JP3157619B2 - ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイナーゼ−２含有組織培養用無血清培地と細胞増殖方法 - Google Patents
ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイナーゼ−２含有組織培養用無血清培地と細胞増殖方法Info
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Description
【０００１】
【技術分野】本発明は、ティシュ・インヒビター・オブ
・メタロプロテイナーゼ−２（以下、ＴＩＭＰ−２と記
す）を含有せしめた接着性細胞および浮遊細胞培養用の
無血清培地に関するものであり、また、この培地を用い
て接着性細胞および浮遊細胞を短期間に増殖させる方法
に関するものである。
・メタロプロテイナーゼ−２（以下、ＴＩＭＰ−２と記
す）を含有せしめた接着性細胞および浮遊細胞培養用の
無血清培地に関するものであり、また、この培地を用い
て接着性細胞および浮遊細胞を短期間に増殖させる方法
に関するものである。
【０００２】さらに詳しくは、本発明は、１０−１５％
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有せしめた組織培養用培地
に代えて有効に用い得るＴＩＭＰ−２含有組織培養用無
血清培地に関するものであり、また、この無血清培地を
用いて、哺乳類から分離、樹立した接着性細胞あるい
は、非接着性細胞あるいはヒト型あるいはマウス型の融
合細胞等の浮遊細胞その他を培養する方法に関するもの
である。
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有せしめた組織培養用培地
に代えて有効に用い得るＴＩＭＰ−２含有組織培養用無
血清培地に関するものであり、また、この無血清培地を
用いて、哺乳類から分離、樹立した接着性細胞あるい
は、非接着性細胞あるいはヒト型あるいはマウス型の融
合細胞等の浮遊細胞その他を培養する方法に関するもの
である。
【０００３】
【背景技術】ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプ
ロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）はヒトおよびその他の動物の
培養細胞（繊維芽細胞、腫瘍細胞、軟骨細胞、平骨筋細
胞、内皮細胞など）や血小板、単球、マクロファージ、
歯髄などが産生する分子量約３０ｋＤａの糖蛋白質であ
る。従来、ＴＩＭＰは間質コラゲナーゼ活性を阻害する
ことからコラゲナーゼ・インヒビターと呼ばれていた
が、間質コラゲナーゼ以外に種々のメタロプロテイナー
ゼ（７２ｋＤａゼラチナーゼ、９２ｋＤａゼラチナー
ゼ、ストロムライシン−１）を阻害することが明らかに
なり、ＴＩＭＰ（ティシュ・インヒビター・オブ・メタ
ロプロテイナーゼ）と改名された。（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ
ら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，４９，４６９〜４
７９、１９９０： Ｃａｗｓｔｏｎ ｉｎ“Ｐｒｏｔｅ
ｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”、ｅｄ．ｂｙ Ｂ
ａｒｒｅｔｔら、Ｅｌｓｅｖｉｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａ
ｍ，１９８６，ｐ５８９．参照）。
ロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）はヒトおよびその他の動物の
培養細胞（繊維芽細胞、腫瘍細胞、軟骨細胞、平骨筋細
胞、内皮細胞など）や血小板、単球、マクロファージ、
歯髄などが産生する分子量約３０ｋＤａの糖蛋白質であ
る。従来、ＴＩＭＰは間質コラゲナーゼ活性を阻害する
ことからコラゲナーゼ・インヒビターと呼ばれていた
が、間質コラゲナーゼ以外に種々のメタロプロテイナー
ゼ（７２ｋＤａゼラチナーゼ、９２ｋＤａゼラチナー
ゼ、ストロムライシン−１）を阻害することが明らかに
なり、ＴＩＭＰ（ティシュ・インヒビター・オブ・メタ
ロプロテイナーゼ）と改名された。（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ
ら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．，４９，４６９〜４
７９、１９９０： Ｃａｗｓｔｏｎ ｉｎ“Ｐｒｏｔｅ
ｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”、ｅｄ．ｂｙ Ｂ
ａｒｒｅｔｔら、Ｅｌｓｅｖｉｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａ
ｍ，１９８６，ｐ５８９．参照）。
【０００４】最近、上述のＴＩＭＰとは分子量の異なる
ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイナーゼ
−２（ＴＩＭＰ−２，約２１ｋＤａ）と呼ばれるメタロ
プロテイナーゼ・インヒビターが発見された（Ｓｔｅｔ
ｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４６，１７３７４〜１７３７８、１９８９；Ｇ
ｏｌｄｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０７〜８２１１、１９８９；
Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６
８，２６７〜２７４、１９９０参照）。
ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイナーゼ
−２（ＴＩＭＰ−２，約２１ｋＤａ）と呼ばれるメタロ
プロテイナーゼ・インヒビターが発見された（Ｓｔｅｔ
ｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２４６，１７３７４〜１７３７８、１９８９；Ｇ
ｏｌｄｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０７〜８２１１、１９８９；
Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２６
８，２６７〜２７４、１９９０参照）。
【０００５】ＴＩＭＰ−２と従来のＴＩＭＰとの違い
は、分子量の他に、Ｃｏｎ−Ａ−セファロースカラムに
結合しないということにより区別される。ヒトＴＩＭＰ
−２はｃＤＮＡクローニングによりその一次構造が明ら
かにされている（Ｂｏｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２８００〜２８０
４、１９９０参照）。それによると、ヒトＴＩＭＰ−２
は、１９４個のアミノ酸残基からなり、ヒトＴＩＭＰと
３８％の相同性を有している。
は、分子量の他に、Ｃｏｎ−Ａ−セファロースカラムに
結合しないということにより区別される。ヒトＴＩＭＰ
−２はｃＤＮＡクローニングによりその一次構造が明ら
かにされている（Ｂｏｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２８００〜２８０
４、１９９０参照）。それによると、ヒトＴＩＭＰ−２
は、１９４個のアミノ酸残基からなり、ヒトＴＩＭＰと
３８％の相同性を有している。
【０００６】また、ヒトＴＩＭＰ−２は、ヒトＴＩＭＰ
と同じ１２個のシステイン残基を持ち、その位置もよく
保存されている。
と同じ１２個のシステイン残基を持ち、その位置もよく
保存されている。
【０００７】一方、ＴＩＭＰはプロ９２ｋＤａゼラチナ
ーゼおよびその活性型ゼラチナーゼと複合体を形成し、
また、ＴＩＭＰ−２はプロ７２ｋＤａゼラチナーゼと複
合体を形成していることが認められている。（Ｗｉｌｈ
ｅ１ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７２
１３〜１７２２１、１９８９；Ｗａｒｄら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．，２７８，１７９〜１８７、１９９１参
照）。
ーゼおよびその活性型ゼラチナーゼと複合体を形成し、
また、ＴＩＭＰ−２はプロ７２ｋＤａゼラチナーゼと複
合体を形成していることが認められている。（Ｗｉｌｈ
ｅ１ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７２
１３〜１７２２１、１９８９；Ｗａｒｄら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ．，２７８，１７９〜１８７、１９９１参
照）。
【０００８】ＴＩＭＰ−２はヒトおよびその他の動物の
培養細胞（ヘパトーマ細胞、気管支上皮細胞、線維芽細
胞、黒色腫細胞、骨肉腫細胞、大動脈内皮細胞、神経鞘
腫細胞、直腸癌細胞、リウマチ滑膜細胞など）や胎盤、
羊水、血液、軟骨、関節液などで合成、分泌され、ＴＩ
ＭＰと同様に細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ
の共通のインヒビターとして生物活性を有している。本
発明者らは、先にヒトＴＩＭＰが広範囲の細胞に増殖活
性を示すことを明らかにしたが（Ｈａｙａｋａｗａら、
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２９８，２９〜３２，１９９
２）、このたび、ヒトＴ１ＭＰ−２に対するマウスモノ
クローナル抗体の作製に成功し、それらの抗体の組合せ
によるサンドイッチ酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によりヒ
トおよびウシ組織体液および血液中のＴＩＭＰ−２濃度
を高感度で測定することに成功した。
培養細胞（ヘパトーマ細胞、気管支上皮細胞、線維芽細
胞、黒色腫細胞、骨肉腫細胞、大動脈内皮細胞、神経鞘
腫細胞、直腸癌細胞、リウマチ滑膜細胞など）や胎盤、
羊水、血液、軟骨、関節液などで合成、分泌され、ＴＩ
ＭＰと同様に細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ
の共通のインヒビターとして生物活性を有している。本
発明者らは、先にヒトＴＩＭＰが広範囲の細胞に増殖活
性を示すことを明らかにしたが（Ｈａｙａｋａｗａら、
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２９８，２９〜３２，１９９
２）、このたび、ヒトＴ１ＭＰ−２に対するマウスモノ
クローナル抗体の作製に成功し、それらの抗体の組合せ
によるサンドイッチ酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によりヒ
トおよびウシ組織体液および血液中のＴＩＭＰ−２濃度
を高感度で測定することに成功した。
【０００９】従来、組織培養用培地にウシ胎児血清（Ｆ
ＣＳ）を添加すると細胞増殖が促進されることはよく知
られている。先に本発明者らは、ヒトＴＩＭＰを組織培
養用無血清培地に添加すると細胞増殖が促進されること
を明らかにした（特願平４−１８８５２８号）が、それ
以外にこれまでに、細胞増殖を促進する因子について
は、何ら報告されていない。
ＣＳ）を添加すると細胞増殖が促進されることはよく知
られている。先に本発明者らは、ヒトＴＩＭＰを組織培
養用無血清培地に添加すると細胞増殖が促進されること
を明らかにした（特願平４−１８８５２８号）が、それ
以外にこれまでに、細胞増殖を促進する因子について
は、何ら報告されていない。
【００１０】本発明者らは、上記のヒトＴＩＭＰ−２に
対するモノクローナル抗体を用いたアフィニティカラム
でヒト胎盤からＴＩＭＰ−２を分離、精製したものを組
織培養用無血清培地に添加し、ヒト歯肉線維芽細胞、パ
ーキットリンパ細胞およびヒト慢性赤血球性白血病細胞
を培養したところ、ＴＩＭＰ−２濃度１０ｎｇ／ｍｌで
最大細胞増殖効果が認められた。また、マウス由来ハイ
ブリドーマやマウス由来コロン２６細胞の増殖用培地に
ヒトＴＩＭＰ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したところ
細胞増殖効果が認められた。上記２種のマウス由来細胞
にヒトＴＩＭＰを添加しても増殖効果は認められなかっ
た。
対するモノクローナル抗体を用いたアフィニティカラム
でヒト胎盤からＴＩＭＰ−２を分離、精製したものを組
織培養用無血清培地に添加し、ヒト歯肉線維芽細胞、パ
ーキットリンパ細胞およびヒト慢性赤血球性白血病細胞
を培養したところ、ＴＩＭＰ−２濃度１０ｎｇ／ｍｌで
最大細胞増殖効果が認められた。また、マウス由来ハイ
ブリドーマやマウス由来コロン２６細胞の増殖用培地に
ヒトＴＩＭＰ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したところ
細胞増殖効果が認められた。上記２種のマウス由来細胞
にヒトＴＩＭＰを添加しても増殖効果は認められなかっ
た。
【００１１】これらの知見に基づき、本発明者らは、細
胞培養に対するＴＩＭＰ−２の成長因子としての効果を
確認し、ＴＩＭＰ−２を無血清培地中に添加して用いる
ことによって、接着性細胞および浮遊細胞を培養するた
めの極めて優れた無血清培地を提供することに成功し
た。
胞培養に対するＴＩＭＰ−２の成長因子としての効果を
確認し、ＴＩＭＰ−２を無血清培地中に添加して用いる
ことによって、接着性細胞および浮遊細胞を培養するた
めの極めて優れた無血清培地を提供することに成功し
た。
【００１２】
【発明の開示】本発明はティシュ・インヒビター・オブ
・メタロプロテイナーゼ−２を含有せしめたことを特徴
とする組織培養用無血清培地を提供するものであり、さ
らにティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイナ
ーゼ−２を細胞増殖因子として用いて、動物組織細胞あ
るいは動物由来の融合細胞をティシュ・インヒビター・
オブ・メタロプロテイナーゼ−２含有組織培養用無血清
培地中で増殖させる方法を提供するものである。本発明
の組織培養用培地に添加するＴＩＭＰ−２としては、哺
乳類の組織、血液、体液および哺乳類より分離された正
常細胞、腫瘍細胞からの精製品を使用することができる
が、リコンビナントＤＮＡ法などによって作製されたも
のも使用することができる。
・メタロプロテイナーゼ−２を含有せしめたことを特徴
とする組織培養用無血清培地を提供するものであり、さ
らにティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイナ
ーゼ−２を細胞増殖因子として用いて、動物組織細胞あ
るいは動物由来の融合細胞をティシュ・インヒビター・
オブ・メタロプロテイナーゼ−２含有組織培養用無血清
培地中で増殖させる方法を提供するものである。本発明
の組織培養用培地に添加するＴＩＭＰ−２としては、哺
乳類の組織、血液、体液および哺乳類より分離された正
常細胞、腫瘍細胞からの精製品を使用することができる
が、リコンビナントＤＮＡ法などによって作製されたも
のも使用することができる。
【００１３】本発明により、組織培養用無血清培地にＴ
ＩＭＰ−２を一定量添加した培地が提供され、また、こ
のＴＩＭＰ−２含有無血清培地を用いて哺乳類より分
離、樹立した接着性細胞、非接着性細胞およびヒト、マ
ウス型融合浮遊細胞などを増殖させるという極めて有用
な培養法が提供される。
ＩＭＰ−２を一定量添加した培地が提供され、また、こ
のＴＩＭＰ−２含有無血清培地を用いて哺乳類より分
離、樹立した接着性細胞、非接着性細胞およびヒト、マ
ウス型融合浮遊細胞などを増殖させるという極めて有用
な培養法が提供される。
【００１４】本発明により、現在通常のウシ胎児血清添
加培養液の使用による培養コストを大巾に低減すること
ができ、かつ培養液中の希薄な産生たん白質の精製を容
易にすることができるなど、本発明による産業的貢献は
極めて大きいものであり、また、本発明により、最近の
動物愛護運動からのウシ胎児血清生産に対する批判にも
耐え得るという利点がもたらされる。
加培養液の使用による培養コストを大巾に低減すること
ができ、かつ培養液中の希薄な産生たん白質の精製を容
易にすることができるなど、本発明による産業的貢献は
極めて大きいものであり、また、本発明により、最近の
動物愛護運動からのウシ胎児血清生産に対する批判にも
耐え得るという利点がもたらされる。
【００１５】以下に実施例を示し、本発明を具体的に説
明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではな
い。なお、下記の実施例中で用いられているヒトＴＩＭ
Ｐ−２およびヒトＴＩＭＰは、下記の如くして調製され
たものである。
明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではな
い。なお、下記の実施例中で用いられているヒトＴＩＭ
Ｐ−２およびヒトＴＩＭＰは、下記の如くして調製され
たものである。
【００１６】ヒトＴＩＭＰ−２（ｈＴＩＭＰ−２）の調
製 （ａ） ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチドの調製 Ｂｏｏｎｅらは、ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチドの配列
を、ｃＤＮＡの配列から予測している（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７；２８００〜２
８０４、１９９０）。その予測されたアミノ酸配列構造
中より、表１に示した３種のポリペプチド（Ｐ−１、Ｐ
−２、Ｐ−３）をそれぞれペプチドシンセサイザー９６
００（ミリジェン／バイオサーチ）を用いて合成し、続
いて、それらの各ポリペプチドのＣ末端にシステイン残
基を導入した。
製 （ａ） ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチドの調製 Ｂｏｏｎｅらは、ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチドの配列
を、ｃＤＮＡの配列から予測している（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７；２８００〜２
８０４、１９９０）。その予測されたアミノ酸配列構造
中より、表１に示した３種のポリペプチド（Ｐ−１、Ｐ
−２、Ｐ−３）をそれぞれペプチドシンセサイザー９６
００（ミリジェン／バイオサーチ）を用いて合成し、続
いて、それらの各ポリペプチドのＣ末端にシステイン残
基を導入した。
【００１７】得られた３種の粗ポリペプチドは、それぞ
れ、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ（Ｗａｔｅｒｓ，５μ、
Ｃ１８−１００Å、３．９×１５０ｍｍ）カラムを用い
て高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
れ、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ（Ｗａｔｅｒｓ，５μ、
Ｃ１８−１００Å、３．９×１５０ｍｍ）カラムを用い
て高速液体クロマトグラフィーにより精製した。
【００１８】
【表１】
【００１９】（ｂ） ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチドと
キーホールリンペットヘモシアニン複合体の調製 （ａ）で得られた３種のポリペプチドについて、それぞ
れ下記のとおりにして複合体を調製した。２ｍｇキーホ
ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ．）を１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．
５に溶解したものと１．８５ｍｇＮ−（ε−ｍａｌｅｉ
ｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ
ｅを２００μｌのジメチルホルムアミドに溶解したもの
とを混合し、３０℃、３０分間インキュベーションし
た。次に上記の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ
７．０で平衡化したＰＤ−１０（ファルマシア）でゲル
濾過した。
キーホールリンペットヘモシアニン複合体の調製 （ａ）で得られた３種のポリペプチドについて、それぞ
れ下記のとおりにして複合体を調製した。２ｍｇキーホ
ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ．）を１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．
５に溶解したものと１．８５ｍｇＮ−（ε−ｍａｌｅｉ
ｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄ
ｅを２００μｌのジメチルホルムアミドに溶解したもの
とを混合し、３０℃、３０分間インキュベーションし
た。次に上記の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ
７．０で平衡化したＰＤ−１０（ファルマシア）でゲル
濾過した。
【００２０】マレイミドが結合されたＫＬＨを分取し、
１．５ｍｌ以下に濃縮した。マレイミドが結合されたＫ
ＬＨに対し５０倍モル量の前記（ａ）で合成した各ポリ
ペプチドを１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．０
に溶解したものと混合した。４℃、２０時間インキュベ
ーションし、３種のポリペプチドーＫＬＨ複合体を調製
した。
１．５ｍｌ以下に濃縮した。マレイミドが結合されたＫ
ＬＨに対し５０倍モル量の前記（ａ）で合成した各ポリ
ペプチドを１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．０
に溶解したものと混合した。４℃、２０時間インキュベ
ーションし、３種のポリペプチドーＫＬＨ複合体を調製
した。
【００２１】（ｃ） 抗体産生細胞の調製 前記（ｂ）の方法により調製した各複合体２５０μｇを
完全フロイントアジュバントと共に８週令Ｂａｌｂ／ｃ
雌マウスにそれぞれ腹腔内投与し、初回免疫した。１５
日後に０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ６．０に溶解した各
複合体２００μｇを初回免疫したそれぞれのマウスに腹
腔内投与し追加免疫した。さらに、３８日後に追加免疫
時と同様に各複合体７０μｇを静脈内および１３０μｇ
を腹腔内投与し、最終免疫とした。その３日後に脾臓を
摘出し、脾細胞懸濁液を調製した。
完全フロイントアジュバントと共に８週令Ｂａｌｂ／ｃ
雌マウスにそれぞれ腹腔内投与し、初回免疫した。１５
日後に０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ６．０に溶解した各
複合体２００μｇを初回免疫したそれぞれのマウスに腹
腔内投与し追加免疫した。さらに、３８日後に追加免疫
時と同様に各複合体７０μｇを静脈内および１３０μｇ
を腹腔内投与し、最終免疫とした。その３日後に脾臓を
摘出し、脾細胞懸濁液を調製した。
【００２２】（ｄ） 細胞融合 （１） 以下の材料および方法を用いた。 ＲＰＭＩ １６４０培地：ＲＰＭＩ １６４０（Ｆｌｏ
ｗ Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピル
ビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム
（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ
／ｍｌ）および硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍｌ）を
加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２μｍ東
洋メンブレンフィルターで除菌濾過した。
ｗ Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピル
ビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム
（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ
／ｍｌ）および硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍｌ）を
加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２μｍ東
洋メンブレンフィルターで除菌濾過した。
【００２３】ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ １６４０培
地に除菌濾過した仔牛胎児血清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加
えた。 ＰＥＧ ４，０００溶液：ＲＰＭＩ １６４０培地にポ
リエチレングリコール４，０００（ＰＥＧ ４，００
０、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）を５０％（ｗ／ｗ）になるよ
うに加え、無血清溶液を調製した。８−アザグアニン耐
性ミエローマ細胞ＳＰ２（ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４）との
融合は、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｍｉｓ
ｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ３５１〜３７２、１
９８０に記載のＯｉらの方法を若干改変して行った。
地に除菌濾過した仔牛胎児血清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加
えた。 ＰＥＧ ４，０００溶液：ＲＰＭＩ １６４０培地にポ
リエチレングリコール４，０００（ＰＥＧ ４，００
０、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）を５０％（ｗ／ｗ）になるよ
うに加え、無血清溶液を調製した。８−アザグアニン耐
性ミエローマ細胞ＳＰ２（ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４）との
融合は、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ
ｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｍｉｓ
ｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ３５１〜３７２、１
９８０に記載のＯｉらの方法を若干改変して行った。
【００２４】（２） 前記（ｃ）で調製した各有核牌臓
細胞（生細胞率１００％）について、それぞれ、ミエロ
ーマ細胞（生細胞率１００％）と５：１の割合で融合し
た。なお、この場合、脾蔵細胞とミエローマ細胞とは別
々に前記のＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄しておき、次
に両者を同じＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、上記の
割合で混合した。混合した各培地に対し、新たにＲＰＭ
Ｉ １６４０培地を前記のペプチドＰ−１，Ｐ−２，Ｐ
−３の各複合体の場合につき、各２５．８ｍｌ、２８．
５ｍｌ、３４．５ｍｌ加え、容量５０ｍｌのポリプロピ
レン製遠沈管（岩城硝子）を用いて、４００×ｇで１０
分間遠心し、上清を完全に吸引除去した。得られた各沈
殿細胞に３７℃加温ＰＥＧ ４，０００溶液を、ペプチ
ドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の場合につき、そ
れぞれ、２．３ｍｌ、４．８ｍｌ、５．０ｍｌの量をも
って、穏やかに撹拌しながら、１分間で滴下し、さらに
１分間撹拌し各細胞を再懸濁、分散させた。得られた各
懸濁液に対し、３７℃加温ＲＰＭＩ １６４０培地を、
ペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の場合につ
いて、それぞれ、４．６ｍｌ、９．６ｍｌ、１０．０ｍ
ｌの量を用いて、２分間、滴下した後、さらに、新たな
同じ培地をペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体
の場合につき、それぞれ、１６．０ｍｌ、３３．６ｍ
ｌ、３５．０ｍｌを用いて、２〜３分間において、常に
撹拌しながら滴下し細胞を分散させた。
細胞（生細胞率１００％）について、それぞれ、ミエロ
ーマ細胞（生細胞率１００％）と５：１の割合で融合し
た。なお、この場合、脾蔵細胞とミエローマ細胞とは別
々に前記のＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄しておき、次
に両者を同じＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、上記の
割合で混合した。混合した各培地に対し、新たにＲＰＭ
Ｉ １６４０培地を前記のペプチドＰ−１，Ｐ−２，Ｐ
−３の各複合体の場合につき、各２５．８ｍｌ、２８．
５ｍｌ、３４．５ｍｌ加え、容量５０ｍｌのポリプロピ
レン製遠沈管（岩城硝子）を用いて、４００×ｇで１０
分間遠心し、上清を完全に吸引除去した。得られた各沈
殿細胞に３７℃加温ＰＥＧ ４，０００溶液を、ペプチ
ドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の場合につき、そ
れぞれ、２．３ｍｌ、４．８ｍｌ、５．０ｍｌの量をも
って、穏やかに撹拌しながら、１分間で滴下し、さらに
１分間撹拌し各細胞を再懸濁、分散させた。得られた各
懸濁液に対し、３７℃加温ＲＰＭＩ １６４０培地を、
ペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の場合につ
いて、それぞれ、４．６ｍｌ、９．６ｍｌ、１０．０ｍ
ｌの量を用いて、２分間、滴下した後、さらに、新たな
同じ培地をペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体
の場合につき、それぞれ、１６．０ｍｌ、３３．６ｍ
ｌ、３５．０ｍｌを用いて、２〜３分間において、常に
撹拌しながら滴下し細胞を分散させた。
【００２５】得られた各懸濁液を、４００×ｇで７分間
遠心分離し、上清を完全に吸引除去した。次に得られた
各沈殿細胞に対し、３７℃加温ＮＳ−１培地をペプチド
Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の各場合につき、そ
れぞれ、２２．７ｍｌ、４０．０ｍｌ、４０．０ｍｌ速
やかに加え、細胞の大きい塊を１０ｍｌのピペットを用
いて注意深くピペッティングして分散した。得られた各
分散液に対し、さらに新たに、３７℃加温ＮＳ−１培地
をペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の各場合
につき、それぞれ、４５．３ｍｌ、１０４ｍｌ、１１０
ｍｌ加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロウエ
ル（岩城硝子）にウエル当り６．０×１０５個／０．１
ｍｌの細胞を加えた。次いで、これを７％炭酸ガス／９
３％空気中で温度３７℃、湿度１００％下で培養した。
遠心分離し、上清を完全に吸引除去した。次に得られた
各沈殿細胞に対し、３７℃加温ＮＳ−１培地をペプチド
Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の各場合につき、そ
れぞれ、２２．７ｍｌ、４０．０ｍｌ、４０．０ｍｌ速
やかに加え、細胞の大きい塊を１０ｍｌのピペットを用
いて注意深くピペッティングして分散した。得られた各
分散液に対し、さらに新たに、３７℃加温ＮＳ−１培地
をペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の各場合
につき、それぞれ、４５．３ｍｌ、１０４ｍｌ、１１０
ｍｌ加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロウエ
ル（岩城硝子）にウエル当り６．０×１０５個／０．１
ｍｌの細胞を加えた。次いで、これを７％炭酸ガス／９
３％空気中で温度３７℃、湿度１００％下で培養した。
【００２６】（ｅ） 選択培地によるハイブリドーマの
選択的増殖 （１） 使用する培地は以下のとおりである。 ＨＡＴ培地：前記（ｄ）で述べたＮＳ−１培地にさらに
ヒポキサンチン（１００μＭ）アミノプテリン（０．４
μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。
選択的増殖 （１） 使用する培地は以下のとおりである。 ＨＡＴ培地：前記（ｄ）で述べたＮＳ−１培地にさらに
ヒポキサンチン（１００μＭ）アミノプテリン（０．４
μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。
【００２７】（２） 前記（ｄ）の培養開始後翌日（１
日目）、細胞に１０ｍｌピペットでＨＡＴ培地２滴（約
０．１ｍｌ）を加えた。２、３、５、８、１１日目に培
地の半分（０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換
え、１１日目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換え
た。通常約２週間で充分なハイブリドーマの生育が観察
される。ハイブリドーマ生育全ウエルについて次項
（ｆ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）に
より陽性ウエルをチェックした。
日目）、細胞に１０ｍｌピペットでＨＡＴ培地２滴（約
０．１ｍｌ）を加えた。２、３、５、８、１１日目に培
地の半分（０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換
え、１１日目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換え
た。通常約２週間で充分なハイブリドーマの生育が観察
される。ハイブリドーマ生育全ウエルについて次項
（ｆ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）に
より陽性ウエルをチェックした。
【００２８】次にフィーダーとして１０７個のマウス胸
腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌをポリスチレン製２４穴セ
ルウエル（岩城硝子）に加えたものを用い、上記で検出
された各陽性ハイブリドーマの全内容物を移した。これ
を前記（ｄ）におけると同様に７％炭酸ガス存在下、３
７℃で約２〜３日培養に付した。ハイブリドーマの充分
生育した時点でＥＬＩＳＡ法により陽性を再確認し、そ
れぞれについて次項（ｇ）記載の限界希釈法によるクロ
ーニングを行った。なお、クローニングに使用後の残液
をポリスチレン製２５ｃｍ２組織培養フラスコ（岩城硝
子）に移し、凍結保存用試料を調製した。
腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌをポリスチレン製２４穴セ
ルウエル（岩城硝子）に加えたものを用い、上記で検出
された各陽性ハイブリドーマの全内容物を移した。これ
を前記（ｄ）におけると同様に７％炭酸ガス存在下、３
７℃で約２〜３日培養に付した。ハイブリドーマの充分
生育した時点でＥＬＩＳＡ法により陽性を再確認し、そ
れぞれについて次項（ｇ）記載の限界希釈法によるクロ
ーニングを行った。なお、クローニングに使用後の残液
をポリスチレン製２５ｃｍ２組織培養フラスコ（岩城硝
子）に移し、凍結保存用試料を調製した。
【００２９】（ｆ） ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＴＩＭ
Ｐ−２抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２０５〜２１４、
１９８０に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干改変し
た方法を用いた。この方法は、ハイブリドーマ抗体の検
出に適している。９６穴ミクロタイトレーションプレー
ト（ＦｌｏｗＬａｂ．）を前記（ａ）で得られた各ポリ
ペプチド５０ｎｇでコートした。
Ｐ−２抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２０５〜２１４、
１９８０に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干改変し
た方法を用いた。この方法は、ハイブリドーマ抗体の検
出に適している。９６穴ミクロタイトレーションプレー
ト（ＦｌｏｗＬａｂ．）を前記（ａ）で得られた各ポリ
ペプチド５０ｎｇでコートした。
【００３０】これに前記（ｅ）で得られたハイブリドー
マ生育ウエルの上清の一部を加えて室温で約１時間イン
キュベートした。２次抗体として西洋わさびペルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ
Ｌａｂ．）を加え、さらに室温で約１時間インキュベ
ートした。次に基質である過酸化水素とｏ−フェニレン
ジアミンを加え生成した褐色の程度をマイクロプレート
リーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東洋ソーダ）を用いて４９２
ｎｍの吸光度を測定し判定した。
マ生育ウエルの上清の一部を加えて室温で約１時間イン
キュベートした。２次抗体として西洋わさびペルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ
Ｌａｂ．）を加え、さらに室温で約１時間インキュベ
ートした。次に基質である過酸化水素とｏ−フェニレン
ジアミンを加え生成した褐色の程度をマイクロプレート
リーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東洋ソーダ）を用いて４９２
ｎｍの吸光度を測定し判定した。
【００３１】（ｇ） クローニング 前記（ｅ）の操作後、各ウエル中には、２種以上のハイ
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当りフ
ィーダーとして１０７個のマウス胸腺細胞を含むクロー
ニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエ
ル、３６ウエルおよび２４ウエルにウエル当り５個、１
個および０．５個のハイブリドーマを加えた。５日目に
全ウエルに各約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加した。
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当りフ
ィーダーとして１０７個のマウス胸腺細胞を含むクロー
ニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエ
ル、３６ウエルおよび２４ウエルにウエル当り５個、１
個および０．５個のハイブリドーマを加えた。５日目に
全ウエルに各約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加した。
【００３２】クローニング開始後１１〜１４日で充分な
ハイブリドーマの生育が認められ、コロニーを形成して
いるウエルを１２個選びＥＬＩＳＡ法を行った。テスト
した全ウエルが陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコ
ロニー数を確認し、ウエル中に１コロニーが確認された
ウエルを２個選びその内１ウエルを再クローニングす
る。最終的に表２に示したようにＰ１−ペプチド、Ｐ２
−ペプチド、Ｐ３−ペプチドのそれぞれに対するモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ計５１クローンを得
た。
ハイブリドーマの生育が認められ、コロニーを形成して
いるウエルを１２個選びＥＬＩＳＡ法を行った。テスト
した全ウエルが陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコ
ロニー数を確認し、ウエル中に１コロニーが確認された
ウエルを２個選びその内１ウエルを再クローニングす
る。最終的に表２に示したようにＰ１−ペプチド、Ｐ２
−ペプチド、Ｐ３−ペプチドのそれぞれに対するモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ計５１クローンを得
た。
【００３３】（ｈ） モノクローナル抗体の生体外増殖
および生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、得
られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な培
養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から１０〜
１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得るこ
とができた。一方、大量に抗体を得るためには脾細胞と
ミエローマ細胞の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃ
マウス）にマウス１匹当り０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を腹腔内
投与した。１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×１０
７個を同じく腹腔内投与し、さらにその１〜２週間後に
生体内で産生された４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル
抗体を含む腹水を得ることができた。
および生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、得
られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な培
養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から１０〜
１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得るこ
とができた。一方、大量に抗体を得るためには脾細胞と
ミエローマ細胞の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃ
マウス）にマウス１匹当り０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を腹腔内
投与した。１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×１０
７個を同じく腹腔内投与し、さらにその１〜２週間後に
生体内で産生された４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル
抗体を含む腹水を得ることができた。
【００３４】（ｉ） モノクローナル抗体の重鎖および
軽鎖 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、前述のＰ１−ペプチ
ド、Ｐ２−ペプチド、Ｐ３−ペプチドそれぞれをコート
したミクロタイトレーションプレートに、前記（ｇ）で
得られた各モノクローンの培養上清を加えた。次にＰＢ
Ｓにより洗浄した後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウ
スＩｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．）を加えた。ＰＢＳ
による洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質と
して過酸化水素および２，２′−アジノ−ジ（３−エチ
ルベンゾチアゾリン硫酸）を用いてそれぞれの重鎖およ
び軽鎖を判定した。その結果をまとめて後掲の表２に示
した。
軽鎖 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、前述のＰ１−ペプチ
ド、Ｐ２−ペプチド、Ｐ３−ペプチドそれぞれをコート
したミクロタイトレーションプレートに、前記（ｇ）で
得られた各モノクローンの培養上清を加えた。次にＰＢ
Ｓにより洗浄した後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウ
スＩｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．）を加えた。ＰＢＳ
による洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質と
して過酸化水素および２，２′−アジノ−ジ（３−エチ
ルベンゾチアゾリン硫酸）を用いてそれぞれの重鎖およ
び軽鎖を判定した。その結果をまとめて後掲の表２に示
した。
【００３５】（ｊ） モノクローナル抗体の精製 前記（ｈ）で得られた各腹水を４０％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画した後、ＩｇＧクラスの抗体について０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝
液，ｐＨ８．９で平衡化したプロテインＡアフィゲル
（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂ．）カラムに吸着させ、上記洗
浄液で洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液，ｐＨ５．０で
溶出することにより精製した。
ウムで分画した後、ＩｇＧクラスの抗体について０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝
液，ｐＨ８．９で平衡化したプロテインＡアフィゲル
（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂ．）カラムに吸着させ、上記洗
浄液で洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液，ｐＨ５．０で
溶出することにより精製した。
【００３６】なお、クローン番号６７−４Ｈ１１のハイ
ブリドーマは、微工研菌寄第１２６９０号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２６９０）の受託番号をもって、微生物工業技術
研究所に寄宅されており、また、同クローン番号６８−
６Ｈ４のハイプリドーマは、微工研菌寄第１２６９１号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６９１）の受託番号をもって、同
研究所に寄託されている。
ブリドーマは、微工研菌寄第１２６９０号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２６９０）の受託番号をもって、微生物工業技術
研究所に寄宅されており、また、同クローン番号６８−
６Ｈ４のハイプリドーマは、微工研菌寄第１２６９１号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２６９１）の受託番号をもって、同
研究所に寄託されている。
【００３７】
【表２】
【００３８】（ｋ） ｎＴＩＭＰ−２の精製 ヒト胎盤に１ｍＭ塩酸カルシウム、０．１Ｍ塩化ナトリ
ウム、１ｍＭＮ−エチルマレイミド、５ｍＭＥＤＴＡ、
５ｍＭベンザミジンおよび０．００５％ブリッジ３５含
有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．４を加え、Ｔ
ＩＭＰ−２を抽出した。遠心後、その上清をｐＨ７．１
に調整し、前記（ｊ）項で精製したヒトＴＩＭＰ−２モ
ノクローナル抗体（クローン番号６７−４Ｈ１１）結合
セファロース４Ｂアフィニティー・カラムを用いて精製
し、最後に、３５℃、３０分間、４Ｍ塩酸グアニジン中
で処理した後、ウルトロゲルＡｃＡ５４カラムでゲル濾
過し、ＴＩＭＰ−２に結合している可能性のある細胞成
長因子を解離、分画により、除去した（表３）。
ウム、１ｍＭＮ−エチルマレイミド、５ｍＭＥＤＴＡ、
５ｍＭベンザミジンおよび０．００５％ブリッジ３５含
有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．４を加え、Ｔ
ＩＭＰ−２を抽出した。遠心後、その上清をｐＨ７．１
に調整し、前記（ｊ）項で精製したヒトＴＩＭＰ−２モ
ノクローナル抗体（クローン番号６７−４Ｈ１１）結合
セファロース４Ｂアフィニティー・カラムを用いて精製
し、最後に、３５℃、３０分間、４Ｍ塩酸グアニジン中
で処理した後、ウルトロゲルＡｃＡ５４カラムでゲル濾
過し、ＴＩＭＰ−２に結合している可能性のある細胞成
長因子を解離、分画により、除去した（表３）。
【００３９】精製により得られたｈＴＩＭＰ−２は、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８０，５７９〜５９９，１９
７３記載のＬａｅｍｍｌｉらの方法に従いドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で調べたとこ
ろ分子量約２１ｋＤａの単一バンドを示した。なお、各
精製段階のｈＴＩＭＰ−２濃度は後記（１）項記載の１
ステップサンドイッチＥＩＡにより測定した。
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８０，５７９〜５９９，１９
７３記載のＬａｅｍｍｌｉらの方法に従いドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で調べたとこ
ろ分子量約２１ｋＤａの単一バンドを示した。なお、各
精製段階のｈＴＩＭＰ−２濃度は後記（１）項記載の１
ステップサンドイッチＥＩＡにより測定した。
【００４０】（ｌ） １ステップサンドイッチＥＩＡ 前記（ｊ）項で精製したモノクローナル抗体（固相クロ
ーン番号６８−６Ｈ４、複合体：クローン番号６７−４
Ｈ１１）と上記（ｋ）項で調製したヒト胎盤を用いて表
４に示す方法で標準曲線を作成した。得られた標準曲線
の定量感度は約１６ｐｇであり、６．３−５０ｎｇ／ｍ
ｌ（６３−５００ｐｇ／アッセイ）の範囲で直線性が認
められた。
ーン番号６８−６Ｈ４、複合体：クローン番号６７−４
Ｈ１１）と上記（ｋ）項で調製したヒト胎盤を用いて表
４に示す方法で標準曲線を作成した。得られた標準曲線
の定量感度は約１６ｐｇであり、６．３−５０ｎｇ／ｍ
ｌ（６３−５００ｐｇ／アッセイ）の範囲で直線性が認
められた。
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】１） １μｇ／ｍｌＩｇＧ−ＰＯＤ複合体
溶液（溶解緩衝液：１％ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび１０ｍＭＥＤＴＡ含有３０ｍＭリン酸緩衝液，
ｐＨ７．０） ２） 生理食塩液 ３） ２ｍｇ／ｍｌｏ−フェニレンジアミン溶液（溶解
緩衝液：０．０２％過酸化水素含有クエン酸−リン酸緩
衝液，ｐＨ４．６） ４） ２Ｎ硫酸
溶液（溶解緩衝液：１％ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび１０ｍＭＥＤＴＡ含有３０ｍＭリン酸緩衝液，
ｐＨ７．０） ２） 生理食塩液 ３） ２ｍｇ／ｍｌｏ−フェニレンジアミン溶液（溶解
緩衝液：０．０２％過酸化水素含有クエン酸−リン酸緩
衝液，ｐＨ４．６） ４） ２Ｎ硫酸
【００４４】ヒトＴＩＭＰ（ｈＴＩＭＰ）の調製 （ａ） 抗ｈＴＩＭＰモノクローナル抗体の調製 特開昭６３−２１９３９２号公報記載の方法に従ってウ
シ歯髄ＴＩＭＰに対するマウスモノクローナル抗体を調
製した。得られた１７種のクローンの内、ｈＴＩＭＰと
交差反応を示すクローン番号、７−６Ｃ１、７−２１Ｂ
１２および７−２３Ｇ９の融合細胞をＢａｌｂ／ｃマウ
スに投与し腹水を得た。得られた各腹水中のモノクロー
ナル抗体をＣｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，７，
３４１−３５０，１９８７に記載のＫｏｄａｍａらの方
法に従って精製した。
シ歯髄ＴＩＭＰに対するマウスモノクローナル抗体を調
製した。得られた１７種のクローンの内、ｈＴＩＭＰと
交差反応を示すクローン番号、７−６Ｃ１、７−２１Ｂ
１２および７−２３Ｇ９の融合細胞をＢａｌｂ／ｃマウ
スに投与し腹水を得た。得られた各腹水中のモノクロー
ナル抗体をＣｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，７，
３４１−３５０，１９８７に記載のＫｏｄａｍａらの方
法に従って精製した。
【００４５】（ｂ） ｈＴＩＭＰの精製 ｈＴＩＭＰはヒト歯肉線維芽細胞（Ｇｉｎ−１細胞）の
コンディション培養液より、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ
−４４、Ｃｏｎ Ａセファロース、抗ｈＴＩＭＰモノク
ローナル抗体（クローン番号，７−２１Ｂ１２）−セフ
ァロース・アフィニティー・カラムを用いて精製し、最
後に、３５℃、３０分間、４Ｍ塩酸グアニジン中で処理
した後、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ６０カラムにかけて、ｈＴ
ＩＭＰに結合している可能性のある細胞成長因子を解
離、分画によって除去した。
コンディション培養液より、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ
−４４、Ｃｏｎ Ａセファロース、抗ｈＴＩＭＰモノク
ローナル抗体（クローン番号，７−２１Ｂ１２）−セフ
ァロース・アフィニティー・カラムを用いて精製し、最
後に、３５℃、３０分間、４Ｍ塩酸グアニジン中で処理
した後、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ６０カラムにかけて、ｈＴ
ＩＭＰに結合している可能性のある細胞成長因子を解
離、分画によって除去した。
【００４６】
実施例１ Ｇｉｎ−１細胞増殖に対するｈＴＩＭＰ−２濃度の影響 ヒト歯肉線維芽細胞（Ｇｉｎ−１）の増殖に対してダル
ベッコ変法イーグル（Ｄ−ＭＥＭ）培地にｈＴＩＭＰ濃
度を段階的に変えてその増殖程度をＡｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，３９，１９７−２０１，１９７１に記載のＨ
ｉｎｅｇａｒｄｎｅｒの方法に従って細胞中のＤＮＡ量
より調べた。後掲図１に示したように７日目の培養期間
中、ｈＴＩＭＰ−２濃度１０ｎｇ／ｍｌで最大活性を示
している。なお、１００ｎｇ／ｍｌ以上では逆にｈＴＩ
ＭＰ−２による増殖抑制がみられた。
ベッコ変法イーグル（Ｄ−ＭＥＭ）培地にｈＴＩＭＰ濃
度を段階的に変えてその増殖程度をＡｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，３９，１９７−２０１，１９７１に記載のＨ
ｉｎｅｇａｒｄｎｅｒの方法に従って細胞中のＤＮＡ量
より調べた。後掲図１に示したように７日目の培養期間
中、ｈＴＩＭＰ−２濃度１０ｎｇ／ｍｌで最大活性を示
している。なお、１００ｎｇ／ｍｌ以上では逆にｈＴＩ
ＭＰ−２による増殖抑制がみられた。
【００４７】実施例２、３ Ｋ−５６２細胞およびＲａｊｉ細胞に対するｈＴＩＭＰ
−２濃度の影響 ヒト慢性赤血球性白血病細胞（Ｋ−５６２）およびヒト
パーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）の増殖に対してＡ
ＳＦ１０４無血清培地にｈＴＩＭＰ濃度を段階的に変え
てその影響を調べたところ、後掲図２および図３に示し
たように７日目の培養期間中、ｈＴＩＭＰ−２濃度１０
ｎｇ／ｍｌで最大活性を示している。なお、１００ｎｇ
／ｍｌ以上では逆にｈＴＩＭＰ−２による増殖抑制がみ
られ、実施例３のＧｉｎ−１細胞の場合と同様な結果が
得られた。
−２濃度の影響 ヒト慢性赤血球性白血病細胞（Ｋ−５６２）およびヒト
パーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）の増殖に対してＡ
ＳＦ１０４無血清培地にｈＴＩＭＰ濃度を段階的に変え
てその影響を調べたところ、後掲図２および図３に示し
たように７日目の培養期間中、ｈＴＩＭＰ−２濃度１０
ｎｇ／ｍｌで最大活性を示している。なお、１００ｎｇ
／ｍｌ以上では逆にｈＴＩＭＰ−２による増殖抑制がみ
られ、実施例３のＧｉｎ−１細胞の場合と同様な結果が
得られた。
【００４８】実施例４ マウス由来ハイブリドーマ増殖に対するｈＴＩＭＰおよ
びｈＴＩＭＰ−２の効果 マウス抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ（クローン番号、２１−４Ｇ３，ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２２０１）増殖に対するｈＴＩＭＰ（１０
０ｎｇ／ｍｌ）およびｈＴＩＭＰ−２（１０ｎｇ／ｍ
ｌ）添加効果を調べたところ、図４に示したようにｈＴ
ＩＭＰでは効果を認められなかったが、ｈＴＩＭＰ−２
では増殖効果が有意に増大していることが認められる。
びｈＴＩＭＰ−２の効果 マウス抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ（クローン番号、２１−４Ｇ３，ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２２０１）増殖に対するｈＴＩＭＰ（１０
０ｎｇ／ｍｌ）およびｈＴＩＭＰ−２（１０ｎｇ／ｍ
ｌ）添加効果を調べたところ、図４に示したようにｈＴ
ＩＭＰでは効果を認められなかったが、ｈＴＩＭＰ−２
では増殖効果が有意に増大していることが認められる。
【００４９】実施例５ マウス由来コロン２６細胞の増殖に対するｈＴＩＭＰ、
ｂＴＩＭＰおよびｈＴＩＭＰ−２の効果 マウスコロン２６細胞（マウス直腸癌コロン２６細胞）
の増殖に対してｈＴＩＭＰ（１００ｎｇ／ｍｌ）および
ｈＴＩＭＰ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加しその効果を
調べた。図５に示したようにｈＴＩＭＰでは効果は認め
られなかったが、ｈＴＩＭＰ−２で増殖効果が有意に増
大していることが認められた。
ｂＴＩＭＰおよびｈＴＩＭＰ−２の効果 マウスコロン２６細胞（マウス直腸癌コロン２６細胞）
の増殖に対してｈＴＩＭＰ（１００ｎｇ／ｍｌ）および
ｈＴＩＭＰ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加しその効果を
調べた。図５に示したようにｈＴＩＭＰでは効果は認め
られなかったが、ｈＴＩＭＰ−２で増殖効果が有意に増
大していることが認められた。
【００５０】以上から明らかなように、上記の実験結果
は、ＴＩＭＰ−２が明らかに広い範囲の細胞の増殖に深
い関わりをもっていることを示しているものである。特
にｈＴＩＭＰは、マウス由来細胞やマウス由来ハイブリ
ドーマにその増殖効果をもたなかったが、ｈＴＩＭＰ−
２でその効果が認められた。
は、ＴＩＭＰ−２が明らかに広い範囲の細胞の増殖に深
い関わりをもっていることを示しているものである。特
にｈＴＩＭＰは、マウス由来細胞やマウス由来ハイブリ
ドーマにその増殖効果をもたなかったが、ｈＴＩＭＰ−
２でその効果が認められた。
【００５１】本発明は、天然のＴＩＭＰ−２またはリコ
ンビナントＴＩＭＰ−２を単独であるいはＴＩＭＰと組
み合わせて合成人口培養液中に加えることにより、これ
まで、合成人工培養液中では細胞増殖が困難であった
り、細胞増殖が制限されていた細胞の増殖を行うことを
可能にしたものであり、細胞培養を用いる諸研究や、さ
らに、工業レベルへの応用等、これらの分野での進歩に
大きな貢献をするものである。
ンビナントＴＩＭＰ−２を単独であるいはＴＩＭＰと組
み合わせて合成人口培養液中に加えることにより、これ
まで、合成人工培養液中では細胞増殖が困難であった
り、細胞増殖が制限されていた細胞の増殖を行うことを
可能にしたものであり、細胞培養を用いる諸研究や、さ
らに、工業レベルへの応用等、これらの分野での進歩に
大きな貢献をするものである。
【図１】Ｄ−ＭＥＭ無血清培養液中でのヒトＧｉｎ−１
細胞増殖に対するｈＴＩＭＰ−２のもたらす添加効果を
示す図であり、
細胞増殖に対するｈＴＩＭＰ−２のもたらす添加効果を
示す図であり、
【図２】ＡＳＦ１０４無血清培養液中でのヒトＫ−５６
２細胞増殖に対するｈＴＩＭＰ−２のもたらす添加効果
を示す図であり、
２細胞増殖に対するｈＴＩＭＰ−２のもたらす添加効果
を示す図であり、
【図３】ＡＳＦ１０４無血清培養液中でのヒトＲａｊｉ
細胞増殖に対するｈＴＩＭＰ−２のもたらす添加効果を
示す図であり、
細胞増殖に対するｈＴＩＭＰ−２のもたらす添加効果を
示す図であり、
【図４】ＰＲＭＩ１６４０無血清培養液中でのマウス抗
ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体産生細胞ハ
イブリドーマ増殖に対するｈＴＩＭＰおよびｈＴＩＭＰ
−２のもたらす添加効果を示す図であり、
ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体産生細胞ハ
イブリドーマ増殖に対するｈＴＩＭＰおよびｈＴＩＭＰ
−２のもたらす添加効果を示す図であり、
【図５】マウスコロン２６細胞増殖に対するｈＴＩＭ
Ｐ、ｂＴＩＭＰおよびｈＴＩＭＰ−２の添加効果を示す
図である。
Ｐ、ｂＴＩＭＰおよびｈＴＩＭＰ−２の添加効果を示す
図である。
【００５２】
【表５】
【００５３】
【表６】
【００５４】
【表７】
【００５５】
【表８】
【００５６】
【表９】
【００５７】
【表１０】
【００５８】
【表１１】
【００５９】
【表１２】
【００６０】
【表１３】
【００６１】
【表１４】
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−171182（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/00 - 5/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ティシュ・インヒビター・オブ・メタロ
プロテイナーゼ−２を含有せしめたことを特徴とする組
織培養用無血清培地。 - 【請求項２】 ティシュ・インヒビター・オブ・メタロ
プロテイナーゼ−２を細胞増殖成長因子として用いて、
動物組織細胞あるいは動物由来の融合細胞をティシュ・
インヒビター・オブ・メタロプロテイナーゼ−２含有組
織培養用無血清培地中で増殖させることを特徴とする細
胞増殖方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26264792A JP3157619B2 (ja) | 1992-08-19 | 1992-08-19 | ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイナーゼ−２含有組織培養用無血清培地と細胞増殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26264792A JP3157619B2 (ja) | 1992-08-19 | 1992-08-19 | ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイナーゼ−２含有組織培養用無血清培地と細胞増殖方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662843A JPH0662843A (ja) | 1994-03-08 |
| JP3157619B2 true JP3157619B2 (ja) | 2001-04-16 |
Family
ID=17378688
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26264792A Expired - Lifetime JP3157619B2 (ja) | 1992-08-19 | 1992-08-19 | ティシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイナーゼ−２含有組織培養用無血清培地と細胞増殖方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3157619B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112015008925B1 (pt) | 2012-10-18 | 2021-02-02 | Lifeline Scientific, Inc. | composição de armazenamento de biomateriais |
-
1992
- 1992-08-19 JP JP26264792A patent/JP3157619B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0662843A (ja) | 1994-03-08 |
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