CN108041023B - 一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高软骨组织体外保存效果的力学刺激方法，包括：体外无菌获取动物或人的关节软骨组织；在一定的压力、湿度、气温条件下，软骨组织保存在组织培养液中，采用特殊滚压力学刺激方法，按照刺激频率、时间、压强大小的参数组合(0.1‑3HZ，1‑120min，0.1‑3Mpa)，对软骨移植块进行每3天给予一次周期性力学刺激，然后更换培养液保存；在不同时间段对软骨组织的细胞存活率、杨氏模量检测；本方法显著提高软骨组织细胞活性、组织力学性能以及这种作用的持续时间，提高了软骨组织体外保存效果。本发明应可用于软骨组织培养保存组织库，显著提高软骨组织库利用率和关节软骨修复质量。

Description

一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法。

背景技术

近年来，随着我国体育运动全面普及，关节软骨损伤患者也随之越来越多。然而，关节软骨损伤特别是严重的累及软骨下骨的软骨缺损往往缺乏理想的治疗方法，因此关节软骨损伤的治疗是国际上亟待解决的医学难题。当前，临床上治疗关节软骨损伤的方法有：微骨折法、自体软骨细胞移植术、组织工程软骨移植法、自体及同种异体关节软骨移植法等。前三种方法临床上观察难以形成质量高的透明软骨以修复损伤，同种异体骨软骨组织移植具有修复为透明软骨和其下方软骨下骨的双重作用，通过国外临床应用20余年的验证，证明是一种十分理性的复杂关节软骨(包括软骨下骨损伤)损伤的修复方法[1-3]。我国这方面的研究和临床应用尚处于空白，开展有活性的关节软骨同种异体移植很少。一个主要的瓶颈是国内尚未建立体外保存活性关节软骨技术。关节软骨在体外组织培养液中保存成为一种十分有前景的组织库技术，目前国内外常用的软骨移植块的保存方法为液体静态保存法，然而软骨在组织培养液中缺乏力学刺激情况下，保存2周后软骨细胞活性将显著下降；由于细胞存活率低于70％将不适宜异体移植，进而从限制了临床应用。存在这一现象的原因之一是软骨组织在体外保存环境中没有类似身体内力学环境及力学刺激。生理状态下，滚压载荷是人体或动物膝关节生理活动状态下的正常力学载荷，关节软骨在力学载荷的刺激下促进营养物质与代谢物质交换从而保持其活性和力学性能，以适应身体运动的生理需求。软骨组织细胞存活率是一项公认的检测软骨活性的指标，弹性模量是检测软骨组织力学性能的公认指标，也是组织库质量指标。

综上，如能提供一种利用模拟人体或动物生理活动状态下滚压载荷的方法，将可能大大提升关节软骨体外保存效果。

参考文献：

[1]Raz G.,Safir O.A.,Backstein D.J.,Lee P.T.,Gross A.E.Distal FemoralFreshOsteochondral Allografts:Follow-up at a Mean of Twenty-two Years.J BoneJoint Surg Am,2014,96(13):1101-1107.

[2]Shaha J.S.,Cook J.B.,Rowles D.J.,Bottoni C.R.,Shaha S.H.,TokishJ.M.Return to an athletic lifestyle after osteochondral allografttransplantation of the knee.Am J Sports Med,2013,41(9):2083-2089.

[3]Hunt H.E.,Sadr K.,Deyoung A.J.,Gortz S.,Bugbee W.D.The role ofimmunologic response in fresh osteochondral allografting of the knee.Am JSports Med,2014,42(4):886-891.

发明内容

为解决现有体外保存活性关节软骨技术保存2周后软骨细胞活性显著下降的问题，本发明提供一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法，利用人体活动的滚压力学刺激原理，在体外软骨组织保存环境中施加滚压力学刺激，以实现提高体外组织培养保存软骨细胞活性和力学性能的目标，从而建立体外组织培养环境中保存软骨的滚压力学刺激的组织库新方法。技术方法如下所述：

一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法，包括以下步骤：

步骤一、体外获取动物或人的关节软骨组织；

步骤二、将体外获取的关节软骨组织置于内含组织培养液的滚压力学刺激装置内，对软骨组织块施加滚压力学刺激；所述的滚压力学刺激方法为：按照刺激频率为0.1-3.0HZ、刺激时间为1.0-120min、压强为0.1-3Mpa的组合参数，给予软骨组织每3天刺激1次的周期性滚压力学刺激，然后更换所述DMEM组织培养液并体外保存；所述力学刺激方法所需的环境是：无菌条件下，温度控制在0℃-37℃，1个标准大气压，湿度为40％-60％；

步骤三、力学刺激后在第3天，7天，14天，21天检测软骨细胞存活率、蛋白多糖、II型胶原和软骨组织的杨氏模量，评价力学刺激后的作用及效果。

所述步骤二中所述的滚压力学刺激装置采用专利申请文件“一种软骨组织块体外保存力学加载装置”(申请号为CN201520298426.X)提供的装置，所述装置包含箱体、力学加载装置和软骨组织块存放装置，所述力学加载装置通过往复运动与软骨组织块表面进行摩擦，施加滚动力和滑动力的力学载荷。

优选的，所述步骤一软骨组织取材方法为无菌取材来自人和动物膝关节软骨，该软骨采用非活体人或动物膝关节软骨；将骨软骨块骨质面修整齐平；所述软骨组织取材选部位为股骨内外髁关节面的负重区。

更优选的，所述步骤一软骨组织取材的具体操作方法为：遵照无菌原则将人或动物的膝关节样本固定于手术台上，采用碘伏对样本进行消毒，铺无菌巾；取材在手术室中操作，取材器械与相关用品均高温高压灭菌处理；确认关节囊完整性，行膝关节正中切口，打开关节囊，离断髌韧带，检查前后交叉韧带完整性之后将其关节离断，完全暴露膝关节面，检查关节面有无损伤或炎症表现，选取股骨关节面内外髁负重区，使用专用骨软骨采集器械取材圆柱形骨软骨块或者取下带有股骨髁关节软骨面的半髁,而后将骨软骨块底面的骨质修整平齐，放入无菌器皿中，PBS冲洗。

更进一步的，所述步骤一中取材圆柱形骨软骨块的规格为长度15mm，直径为6.0mm、8.0mm或10.0mm。

优选的，所述步骤二中组织培养液为DMEM培养液或者TSMU培养液，所述DMEM培养液为常用细胞培养液，含多种氨基酸和葡萄糖；所述TSMU培养液成分为：每1000ml所述培养液包括，葡萄糖80～125mmol、氨基酸0.1～2.0mmol、抗氧化剂0.2～2.0mmol、碱性成纤维细胞生长因子5～60nmol、无机盐1～120mmol、维生素1～9mmol、丙酮酸钠1～2mmol、青霉素50～70U、余为去离子水。无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或几种的组合。所述TSMU培养液为已公开的中国专利申请“一种骨软骨移植物保存液及其制备方法”(申请号：CN201510093497.0)中所述骨软骨移植物保存液。所述TSMU培养液在基础培养液的基础上添加抗氧化因子等成分，较基础培养液能有效提高软骨体外保存效果。

进一步的，所述TSMU培养液中无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或几种的组合。

优选的，所述步骤三中，通过EB/FDA双荧光染色法计算软骨细胞存活率；采用番红O-固绿染色法检测蛋白多糖含量；采用免疫组化法检测II型胶原含量；采用英斯特朗力学测试仪检测杨氏模量。

本发明的另一目的在于提供一种组织库软骨保存方法，采用上述一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法。

目前国内外对于软骨的研究多集中在软骨细胞水平以及滚压力学对软骨细胞分化的影响方面；本发明针对软骨组织的宏观角度以期延长软骨组织的保存时间，从而用于异体移植的技术领域。

与常用的软骨组织块液体中静态保存方法相比，本发明提供的一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法可明显提高软骨细胞存活率及软骨组织的力学性能，减少软骨细胞凋亡，延长了作用时间，提高了软骨组织体外保存效果，有利于提高软骨组织库利用率和软骨修复技术水平。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为发明提供的一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法流程图；

图2为本发明实施例1中力学刺激后第3天、7天、14天和21天检测软骨细胞存活率的结果示意图；

图3为本发明实施例5中固定频率和时间，第14天动态组和静态组细胞存活率随压强变化图；

图4为本发明实施例5中固定压强和时间，第14天动态组和静态组细胞存活率随频率变化图；

图5为本发明实施例5中固定压强和频率，第14天动态组和静态组细胞存活率随时间变化图；

图6为本发明实施例5中力学刺激后Western Blot法检测软骨中凋亡蛋白caspase-3、bax和GADPH的动态组和静态组对比图；

图7为本发明实施例6中动态组和静态组在14天和21天的细胞存活率对比图；

图8为本发明实施例6中动态组和静态组在14天和21天的杨氏模量对比图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明在非活体的人或动物的膝关节取材软骨组织所用的设备为骨软骨移植器械(ARTHREX公司，美国加利福尼亚州)，从而提高取材的准确性和精准度。

本发明用到的滚压力学刺激装置包括箱体、力学加载装置和软骨组织块存放装置，力学加载装置和软骨组织块存放装置分别设置于箱体内的两侧，软骨组织块存放装置内插入软骨组织块，力学加载装置通过往复运动与软骨组织块表面进行摩擦，施加滚动力和滑动力的力学载荷。

本发明采用EB/FDA双荧光染色法计算软骨细胞存活率，所述EB/FDA双荧光染色法具体过程为：使用O.C.T.包埋剂包埋软骨，放入冰冻切片机内，温度恒定在-24℃，半小时后待组织冰冻固定进行切片；切片厚度在8.0μm；4％多聚甲醛固定20min；使用EB/FDA双荧光染色法，向细胞悬液中加入FDA 50mg/L和EB 10mg/L，37℃避光孵育20min；在480nm波长激光激发下进行检测；使用图像分析软件对图片中绿色和红色细胞计数，计算软骨组织细胞存活率。

采用英斯特朗生物力学测试机检测其杨氏模量。具体操作过程为：去除软骨下骨，软骨样本平均为厚度2mm，直径8mm；在室温(18～24℃)下进行测试，时间期间滴加PBS液保持软骨样本湿润。使用配套软件，将预压缩压力设定为5.0N，传感器到达5.0N时位移与压力调零，即开始记录位移、时间与载荷。以0.1mm/秒的速度，每次压缩位移为初始高度的5％，载荷应变曲线逐渐趋于稳定。实验结果以测量3次结果的平均值为准，每次加压后静置1小时，使得软骨盘吸水复原。根据实时图像判断软骨压缩状态制定合理的加载力大小。

本发明中用到的组织培养液可以为DMEM培养液。DMEM培养液为常用细胞培养液，含多种氨基酸和葡萄糖。

本发明中用到的组织培养液还可以是TSMU培养液，所述TSMU培养液为已公开的中国专利申请“一种骨软骨移植物保存液及其制备方法”(申请号：CN201510093497.0)中所述骨软骨移植物保存液，每1000ml所述骨软骨移植物保存液包括：葡萄糖80～125mmol、氨基酸0.1～2.0mmol、抗氧化剂0.2～2.0mmol、碱性成纤维细胞生长因子5～60nmol、无机盐1～120mmol、维生素1～9mmol、丙酮酸钠1～2mmol、青霉素50～70U、余为去离子水。所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或几种的组合。本发明中用到的骨软骨移植物保存液具体配制步骤为：

取葡萄糖14.4g、氨基酸0.21g、抗氧化剂0.23g、碱性成纤维细胞生长因子0.0016g、氯化钠0.60g、维生素1.06g、丙酮酸钠0.22g、青霉素70U和去离子水配制成1000ml溶液，搅拌均匀，调节pH值至7.40，过滤除菌，即得，将骨软骨移植物保存液放入4℃保存。

正如背景技术所介绍的，目前国内外常用的软骨移植块的保存方法为液体静态保存法，然而软骨在组织培养液中缺乏力学刺激情况下，保存2周后软骨细胞活性将显著下降，将不适宜异体移植，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法。

本发明的一种典型的实施方式中，如图1所示，一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法包括如下步骤：

步骤一：遵照无菌原则将非活体的人或动物的膝关节样本固定于手术台上，采用碘伏对样本进行消毒，铺无菌巾。取材在手术室中操作，取材器械与相关用品均高温高压灭菌处理。确认关节囊完整性，行膝关节正中切口，打开关节囊，离断髌韧带，检查前后交叉韧带完整性之后将其关节离断，完全暴露膝关节面，检查关节面有无损伤或炎症表现，选取股骨关节面内外髁负重区，使用专用骨软骨采集器械取材圆柱形骨软骨块或者取下带有股骨髁关节软骨面的半髁,而后将骨软骨块底面的骨质修整平齐，放入无菌器皿中，PBS冲洗。

步骤二：将体外获取的关节软骨组织置于内含组织培养液的滚压力学刺激装置内，对软骨组织块施加滚压力学刺激；按照刺激频率为0.1-3.0HZ、刺激时间为1.0-120min、压强为0.1-3Mpa的组合参数，给予软骨组织每3天刺激1次的周期性滚压力学刺激，然后更换组织培养液并体外保存；所述力学刺激方法所需的环境是：无菌条件下，温度控制在0℃-37℃，1个标准大气压，湿度为40％-60％。

步骤三：在力学刺激后第3天，7天，14天，21天等时间段，检测软骨细胞存活率、蛋白多糖、II型胶原和软骨组织的杨氏模量，评价力学刺激后的作用效果。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述：

实施例1：

(1)体外无菌获取新鲜的、动物死亡3小时以内的膝关节负重区骨软骨组织，长度15mm，直径约为6.0mm。

(2)实验初期力学刺激方案：将体外获取的关节软骨组织置于内含DMEM组织培养液的滚压力学刺激装置内，对软骨组织块施加滚压力学刺激；按照刺激频率为2HZ、刺激时间为30min、压强为1.5Mpa的组合参数，给予软骨力学刺激，然后更换新鲜的组织培养液并体外保存；所述力学刺激方法所需的环境是：无菌条件下，温度控制在0℃-37℃，1个标准大气压，湿度为40％-60％。

(3)在力学刺激后第3天，7天，14天，21天，检测软骨细胞存活率，评价力学刺激后的作用效果。如图2所示，加压组第3天软骨细胞存活率为94.1％，静态组为92.5％，有统计学意义，第7天、第14天和第21天无此趋势。因此，力学刺激后，组织培养保存软骨组织细胞存活率提升的作用时间为3天。

实施例2：

(1)遵照无菌原则将膝关节样本固定于手术台上，使用碘伏对样本进行消毒，铺无菌巾。行膝关节正中切口，打开关节囊，离断髌韧带与前后交叉韧带，选取股骨关节面内外髁负重区，使用专用骨软骨采集器械取材圆柱形骨软骨块(长度约为10mm，直径约为8mm，取材过程中给予持续的PBS冲洗)，而后将骨软骨块底面修整平齐，放入无菌器皿中用PBS冲洗。

(2)利用研制的滚压力学加载装置，按照加载频率、时间、压强大小三个因素为加载条件对软骨组织进行加载；环氧乙烷消毒加载盒；条件为室温下，1个标准大气压，湿度40％-60％；将软骨组织块放在含DMEM组织液的加载装置上，通过调速电机带动滑杆、摩擦架在软骨组织块上做往返运动，同时底部滚筒旋转，从而实现对软骨组织块施加滚压力学载荷；刺激参数2HZ，20min，1.5Mpa。

(3)力学加载后使用培养液进行液体保存，每3天将软骨转入滚压加载装置内并对软骨施加一次力学刺激，然后更换新鲜培养液并在培养液内保存。设置静态组，全程培养液静态保存。

(4)在第2周进行软骨相关检测，包括软骨细胞存活率、蛋白多糖和II型胶原、杨氏模量。使用EB/FDA双荧光染色法，计算软骨细胞存活率；采用番红O-固绿染色法检测蛋白多糖含量；采用免疫组化法检测II型胶原含量；采用英斯特朗力学测试仪检测杨氏模量。加载组细胞存活率为66.5％，静态组为61.6％；加载组蛋白多糖积分光密度值(IOD值)为163.5，静态组为145.6；加载组II型胶原IOD值为127.7，静态组为108.1；加载组杨氏模量为7.8MPa，静态组为6.9MPa。

实施例3：

(1)遵照无菌原则将膝关节样本固定于手术台上，使用碘伏对样本进行消毒，铺无菌巾。行膝关节正中切口，打开关节囊，离断髌韧带与前后交叉韧带，选取股骨关节面内外髁负重区，使用专用骨软骨采集器械取材圆柱形骨软骨块(长度约为10mm，直径约为8mm，取材过程中给予持续的PBS冲洗)，而后将骨软骨块底面修整平齐，放入无菌器皿中用PBS冲洗。

(2)利用研制的滚压力学加载装置，按照加载频率、时间、压强大小三个因素为加载条件对软骨组织进行加载；环氧乙烷消毒加载盒；条件为室温下，1个标准大气压，湿度40％-60％；将软骨组织块放在含DMEM组织液的加载装置上，通过调速电机带动滑杆、摩擦架在软骨组织块上做往返运动，同时底部滚筒旋转，从而实现对软骨组织块施加滚压力学载荷；刺激参数2HZ，30min，0.5Mpa。

(3)力学加载后使用培养液进行液体保存，每3天将软骨转入滚压加载装置内并对软骨施加一次力学刺激，然后更换新鲜培养液并在培养液内保存。设置静态组，全程培养液静态保存。

(4)在第2周进行软骨相关检测，包括软骨细胞存活率、蛋白多糖和II型胶原、杨氏模量。使用EB/FDA双荧光染色法，计算软骨细胞存活率；采用番红O-固绿染色法检测蛋白多糖含量；采用免疫组化法检测II型胶原含量；采用英斯特朗力学测试仪检测杨氏模量。加载组细胞存活率为65.2％，静态组为62.1％；加载组蛋白多糖IOD值为157.8，静态组为143.5；加载组II型胶原IOD值为118.5，静态组为102.4；加载组杨氏模量为7.4MPa，静态组为6.6MPa。

实施例4：

(1)遵照无菌原则将膝关节样本固定于手术台上，使用碘伏对样本进行消毒，铺无菌巾。行膝关节正中切口，打开关节囊，离断髌韧带与前后交叉韧带，选取股骨关节面内外髁负重区，使用专用骨软骨采集器械取材圆柱形骨软骨块(长度约为10mm，直径约为8mm，取材过程中给予持续的PBS冲洗)，而后将骨软骨块底面修整平齐，放入无菌器皿中用PBS冲洗。

(2)利用研制的滚压力学加载装置，按照加载频率、时间、压强大小三个因素为加载条件对软骨组织进行加载；环氧乙烷消毒加载盒；条件为室温下，1个标准大气压，湿度40％-60％；将软骨组织块放在含DMEM组织液的加载装置上，通过调速电机带动滑杆、摩擦架在软骨组织块上做往返运动，同时底部滚筒旋转，从而实现对软骨组织块施加滚压力学载荷；刺激参数1HZ，40min，2.0Mpa。

(3)力学加载后使用培养液进行液体保存，每3天将软骨转入滚压加载装置内并对软骨施加一次力学刺激，然后更换新鲜的培养液并在培养液内保存。设置静态组，全程培养液静态保存。

(4)在第2周进行软骨相关检测，包括软骨细胞存活率、蛋白多糖和II型胶原、杨氏模量。使用EB/FDA双荧光染色法，计算软骨细胞存活率；采用番红O-固绿染色法检测蛋白多糖含量；采用免疫组化法检测II型胶原含量；采用英斯特朗力学测试仪检测杨氏模量。加载组细胞存活率为64.3％，静态组为60.7％；加载组蛋白多糖IOD值为152.7，静态组为138.3；加载组II型胶原IOD值为116.2，静态组为98.7；加载组杨氏模量为7.2MPa，静态组为6.8MPa。

实施例5：

(1)体外无菌获取膝关节负重区骨软骨组织，长度15mm，直径约为8.0mm。

(2)将体外获取的关节软骨组织置于内含DMEM组织培养液的滚压力学刺激装置内，给予软骨组织每3天刺激1次的周期性滚压力学刺激，然后更换新鲜的DMEM组织培养液并体外保存；所述力学刺激方法所需的环境是：无菌条件下，温度控制在0℃-37℃，1个标准大气压，湿度为40％-60％。

(3)研究加载参数压强、频率、时间的有效范围：

根据前期研究成果，以频率为2HZ，时间为30min，改变压强大小，以第14天细胞存活率高于静态组为标准，如图3、表1所示，其中压强为0时表示静态组，在压强参数在0.1-3MPa范围内时，动态组的细胞存活率高于静态组。

表1改变压强大小动态组和静态组的细胞存活率

压强(MPa)	0(静态组)	0.1	0.5	1.1	1.5	2	2.5	3
									细胞成活率(％)	61.2	62.7	65.4	66.8	64.9	64.7	62.9	62.1

根据前期研究成果，以压强1.5MPa，时间为30min，改变频率大小，以第14天细胞存活率高于静态组为标准，如图4、表2所示，其中频率为0时表示静态组，得出的频率参数范围在0.1-3HZ内时，动态组的细胞存活率高于静态组。

表2改变频率大小动态组和静态组的细胞存活率

频率(HZ)	0(静态组)	0.1	0.5	0.9	1.4	2	2.5	3
									细胞成活率(％)	61.2	62.7	63.8	62.4	63.6	64.5	63.2	61.8

根据前期研究成果，以压强1.5MPa，频率为2HZ，改变时间长短，以第14天细胞存活率高于静态组为标准，如图5、表3所示，其中时间为0时表示静态组，得出在时间1-120min范围内，动态组的细胞存活率高于静态组。

表3改变时间长短动态组和静态组的细胞存活率

时间(min)	0(静态组)	1	20	40	60	80	100	120
									细胞成活率(％)	61.2	62.4	64.7	64.3	63.6	63.1	63.3	62.1

根据以上研究，得出较优的最终参数组合：刺激频率范围为0.1-3HZ，刺激时间范围为1-120min，刺激压强范围为0.1-3Mpa。

(4)探究相关机理：力学刺激后采用Western Blot法检测加载组和静态组软骨中凋亡蛋白caspase-3、bax。进行样本蛋白质提取，在电泳仪中行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜仪中进行转膜，继而封闭，一抗和二抗孵育，滴加显色液，在凝胶成像系统中曝光，分析目的条带着色深浅程度及其位置。如图6所示，显示加载组凋亡蛋白表达比静态组减少，得出结论力学刺激可能是通过抑制细胞凋亡从而提高软骨组织活力。

实施例6：

(1)体外无菌获取膝关节负重区骨软骨组织，长度15mm，直径约为10.0mm。

(2)将体外获取的关节软骨组织置于内含DMEM组织培养液的滚压力学刺激装置内，对软骨组织块施加滚压力学刺激；按照刺激频率为2HZ、刺激时间为20min、压强为1.5Mpa的组合参数，给予软骨组织每3天刺激1次的周期性滚压力学刺激，然后更换DMEM组织培养液并体外保存；所述力学刺激方法所需的环境是：无菌条件下，温度控制在0℃-37℃，1个标准大气压，湿度为40％-60％。

(3)在力学刺激后第3天，7天，14天，21天等时间段，检测软骨细胞存活率、软骨组织的杨氏模量，评价力学刺激后的作用效果。在14天和21天的细胞存活率如图7所示，在14天和21天的杨氏模量如图8所示，第14天加载组的细胞存活率、杨氏模量高于静态组，有统计学意义。

实施例7：

(1)体外无菌获取膝关节负重区骨软骨组织，长度15mm，直径约为10.0mm。

(2)利用研制的滚压力学加载装置，按照加载频率、时间、压强大小三个因素为加载条件对软骨组织进行加载；环氧乙烷消毒加载盒；条件为室温下，1个标准大气压，湿度40％-60％；将软骨组织块放在含TSMU培养液的加载装置上，通过调速电机带动滑杆、摩擦架在软骨组织块上做往返运动，同时底部滚筒旋转，从而实现对软骨组织块施加滚压力学载荷；刺激参数1HZ，40min，2.0Mpa。

(3)力学加载后使用培养液进行液体保存，每3天将软骨转入滚压加载装置内并对软骨施加一次力学刺激，然后换液并在培养液内保存。设置静态组，全程培养液静态保存。

(4)在第2周进行软骨细胞存活率的检测。使用EB/FDA双荧光染色法，计算软骨细胞存活率。加载组细胞存活率为91.6％，静态组为87.8％。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

1)、本发明公开的一种关节软骨体外保存力学刺激方法，在一定的压力、湿度、气温条件下，采用特殊滚压力学刺激方法，按照刺激频率、时间、压强大小的参数组合(0.1-3HZ，1-120min，0.1-3Mpa)，对组织培养液中的软骨移植块进行每3天给予一次周期性力学刺激，然后更换培养液保存。这样产生了抑制细胞凋亡的效应，与静态保存相比，能更好地维持体外保存软骨活力，提高了软骨组织体外保存效果。可用于软骨组织培养保存组织库，提高软骨组织库利用率和关节软骨修复质量。

2)、本发明提供的关节软骨体外保存力学刺激方法可以延长第2周软骨细胞的存活率和软骨组织的杨氏模量，为异体移植提供更长期的保存方法。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、体外获取动物或人的关节软骨组织；

步骤二、将体外获取的关节软骨组织置于内含组织培养液的滚压力学刺激装置内，对软骨组织块施加滚压力学刺激；所述的滚压力学刺激方法为：按照刺激频率为0.1-3.0HZ、刺激时间为1.0-120min、压强为0.1-3Mpa的组合参数，给予软骨组织每3天刺激1次的周期性滚压力学刺激，然后更换组织培养液并体外保存；所述力学刺激方法所需的环境是：无菌条件下，温度控制在0℃-37℃，1个标准大气压，湿度为40％-60％；

步骤三、力学刺激后在第3天，7天，14天，21天检测软骨细胞存活率、蛋白多糖、II型胶原和软骨组织的杨氏模量，评价力学刺激后的作用及效果；

步骤一软骨组织取材方法为无菌取材来自人和动物膝关节软骨，该软骨采用非活体人或动物膝关节软骨；将骨软骨块骨质面修整齐平；所述软骨组织取材选部位为股骨内外髁关节面的负重区；

步骤一软骨组织取材的具体操作方法为：遵照无菌原则将人或动物的膝关节样本固定于手术台上，采用碘伏对样本进行消毒，铺无菌巾；取材在手术室中操作，取材器械与相关用品均高温高压灭菌处理；确认关节囊完整性，行膝关节正中切口，打开关节囊，离断髌韧带，检查前后交叉韧带完整性之后将其关节离断，完全暴露膝关节面，检查关节面有无损伤或炎症表现，选取股骨关节面内外髁负重区，使用专用骨软骨采集器械取材圆柱形骨软骨块或者取下带有股骨髁关节软骨面的半髁，而后将骨软骨块底面的骨质修整平齐，放入无菌器皿中，PBS冲洗；

所述步骤一中取材圆柱形骨软骨块的规格为长度15mm，直径为6.0mm、8.0mm或10.0mm；

所述步骤二中所述的滚压力学刺激装置包含箱体、力学加载装置和软骨组织块存放装置，所述力学加载装置通过往复运动与软骨组织块表面进行摩擦，施加滚动力和滑动力的力学载荷；

所述步骤二中组织培养液选自DMEM培养液或TSMU培养液；

所述TSMU培养液成分为：每1000ml所述培养液包括，葡萄糖80～125mmol、氨基酸0.1～2.0mmol、抗氧化剂0.2～2.0mmol、碱性成纤维细胞生长因子5～60nmol、无机盐1～120mmol、维生素1～9mmol、丙酮酸钠1～2mmol、青霉素50～70U、余为去离子水。

2.根据权利要求1所述的一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法，其特征在于，所述TSMU培养液中无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或几种的组合。

3.根据权利要求1所述的一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法，其特征在于，所述步骤三中，通过EB/FDA双荧光染色法计算软骨细胞存活率；采用番红O-固绿染色法检测蛋白多糖含量；采用免疫组化法检测II型胶原含量；采用英斯特朗力学测试仪检测杨氏模量。

4.一种组织库软骨保存方法，其特征在于，采用权利要求1～3任一项所述的一种提高关节软骨体外保存效果的力学刺激方法。

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