JP6374872B2 - 生物材料特性の維持および保存方法 - Google Patents
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Description
試料をさまざまな溶液(例えば、DMEM、SPS、PBS、およびUHK)中で28日間低温保存した。これらの試料をその後保存状態から取り出し、軟骨組織の軟骨細胞生存性および透過性(すなわち、軟骨組織の細胞外マトリックス完全性)を評価した。図1に示されるように、軟骨細胞生存性および増殖性を4つの異なる溶液中に28日間保存された試料において評価した。DMEM中に保存された細胞は、生存性をレサズリン還元代謝アッセイで評価することにより示されるようにSPS、PBS、およびUHK中に保存された試料よりかなり高い軟骨細胞生存性を示した。具体的には、図1のデータは平均RFU/6mmプラグ±1se(標準誤差)として表され、*はp<0.05での有意差を示す。細胞生存性における統計的有意差をDMEMおよび他の溶液中に保存された細胞間で2日目から観測した。DMEMは培養の4日後に対照レベルに達した。未処理の対照値は図の上部に平均(破線)±1se(陰影)として示される。これらの結果と軟骨組織マトリックス透過性の損失(図3に示される)との間の相関係数(R2)は保存後回復組織培養の4日間で増加した(図1)。これらのデータは複合細胞外タイプ培地(例えば、DMEM)が軟骨細胞機能の維持に最適であることを示し(図1)、これは細胞生存(すなわち、細胞生存性)と相関する。さらに、これらの試料の細胞内タイプ溶液(すなわち、SPSおよびUHK)中での約1ヶ月間の保存は生理的組織培養条件下での回復後増殖中の代謝を低下させた(図1)。同様に、これらの試料のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、栄養素を含まない細胞外製剤中での保存も回復後組織培養中に低い増殖性を示した。これらの観測はDMEM中に保存された軟骨プラグの有意により良好な性能(すなわち、軟骨細胞生存性)の要因は栄養素であることを示す(図1)。
実施例1:細胞外タイプ溶液中での保存中のマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)阻害の軟骨組織特性に対する影響を評価する
動物生成物を含まない培地を異なる濃度のMMP阻害剤(例えば、ドキシサイクリン)で製剤する。軟骨細胞生存性、軟骨組織化学的性質、透過性および他の生物材料特性を含む生物材料特性を少なくとも1ヶ月の低温保存期間にわたり比較する。生物材料試験は構築された方法[Yao,2002;Gu,2004;Brockbank,2011(以下の参考文献リスト参照)]を用いて行う。
ブタ軟骨プラグを入手し、これらのプラグを4℃(低温条件)で0〜300μMのドキシサイクリンを補充した動物生成物を含まないDMEM中に保存する。特定の試料では、予備研究(図1〜3)と同様に培地を毎週交換し、他の試料については保存中に培地を交換しない。これらの2つの試料セット(すなわち、(1)毎週培地交換と(2)培地交換なし)を比較する。特定の態様では、同種移植片を一度保存した後再度処理する必要性は最小化することが望ましい。
ブタの膝を成体家畜ヨークシャー雑種農場ブタ(25Kg)から屠殺後に調達する。膝を調達した後、膝をヨウ素溶液を含むジップロックバッグに入れ、無菌解剖のため実験室まで氷の上に置いて輸送する。大腿骨頭軟骨円板形状プラグを無菌パンチを用いて用意する。5つのプラグの群を無菌容器中の保存溶液中に毎週の培地交換ありおよびなしで1〜2ヶ月間入れる。
レサズリン還元アッセイを用い、対照および処理後の軟骨プラグの代謝活性を評価する[O’Brien,2000;Brockbank,2011]。組織プラグ(n=5/実験/ドナー)を2mLのDMEM+10%FBS培地中で1時間インキュベートし、平衡化した後、20%レサズリン還元アッセイ溶液を標準的な細胞培養条件下で3時間添加する。レサズリン還元アッセイ試薬は代謝活性の検出に基づく蛍光指示薬である。蛍光の量はマルチモードマイクロプレートリーダーにより544nmの励起波長および590nmの発光波長で2回測定する。この評価は毎日数日間行い、組織中の再加熱された細胞の特徴分析を可能にする(図2)。レサズリンは用いられる濃度では細胞毒性でないため、同じ組織試料を数回試験することができる。再加熱直後(0日目)の結果は細胞生存性を示し、1〜2日後の低下はアポトーシスによる細胞死を示し、増加は細胞増殖性を示す。組織プラグを次に乾燥させ、乾燥重量を求める。各実験群および未処理の対照について、細胞代謝活性は乾燥重量mg当たりまたは組織プラグ当たりの相対蛍光単位(RFU)として表す。
上述した代謝アッセイは主要な生存性評価方法であるが、追加の生存性評価アッセイを行ってもよい。例えば、細胞生存性は細胞の蛍光生/死染色によりさらに測定することができる。細胞は酵素消化による組織プラグからの放出後評価、および膜完全性に基づくトリパンブルー色素排除アッセイを用いて評価することもできる[Brockbank,2011]。細胞はまた、細胞、軟骨細胞が実際にインビトロで接着および増殖することができるかを確認するため、DMEM中で少なくとも1週間培養してもよい。培養について細胞数およびデジタル画像分析を行ってもよい。
組織導電性をゼロ流体流動条件で、各試料を含有するプレキシグラスチャンバーの周りに配置された電流および電圧電極からなる標準的な装置[Gu2002a;2002b]を用いて測定する。4線法およびKeithleyソースメーターの組み合わせを用い、試料にかかる抵抗(R)を0.015mA/cm2の非常に低い電流密度で測定する。電流 感知マイクロメーターを用いて試料寸法を測定し、対応する導電性を下記の式:
ゼロ流体流動条件下、NaCl溶液中の組織の導電性(χ)は、Maroudas(1968):
軟骨試料の力学特性は閉じ込め圧縮クリープ試験を用いて測定する。この試験は動的粘弾性測定装置(Q800、TA Instruments、デラウェア州ニューキャッスル)上で荷重負荷軸方向で行う。試料を閉じ込めチャンバーにおいて1分の圧縮自重負荷下で測定されたその初期高さでPBS中で平衡化させる(図4)。平衡化後、膨張応力を初期高さで記録し、試料に一定の圧縮応力を3時間加える。クリープデータは二相理論に曲線あてはめを行い、集合弾性HAおよび流体力学的透過性を求める[Yao,2002]。
実施例1においてすぐ上に記載した方法を用いる低温保存実験では、1頭のブタから45片のブタ軟骨プラグを採取した。20片の軟骨プラグを生存性試験(図5)に用いた。この生存性試験では、ドキシサイクリン濃度当たり4つのプラグを用いた。残りの25片は力学試験(図6)に用いた。
レサズリン還元法を用いて軟骨細胞代謝活性を評価した。一般的にはアラマーブルーアッセイとして知られるレサズリン還元アッセイは、成長培地の化学還元に応じた蛍光および色の変化の両方により代謝活性を検出する水溶性蛍光生存性酸化−還元(REDOX)指示薬を組み入れる。代謝活性細胞はレサズリンを蛍光性レゾルフィンに還元する。未処理の対照および低温保存された組織試料を37℃の培養条件に1時間入れ、10%FBSを含むDMEM中での組織培養条件まで調節した。組織を次に3時間レサズリン希釈標準溶液でインキュベートした後、培地のアリコートをマイクロ滴定プレートウェルに入れ、590nmの波長でマイクロ滴定プレート分光蛍光光度計で測定した。データは平均±1se相対蛍光単位として表す。
軟骨プラグは透過性についてもそれらの導電性を測定することにより評価し、軟骨組織マトリックス特性が保存中に変化したかを割り出した。試料は保存された直径6mmの軟骨円板から角膜トレフィンを用いて5mm円筒状プラグを切断することにより用意した。試料を保存の0および1ヶ月後に試験し、軟骨表面を鋭刃を用いて手作業で整えた。導電性は低張生理食塩水中で試験した。各試料の高さは電流感知マイクロメーターで測定した。すべての導電性測定は低張生理食塩水中で室温(22℃)で行った。導電性は生体組織の材料特性である。その値は、組織組成および構造によって決まる、組織内部の小イオンの拡散性に関連づけられる。
一元配置ANOVA(p<0.05を有意とみなす)を行い、細胞蛍光単位および導電性の平均値の差を割り出した。
生存性は用量依存的にドキシサイクリンの存在の影響を受けた。図5に示すように、ゼロ群(すなわち、ドキシサイクリンを添加していない群)はすべての時間点ですべての処理群より有意に高かった(p<0.05)。図5にさらに示すように、10μM群は2〜4週目ですべての他の群より有意に高かった(図5;p<0.05)。このデータは一元配置分散分析(ANOVA)を用いて平均±1標準誤差として表し、n=4である。
図6に示すように、導電性は0μM群において1ヶ月でより低く、すべてのドキシサイクリン群(すなわち、10μM、30μM、100μM、および300μM)は時間ゼロ群と同様だった(図6;p<0.05)。このデータは一元配置分散分析(ANOVA)を用いて平均±1標準誤差として表し、n=5である。
ステップI:動物生成物を含まない低温保存溶液をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で主要栄養素ありおよびなしで製剤する。ステップII:さまざまな濃度のドキシサイクリンを実施例2の新規細胞内タイプ保存製剤に添加してMMP活性を最小化する。
ステップI:DMEM製剤ベースの栄養素カクテルをベルザー溶液、SPS−1(Organ Recovery Systems、イリノイ州アイタスカ)として市販される先導的な臨床臓器保存製剤に添加する。栄養素カクテルはDMEM(Mediatech、バージニア州マナサス、Cat♯10−014−CM)に用いられる濃度のD−グルコースおよびアミノ酸(グリシン、L−アルギニン塩酸塩、L−シスチン2HCl、L−グルタミン、L−ヒスチジン塩酸塩−H20、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン塩酸塩、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン二ナトリウム塩脱水物およびL−バリン)からなる。改変製剤を元の製剤と比較する。ステップII:0〜300μMのドキシサイクリンを改変ベルザー溶液に添加する。細胞生存性、生物材料特性、および軟骨組織生物化学性質を軟骨プラグについて少なくとも1ヶ月の低温保存期間にかけて測定する。実施例1からの最適化された細胞外溶液との比較に最適なドキシサイクリン用量を選択する。溶液交換スケジュールについても実施例1に記載したとおり評価する。
(実験設計)
軟骨プラグ特性は実施例1および実施例2において記載した細胞外タイプおよび細胞内タイプ保存製剤中での保存後に評価する。プラグは2ヶ月の期間(例えば、時間0ならびに保存の1、4および8週間後)にかけて評価し、前記実施例に用いたアッセイに加えて遺伝子発現を評価する。2つの試料を各時間点で各群について評価し、実験を4回繰り返す(7群×2組×4実験=56個の試料)。
遺伝子発現:試料を液体窒素中で急速凍結し、−80℃で保存する。細胞RNA全体を単離し(RNeasyキット、Qiagen、カリフォルニア州)、cDNAに逆転写し(OmniscriptRTキット、Qiagen、カリフォルニア州)、その質について評価し、保存による遺伝子発現の変化をリアルタイムPCRを用いて定量化する。表現型の維持(および/または表現型の損失)はSox9、アグリカン、コラーゲンII型(脱分化マーカーであるコラーゲンI型に対して)、軟骨オリゴマーマトリックス、ECM再吸収マーカー(MMP−9)ならびにタンパク質および肥大性マーカー遺伝子(コラーゲン10型およびアルカリホスファターゼ)の発現を評価することにより評価する。
下記の参考文献のリストにおける引用は、少なくとも本文中に引用される理由で本明細書において参照により関連部分に組み入れられる。
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Claims (12)
- 生物材料特性の損失を低減または防止する少なくとも1つの作用剤を含む溶液中に入られた生物材料を含む組成物であって、
前記溶液が血清を含まない溶液であり、
前記生物材料が細胞外マトリックスまたは軟骨組織中の軟骨細胞を含み、
前記少なくとも1つの作用剤が1.0nM〜10μMの範囲の濃度を有するドキシサイクリンを含み、
前記生物材料特性は、細胞外マトリックス透過性を含む細胞外マトリックス完全性及び細胞生存性を含む、組成物。 - 前記細胞外マトリックス完全性が、細胞外マトリックス含水量、細胞外マトリックスグリコサミノグリカン含有量、またはこれらのいずれかの組み合わせをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記血清がウシ胎児血清である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記溶液が等張性である細胞外タイプ溶液である、または前記溶液が等張性である細胞内タイプ溶液である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞内タイプ溶液が、下記の成分:D−グルコース、グリシン、L−アルギニン塩酸塩、L−シスチン塩酸塩、L−グルタミン、L−ヒスチジン塩酸塩、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン塩酸塩、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、コリン、D−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、これらのいずれかの塩、またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも1つを含む栄養素カクテルをさらに含む、請求項4に記載の組成物。
- ドキシサイクリンが酵素活性を最小化して生物材料特性の損失を低減または防止し、前記生物材料特性が細胞外マトリックス完全性を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- ドキシサイクリンがマトリックスメタロプロテイナーゼの酵素阻害剤であり、前記マトリックスメタロプロテイナーゼがMMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、およびMMP28からなる群から選択される1つ以上のメンバーを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物を調製するステップを含む、−25℃〜+35℃の範囲の低温で生物材料を保存する方法であって、組成物の調製が前記生物材料を生物材料特性の損失を低減または防止する少なくとも1つの作用剤を含む溶液中に入れるステップを含む、方法。
- 血清を含まない溶液を含む組成物であって、
前記血清を含まない溶液がドキシサイクリンを1.0nM〜10μMの範囲の濃度で含み、
前記血清を含まない溶液が細胞培地を含まない細胞内タイプ溶液であり、
ドキシサイクリンがMMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも1つの酵素活性を低減または阻害する、組成物。 - ドキシサイクリンがMMP1、MMP8、MMP9、およびMMP13の少なくとも2つの酵素活性を低減もしくは阻害する、またはドキシサイクリンがMMP1、MMP8、MMP9、およびMMP13の少なくとも3つの酵素活性を低減もしくは阻害する、請求項9に記載の組成物。
- 前記細胞内タイプ溶液が下記の成分:D−グルコース、グリシン、L−アルギニン塩酸塩、L−シスチン塩酸塩、L−グルタミン、L−ヒスチジン塩酸塩、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン塩酸塩、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、コリン、D−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、これらのいずれかの塩、またはこれらのいずれかの組み合わせの少なくとも1つを含む栄養素カクテルをさらに含む、請求項9又は10に記載の組成物。
- 生物材料を−25℃〜+35℃の範囲の低温で請求項9〜11のいずれか一項に記載の組成物中に保存するステップを含む方法であって、
前記組成物が細胞外マトリックス完全性および細胞生存性の維持を促進する少なくとも1つの添加剤を含み、
前記少なくとも1つの添加剤が1つの酵素阻害剤、1つのアミノ酸、複数のアミノ酸、1つの糖、複数の糖、1つの脂質、複数の脂質、1つのビタミン、複数のビタミン、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、方法。
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