CN110326611B - 生物材料性能的保存和储存方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了增强的用于储存生物材料的组合物和方法。在某些方面中，这些生物材料包括天然和工程改造的真核组织。本文所述方法包括以降低或防止储存期间或从储存中取出生物材料后生物材料性能(如胞外基质完整性、细胞活力或其组合)损失的方式储存这些生物材料。在某些方面中，可在含有防止或降低胞外基质完整性损失的试剂的不含动物产品的溶液中储存这些生物材料。

Description

生物材料性能的保存和储存方法
技术领域
本发明涉及储存真核细胞生物材料(例如与材料和组织相关联的细胞)的方法，同时降低或防止储存相关的生物材料性能的损失。本发明还涉及在储存期间维持生物材料的(i)胞外基质完整性(包括胞外基质渗透性、水含量和糖胺聚糖含量)以及(ii)细胞活力。
背景技术
在过去的几十年间，已开发了储存方法和技术以保存真核组织和细胞。这些储存方法和技术涉及在工程改造的胞外基质、工程改造的组织和天然组织中将各种真核细胞储存一段时间，储存方式允许在之后使用这些储存的组织，如用于植入或移植至患者或用于药物或化学筛选生物试验。
虽然这些储存方法和技术广泛地适用于基础研究和转化研究环境，但在储存期间维持生物材料性能(例如胞外基质完整性和细胞活力)仍是一项挑战。例如，使用现有技术时观察到了显著降低的胞外基质渗透性和组织细胞活力，且这些降低可导致从储存中取出后低效的生物材料功能。
在一个示例中，使用多种储存技术保存软骨细胞和软骨组织，随后将其从储存中取出并用作骨软骨同种异体移植物。该同种异体移植物可修复(1)外伤诱导的软骨缺陷和(2)由骨关节炎破坏的软骨表面。使用软骨细胞和软骨作为骨软骨同种异体移植物以治疗骨关节炎是重要的，因为预测骨关节炎目前在美国影响约2000万人。因此，结果是，已产生了一个巨大的产业用于提供整形外科植入物来治疗因内源性软骨缺失或内源性软骨损伤而导致具有缺陷型关节、骨质疏松性骨折或背部疾病的人。
虽然骨软骨同种异体移植物显示出治疗软骨相关医疗病症的希望，但移植的关节软骨的软骨细胞活力和胞外基质完整性很大程度上决定了骨软骨同种异体移植物移植的结果(即成功的手术效果对比失败的手术效果等)。目前的保存技术无法可接受地维持软骨的胞外细胞基质完整性并在某些方面提高软骨细胞活力。例如，常规的软骨细胞和软骨低温保存包括在包含二甲亚砜(DMSO)的溶液中冷冻这些细胞和组织，但这些技术导致关节软骨中80–100％的软骨细胞死亡且胞外基质因为冰的形成而受损。
上述较差的低温保存结果最终导致移植所谓“新鲜”关节部分(即软骨细胞和/或软骨同种异体移植物)的实践。例如，通常在供体死亡的24小时内收获供体来源的骨软骨组织移植物并在4℃下储存最多42天以用于修复临床软骨缺陷。此外，将市售可得的新鲜骨关节同种异体移植物储存至少17天以允许在移植前进行血清学和微生物学测试以最小化受体中的潜在感染。
发明内容
虽然骨软骨同种异体移植物移植已经是用于修复(1)外伤诱导的软骨缺陷和(2)由骨关节炎破坏的软骨表面的有效治疗方法，但对于在储存期间维持软骨的软骨细胞活力和胞外基质完整性而言仍存在多项挑战。最近的研究表明，重要的是同时维持软骨细胞活力和胞外基质完整性以促进成功的同种异体移植物移植。例如，如果从储存中取出期间或之后细胞活力和/或基质完整性降低，则成功移植的可能性也会降低。在工程改造或天然的组织中的大多数真核细胞中都存在这些挑战。因此，新的真核组织和细胞保存技术是有用的。
本文描述了用于储存生物材料的组合物和方法。在某些方面中，这些生物材料包括真核细胞和真核组织，如软骨细胞和软骨。本文所述方法包括以降低或防止储存期间或从储存中取出生物材料后生物材料性能(如胞外基质渗透性和软骨细胞活力)损失的方式储存这些生物材料。在某些方面中，将这些生物材料置于溶液中并随后储存以用于下次使用，所述溶液包含动物来源的产物。在某些方面中，本文所述溶液含有防止或降低生物材料性能损失的试剂，且在某些方面中，该试剂可包括至少一种酶的抑制剂。例如，该试剂可包括天然或合成的基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂，其包括但不限于内源性金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、调节TIMP合成的化合物或多西环素等。
本发明的优势部分列于后文说明书中或可通过下文所述方面的实践进行了解。通过所附权利要求中特别指出的要素和组合将会认识和获得下述优点。应当理解，上述一般描述和以下详细描述仅仅是示例性和说明性的，而非限制性的。
附图说明
图1比较软骨细胞在四种不同溶液中储存28天后的软骨细胞活力和增殖。通过测量各样品的相对荧光单位(RFU)来定量活力和增殖。
图2显示4种不同溶液中冷储存期间高细胞活力与软骨基质渗透性和电导率损失之间的关联系数(R2)。如图2所示，在4天的储存后恢复组织培养期间，关联系数从0.78升高至0.90。
图3显示低温储存对于软骨渗透性的影响，其基于低渗盐水中软骨样品的电导率。
图4是用于定量软骨机械性能(如蠕变压缩)的压缩室的示意图。
图5显示多种储存间隔后多西环素浓度对于软骨细胞活力的影响。
图6显示在多种多西环素浓度中冷冻储存一个月后对猪软骨塞电导率的影响。
实施方式详述
通过参考以下特定实施方式的详述、本文包含的实施例以及附图及其描述，可以容易地理解公开的方法和组合物。下文所述各方面不限于所述特定组合物和/或方法，其当然可以变化。
本申请引用了多份出版物。这些出版物全文以及下文参考文献列表中包含的出版物的公开内容在此通过引用全文纳入本申请中以更完整地描述本申请所属领域的状态。所公开的参考文献还根据参考的特定部分单独和特定地通过引用纳入本文。
可以以范围的形式表示或给出浓度、数量和其它数值数据。应该理解，使用这种范围形式只是为了方便和简洁，因此，应该灵活地将其解释成不仅包括作为范围界限明确列举的数值，而且包括所有包含在该范围内的单个数值或子范围，就如同各数值和子范围都已明确列举。例如，“约1至5”的数值范围应理解为不仅包括明确表示的约1至约5的数值，还单独地包括单个值(如2、3和4)和子范围(如1-3、2-4和3-5等)以及1、2、3、4和5。相同的原理适用于仅仅陈述了一个作为最小值或最大值的数值的范围。此外，无论所描述的范围或特征的宽度如何，这种解释都适用。
在本说明书和后面的权利要求书中将提到许多术语，这些术语应具有以下定义：
“不含动物产品”的溶液包括除下文所述生物材料外不包含动物产品或来源于动物的任何产品的溶液。“动物产品”可包括胎牛血清(FBS)，其是包括生长因子的动物来源的产品并通常用于常规细胞培养。因此，在一个示例中，“不含动物产品”的溶液可包括缺少FBS的溶液。
术语“生物材料”包括非植物、哺乳动物真核细胞和组织。
本文描述了活生物材料和用于储存这类生物材料的方法。在某些方面中，这些生物材料包括工程改造和天然的组织中的真核细胞，且本文所述方法包括以降低或防止储存期间或从储存中取出生物材料后生物材料性能损失(例如，降低或防止胞外基质渗透性、组织细胞活力或其组合的损失)的方式储存这些生物材料。在某些方面中，将这些生物材料置于溶液中，其可包括不含动物产品的溶液，含有至少一种降低或防止生物材料性能损失的试剂。随后，将置于含有至少一种试剂的溶液中的生物材料在特定温度范围下储存直至进一步需要这些生物材料时。对至少一种试剂的浓度进行优化从而最大化生物材料性能(如胞外基质完整性和细胞活力)。
在某些方面中，该生物材料可包括任何非植物、哺乳动物真核细胞和/或组织，包括原代细胞(如非永生细胞和/或组织)和永生细胞。在某些方面中，该生物材料可包括天然和工程改造的组织和细胞。天然和工程改造的生物材料的示例可包括但不限于：软骨细胞、软骨、成骨细胞、破骨细胞、骨、组织塞(tissue plug)、同种异体移植物组织塞、软骨组织塞、角膜、心脏瓣膜、血管、输尿管、肠、皮肤、牙齿、肿瘤活检、椎间盘或椎间体、韧带、肌腱等。在至少一个方面中，该生物材料包括至少软骨细胞、软骨或其组合。在其他方面中，该生物材料仅包括软骨细胞、软骨或其组合。在某些方面中，该生物材料包括自体移植物组织、同种异体移植物组织和异种移植物组织。例如，对于合适的人移植物组织，同种异体组织和/或组织塞可来源于人供体。异种移植物组织可来源于猪供体、牛供体、绵羊供体、马供体或任何其他物种以用于医疗目的。本文所述组织还可来源于相同物种中兽医应用的动物物种；示例包括狗、猫、绵羊、奶牛和马。
在由本文所述组合物和方法使用本文所述组织和细胞时，一个目的是防止胞外基质完整性的损失和/或降低或防止细胞活力的损失。例如，可基于胞外膜渗透性、胞外膜水含量、胞外膜糖胺聚糖含量或其组合来测定胞外基质完整性。在某些方面中，在储存生物材料以防止或降低胞外基质完整性损失时，一个目的是维持胞外膜渗透性、胞外膜水含量、胞外膜糖胺聚糖含量或其组合中的至少一种。在测定生物材料的基质完整性时，可使用本领域已知的多种技术。这些技术包括测量渗透性、水含量和糖胺聚糖含量的基质电导率试验、凹痕测试、压力/应变测试、弹性、拉曼光谱、各种显微镜方法(如具有二次谐波发生的激光扫描显微镜)等。如上文进一步说明的那样，另一个目的是降低或防止生物材料细胞活力的损失。在某些方面中，可使用本文所述组合物和方法来降低或防止多种类型的细胞死亡，包括但不限于，坏死性细胞死亡、凋亡性细胞死亡、自噬性(II型)细胞死亡、失巢凋亡和坏死性凋亡，并且在某些方面中，可通过使用下文进一步描述的试剂来限制这些类型的细胞死亡。此外，还可以使用代谢活性试验(如刃天青试验)、各种细胞染色技术(如过台盼蓝排除试验和活/死染色)、免疫组化、生物化学和各种基因表达试验。
在一个方面中，当使用含有基质的组织作为生物材料时，重要的是防止或降低胞外基质完整性的损失和细胞活力的损失以维持组织的结构完整性和正常生物功能。例如，软骨含有软骨细胞(即细胞)和胞外基质，其中胞外基质主要由胶原纤维、蛋白聚糖和弹性蛋白纤维组成。对于在体内、离体和体外应用中维持正常的生理生物学功能而言，软骨细胞活力和软骨胞外基质完整性都是重要的。例如，软骨的胞外基质提供结构完整性并维持体内特定的刚性水平，其在骨支撑、合适的关节灵活性等方面起作用。在某些方面中，软骨胞外基质的渗透性特别重要。例如，软骨渗透性可与维持软骨胞外基质的结构完整性以及辅助维持软骨细胞活力相关并在其中起重要作用。在某些方面中，下降的软骨胞外基质通透性可与升高的软骨细胞活力和下降的软骨胞外基质结构完整性相关。在储存的软骨随后被用于同种异体移植物移植时，这一因生成细胞产物(如酶)而升高的活性和下降的结构完整性可导致成功移植的可能性下降。因此，在某些方面中，本文所述方法和组合物用于防止或降低软骨胞外基质完整性的损失，同时降低和/或防止软骨细胞活力的损失，且在某些方面，本文所述方法和组合物用于降低和/或防止自体异种移植物中软骨胞外基质完整性的损失，同时优化软骨细胞活力。
可以将本文所述生物材料置于防止或降低生物材料性能(如胞外基质完整性、细胞活力或其组合)损失的溶液中，且在某些方面中，该溶液可以是不含动物产品的溶液(例如不含FBS)或者可以含有动物产品(如包含FBS)。应注意，以下描述和实施方式也适用于含有包括生物材料的动物产品的溶液。在某些方面中，将生物材料至少部分浸没在溶液中，且在其他方面中，将生物材料完全浸没在溶液中。
在一个方面中，该溶液可以是包含至少一种试剂的胞外型溶液，所述试剂防止或降低生物材料性能(如胞外基质完整性、细胞活力或其组合)损失。例如，胞外型溶液可包括等渗、血浆样(plasma-like)溶液，其具有模拟细胞和组织的正常胞外环境的离子补充物。这些等渗、血浆样溶液可包括细胞培养基，其向生物材料(如细胞和/或组织)提供多种氨基酸和代谢物用于营养支持。例如，用于胞外型溶液的细胞培养基可包括但不限于：达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、αMEM、格拉斯哥MEM(Glasgow's MEM)、汉姆F10(Ham's F10)、汉姆F-12(Ham's F-12)、莱博维茨L-15(Leibovitz's L-15)、伊思考夫改良DMEM(Iscove'sModified DMEM)、DMEM/汉姆F-12，及其衍生物。该胞外型溶液可以是不含动物产品的，使得在将生物材料置于细胞溶液中前，细胞溶液不含有动物产品。例如，在使用细胞培养基时，细胞培养基可不含胎牛血清(FBS)或来源于动物的任何其他产品。
在某些方面中，该溶液包括胞内型溶液。该胞内型溶液可包括但不限于：经配置以限制储存期间生物材料中的细胞与胞内型溶液之间水和离子被动交换的等渗溶液。例如，胞内型溶液可包含非渗透性阴离子(如乳糖醛酸盐或葡萄糖酸盐)以部分替换胞外空间中的氯离子，其提供渗透支持以平衡细胞内锁定的胞质大分子及其相关抗衡离子生成的胞内膨胀压。胞内型溶液可包括但不限于
Figure BDA0002166340510000061
(即贝尔泽溶液(Belzer's Solution))和
Figure BDA0002166340510000062
(如SPS-1)。与上文所述胞外型溶液类似，胞内型溶液可以是不含动物产品的。
可向胞内型溶液中添加其他组分以进一步补充胞内型溶液并进一步促进生物材料活力。例如，这些额外的组分向生物材料提供额外的营养支持，其降低或防止生物材料活力的损失。这些额外的组分可包括但不限于：具有非动物来源(即合成来源的)必需氨基酸的营养混合物(nutrient cocktail)、合成来源的非必需氨基酸、合成来源的维生素、合成来源的脂质、合成来源的碳水化合物，或其任意组合。营养混合物中包含的碳水化合物的示例还可包括单糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖)、二糖(例如麦芽糖、乳糖等)，或其组合。混合物中提供的氨基酸的示例可包括但不限于甘氨酸、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸或其任何盐的任意组合。混合物中提供的维生素的示例可包括但不限于胆碱、D-泛酸钙(D-calcium)、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇或其任何盐的任意组合。
如上文所示，溶液中可以包含防止或降低生物材料性能(如胞外基质完整性、细胞活力或其组合)损失的试剂。在某些方面中，该试剂可阻止或降低胞外基质完整性的损失。例如，防止或降低胞外基质完整性损失的试剂可包括小有机化合物、无机化合物、生物分子(例如蛋白质、多肽、肽、核酸、核酸适体、肽适体)或其任意组合，其与例如对照相比能够抑制或降低溶液中的胞外基质完整性损失。在某些方面中，与例如对照相比时，该试剂可使生物材料性能(如胞外基质完整性)损失降低例如5％或更多、10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多或99％或更多。换言之，与例如对照相比时，该试剂可基本或完全抑制生物材料性能损失，其幅度为例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。在某些方面中，溶液中包含的试剂浓度范围是1pM至1000μM、1pM至500μM、1pM至30μM、1pM至1000nM、1pM至500nM、1pM至250nM、100pM至750μM、100pM至500μM、100pM至20μM、100pM至1000nM、1pM至750nM、1pM至500nM、1pM至250nM、1pM至1nM、500pM至500μM、500pM至250μM、500pM至100μM、500pM至10μM,500pM至1000nM、500pM、至750nM、500pM至500nM、500pM至250nM、500pM至100nM、500pM至1nM、1nM至1000μM、1nM至750μM 1nM至500μM、1nM至250μM、1nM至100μM、1pM至1μM、100nM至1000μM,100nM至750μM、100nM至500μM、100nM至250μM、100nM至100μM、100pM至1μM、250nM至1000μM、250nM至750μM、250nM至500μM、250nM至250μM、250nM至100μM、250nM至1μM,500nM至1000μM,500nM至750μM、500nM至500μM、500nM至250μM、100nM至100μM、500nM至1μM、750nM至1000μM、750nM至750μM、750nM至500μM、750nM至250μM、750nM至100μM、750nM至1μM、0.5μM至1000μM、10μM至950μM、20μM至900μM、30μM至850μM、40μM至800μM、50μM至750μM、60μM至700μM、70μM至650μM、80μM至600μM、90μM至550μM、100μM至500μM、110μM至450μM、120μM至400μM、130μM至350μM、140μM至300μM、150μM至250μM、160μM至200μM、0.5μM至100μM、1μM至90μM、5μM至90μM、10μM至85μM、10μM至75μM、20μM至85μM、20μM至65μM、30μM至70μM、30至50μM、40μM至80μM或者40μM至50μM，其中上述范围内出现的任何浓度也可作为范围的端点。
在一个方面中，认为该试剂抑制或降低影响生物材料性能(如胞外基质完整性)的酶的活性。因此，该试剂可作为与促进生物材料损伤(如胞外基质损伤)相关的特定酶的酶抑制剂。在该方面中，该酶抑制剂可以上文所述范围使用以抑制或降低酶的活性并提高生物材料性能的保留(如胞外基质完整性的保留)。在一个方面中，该酶抑制剂可具体包括但不限于基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。
例如，在某些方面中，MMP可通过酶促降解至少一部分生物材料来对生物材料性能(如胞外基质完整性)产生不利影响并潜在地导致储存后低效的生物材料功能。因此，在某些方面中，需要通过使用MMP抑制剂来降低或抑制MMP酶活性。例如，该MMP抑制剂可以抑制或降低MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28或其任意组合的酶活性。在某些方面中，该MMP抑制剂可以降低或抑制MMP1、MMP 8、MMP9、MMP13或其任意组合中至少一种的酶活性。在某些方面中，该MMP抑制剂可以降低或抑制MMP1、MMP8、MMP9、MMP13或其任意组合中至少两种的酶活性。在某些方面中，该MMP抑制剂可以降低或抑制MMP1、MMP 8、MMP9、MMP13或其任意组合中至少三种的酶活性。此外，该MMP抑制剂可包括但不限于天然或合成的基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。合成的MMP抑制剂通常含有螯合基团，其紧密地结合MMP活性位点处的催化性锌原子。常见的螯合基团包括异羟肟酸酯/盐、羧酸酯/盐、硫醇和氧膦基。在某些方面中，异羟肟酸酯/盐是特别强力的MMP抑制剂，因为其对锌原子进行双齿螯合(bidentate chelation)。锌螯合剂可包括二乙基二硫代氨基甲酸(DEDTC)和乙二胺四乙酸钙(EDTA)。在某些方面中，本文所述抑制剂可包括但不限于：多西环素、PCK3145(对应于前列腺分泌蛋白94的氨基酸31-45的合成肽)、BB-2516(马立马司他)、BB-94(即巴马司他，其是(2R,3S)-N4-羟基-N1-[(1S)-2-(甲基氨基)-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-2-(2-甲基丙基)-3-[(2-噻吩基硫代)甲基]丁二酰胺)、调节内源性金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的化合物(例如调节TIMP合成的化合物)，或其任意组合。例如，已证明一种天然化合物京尼平上调TIMP-1的表达。不希望受理论限制，京尼平诱导的TIMP-1的上调降低或抑制了MMP-2活性，且在某些方面中，京尼平可用于在本发明所述方法和组合物中抑制或降低MMP酶活性。此外，已证明转化生长因子-β(TGF-β)信号通过刺激胶原生成和其他胞外基质蛋白并通过上调TIMP-1基因抑制基质降解从而在胞外基质沉积中起重要作用。因此，调节TGF-β信号并最终调节TIMP表达(如TIMP-1表达)和MMP抑制的化合物可用作本发明所述方法的抑制剂。
在某些实施方式中，将生物材料置于包含至少一种降低或防止生物材料胞外基质完整性损失的试剂和至少一种或多种促进细胞活力保留的试剂的溶液。
在将生物材料置于上述任一种溶液中后，随后可储存该生物材料。例如，在将生物材料置于包含至少一种试剂的溶液中后，可在多种温度下储存该混合物以进一步促进生物材料胞外基质的保存并进一步防止或降低生物材料活力的损失。例如，这些温度可包括但不限于低温温度和常温温度。在将生物材料储存于低温温度中时，优选减少或防止冰核。在某些方面中，低温温度可包括以下温度范围：-25℃至+35℃、-15℃至+30℃、-5℃至+25℃、-5℃至+20℃、-5℃至+15℃、-5℃至+10℃、-5℃至+5℃、0℃至+10℃、0℃至+9℃、0℃至+8℃、0℃至+7℃、0℃至+6℃、0℃至+5℃、0℃至+5℃、0℃至+4℃、0℃至+3℃、0℃至+2℃、+1℃至+8℃、+1℃至+6℃、+1℃至+4℃、+1℃至+3℃、+2℃至+9℃、+2℃至+6℃、+2℃至+4℃、+3℃至+8℃、+3℃至+6℃、+3℃至+5℃、+4℃至+8℃、+4℃至+6℃、+5℃至+9℃、+5℃至+7℃、+6℃至+10℃、+6℃至+8℃、+7℃至+9℃和+8℃至+10℃。在某些方面中并取决于生物材料，优选低温温度。例如，如果软骨细胞和/或软骨是生物材料，可使用上文所述低温温度保存软骨细胞和/或软骨。例如，如果软骨细胞和/或软骨是生物材料，低温温度的范围优选-25℃至+35℃，更优选-5℃至+25℃，且最优选0℃至+10℃。在某些方面中，可将生物材料储存数小时、数天、数月或数年。例如，优选将软骨细胞和/或软骨(如软骨组织塞)储存数小时至最多三个月、数小时至最多两个月、数小时至最多一个月，等。
在某些方面中，可以多种所需时间间隔替换储存的生物材料的不含动物产品的溶液。例如，可在生物材料储存期间并直至从储存中取出储存的生物材料以用于进一步使用前，每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两月一次替换不含动物产品的溶液。
在使用上文所述方法和组合物时，在某些方面中，该生物材料包括软骨细胞和/或软骨。本发明的一个目的包括在储存期间降低或防止生物材料的胞外基质材料性能损失并优化生物材料的细胞活力，用于以后的应用。在该方面中，将软骨细胞和/或软骨置于包含至少一种试剂的溶液中，所述试剂至少降低或防止胞外基质完整性的损失。可将软骨细胞和/或软骨置于胞外型溶液中，该胞外型溶液包含上文所述浓度的MMP抑制剂，且随后可将该混合物在范围为-25℃至+30℃的低温温度下储存一段时间。在另一个方面中，可将软骨细胞和/或软骨置于胞内型溶液中，该胞内型溶液包含上文所述浓度的MMP抑制剂，且在某些方面中，该胞内型溶液任选地还包含上文所述营养混合物以促进细胞活力的保留。随后将置于胞内型溶液中的软骨细胞和/或软骨在范围为-25℃至+25℃的低温温度下储存一段时间。
在一个方面中，需要确定最能够降低或防止储存期间生物材料性能(例如胞外基质完整性，包括胞外基质渗透性、水含量、细胞活力等)损失的溶液。在进一步确定最能够降低或防止生物材料性能损失的方法和组合物的同时，可将相同的生物材料置于上文所述两种不同的溶液(即胞内型和胞外型)中。这两种溶液都含有减少或防止生物材料胞外基质性能损失的试剂，且该胞内型溶液可任选地含有营养混合物。在将相同的生物材料置于两种不同溶液中后，可以类似方式(即在相同温度下，储存相同时间等)储存两种不同溶液中的生物材料。一段时间后，将置于两种不同溶液中的相同生物材料从储存中取出并测试生物材料性能(如细胞活力、胞外基质渗透性等)并对其进行比较以确定最能够降低或防止生物材料活力损失的方法和组合物。在某些方面中，这些方法和技术可适用于软骨细胞和/或软骨以进一步确定最能够在储存期间降低或防止生物材料完整性损失的溶液。
在一些实施方式中，本发明涉及一种组合物，其包含置于溶液中的生物材料，所述溶液包含至少一种降低或防止生物材料性能损失的试剂。该生物材料性能可包括胞外基质完整性、细胞活力或其组合。胞外基质完整性可包括例如胞外基质渗透性、胞外基质水含量、胞外膜糖胺聚糖含量或其任意组合。该生物材料可包括真核组织。在一些实施方式中，该生物材料可包括软骨。在一些实施方式中，该生物材料可包括胞外基质中的软骨细胞。在一些实施方式中，该生物材料可包括含有活细胞的同种异体移植物材料。在一些实施方式中，该生物材料可包括含有活细胞和胞外基质的同种异体移植物材料，且该试剂降低或防止胞外基质完整性、细胞活力或其组合的损失。在这类实施方式中，该同种异体移植物材料可以是软骨。在一些实施方式中，该溶液可以是不含动物产品的溶液，如不包含胎牛血清的溶液。在一些实施方式中，该溶液可以是胞外型溶液，如等渗胞外型溶液。在一些实施方式中，该溶液可以是胞内型溶液，如等渗胞内型溶液。
在一些实施方式中，该至少一种降低或防止生物材料性能损失的试剂在溶液中的浓度范围是100pM至1mM。在一些实施方式中，该至少一种试剂是酶抑制剂，如最小化酶活性以降低或防止生物材料性能损失的酶抑制剂，该生物材料性能包括胞外基质完整性。例如，该酶抑制剂可以抑制至少一种基质金属蛋白酶，如一种或多种以下物质：MMP 1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP 19、MMP 20、MMP 21、MMP 23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28或其任意组合。在一些实施方式中，该酶抑制剂在溶液中的浓度范围是1.0nM至1000μM。在一些实施方式中，该酶抑制剂可选自：多西环素、TIMP、上调内源性TIMP的化合物、PCK3145、BB-2516和BB-94。
在一些实施方式中，本发明涉及一种组合物，其包含置于溶液中的生物材料，该溶液包含至少一种降低或防止生物材料性能损失的试剂，其中该溶液是不含动物产品的溶液，包括等渗的胞外型溶液，该生物材料包括软骨或胞外基质中的软骨细胞，且该至少一种试剂包括浓度为1.0nM至1mM的基质金属蛋白酶的酶抑制剂。在一些实施方式中，本发明涉及一种组合物，其包含置于溶液中的至少一种降低或防止生物材料性能损失的试剂，该溶液是不含动物产品的溶液，包括等渗的胞内型溶液，该生物材料包括软骨或胞外基质中的软骨细胞，且该至少一种试剂包括浓度为1.0nM至1mM的基质金属蛋白酶的酶抑制剂。
在一些实施方式中，本发明涉及一种储存生物材料的方法，该方法包括将生物材料置于溶液中，所述溶液包含至少一种降低或防止生物材料性能损失的试剂。在一些实施方式中，该生物材料可包含天然或工程改造的真核组织。在一些实施方式中，该生物材料可包括软骨。在一些实施方式中，该生物材料包括胞外基质中的软骨细胞。在一些实施方式中，该生物材料包括含有活细胞的同种异体移植物材料。在一些实施方式中，该生物材料包括含有活细胞和完整胞外基质的同种异体移植物材料。在一些实施方式中，该同种异体移植物材料可以是软骨。在一些实施方式中，该溶液可以是不含动物产品的溶液。在一些实施方式中，该溶液可以是胞外型溶液，如等渗的胞外型溶液。在一些实施方式中，该溶液可以是胞内型溶液，如等渗的胞内型溶液。在一些实施方式中，该溶液不包含胎牛血清。在一些实施方式中，该至少一种试剂在溶液中的浓度范围是1.0nM至1mM。在一些实施方式中，该至少一种试剂可以是酶抑制剂，如最小化酶活性以降低或防止生物材料性能损失的酶抑制剂，该生物材料性能包括胞外基质完整性。在一些实施方式中，该酶抑制剂可以抑制至少一种基质金属蛋白酶，如选自下组的至少一种基质金属蛋白酶：MMP 1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28及其任意组合。在一些实施方式中，该酶抑制剂可选自：多西环素、TIMP、上调内源性TIMP的化合物、PCK3145、BB-2516和BB-94。在一些实施方式中，该方法还包括在-25℃至+35℃的温度范围下储存置于溶液中生物材料。在一些实施方式中，该溶液是不含动物产品的溶液，包括胞外型溶液，该胞外型溶液是等渗的，该生物材料是软骨或胞外基质中的软骨细胞，且该至少一种试剂包括浓度范围为1.0nM至1mM的基质金属蛋白酶的酶抑制剂。在一些实施方式中，该溶液是不含动物产品的溶液，包括胞内型溶液，该胞内型溶液是等渗的，该生物材料是软骨或胞外基质中的软骨细胞，且该至少一种试剂包括浓度范围为1.0nM至1mM的基质金属蛋白酶的酶抑制剂。
在一些实施方式中，本发明涉及一种组合物，其包含不含动物产品的溶液，该溶液包含至少一种基质金属蛋白酶抑制剂。在一些实施方式中，该不含动物产品的溶液包含细胞培养基。在一些实施方式中，该不含动物产品的溶液是不包含细胞培养基的胞内型溶液。在一些实施方式中，该基质金属蛋白酶抑制剂降低或抑制MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28或其任意组合中至少一种的酶活性。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂降低或抑制MMP1、MMP8、MMP9、MMP13或其任意组合中至少一种的酶活性。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂降低或抑制MMP1、MMP8、MMP9、MMP13或其任意组合中至少两种的酶活性。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂降低或抑制MMP1、MMP8、MMP9、MMP13或其任意组合中至少三种的酶活性。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂在不含动物产品的溶液中的浓度范围为1.0nM至1000μM。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂在不含动物产品的溶液中的浓度范围为100nM至100μM。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂在不含动物产品的溶液中的浓度范围为1pM至30μM。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂在不含动物产品的溶液中的浓度范围为100pM至20μM。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂在不含动物产品的溶液中的浓度范围为500pM至10μM。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂在不含动物产品的溶液中的浓度范围为1μM至5μM。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂选自：多西环素、TIMP、上调内源性TIMP的化合物、PCK3145、BB-2516和BB-94。在一些实施方式中，该至少一种基质金属蛋白酶抑制剂选自：多西环素、TIMP、上调内源性TIMP的化合物、PCK3145、BB-2516和BB-94。在一些实施方式中，该基质金属蛋白酶抑制剂是浓度范围为1.0nM至1000μM的多西环素。在一些实施方式中，该胞内型溶液还包含营养混合物，该营养混合物包含至少一种以下组分：D-葡萄糖、甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇、其任何盐或其任意组合。在一些实施方式中，该胞内型溶液还包含营养混合物，该营养混合物包含至少一种以下组分：D-葡萄糖、甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺、肌醇、其任何盐或其任意组合。
在一些实施方式中，本发明涉及一种组合物，其包含溶液中的生物材料，该溶液促进胞外基质完整性和细胞活力的保留，该溶液包含酶抑制剂。在一些实施方式中，本发明涉及一种方法，该方法包括使用至少一种促进胞外基质完整性和细胞活力保留的添加剂在低温温度下在胞内型溶液内储存生物材料。在一些实施方式中，该至少一种添加剂包括酶抑制剂、氨基酸、多种氨基酸、糖、多种糖、脂质、多种脂质、维生素、多种维生素，或其任意组合。
通过以下实施例可以更好地理解上述内容，提供以下实施例仅是为了说明目的，而非旨在限制本发明的范围。
实施例
给出下列实施例以为本领域的普通技术人员完整地公开和描述本文描述和要求权利的组合物和方法是如何制备和评价的，这些实施例完全是出于示例目的而不是为了限制对发明人而言其发明的范围。已经作出了努力以确保数字(含量、温度等)的精确性，但也应当考虑正常的错误和偏差。除非另外指出，否则，份是重量份，温度按℃表示或是环境温度，压力为大气压或接近大气压。对反应条件，如组分浓度、所需溶剂、溶剂混合物、温度、压力和使由所述方法得到的产物纯度和产率最佳化的其他反应范围和条件，可以有许多的变化和组合。
初步研究
将样品在多种溶液(例如DMEM、SPS、PBS和UHK)中低温储存28天。随后将这些样品从储存中取出并评价软骨软骨细胞活力和渗透性(即软骨的胞外基质完整性)。如图1所示，在样品中评价软骨细胞活力和增殖，所述样品在四种不同溶液中储存28天。通过使用刃天青还原代谢试验评估活力，与SPS、PBS和UHK中储存的样品相比，DMEM中储存的细胞显示明显较高的软骨细胞活力。具体而言，图1的数据以平均RFU/6mm塞±1se的形式表示且*表示p<0.05的显著性差异。从第2天起始的在DMEM与其他溶液中储存的细胞之间观察到细胞活力方面统计学显著的差异。培养4天后DMEM达到对照水平。未处理的对照值以平均值(虚线)±1se(影线)的形式显示于图的顶部。在储存后恢复组织培养(图1)中，这些结果与软骨基质渗透性缺失之间的相关系数(R2)在4天中增加(示于图3)。这些数据表明，复杂的胞外型培养基(如DMEM)对于维持软骨细胞功能而言是最佳的(图1)，所述软骨细胞功能与细胞存活(即细胞活力)相关。此外，将这些样品在两种胞内型溶液(即SPS和UHK)中储存约一个月导致在生理组织培养条件下恢复后增殖期间代谢较少(图1)。类似地，将这些样品储存于磷酸盐缓冲盐水(PBS)(一种不含营养物的胞外制剂)中也显示恢复后组织培养期间的增殖较少。这些观察表明，营养物造成储存在DMEM中的软骨塞的明显更好的性能(即软骨细胞活力)(图1)。
有趣的是，在4天的储存后恢复之后，储存在DMEM中的软骨显示最高的细胞活力(即RFU活力值)但最低的电导率(mS/cm)。虽然该结果表明DMEM促进最高的细胞活力，但该结果还表明软骨基质渗透性的最大损失发生在软骨储存于DMEM中时。该观察产生以下假说，即细胞活力的保留导致影响胞外基质渗透性的细胞来源材料的释放。具体而言，这些研究证明了细胞活力保留与软骨基质渗透性损失之间的强关联(R2＝0.90)(图2)。图2具体显示了高细胞活力与软骨基质渗透性和电导率损失之间的相关系数(R2)由于在4种不同溶液中冷冻储存而在4天的储存后恢复组织培养期间从0.78升高至0.90。
基于图1和2的数据，在各样品中进一步评价软骨渗透性，所述样品储存在不同的溶液中。与在其他溶液(即PBS、UHK和SPS)中储存的样品相比，在DMEM中储存28天的样品(即DMEM 28)表现出显著较低的电导率。图3显示低温储存对软骨渗透性的影响，其通过测量低温盐水中电导率来评价。数据以平均值±1se的形式表示且*表示第一天时DMEM对照与28天后储存组之间p<0.05的显著性差异，每个猪供体n＝5个样品。在四个独立实验中，第28天DMEM组显著较少。因此，这些数据进一步显示将软骨储存于DMEM中时高细胞活力与低渗透性之间的关联。
实施例
实施例1：评价在胞外型溶液中储存期间基质金属蛋白酶(MMP)抑制对于软骨性能的影响。
使用多种浓度的MMP抑制剂(如多西环素)配制不含动物产品的培养基。在至少一个月的低温储存期间内比较生物材料性能(包括软骨细胞活力、软骨化学、渗透性和其他生物材料性能)。使用已建立的方法进行生物材料测试[Yao,2002；Gu,2004；Brockbank,2011(参见下文参考文献列表)]。
多西环素在临床上用于治疗牙周病且是仅有的广泛用于临床使用的MMP抑制剂。已证明多西环素对于软骨具有有益的体内作用，如降低动物模型和人中的MMP 8、9和13活性。此外，体外研究显示多西环素可抑制MMP合成以及MMP活性。
其他MMP抑制剂也可以是有效的，包括，例如，TIMP、PCK3145(对应于前列腺分泌蛋白94的氨基酸31-45的合成肽)和马立马司他(BB-2516)。在早期临床研究中，PCK3145和马立马司他都是良好耐受的。还可能不需要以一周为间隔的溶液替换，但需要探索软骨质量与溶液体积的比例。对于不进行溶液替换的长期储存，可能需要高多西环素浓度。
实验设计：
获得猪软骨塞并将这些塞在4℃(低温条件)下储存于附加有0-300μM多西环素的不含动物产品的DMEM中。在某些样品中，每周改变介质，如先前研究中那样(图1-3)，且对于其他样品，在储存期间不改变介质。比较这两个样品组(即(1)每周改变的介质和(2)无介质改变)。在某些方面中，一旦将同种异体移植物置于储存中后，需要最小化同种异体移植物的操作需要。
方法：
从成年家养约克郡跨农场猪(25Kg)中在死后获取猪膝。获取膝后，将膝置于含有碘溶液的密封塑料袋中并在冰上转移至实验室用于无菌解剖。使用无菌穿孔制备股骨头软骨盘状塞。将5个塞的各组置于无菌容器内的储存溶液中，每周替换或不替换基质，持续1-2月。
代谢活性：
使用刃天青还原试验来评估对照和经处理的软骨塞的代谢活性[O’Brien,2000；Brockbank,2011]。将组织塞(n＝5/实验/供体)在2ml的DMEM+10％FBS培养基中孵育一小时以进行平衡，随后在标准细胞培养条件下添加20％刃天青还原试验溶液，持续3小时。刃天青还原试验试剂是基于代谢活性检测的荧光指示剂。在544nm的激发波长和590nm的发射波长下通过多模式酶标仪重复测量荧光量。每天进行该评估并持续数天以对组织中经复温的细胞进行表征(图2)。刃天青在所用浓度下不具有细胞毒性，因此可在多种情况下测试相同的组织样品。复温后不久(第0天)的结果显示细胞活力，1-2天后的下降表明因为凋亡产生的细胞死亡，而上升测量细胞增殖。随后干燥组织塞以获得干重。对于各实验组和未处理对照，细胞代谢活性表示为每mg干重或每个组织塞的相对荧光单位(RFU)。
其他活力评估方法：
上文所述代谢试验是主要的活力评估方法；然而，还可进行其他的活力评估试验。例如，可通过细胞的荧光活/死染色进一步测定细胞活力。还可在通过酶消化从组织塞中释放细胞后对细胞进行评估并使用基于膜完整性的台盼蓝排除试验进行评估[Brockbank,2011]。还可将细胞在DMEM中培养至少一周以验证细胞(软骨细胞)实际上能够在体外粘附并增殖。可对培养物进行细胞计数和数码成像分析。
水、蛋白聚糖和胶原含量：材料性能测量后，可将样品冻干以测定水(孔隙)、蛋白聚糖(S-GAG)和胶原(羟基脯氨酸)含量。基于阿基米德原理分析样品的孔隙度[Gu,2004]，使用Farndale(1982)所述方法分析样品的S-GAG并使用Bergman和Loxley(1970)的方法分析样品的羟基脯氨酸含量。
电导率：
使用标准设备在零流体流动条件下测量组织电导率[Gu 2002a；2002b]，该设备由置于含有各试样的树脂玻璃室周围的电流和电压电极组成。使用4导线方法和Keithley源表的组合，在0.015mA/cm2的非常低的电流密度下测量跨试样的电阻(R)。电流传感测微计用于测量试样尺寸，使用以下方程生成相应的电导率：
χ＝h/(RA) (1)
其中A是横截面面积，且h是组织试样的厚度。在室温(22℃)下在等渗或低渗磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH7.4)中进行电导率测量。
溶质扩散率：
在零流体流动条件下，根据Maroudas(1968)NaCl溶液中组织的电导率(χ)与Na+和Cl-扩散率(Dα,α＝+,-)相关：
Figure BDA0002166340510000171
其中Fc是法拉第常数，
Figure BDA0002166340510000172
是水的体积分数(孔隙度)，c+是阳离子(Na+)浓度且c-是阴离子(Cl-)浓度，R是气体常数，T是温度。可使用唐南方程(Donnanequation)[Maroudas，1975]计算c+和c-：
Figure BDA0002166340510000173
其中cF是组织固定电荷密度(FCD)且c*是电解液的NaCl浓度。由经测量的蛋白聚糖含量测定组织FCD。使用电解液的电导率、FCD、孔隙度和浓度数据，可由方程3计算离子扩散率。该方法可用于研究猪和牛软骨组织[Gu,2004；Jackson,2006]。
压缩聚集体模量和水力渗透性：
使用限制蠕变压缩测试测定软骨样品的机械性能。在动态机械分析仪(Q800，特拉华州新塞的TA仪器公司(TA Instruments))的承载轴向上应用该测试。使试样在限制室中的轻微压缩自重下以其初始测量的高度在PBS中平衡(图4)。平衡后，在初始高度下记录膨胀应力并对试样施加恒定压缩应力持续3小时。将蠕变数据曲线拟合至双相理论以获得聚集体模量HA和水力渗透性[Yao,2002]。
实验数据
在使用实施例1中刚刚描述的方法的冷冻储存实验中，从一只猪获取45片猪软骨塞。在活力测试中包含20片软骨塞(图5)。在该活力测试中，每种多西环素浓度使用4片塞。另外25片塞用于机械测试(图6)。
对于图5所示数据，各塞直径为6mm。可注射形式的多西环素(DOXY 100TM)获自APP制药公司(APP Pharmaceuticals,LLC)(伊利诺伊州绍姆堡)，其分子量为1,025.89道尔顿。储存溶液含有DMEM、1.44mg/ml抗坏血酸、甘露醇0.9mg/ml和不同浓度的多西环素(0uM、10uM、30uM、100uM、300uM)。储存温度为4℃。如图5所示，从第0周至第4周追踪活力测试。如图6所示，仅在第4周进行机械测试。
活力评估：使用刃天青还原方法评估软骨细胞代谢活性。刃天青还原试验(通常称作阿拉马蓝试验)含有水溶性荧光活力氧化还原(REDOX)指示剂，其通过响应生长培养基的化学还原的发荧光和改变颜色来检测代谢活性。代谢活性细胞还原刃天青以发出试卤灵荧光。将新鲜的对照和低温储存的组织样品置于37℃培养条件中1小时以对DMEM加10％FBS中的组织培养条件进行调节。随后将组织与刃天青工作溶液孵育三小时，之后将等分的基质置于微滴定板孔中并在590nm的波长下在微滴定板荧光分光光度计上读取。数据表示为平均值±1se相对荧光单位。
生物材料测试：还通过测量电导率来评估软骨塞的渗透性以确定储存期间软骨基质性能是否改变。从储存的6mm直径软骨盘中通过使用角膜环钻切割5mm圆柱塞来制备试样。在储存后0和1个月测试样品，使用锋利的刀片手工修整软骨表面。随后在低渗盐水中测试电导率。使用电流传感测微计测量各试样的高度。所有电导率测量都在室温(22℃)下在低渗盐水中进行。电导率是生物组织的材料性能。其值与组织内小离子的扩散率相关，其取决于组织组成和结构。
统计方法：进行单向ANOVA(p<0.05被认为显著)来测定细胞荧光单位和电导率的平均值的差异。
多西环素的存在以剂量依赖的方式影响活力。如图5所示，在所有时间点处，零组(即未添加多西环素的组)都显著高于所有处理组(p<0.05)。还如图5所示，第2-4周，10μM组显著高于所有其他组(图5；p<0.05)。该数据表示为平均值±平均值的1个标准误，n＝4，使用单向方差分析(ANOVA)。
如图6所示，在一个月时0μM组中电导率较低且所有多西环素组(即10μM、30μM、100μM和300μM)都与零时刻组类似(图6；p<0.05)。该数据表示为平均值±平均值的1个标准误，n＝5，使用单向方差分析(ANOVA)。
该使用多西环素的实验结果显示，在活细胞存在的情况下，MMP的抑制促进电导率和渗透性保留。例如，这由10μM组活力(图5)和电导率结果(图6)证明。
实施例2：测定关键培养基组分对于胞内型低温溶液中储存的软骨的影响
步骤I：配制不含动物产品的低温储存溶液，其含有或不含有达氏修正伊氏培养基(DMEM)中的主要营养物。步骤II：向实施例2的新的胞内型储存制剂中添加多种浓度的多西环素以最小化MMP活性。
实验设计：
步骤I：向贝尔泽溶液(Belzer's Solution)中添加基于DMEM制剂的营养混合物，该贝尔泽溶液是商品名为SPS-1的主要临床器官保存制剂(伊利诺伊州伊塔斯加的器官恢复系统公司(Organ Recovery Systems))。该营养混合物由用于DMEM的浓度的D-葡萄糖和氨基酸(甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸2HCl、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐-H20、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐脱水物和L-缬氨酸)组成(弗吉尼亚州玛纳萨斯的密迪亚泰克公司(Mediatech)，货号#10-014-CM)。将改良的制剂与初始制剂比较。步骤II：将0-300μM多西环素添加至改良的贝尔泽溶液中。在至少一个月的低温储存期间对软骨塞测定细胞活力、生物材料性能和软骨生物化学。选择最佳的多西环素剂量以与实施例1的优化的胞外溶液比较。还如实施例1所述评估溶液变化方案。
选择了贝尔泽溶液(SPS-1)和多西环素，因为其是FDA批准的产品。步骤I：初步数据中使用DMEM获得的较高活力值(图2)最可能是由于支持低温储存期间4℃下预期的低水平代谢(<10％)的营养组分。步骤II：该步骤是有用的，因为在步骤I中通过营养补充改善软骨细胞活力时，可出现增加的MMP合成。
实施例3：比较胞外型和胞内型溶液。
实验设计：
在实施例1和实施例2中所述的胞外型和胞内型保存制剂中储存后评估软骨塞性能。在2个月的期间内评估塞(例如，时间0和储存1、4和8周后)并且除先前实施例中使用的试验外还评估基因表达。对各组在各时间点评估两个样品，并对实验重复四次(7组x2个重复x4个实验＝56个样品)。
该实施例的目的是比较实施例1的胞外型溶液与实施例2的胞内型溶液。除了上文所述细胞活力和ECM试验外，还进行基因表达分析以确保软骨细胞相对于新鲜未处理的软骨中的软骨细胞表达适当的前软骨基因(pro-cartilage gene)。
方法：
基因表达：将样品在液氮中速冻并储存于-80℃。分离总细胞RNA(RNeasy试剂盒，凯杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州)、反转录成cDNA(Omniscript RT试剂盒，凯杰公司，加利福尼亚州)，使用实时PCR定量因储存导致的基因表达变化和质量。通过评价Sox9、蛋白聚糖聚合物、II型胶原(对比去分化标记物I型胶原)、软骨寡聚体基质、ECM吸收标记物(MMP-9)加蛋白和肥大性标记物基因(10型胶原和碱性磷酸酶)来评价表型保留(和/或表型缺失)。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域技术人员通常所理解的同样含义。
本领域技术人员应了解或能够确定仅采用常规实验即可获得本文所述的本发明具体实施方式的许多等同形式。这类等同形式应包含在权利要求书的范围内。
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以下参考文献列表中的引用通过引用纳入本文相关部分，用于至少文中所列理由。
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Claims (12)

1.一种储存生物材料的方法，包括：
将生物材料置于溶液中制备成组合物，所述溶液包含至少一种降低或防止生物材料性能损失的试剂；
将所述生物材料低温保存预定的一段时间；以及
在所述生物材料保存后获得活生物材料；
其中，所述溶液是包括达尔伯克改良伊格尔培养基即DMEM培养基的不含动物产品的溶液，所述活生物材料包括软骨或胞外基质中软骨细胞的活细胞，所述至少一种试剂包括浓度范围为10μM-30μM的多西环素，所述生物材料性能包括细胞活力和胞外基质完整性，其中，胞外基质完整性包括胞外基质渗透性。
2.如权利要求1所述的方法，所述组合物包含至少一种促进胞外基质完整性和细胞活力的保留的添加剂，所述至少一种添加剂包括一种或多种氨基酸、一种或多种糖、一种或多种脂质、一种或多种维生素，或其任意组合。
3.如权利要求1所述的方法，所述低温为-25℃至+35℃。
4.如权利要求1所述的方法，所述低温为0℃至+10℃。
5.如权利要求1所述的方法，所述低温为0℃至+5℃。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种试剂是10μM多西环素。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述生物材料的储存包括数小时至3个月的储存期。
8.如权利要求2所述的方法，其中，所述生物材料的储存包括数小时至3个月的储存期。
9.如权利要求3所述的方法，其中，所述生物材料的储存包括数小时至3个月的储存期。
10.如权利要求4所述的方法，其中，所述生物材料的储存包括数小时至3个月的储存期。
11.如权利要求5所述的方法，其中，所述生物材料的储存包括数小时至3个月的储存期。
12.如权利要求6所述的方法，其中，所述生物材料的储存包括数小时至3个月的储存期。
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