있는 것을 알 수 있다. 이것에 의해, 본 발명에서 제작되는 모자이크 세포덩어리는 자연히 융합 가능하며, 융합시킴으로써 보다 큰 구조체를 형성할 수 있는 것이 나타내어졌다. 따라서, 본 발명에서 사용함으로써 두께를 가진 세포 시트상으로 제작하는 것도, 보다 입체적인 3차원 구조체를 제작하는 것도 가능한 것을 알 수 있다.

실시예 8:재조합 젤라틴 μ블록을 사용한 증식배지하의 모자이크 세포덩어리제작

인간 골수 유래 간엽계 줄기세포(hMSC)를 증식배지(다카라 바이오:MSCGM-CD^TM BulletKit^TM)로 50만cells/mL로 조정하고, 실시예 2에서 제작한 재조합 젤라틴 μ블록을 1.0mg/mL가 되도록 첨가한 후 100μL를 스미론셀타이트 X96U 플레이트에 파종하고, 18시간 정치하고, 직경 1mm 구상의 모자이크 세포덩어리를 제작했다(세포 1개당 0.002㎍의 고분자 블록). 그 후, 배지를 200μL로 늘리고, 3일마다 배지를 교환해서 배양했다. Day7에서 직경(=두께) 1.34mm의 구상으로 모자이크 세포덩어리가 형성되었다(또한, 본 모자이크 세포덩어리는 U자형의 플레이트내에서 제작하므로 구상으로 제작된다). Day7의 모자이크 세포덩어리의 절편사진을 도 16, 17에 나타낸다. 이 단면절편상에서 두께가 얇은 개소에서도 적어도 624㎛ 이상의 두께를 달성하고 있는 것을 알 수 있다.

실시예 9:모자이크 세포덩어리의 볼륨업(증식배지하에서)

실시예 8에서 제작한 3일째(Day3)의 모자이크 세포덩어리에 대해서 배지교환시 실시예 2에서 제작한 0.1mg의 재조합 젤라틴 μ블록을 증식배지(다카라 바이오:MSCGM-CD^TM BulletKit^TM)로 현탁해서 첨가했다. 이후, Day 7, 10, 14, 17, 21의 배지교환에 맞춰 0.1mg씩의 재조합 젤라틴 μ블록을 첨가해 갔다.

이 모자이크 세포덩어리를 실체 현미경으로 관찰했을 때의 직경(다른 2개의 직경의 평균으로서 산출), 및 촬상한 모자이크 세포덩어리의 면적, 계산상의 체적(상기에서 구한 직경으로부터 4/3πr³으로 계산), 각각에 대한 경시 변화를 도 12, 13, 14, 15에 나타냈다. 그 결과, 최종적으로 Day 21에서 평균 직경(=두께) 3.41mm의 구상으로 형성되었다. 이것에 의해, 적어도 사이즈 3.41mm까지의 크기의 모자이크 세포덩어리를 제작 가능한 것을 알 수 있다. 또한, 본 방법에 의한 볼륨업을 계속함으로써 그 사이즈를 크게 하는 것이 가능한 것을 알 수 있다.

이 때의 조직 절편(HE염색)을 도 18, 19에 나타냈다. 세포와 재조합 젤라틴 μ블록이 모자이크상으로 배치되어 있는 것을 알 수 있다. 또한, 모자이크 세포덩어리는 3mm 크기이며, 표본으로서 작기 때문에 구의 중앙부를 단면으로 하는 것은 곤란했다. 따라서, 절편으로서 구의 최심부분을 얻지 못함에도 불구하고, 상기 검체의 이 절편을 채취한 부분에서도 두께는 적어도 1.17mm인 것을 알 수 있다.

Day 7, 10, 14, 17, 21의 배지교환시 젤라틴 μ블록을 추가하지 않고, 배양한 것에서는 도 12, 13, 14에 나타내어지듯이 직경이 바뀌지 않는다. 젤라틴 μ블록을 추가하지 않고 배양한 것에서는 모자이크 세포덩어리의 최외곽층에 증식한 세포에 의해 세포와 세포가 산생한 세포외기질만의 층상구조가 형성된다. 그것에 의해 그 세포와 산생 세포외기질의 층에 의해 영양의 확산이 저지되는 상태를 형성해 버려 그 이상으로 세포가 증식(구가 커진다)할 수 없게 되기 때문이다. 한편, 배지교환에 맞춰 수시 젤라틴 μ블록을 추가해 간 경우 젤라틴 μ블록이 증식한 세포와 함께 항상 모자이크상으로 끼워 넣어짐으로써 세포가 증식해도 세포와 젤라틴 μ블록으로 이루어지는 모자이크 구조를 계속해서 유지하는 것이 가능해진다. 그것에 의해 젤라틴 μ블록으로 제공되는 영양의 공급 경로가 항상 확보되어 세포와 산생된 세포외기질로 형성되어 버리는 외각층이 생성되지 않아 모자이크 세포덩어리는 크게 될 수 있는 것이다.

실시예 10:모자이크 세포덩어리의 볼륨업(연골 분화 배지하에서)

실시예 4에서 제작한 3일째(Day3)의 모자이크 세포덩어리에 대해서 배지교환시 실시예 2에서 제작한 0.1mg 재조합 젤라틴 μ블록(0.1mg)을 연골 분화 배지(다카라 바이오:hMSC Differentiation BulletKit^TM, Chondrogenic, TGF-β3)로 현탁해서 첨가했다. 이후, Day 7, 10, 14, 17, 21의 배지교환에 맞춰 0.1mg씩의 재조합 젤라틴 μ블록을 첨가해 갔다.

이 모자이크 세포덩어리를 실체 현미경으로 관찰했을 때의 직경(다른 2개의 직경의 평균으로서 산출), 및 촬상한 모자이크 세포덩어리의 면적, 계산상의 체적(상기에서 구한 직경으로부터 4/3πr³으로 계산), 각각에 관한 경시 변화를 도 12, 13, 14, 15에 나타냈다. 그 결과, 최종적으로 Day 21에서 평균 직경(=두께) 2.05mm의 구상으로 형성되었다. 이것에 의해, 적어도 사이즈 2.05mm까지의 크기의 모자이크 세포덩어리를 제작 가능한 것을 알 수 있다. 또한, 본 방법에 의한 볼륨업을 계속함으로써 그 사이즈를 크게 하는 것이 가능한 것을 알 수 있다.

이 때의 조직 절편(HE염색)을 도 20, 21에 나타냈다. 세포와 재조합 젤라틴 μ블록이 모자이크상으로 배치되어 있는 것을 알 수 있다. 또한, 모자이크 세포덩어리는 2mm 크기이며, 표본으로서 작기 때문에 구의 중앙부를 단면으로 하는 것은 곤란했다. 따라서, 절편으로서 구의 최심부분을 얻을 수 없음에도 불구하고 상기 검체의 이 절편을 채취한 부분에서도 두께는 적어도 897㎛인 것을 알 수 있다.

Day 7, 10, 14, 17, 21의 배지교환시 젤라틴 μ블록을 추가하지 않고 배양한 것에서는 도 12, 13, 14에서 나타내어지듯이 직경이 바뀌지 않는다. 젤라틴 μ블록을 추가하지 않고 배양한 것에서는 모자이크 세포덩어리의 최외곽층에 증식한 세포에 의해 세포와 세포가 산생한 세포외기질만의 층상구조가 형성된다. 그것에 의해 그 세포와 산생 세포외기질의 층에 의해 영양의 확산이 저지되는 상태를 형성해 버려 그 이상으로 세포가 증식(구가 커진다)할 수 없게 되기 때문이다. 한편, 배지교환에 맞춰 수시 젤라틴 μ블록을 추가해 간 경우, 젤라틴 μ블록이 증식한 세포와 함께 항상 모자이크상으로 끼워 넣어짐으로써 세포가 증식해도 세포와 젤라틴 μ블록으로 이루어지는 모자이크 구조를 계속해서 유지하는 것이 가능해진다. 그것에 의해 젤라틴 μ블록으로 제공되는 영양의 공급 경로가 항상 확보되어 세포와 산생된 세포외기질로 형성되어 버리는 외각층이 생성되지 않고 모자이크 세포덩어리는 크게 될 수 있는 것이다.

실시예 11:모자이크 세포덩어리의 GAG 산생량의 정량(경시 변화)

실시예 4 및 실시예 5에서 제작한 모자이크 세포덩어리(hMSC세포+재조합 젤라틴, hMSC세포+천연 젤라틴), 및 세포만으로 제작한 세포덩어리(실시예 4와 같은 방법으로 젤라틴 블록을 넣지 않고 제작했다)에 대해서 모자이크 세포덩어리내의 글리코사미노글리칸량을 정량했다. 측정은 (Farndale et al., Improved quantitation and sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochimica et Biophysica Acta 883(1986)173-177)의 Dimetylmethylene blue dye를 사용하는 방법으로 행하고, 시약은 황산화 GAG 정량 키트(생화학 바이오 비지니스)를 사용했다. 530nm의 흡광을 측정하고, 정량했다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 상기 방법에 의해 특징적인 흡수 피크가 525-530nm에 보여지는 것을 확인했다.

경시에서 GAG량을 정량한 결과를 도 22의 그래프에 나타냈다. 그 결과, 젤라틴 μ블록을 넣지 않고 제작한 세포덩어리에서는 산생하는 글리코사미노글리칸(GAG)량이 낮은 것에 대해서 천연 젤라틴 μ블록을 넣어서 제작한 모자이크 세포덩어리, 및 재조합 젤라틴 μ블록을 넣어서 제작한 모자이크 세포덩어리에 대해서는 산생하는 GAG량이 매우 높았다. 이것에 의해, 실시예 4 및 실시예 5에서 제작한 모자이크 세포덩어리에서는 연골분화가 촉진되고 있는 것, 또 제작한 모자이크 세포덩어리가 세포로서의 기능을 갖고 있는 것(GAG 산생능을 갖고 있는 것)을 확인할 수 있었다. 또한, 천연 젤라틴 μ블록을 넣어서 제작한 모자이크 세포덩어리보다 재조합 젤라틴 μ블록을 넣어서 제작한 모자이크 세포덩어리에서는 산생하는 GAG량이 유의하게 높았다. 이것에 의해, 재조합 젤라틴 μ블록을 넣어서 제작한 모자이크 세포덩어리는 천연 젤라틴 μ블록보다 높은 세포 활성, 기질 산생 활성을 유지할 수 있는 것을 알 수 있고, 천연 젤라틴에서는 불가능했던 기질량의 산생을 재조합 젤라틴을 사용함으로써 달성할 수 있는 것이 나타내어졌다.

실시예 12:모자이크 세포덩어리의 ATP 정량

각 모자이크 세포덩어리내의 세포가 산생·유지하고 있는 ATP(아데노신3인산)량을 정량했다. ATP는 생물 전반의 에너지원으로서 알려지며, ATP 합성량·유지량을 정량함으로써 세포의 대사 활성의 상태, 활동 상태를 알 수 있다. 측정에는 CellTiter-Glo(Promega사)를 사용했다. 비교는 실시예 4 및 실시예 5에서 제작한 모자이크 세포덩어리(hMSC세포+재조합 젤라틴, hMSC세포+천연 젤라틴), 및 세포만으로 제작한 세포덩어리(실시예 4와 같은 방법으로 젤라틴 블록을 넣지 않고 제작했다)에 대해서 모두 Day7의 것으로 CellTiter-Glo를 사용해서 각 모자이크 세포덩어리내의 ATP량을 정량했다.

결과를 도 23에 나타냈다. 이것에 의해, 젤라틴 μ블록을 사용해서 제작한 모자이크 세포덩어리에서는 세포만으로 제작된 세포덩어리보다 유의하게 ATP 산생·유지량이 높은 것을 알 수 있었다(p<0.01). 이것은 젤라틴 블록이 모자이크상으로 끼워 넣어짐으로써 젤라틴 블록에 의한 모자이크 세포덩어리내에의 영양공급 경로가 제공되어 세포만의 덩어리보다 세포의 대사 활성이 높은 상태가 유지되는 것을 시사하고 있다. 또한, 천연 젤라틴 μ블록을 넣어서 제작한 모자이크 세포덩어리보다 재조합 젤라틴 μ블록을 넣어서 제작한 모자이크 세포덩어리에서는 ATP 산생·유지량이 유의하게 높은 것을 알 수 있었다. 이것에 의해, 재조합 젤라틴 μ블록을 넣어서 제작한 모자이크 세포덩어리는 천연 젤라틴 μ블록보다 높은 세포생존, 내부에서도 세포가 살고 있는 것을 알 수 있었다. 천연 젤라틴에서는 불가능했던 세포의 생존 향상이 재조합 젤라틴을 사용함으로써 달성할 수 있는 것이 나타내어졌다.

실시예 13:PLGA μ블록의 제작

PLGA(락트산·글리콜산 공중합체: Wako, PLGA7520) 0.3g을 디클로로메탄(3mL)에 용해했다. 대략 PLGA 용해액을 건조기(EYELA, FDU-1000)로 진공건조하고, PLGA의 건조체를 얻었다. PLGA 건조체를 뉴파워밀(오사카 케미칼, 뉴파워밀 PM-2005)로 분쇄했다. 분쇄는 최대 회전수로 10초×20회의 분쇄로 행했다. 얻어진 분쇄물에 대해서 스테인레스제 체로 사이즈 분별하여 25∼53㎛ 및 53∼106㎛의 PLGA μ블록을 얻었다.

PLGA: 「1/IOB」값:0.0552

실시예 14:PLGA를 사용한 모자이크 세포덩어리의 제작

인간 골수 유래 간엽계 줄기세포(hMSC)를 증식배지(다카라 바이오:MSCGM-CD^TM BulletKit^TM)로 50만cells/mL로 조정하고, 실시예 13에서 제작한 PLGA μ블록을 첨가한 (최종농도로 0.1mg/mL, 0.2mg/mL, 1.0mg/mL, 2.0mg/mL가 되도록 조건을 바꾸어서 작성했다) 후, 100μL를 스미론셀타이트 X96U 플레이트에 파종하고, 18시간 정치하고, 직경 1mm 약·구상의 모자이크 세포덩어리를 제작했다(세포 1개당 0.0002, 0.0004, 0.002, 0.004㎍의 고분자 블록). 그 후, 배지를 200μL로 늘리고, 3일마다 배지를 교환해서 배양했다. 또한, 본 모자이크 세포덩어리는 U자형의 플레이트내에서 제작하기 때문에 구상으로 제작된다. Day2의 PLGA 모자이크 세포덩어리의 실체 현미경 사진을 도 24에 나타낸다.

실시예 15:아가로스 μ블록의 제작

아가로스 분말 5g을 초순수(100mL)에 첨가해서 전자레인지를 사용해서 가열하여 용해했다. 얻어진 5% 아가로스 용해액을 상온으로 되돌림으로써 고형물로 해서 -80℃에서 5시간 동결시킨 후, 동결 건조기(EYELA, FDU-1000)로 동결 건조를 행함으로써 아가로스의 동결 건조체를 얻었다. 아가로스 동결 건조체를 뉴파워밀(오사카 케미칼, 뉴파워밀 PM-2005)로 분쇄했다. 분쇄는 최대 회전수로 10초×20회의 분쇄로 행했다. 얻어진 분쇄물에 대해서 스테인레스제 체로 사이즈 분별하여 25∼53㎛ 및 53∼106㎛의 아가로스 μ블록을 얻었다.

IOB값:3.18

실시예 16:아가로스를 사용한 모자이크 세포덩어리의 제작

인간 골수 유래 간엽계 줄기세포(hMSC)를 증식배지(다카라 바이오:MSCGM-CD^TM BulletKit^TM)로 50만cells/mL로 조정하고, 실시예 15에서 제작한 아가로스 μ블록을 첨가한 (최종농도로 0.1mg/mL, 1.0mg/mL가 되도록 조건을 바꾸어서 작성했다) 후, 100μL를 스미론셀타이트 X96U 플레이트에 파종하고, 18시간 정치하고, 직경 1mm 약·구상의 모자이크 세포덩어리를 제작했다(세포 1개당 0.0002, 0.002㎍의 고분자 블록). 그 후, 배지를 200μL로 늘리고, 3일마다 배지를 교환해서 배양했다. 또한, 본 모자이크 세포덩어리는 U자형의 플레이트내에서 제작하기 때문에 구상으로 제작되었다.

실시예 17:심근세포를 사용한 모자이크 세포덩어리의 제작

신생아 SD래트 심근세포(rCMC)를 심근세포용 배지(Primary Cell Co., Ltd:CMCM 심근세포용 배양 미듐)로 50만cells/mL로 조정하고, 실시예 2에서 제작한 재조합 젤라틴 μ블록을 0.5, 1.0, 3.0mg/mL가 되도록 첨가한 후 각각 100μL를 스미론셀타이트 X96U 플레이트(스미토모 베이크라이트, 바닥이 U자형)에 파종하고, 18시간 정치하고, 직경 1∼2mm정도의 재조합 젤라틴 μ블록이 rCMC세포로 이루어지는 모자이크 세포덩어리를 제작했다(세포 1개당 0.001, 0.002, 0.006㎍의 고분자 블록). 배지교환은 Day3, 7, 10, 14, 17, 21에 행했다.

Day1, Day3의 단계에서 이미 rCMC 모자이크 세포덩어리는 구조체 전체적으로 동기 박동하고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 25). 명세서 중에서는 동영상을 나타내는 것이 곤란하기 때문에 도 25에서는 동영상으로부터 0.2초후의 동일 스폿을 정지 화상으로서 캡처 촬영한 화상이다. 삼각형으로 표시한 부위를 보면 2매의 그림에서 전체가 움직이고 있는 것을 알 수 있다.

이것에 의해, 심근세포를 사용해도 본 발명의 세포 3차원 구조체(모자이크 세포덩어리)가 형성 가능한 것이 확인할 수 있음과 아울러 심근세포를 사용한 모자이크 세포덩어리에 있어서는 구조체 전체적으로 동기 박동하는 세포 구조체가 얻어지는 것이 증명되었다.

실시예 18:GFP 발현 HUVEC(인간 제대정맥 내피세포)를 사용한 모자이크 세포덩어리의 제작

GFP를 발현하고 있는 인간 제대정맥 내피세포(GFP-HUVEC:Angio-Proteomie사)를 내피세포용 배지(크라보우:Medium 200S, LSGS, 항균제 GA용액)로 50만cells/mL 조정하고, 실시예 2에서 제작한 재조합 젤라틴 μ블록을 0.3, 1.0, 3.0mg/mL가 되도록 첨가한 후 각각 100μL를 스미론셀타이트 X96U 플레이트(스미토모 베이크라이트, 바닥이 U자형)에 파종했다(세포 1개당 0.0006, 0.002, 0.006㎍의 고분자 블록). 또한, 마찬가지로 세포를 150만cells/mL로 조정하고, 실시예 2에서 제작한 재조합 젤라틴 μ블록을 1.0mg/mL가 되도록 첨가한 후 100μL, 200μL를 스미론셀타이트 X96U 플레이트(스미토모 베이크라이트, 바닥이 U자형)에 파종한 것도 제작했다. 모두에 대해서 18시간 정치하고, 직경 1∼2mm정도의 재조합 젤라틴 μ블록이 GFP-HUVEC세포로 이루어지는 모자이크 세포덩어리를 제작했다. 배지교환은 Day3, 7, 10, 14, 17, 21에 행했다.

도 26에는 5만cells+0.03mg의 모자이크 세포덩어리와, 30만cells+0.2mg의 모자이크 세포덩어리의 현미경 사진, 및 형광 현미경 사진을 나타내고 있다. GFP-HUVEC세포는 GFP의 형광을 발하기 때문에 형광 현미경에 의해 모자이크 세포덩어리내의 분포를 이해하기 쉽다. 이것에 의해, 본 발명의 세포 3차원 구조체(모자이크 세포덩어리)는 혈관내피세포를 사용해도 제작 가능한 것이 증명되었다.

또, 본 발명의 세포 구조체(모자이크 세포덩어리)에 대해서는 간엽계 줄기세포, 심근세포, 혈관내피세포라는 다양한 세포로 형성 가능한 것이 실증되었다. 동시에 재조합 젤라틴 블록, 동물 젤라틴 블록, PLGA 블록, 아가로스 블록이라는 다양한 고분자 블록을 사용해서 형성 가능한 것도 나타내어졌다. 이것에 의해, 다양한 세포종과 다양한 고분자 블록종에 있어서 본 발명의 세포 3차원 구조체(모자이크 세포덩어리)가 형성 가능한 것이 증명되었다.

SEQUENCE LISTING <110> FUJIFILM Corporation <120> A cell structure composed of polymer blocks having biocompatibility and cells <130> 10F04185 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 571 <212> PRT <213> Recombinant <400> 1 Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly 1 5 10 15 Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro 35 40 45 Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly 50 55 60 Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala 65 70 75 80 Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro 85 90 95 Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly 100 105 110 Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val 115 120 125 Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro 130 135 140 Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly 145 150 155 160 Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala 165 170 175 Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro 180 185 190 Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly 195 200 205 Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp 210 215 220 Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln 225 230 235 240 Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly 245 250 255 Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys 260 265 270 Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg 275 280 285 Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly 290 295 300 Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu 305 310 315 320 Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro 325 330 335 Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly 340 345 350 Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala 355 360 365 Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro 370 375 380 Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly 385 390 395 400 Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro 405 410 415 Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro 420 425 430 Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly 435 440 445 Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val 450 455 460 Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala 465 470 475 480 Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly 485 490 495 Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro 500 505 510 Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln 515 520 525 Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly 530 535 540 Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys 545 550 555 560 Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly 565 570

Claims

생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포를 포함하고, 복수개의 세포 사이의 간극에 복수개의 상기 고분자 블록이 모자이크상으로 배치되어 있는 세포 구조체로서, 두께 또는 직경이 215㎛ 이상 3cm 이하이고, 상기 고분자 블록과 상기 세포의 비율이 세포 1개당 0.00001㎍ 이상 0.006㎍ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 1 항에 있어서,
상기 고분자 블록의 크기는 1㎛ 이상 700㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 2 항에 있어서,
상기 고분자 블록의 크기는 10㎛ 이상 300㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 1 항에 있어서,
두께 또는 직경이 400㎛ 이상 3cm 이하인 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 4 항에 있어서,
두께 또는 직경이 720㎛ 이상 1cm 이하인 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 1 항에 있어서,
생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 1 항에 있어서,
생체 친화성을 갖는 고분자는 생분해성 재료인 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 1 항에 있어서,
생체 친화성을 갖는 고분자는 폴리펩티드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, PLGA, 히알루론산, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸, 콘드로이틴, 셀룰로오스, 아가로스, 카르복시메틸셀룰로오스, 키틴, 또는 키토산인 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 1 항에 있어서,
생체 친화성을 갖는 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 프로넥틴, 라미닌, 테나신, 피브린, 피브로인, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 또는 레트로넥틴인 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 1 항에 있어서,
생체 친화성을 갖는 고분자는 가교되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 10 항에 있어서,
상기 가교는 알데히드류, 축합제, 또는 효소에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
생체 친화성을 갖는 고분자는 유전자 재조합 젤라틴인 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 12 항에 있어서,
생체 친화성을 갖는 고분자는 세포 접착성 시그널을 1분자 중에 2개 이상 갖는 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 12 항에 있어서,
상기 유전자 재조합 젤라틴은 하기 식으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
식:A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B
[식 중, A는 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열을 나타내고, B는 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열을 나타내고, n개의 X는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, n개의 Y는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, n은 3∼100의 정수를 나타내고, m은 2∼10의 정수를 나타낸다. 또한, n개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다]
제 12 항에 있어서,
상기 유전자 재조합 젤라틴은 하기 식으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
식:Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)₆₃]₃-Gly
[식 중, 63개의 X는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, 63 개의 Y는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다. 또한, 63개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다]
제 12 항에 있어서,
상기 유전자 재조합 젤라틴은 (1) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열 또는 (2) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖고 생체 친화성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 구조체의 제조 방법으로서:
상기 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 구조체의 제조 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅하는 공정에 있어서 배지교환을 행하는 것을 특징으로 하는 세포 구조체의 제조 방법.
제 18 항에 있어서,
상기 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅하는 공정에 있어서 배지를 분화배지 또는 증식배지로 교환하는 것을 특징으로 하는 세포 구조체의 제조 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 생체 친화성을 갖는 고분자 블록과 세포 함유 배양액의 혼합물을 인큐베이팅하는 공정에 있어서 생체 친화성을 갖는 고분자 블록을 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 세포 구조체의 제조 방법.
제 17 항에 기재된 세포 구조체의 제조 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 1 항에 기재된 세포 구조체의 복수개를 융합함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 22 항에 기재된 세포 구조체의 제조 방법으로서:
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 구조체의 복수개를 융합하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 구조체의 제조 방법.
생체 친화성을 갖는 복수개의 고분자 블록과 복수개의 세포를 포함하고, 상기 복수개의 세포에 의해 형성되는 복수개의 간극의 일부 또는 전부에 1개 또는 복수개의 상기 고분자 블록이 모자이크상으로 배치되어 있는 세포 구조체를 복수개 융합시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 구조체의 제조 방법.
제 24 항에 있어서,
상기 고분자 블록의 크기는 1㎛ 이상 700㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 구조체의 제조 방법.
제 24 항에 있어서,
상기 융합 전의 각 세포 구조체의 두께 또는 직경은 10㎛ 이상 1cm 이하이며, 상기 융합 후의 두께 또는 직경은 215㎛ 이상 3cm 이하인 것을 특징으로 하는 세포 구조체의 제조 방법.
생체 친화성을 갖는 복수개의 제 1 고분자 블록과 복수개의 세포를 포함하고, 상기 복수개의 세포에 의해 형성되는 복수개의 간극의 일부 또는 전부에 1개 또는 복수개의 상기 고분자 블록이 모자이크상으로 배치되어 있는 세포 구조체에 제 2 고분자 블록을 더 첨가해서 인큐베이팅하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 구조체의 제조 방법.
제 27 항에 있어서,
상기 제 1 고분자 블록의 크기는 1㎛ 이상 700㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 구조체의 제조 방법.
제 27 항에 있어서,
상기 제 2 고분자 블록의 크기는 1㎛ 이상 700㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 구조체의 제조 방법.
제 27 항에 있어서,
상기 제 2 고분자 블록을 첨가해서 인큐베이팅한 후의 두께 또는 직경은 215㎛ 이상 3cm 이하인 것을 특징으로 하는 세포 구조체의 제조 방법.
제 24 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 구조체의 제조 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 세포 구조체.
제 31 항에 있어서,
세포이식, 세포배양 또는 독성 평가 용도로 사용하는 것을 특징으로 하는 세포 구조체.