BR112015008925B1 - composição de armazenamento de biomateriais - Google Patents

Abstract

PRESERVAÇÃO DE PROPRIEDADES DE BIOMATERIAL E MÉTODOS DE ARMAZENAMENTO. São aqui descritos métodos e composições aprimoradas para armazenamento de biomateriais. Em alguns aspectos, os biomateriais incluem tecidos eucariotas naturais e artificiais. Os métodos descritos aqui incluem armazenamento destes biomateriais de modo a reduzir ou impedir que perda de propriedades dos biomateriais (por exemplo, integridade da matriz extracelular, viabilidade celular ou uma combinação dos mesmos) ocorra, quer durante armazenamento ou após remoção do biomaterial de armazenamento. Em alguns aspectos, os biomateriais serão armazenados em soluções sem produtos de origem animal que contêm um agente que previne ou reduz a perda de integridade da matriz extracelular.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente descrição refere-se a métodos para armazena mento de biomateriais eucariotas (por exemplo, células em associação com materiais e tecidos), ao mesmo tempo em que reduz ou evita a perda de propriedades do biomaterial associada ao armazenamento. A presente descrição se refere ainda à manutenção de (i) a integridade da matriz extracelular do biomaterial, incluindo permeabilidade, teor de água e teor de glicosaminoglicanas da matriz extracelular, e (ii) a viabilidade celular durante armazenamento.

ANTECEDENTES

[0002] Ao longo das últimas décadas, métodos e técnicas de ar mazenamento têm sido desenvolvidos para preservar tecidos e células eucariotas. Estes métodos e técnicas de armazenamento são dirigidos ao armazenamento de várias células eucariotas em matrizes extrace- lulares artificiais, tecidos artificiais e tecidos naturais durante um período de tempo de uma maneira que permita o uso destes tecidos armazenados em um momento posterior, tal como para implante ou transplante em pacientes ou para bioensaios de triagem de fármacos ou substâncias químicas.

[0003] Embora estes métodos e técnicas de armazenamento se jam amplamente aplicáveis tanto em situações de pesquisa básica quanto pesquisa traducional, manutenção das propriedades de bioma- teriais (por exemplo, integridade da matriz extracelular e viabilidade celular) durante armazenamento continua a ser um desafio. Por exemplo, permeabilidade da matriz extracelular e viabilidade celular tecidual significativamente diminuídas têm sido observadas usando as técnicas atuais, e estas diminuições podem levar à função ineficiente do biomaterial após remoção de armazenamento.

[0004] Em um exemplo, condrócitos e tecido cartilaginoso são pre servados usando várias técnicas de armazenamento e são subsequentemente removidos do armazenamento e usados como aloenxer- tos osteocondrais. Os aloenxertos podem reparar (1) defeitos da cartilagem induzidos por trauma e (2) superfícies cartilaginosas danificadas pela osteoartrite. O uso de condrócitos e cartilagem como aloenxertos osteocondrais no tratamento de osteoartrite é importante porque estima-se que a osteoartrite afeta atualmente cerca de 20 milhões de pessoas nos Estados Unidos. Assim, como um resultado, uma grande indústria tem crescido para fornecer implantes ortopédicos para tratar pessoas com articulações defeituosas, fraturas osteoporóticas ou problemas nas costas resultantes de uma perda de cartilagem endógena ou resultantes de dano da cartilagem endógena.

[0005] Embora aloenxertos osteocondrais mostrem promessa para o tratamento de condições médicas relacionadas à cartilagem, a viabilidade de condrócitos e integridade da matriz extracelular da cartilagem articular transplantada determinam grandemente os resultados (isto é, um resultado cirúrgico bem sucedido contra um resultado cirúrgico falho, etc.) do transplante de aloenxerto osteocondral. As técnicas de preservação atuais não mantêm aceitavelmente a integridade da matriz extracelular da cartilagem e, em determinados aspectos, a viabilidade de condrócitos poderia ser melhorada. Por exemplo, a crio- preservação convencional de condrócitos e cartilagem inclui o congelamento destas células e tecidos em uma solução que inclui sulfóxido de dimetila (DMSO), mas estas técnicas resultam em morte de 80100% dos condrócitos na cartilagem articular mais danos à matriz ex- tracelular em virtude da formação de gelo.

[0006] Os pobres resultados de criopreservação discutidos acima levaram à prática do assim denominado transplante de segmentos articulares "frescos" (isto é, aloenxertos de condrócitos e/ou cartilagem). Por exemplo, enxertos de tecido osteocondral derivados do doador são, tipicamente, coletados dentro de 24 horas após a morte do doador e guardados a 4°C por até 42 dias para reparo de defeitos clínicos da cartilagem. Além disso, aloenxertos osteoarticulares frescos disponíveis comercialmente são armazenados durante pelo menos 17 dias para permitir que testagem sorológica e microbiológica antes de implantação para minimizar infecção potencial no receptor.

SUMÁRIO

[0007] Embora o transplante de aloenxerto osteocondral seja um tratamento eficaz para reparação de (1) defeitos da cartilagem induzidos por trauma e (2) superfícies cartilaginosas danificadas pela osteo- artrite, vários desafios ainda existem para manter a viabilidade dos condrócitos e integridade da matriz extracelular da cartilagem durante armazenamento. Conforme demonstrado por estudos recentes, pode ser importante manter tanto a viabilidade dos condrócitos quanto integridade da matriz extracelular para promover o transplante bem sucedido do aloenxerto. Por exemplo, se a viabilidade celular e/ou a integridade da matriz diminuem durante ou após remoção de armazenamento, a probabilidade de um transplante bem sucedido pode diminuir. Estes desafios existem com a maioria das células eucariotas em tecidos artificiais ou naturais. Assim, novas técnicas de conservação de tecidos e células eucariotas seriam úteis.

[0008] São aqui descritos métodos e composições para armaze namento de biomateriais. Em alguns aspectos, os biomateriais incluem células eucariotas e tecidos eucariotas, tais como condrócitos e cartilagem. Os métodos descritos aqui incluem armazenamento destes bi- omateriais de uma forma que reduz ou previne a perda de propriedades do biomaterial, tais como permeabilidade da matriz extracelular e viabilidade dos condrócitos, as quais ocorrem durante o armazenamento ou após remoção dos biomateriais de armazenamento. Em al- guns aspectos, os biomateriais são colocados dentro de uma solução a qual pode incluir produtos derivados de animais e são, subsequentemente, armazenados para uso posterior. Em determinados aspectos, as soluções descritas aqui contêm um agente que previne ou reduz a perda de propriedades do biomaterial e, em determinados aspectos, este agente pode incluir pelo menos um inibidor enzimático. Por exemplo, este agente pode incluir um inibidor natural ou sintético de metaloproteinase da matriz (Matrix MetalloProteinase - MMP) o qual pode incluir, porém sem limitações, inibidores de metaloproteinase de tecidos endógenos (Tissue Inhibitors of MetalloProteinase - TIMPs), compostos que regulam a síntese de TIMP ou doxiciclina, respectivamente.

[0009] As vantagens da presente descrição serão apresentadas em parte na descrição que se segue ou podem ser aprendidas pela prática dos aspectos descritos abaixo. As vantagens descritas abaixo serão concretizadas e obtidas por meio dos elementos e combinações particularmente destacados nas reivindicações anexas. Deverá ser entendido que tanto a descrição geral precedente quanto a descrição detalhada a seguir são apenas exemplificativas e explicativas e não são restritivas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00010] A Figura 1 é um gráfico que compara a viabilidade e proliferação de condrócitos após os condrócitos terem sido armazenados durante 28 dias em quatro soluções diferentes. A viabilidade e proliferação foram quantificadas medindo-se as unidades de fluorescência relativas (Relative Fluorescence Unit -RFU) de cada amostra.

[00011] A Figura 2 é um gráfico que mostra o coeficiente de correlação (R2) entre elevada viabilidade celular e perda de permeabilidade da matriz da cartilagem e a condutividade que ocorre durante armazenamento a frio em 4 soluções diferentes. Conforme mostrado na Figu- ra 2, o coeficiente de correlação aumentou 0,78 a 0,90 durante 4 dias de cultura tecidual após recuperação de armazenamento.

[00012] A Figura 3 é um gráfico que ilustra o impacto de armazenamento hipotérmico sobre a permeabilidade da cartilagem com base na condutividade elétrica de amostras de cartilagem em solução salina hipotônica.

[00013] A Figura 4 é uma representação esquemática de uma câmara de compressão usada para quantificar propriedades mecânicas (por exemplo, compressão de fluência) de cartilagem.

[00014] A Figura 5 é um gráfico que mostra o impacto da concentração de doxiciclina sobre a viabilidade celular da cartilagem após vários períodos de armazenamento.

[00015] A Figura 6 é um gráfico que mostra o impacto da condutivi- dade elétrica sobre um tampão de cartilagem de suíno após um mês de armazenamento refrigerado em várias concentrações de doxicicli- na.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES

[00016] As composições e métodos descritos podem ser mais facilmente compreendidos por meio de referência à descrição detalhada a seguir de modalidades particulares, dos Exemplos incluídos aqui e das Figuras e suas descrições. Os aspectos descritos abaixo não estão limitados a composições e/ou métodos específicos conforme descrito os quais podem, naturalmente, variar.

[00017] Ao longo do presente pedido, várias publicações são citadas. As descrições destas publicações na íntegra, bem como as publicações incluídas na lista de referências abaixo, são aqui incorporados por referência ao presente pedido para descrever mais completamente o estado da técnica à qual a presente descrição pertence. As referências citadas também são individual e especificamente incorporadas aqui por referência quanto às partes específicas que são citadas.

[00018] As concentrações, quantidades e outros dados numéricos podem ser expressos ou apresentados aqui em um formato de faixa. Deverá ser entendido que tal formato de faixa é usado meramente por conveniência e brevidade e, portanto, deve ser interpretado de forma flexível de modo a incluir não apenas os valores numéricos explicitamente citados como os limites da faixa, mas também todos os valores numéricos individuais ou subfaixas abrangidas dentro das faixas, como se cada valor numérico e subfaixa fosse expressamente citada. A título de ilustração, uma faixa numérica de "cerca de 1 a 5" deve ser interpretada de modo a incluir não apenas os valores explicitamente citados de cerca de 1 a cerca de 5, mas incluem também os valores individuais, tais como 2, 3 e 4 e suas subfaixas, tais como 1-3, 2-4 e 3-5, etc., bem como 1, 2, 3, 4 e 5, individualmente. O mesmo princípio se aplica a faixas que citam apenas um valor numérico como um mínimo ou máximo. Além disso, tal interpretação deve ser aplicável independentemente da amplitude da faixa ou das características que estão sendo descritas.

[00019] No presente relatório descritivo e nas reivindicações que seguem, referência será feita a uma série de termos que serão definidos como tendo os significados a seguir.

[00020] Solução "sem produto animal" inclui uma solução que não inclui qualquer (quaisquer) produto(s) de origem animal ou quaisquer produtos derivados de animais, excluindo o biomaterial ainda descrito abaixo. "Produtos de origem animal" podem incluir soro fetal bovino (Fetal Bovine Serum - FBS), o qual é um produto derivado de animal que inclui fatores de crescimento e é frequentemente usado em cultura de células convencional. Assim, em um exemplo, uma solução "sem animal produto" pode incluir uma solução sem FBS.

[00021] O termo "biomaterial" inclui tecidos e células eucariotas de mamífero não vegetais.

[00022] São aqui descritos biomateriais viáveis e métodos para ar-mazenamento de tais biomateriais. Em alguns aspectos, estes bioma- teriais incluem células eucariotas em tecidos modificados e naturais e os métodos descritos aqui incluem armazenamento destes biomateri- ais de maneira tal que reduz ou impede que a perda de propriedades dos biomateriais (por exemplo, redução ou prevenção da perda de integridade da matriz extracelular, viabilidade das células teciduais ou uma combinação dos mesmos) ocorra, quer durante armazenamento ou após remoção do biomaterial de armazenamento. Em alguns aspectos, estes biomateriais são colocados dentro de uma solução, a qual pode incluir uma solução sem produtos de origem animal que contém pelo menos um agente que reduz ou previne uma perda de propriedades do biomaterial. Subsequentemente, os biomateriais colocados dentro da solução que contém pelo menos um agente são, então, armazenadas em uma temperatura particular, até que estes bio- materiais ainda sejam necessários. A concentração de pelo menos um agente é otimizada de tal modo que as propriedades dos biomateriais (por exemplo, integridade da matriz extracelular e viabilidade celular) sejam maximizadas.

[00023] Em determinados aspectos, os biomateriais podem incluir quaisquer células e/ou tecidos eucariotas de mamífero não vegetais, incluindo células eucariotas primárias (por exemplo, células e/ou tecidos não imortalizados) e células imortalizadas. Em determinados aspectos, os biomateriais podem incluir tecidos e células naturais e artificiais. Exemplos de biomateriais naturais e artificiais podem incluir, porém sem limitações, condrócitos, cartilagem, osteoblastos, osteoclas- tos, ossos, tampões teciduais, tampões teciduais de aloenxerto, tampões teciduais de cartilagem, uma córnea, válvulas do coração, vasos sanguíneos, ureter, intestino, pele, dentes, biópsias de tumores, discos ou corpos intervertebrais, ligamentos, tendões, etc. Em pelo menos um aspecto, os biomateriais incluem pelo menos condrócitos, cartilagem ou uma combinação dos mesmos. Em outros aspectos, os biomateri- ais incluem apenas condrócitos, cartilagem ou uma combinação dos mesmos. Em determinados aspectos, os biomateriais incluem tecidos de autoenxerto, tecidos de aloenxerto e tecidos de xenoenxerto. Por exemplo, em relação a tecidos para enxerto humano adequados, os tecidos de aloenxerto e/ou tampões teciduais podem ser derivados de um doador humano. Tecidos de xenoenxerto podem ser derivados de um doador suíno, um doador bovino, um doador ovino, um doador equino ou qualquer outra espécie para fins medicinais. Os tecidos descritos aqui podem também ser derivados de espécies animais para aplicações veterinárias dentro da mesma espécie; exemplos incluem cães, gatos, ovelhas, vacas e cavalos.

[00024] Quando de uso dos tecidos e células descritos aqui com as composições e métodos descritos aqui, um objetivo é evitar a perda de integridade da matriz extracelular e/ou reduzir ou impedir a perda de viabilidade celular. Por exemplo, a integridade da matriz extracelular pode ser determinada com base na permeabilidade da membrana ex- tracelular, o teor de água da membrana extracelular, teor de glicosa- minoglicanas da membrana extracelular ou uma combinação dos mesmos. Em determinados aspectos, um objetivo é manter pelo menos um de permeabilidade da membrana extracelular, teor de água da membrana extracelular, teor de glicosaminoglicanas da membrana ex- tracelular ou qualquer combinação dos mesmos quando de armazenamento do biomaterial para prevenir ou reduzir a perda de integridade da matriz extracelular. Quando de determinação de integridade da matriz do biomaterial, numerosos métodos conhecidos na técnica podem ser usados. Estas técnicas incluem ensaios de condutividade elétrica da matriz que medem a permeabilidade, teor de água e teor de glicosaminoglicanas, ensaios de indentação, ensaios de ten- são/deformação, elasticidade, espectroscopia Raman, vários métodos microscópicos (tais como microscopia de varredura a laser com geração de segunda harmônica), etc. Conforme ainda afirmado acima, um outro objetivo é reduzir ou evitar a perda de viabilidade celular do biomaterial. Em determinados aspectos, vários tipos de morte celular incluindo, porém sem limitações, morte celular necrótica, morte celular apoptótica, morte celular autofágica (Tipo II), anoikis e necroptose, podem ser reduzidos ou evitados usando as composições e métodos descritos aqui e, em determinados aspectos, estes tipos de morte celular podem ser limitados mediante uso de um agente conforme ainda descrito abaixo. Além disso, ensaios de atividade metabólica (por exemplo, um ensaio de resazurina), diversas técnicas de coloração celular (por exemplo, um ensaio de exclusão com azul de tripano e colorações vivas/mortas), imuno-histoquímica, bioquímica e vários ensaios de expressão gênica podem ser usados.

[00025] Em um aspecto, quando tecidos que contêm uma matriz estão sendo usados como biomaterial, prevenção ou redução da perda de integridade da matriz extracelular e da perda de viabilidade celular é importante para manter a integridade estrutural e função biológica normal do tecido. Por exemplo, a cartilagem contém condrócitos (isto é, células) e uma matriz extracelular, em que a matriz extracelular é primariamente composta de fibras de colágeno, proteoglicanas e fibras de elastina. Tanto a viabilidade de condrócitos quanto a integridade da matriz extracelular da cartilagem são importantes para manter a função biológica fisiológica normal em aplicações in vivo, ex vivo e in vitro. Por exemplo, a matriz extracelular da cartilagem confere integridade estrutural e mantém um determinado grau de rigidez in vivo, o qual funciona em suporte ao osso, mobilidade das articulações, etc. Em determinados aspectos, a permeabilidade da matriz extracelular da cartilagem é de importância particular. Por exemplo, a permeabilidade da cartilagem pode estar associada com e pode desempenhar um papel importante em manutenção de integridade estrutural da matriz extrace- lular da cartilagem e ajuda a manter a viabilidade dos condrócitos também. Em determinados aspectos, permeabilidade diminuída da matriz extracelular da cartilagem pode estar associada ao aumento da viabilidade de condrócitos e integridade estrutural da matriz extracelular da cartilagem reduzida. Este aumento da viabilidade e diminuição da integridade estrutural em virtude da produção de produtos celulares, tais como enzimas, podem levar a uma diminuição da probabilidade de sucesso do transplante quando a cartilagem armazenada será posteriormente usada para transplante de aloenxerto. Assim, em determinados aspectos, os métodos e composições descritos aqui são usados para prevenir ou reduzir a perda de integridade da matriz extracelular da cartilagem, ao mesmo tempo em que reduz e/ou previne a perda de viabilidade dos condrócitos e, em determinados aspectos, os métodos e composições descritos aqui são usados para reduzir e/ou prevenir a perda de integridade da matriz extracelular de cartilagem em um alo- enxerto, ao mesmo tempo em que otimiza a viabilidade dos condróci- tos.

[00026] Os biomateriais descritos aqui podem ser colocados em uma solução que impede ou reduz a perda de propriedades de bioma- teriais (por exemplo, integridade da matriz extracelular, viabilidade celular ou uma combinação das mesmas) e, em determinados aspectos, esta solução pode ser uma solução sem produtos de origem animal (por exemplo, exclui FBS) ou pode conter produtos de origem animal (por exemplo, inclui FBS). Deverá ser notado que as modalidades e descrições a seguir se aplicam também a soluções que contêm produtos de origem animal, incluindo o biomaterial. Em determinados aspectos, o biomaterial é pelo menos parcialmente submerso na solução e, em outros aspectos, o biomaterial é completamente submerso na so- lução.

[00027] Em um aspecto, a solução pode ser uma solução do tipo extracelular incluindo pelo menos um agente que previne ou reduz a perda de propriedades de biomateriais (por exemplo, integridade da matriz extracelular, viabilidade celular ou uma combinação das mesmas). Por exemplo, as soluções de tipo extracelular podem incluir soluções de tipo plasma isotônicas com complementos iônicos que imitam o ambiente extracelular normal das células e tecidos. Estas soluções de tipo plasma isotônicas podem incluir meios de cultura de células os quais fornecem vários aminoácidos e metabólitos para o biomaterial (por exemplo, células e/ou tecidos) para suporte nutricional. Por exemplo, meio de cultura de células usado para a solução de tipo ex- tracelular pode incluir, porém sem limitações, Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), αMEM, MEM de Glasgow, F10 de Ham, F-12 de Ham, L-15 de Leibovitz, DMEM Modificado de Iscove, DMEM/F-12 de Ham e derivados dos mesmos. A solução de tipo extracelular pode ser isenta de produtos de origem animal de modo que, antes de colocação do biomaterial na solução de células, a solução de células não contenha produtos de origem animal. Por exemplo, quando se usa meio de cultura de células, o meio de cultura de células não conteria soro fetal bovino (Fetal Bovine Serum - FBS) ou qualquer outro produto derivado de um animal.

[00028] Em determinados aspectos, a solução inclui uma solução de tipo intracelular. A solução de tipo intracelular pode incluir, porém sem limitações, uma solução isotônica formulada para restringir a troca passiva de água e íons entre as células no biomaterial e na solução de tipo intracelular durante armazenamento. Por exemplo, uma solução de tipo intracelular pode incluir um ânion de não permeação, tal como gluconato ou lactobionato, para substituir parcialmente os íons de cloreto no espaço extracelular, os quais conferem suporte osmótico para equilibrar a pressão oncótica intracelular gerada por macromoléculas citosólicas e seus contra-íons associados encerrados dentro da célula. Soluções de tipo intracelular podem incluir, porém sem limitações, VIASPAN® (isto é, solução de Belzer) e UNISOL® (por exemplo, SPS- 1). Similar à solução de tipo extracelular descrita acima, a solução de tipo intracelular pode ser isenta de produtos de origem animal.

[00029] Componentes adicionais podem ser adicionados à solução de tipo intracelular para suplementar ainda mais a solução de tipo intracelular e promover ainda mais a viabilidade do biomaterial. Por exemplo, estes componentes adicionais fornecem suporte nutricional adicional para o biomaterial, o que reduz ou previne a perda de viabilidade do biomaterial. Estes componentes adicionais podem incluir, porém sem limitações, um coquetel de nutrientes tendo aminoácidos essencial não derivados de animais (isto é, sinteticamente derivados), aminoácidos não essenciais derivados, vitaminas sinteticamente derivadas, lipídios sinteticamente derivados, carboidratos sinteticamente derivados ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos dos carboidratos incluídos no coquetel de nutrientes podem ainda incluir mo- nossacarídeos (por exemplo, glicose, frutose, galactose), dissacarí- deos (por exemplo, maltose, lactose, etc.) ou uma combinação dos mesmos. Exemplos de aminoácidos fornecidos no coquetel podem incluir, porém sem limitações, qualquer combinação de glicina, L- arginina, L-cistina, L-glutamina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L- lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L- tirosina, L-valina ou qualquer sal dos mesmos. Exemplos de vitaminas fornecidas no coquetel podem incluir, porém sem limitações, qualquer combinação de cloreto de colina, D-cálcio, ácido fólico, niacinamida, piridoxina, riboflavina, tiamina, inositol ou um qualquer sal dos mesmos.

[00030] Conforme indicado acima, um agente que previne ou reduz a perda de propriedades de biomateriais (por exemplo, integridade da matriz extracelular, viabilidade celular ou uma combinação das mesmas) pode ser incluído na solução. Em determinados aspectos, o agente pode prevenir ou reduzir a perda de integridade da matriz ex- tracelular. Por exemplo, agentes que previnem ou reduzem a perda de integridade da matriz extracelular podem incluir pequenos compostos orgânicos, compostos inorgânicos, moléculas biológicas (por exemplo, proteínas, polipeptídeos, peptídeos, ácidos nucleicos, aptâmeros de ácidos nucleicos, aptâmeros peptídicos) ou qualquer combinação dos mesmos, os quais inibem ou reduzem a perda de integridade da matriz extracelular na solução quando, por exemplo, comparado com um controle. Em determinados aspectos, o agente pode reduzir a perda de propriedades do biomaterial (por exemplo, integridade da matriz extra- celular), por exemplo, em 5% ou mais, 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais ou 99% ou mais quando comparado, por exemplo, com um controle. Dito de outra maneira, o agente pode inibir, substancial ou completamente, a perda das propriedades de um biomaterial, por exemplo, em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou 100% quando comparado, por exemplo, com um controle. Em determinados aspectos, a solução inclui um agente em concentrações que variam de 1 pM a 1000 μM, 1 pM a 500 μM, 1 pM a 30 μM, 1pM a 1000 nM, 1 pM a 500 nM, 1 pM a 250 nM, 100 pM a 750 μM, 100 pM a 500 μM, 100 pM a 20 μM, 100 pM a 1000 nM, 1 pM a 750 nM, 1 pM a 500 nM, 1 pM a 250 nM, 1 pM a 1 nM, 500 pM a 500 μM, 500 pM a 250 μM, 500 pM a 100 μM, 500 pM a 10 μM, 500 pM a 1000 nM, 500 pM, a 750 nM, 500 pM a 500 nM, 500 pM a 250 nM, 500 pM a 100 nM, 500 pM a 1 nM, 1 nM a 1000 μM, 1 nM a 750 μM 1 nM a 500 μM, 1 nM a 250 μM, 1nM a 100 μM, 1 pM a 1 μM, 100 nM a 1000 μM, 100 nM a 750 μM, 100 nM a 500 μM, 100 nM a 250 μM, 100 nM a 100 μM, 100 pM a 1 μM, 250 nM a 1000 μM, 250 nM a 750 μM, 250 nM a 500 μM, 250 nM a 250 μM, 250 nM a 100 μM, 250 nM a 1 μM, 500 nM a 1000 μM, 500 nM a 750 μM, 500 nM a 500 μM, 500 nM a 250 μM, 100 nM a 100 μM, 500 nM a 1 μM, 750 nM a 1000 μM, 750 nM a 750 μM, 750 nM a 500 μM, 750 nM a 250 μM, 750 nM a 100 μM, 750 nM a 1 μM, 0,5 μM a 1000 μM, de 10 μM a 950 μM, de 20 μM a 900 μM, de 30 μM a 850 μM, de 40 μM, a 800 μM, de 50 μM a 750 μM, de 60 μM a 700 μM, de 70 μM a 650 μM, de 80 μM a 600 μM, de 90 μM a 550 μM, de 100 μM a 500 μM, de 110 μM a 450 μM, de 120 μM, a 400 μM, de 130 μM a 350 μM, de 140 μM a 300 μM, de 150 μM a 250 μM, de 160 μM a 200 μM, de 0,5 μM a 100 μM, de 1 μM a 90 μM, de 5 μM a 90 μM, de 10 μM a 85 μM, de 10 μM a 75 μM, de 20 μM a 85 μM, de 20 μM a 65 μM, de 30 μM a 70 μM, de 30 a 50 μM, de 40 μM a 80 μM ou de 40 μM a 50 μM, em que qualquer concentração que ocorre dentro das faixas citadas acima também pode servir como um endpoint para uma faixa.

[00031] Em um aspecto, acredita-se que o agente inibe ou reduz a atividade de uma enzima que afeta as propriedades do biomaterial (por exemplo, integridade da matriz extracelular). Assim, o agente pode atuar como um inibidor enzimático de um enzima específica associada à promoção de danos do biomaterial (por exemplo, danos na matriz extracelular). Neste aspecto, o inibidor enzimático pode ser usado nas faixas descritas acima para inibir ou reduzir a atividade de uma enzima e aumentar a retenção das propriedades de biomateriais (por exemplo, retenção de integridade da matriz extracelular). Em um aspecto, este inibidor enzimático pode incluir especificamente, porém sem limitações, um inibidor de metaloproteinase da matriz (Matrix Me-talloProteinase - MMP).

[00032] Por exemplo, em determinados aspectos, MMPs podem afetar negativamente as propriedades do biomaterial (por exemplo, a integridade da matriz extracelular), através de degradação enzimática de pelo menos uma porção do biomaterial e levar potencialmente à função ineficaz do biomaterial após armazenamento. Assim, em determinados aspectos, é desejável reduzir ou inibir a atividade da enzima MMP usando um inibidor de MMP. Por exemplo, o inibidor de MMP pode inibir ou reduzir a atividade enzimática de MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP19, MMP20, MMP21, MMP23A, MMP23B, MMP24, MMP25, MMP26, MMP27, MMP28 ou qualquer combinação das mesmas. Em determinados aspectos, o inibidor de MMP reduz ou inibe a atividade enzimática de pelo menos uma de MMP1, MMP 8, MMP9, MMP13 ou qualquer combinação das mesmas. Em determinados aspectos, o inibidor de MMP reduz ou inibe a atividade enzimática de pelo menos duas de MMP1, MMP 8, MMP9, MMP13 ou qualquer combinação das mesmas. Em determinados aspectos, o inibidor de MMP reduz ou inibe a atividade enzimática de pelo menos três de MMP1, MMP 8, MMP9, MMP13 ou qualquer combinação das mesmas. Além disso, o inibidor de MMP pode incluir, porém sem limitações, inibidores naturais ou sintéticos de metaloproteinase de matriz (Matrix MetalloProteinase - MMP). Inibidores sintéticos de MMP geralmente contêm um grupo de quelação que se liga firmemente ao átomo de zinco catalítico no centro ativo de uma MMP. Grupos de quelação comuns incluem hidroxamatos, carboxilatos, tióis e fosfini- las. Em determinados aspectos, hidroximatos são inibidores especial-mente potentes de MMPs em virtude de sua quelação bidentada de átomos de zinco. Queladores de zinco podem incluir dietilditiocarba- mato (DiEthylDiThioCarbamate - DEDTC) e ácido etilenodiaminotetra- cético de cálcio (EthyleneDiamine Tetraacetic Acid - EDTA). Em determinados aspectos, os inibidores descritos aqui podem incluir, porém sem limitações, doxiciclina, PCK3145 (um peptídeo sintético que cor- responde aos aminoácidos 31-45 da proteína 94 secretora da próstata), BB-2516 (Marimastat), BB-94 (isto é, batimastat, o qual é (2R,3S)- N4-Hidroxi-N1-[(1S)-2-(metilamino)-2-oxo-1-(fenilmetil)etil]-2-(2- metilpropil)-3-[(2-tieniltio)metil]butanodiamida), compostos que regulam inibidores teciduais endógenos des metaloproteinases (Tissue Inhibitors of MetalloProteinase - TIMPs) (por exemplo, compostos que regulam a síntese de TIMP) ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, foi mostrado que genipina, um composto natural, regula positivamente a expressão de TIMP-1. Sem pretender estar limitado pela teoria, a regulação positiva induzida por genipina de TIMP-1 reduz ou inibe a atividade de MMP-2 e, em determinados aspectos, a genipina pode ser usada para inibir ou reduzir a atividade da enzima MMP nos métodos e composições descritos aqui. Além disso, foi mostrado que sinalização ao fator-β de crescimento de transformação (TGF-β) desempenha um papel crucial no depósito de matriz extracelular, ao estimular a produção de colágeno e outras proteínas da matriz extracelu- lar e inibir a degradação da matriz pela regulação positiva do gene de TIMP-1. Portanto, os compostos que regulam a sinalização ao TGF-β e, em última análise, regulam a expressão de TIMP (por exemplo, expressão de TIMP-1) e inibição de MMP podem ser usados como um inibidor com os métodos descritos aqui.

[00033] Em determinados aspectos, o biomaterial é colocado em uma solução que inclui pelo menos um agente que reduz ou previne uma perda de integridade da matriz extracelular do biomaterial e pelo menos um ou mais agentes adicionais que promovem a retenção de viabilidade celular.

[00034] Após colocação do biomaterial em qualquer uma das soluções descritas acima, o biomaterial pode, então, ser armazenado. Por exemplo, após colocar o biomaterial na solução incluindo pelo menos um agente, esta mistura pode ser armazenada em várias temperaturas para promover ainda mais a preservação da matriz extracelular do biomaterial e prevenir ou reduzir ainda mais a perda de viabilidade do biomaterial. Por exemplo, estas temperaturas podem incluir, porém sem limitações, temperaturas hipotérmicas e temperaturas normotér- micas. Ao armazenar o biomaterial em temperaturas hipotérmicas, é preferido reduzir ou evitar a nucleação de gelo. Em determinados aspectos, as temperaturas hipotérmicas podem incluir temperaturas que variam de -25oC de +35oC, que variam de -15oC de +30oC, que variam de -5oC a +25oC, que variam de -5oC a +20oC, que variam de -5oC a +15oC, que variam de -5oC a +10oC, que variam de -5oC a +5oC,que variam de 0 oC a +10oC, que variam de 0 oC a +9 oC, que variam de 0 oC a +8 oC, que variam de 0 oC a +7 oC, que variam de 0 oC a +6 oC, que variam de 0 oC a +5 oC, que variam de 0 oC a +5 oC, que variam de 0 oC a +4 oC, que variam de 0 oC a +3 oC, que variam de 0 oC a +2 oC, que variam de +1 oC a +8 oC, que variam de +1 oC a +6 oC, que variam de +1 oC a +4 oC, que variam de +1 oC a +3 oC, que variam de +2 oC a +9 oC, que variam de +2 oC a +6 oC, que variam de +2 oC a +4 oC, que variam de +3 oC a +8 oC, que variam de +3 oC a +6 oC, que variam de +3 oC a +5 oC, que variam de +4 oC a +8 oC, que variam de +4 oC a +6 oC, que variam de +5 oC a +9 oC, que variam de +5 oC a +7 oC, que va riam de +6 oC a +10 oC, que variam de +6 oC a +8 oC, que variam de +7 oC a +9oC e que variam de +8 oC a +10 oC. Em determinados aspectos e, dependendo do biomaterial, temperaturas hipotérmicas podem ser preferidas. Por exemplo, se condrócitos e/ou cartilagem são o biomaterial, os condrócitos e/ou cartilagem podem ser preservados usando temperaturas hipotérmicas descritas acima. Por exemplo, se os condrócitos e/ou cartilagem são o biomaterial, temperaturas hipo- térmicas que variam, de preferência, entre -25 °C a +35 °C, mais preferivelmente na faixa de -5 °C a +25 °C e, mais preferivelmente, de 0 °C a + 10 °C. Em determinados aspectos, o biomaterial pode ser ar- mazenado por horas, dias, meses ou anos. Por exemplo, pode ser preferível armazenar condrócitos e/ou cartilagem (por exemplo, tampões de tecido de cartilagem) de algumas horas até três meses, de algumas horas até dois meses, de algumas horas até um mês, etc.

[00035] Em determinados aspectos, a solução sem produtos de origem animal do biomaterial armazenado pode ser substituído em vários intervalos de tempo desejados. Por exemplo, a solução sem produtos de origem animal pode ser substituída duas vezes por semana, uma vez por semana, a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, etc. durante todo o período de armazenamento do biomaterial e até que o biomaterial armazenado seja removido de armazenamento para uso posterior.

[00036] Quando de uso dos métodos e composições descritos acima, em determinados aspectos, o biomaterial inclui condrócitos e/ou cartilagem. Um dos objetivos da presente descrição inclui redução ou prevenção da perda de propriedades de material da matriz extracelular e otimizar a retenção de viabilidade celular do biomaterial durante armazenamento para uso posterior. Neste aspecto, os condrócitos e/ou cartilagem são colocados em uma solução que inclui pelo menos um agente que pelo menos reduz ou previne uma perda de integridade da matriz extracelular. Os condrócitos e/ou cartilagem podem ser colocados na solução de tipo extracelular, em que a solução de tipo extrace- lular inclui um inibidor de MMP em uma concentração conforme des-crito acima e esta mistura pode ser subsequentemente armazenada em uma temperatura hipotérmica que varia de -25 °C a + 30 °C por um período de tempo. Em outro aspecto, os condrócitos e/ou cartilagem pode ser colocado na solução de tipo intracelular, em que a solução de tipo intracelular inclui um inibidor de MMP em uma concentração conforme descrito acima e, em determinados aspectos, esta solução de tipo intracelular inclui ainda opcionalmente o coquetel de nutrientes descrito acima, para promover a retenção de viabilidade celular. Os condrócitos e/ou cartilagem colocados na solução de tipo intracelular são subsequentemente armazenados em uma temperatura hipotérmi- ca que varia de -25 °C a +25 °C por um período de tempo.

[00037] Em um aspecto, é desejável determinar qual solução reduz ou previne melhor uma perda das propriedades de biomateriais (por exemplo, integridade da matriz extracelular, incluindo permeabilidade da matriz extracelular, teor de água, viabilidade celular, etc.) durante armazenamento. Enquanto se determina ainda os métodos e composições que melhor reduzem ou previnem uma perda de propriedades de biomaterial, biomateriais idênticos podem ser colocados em duas soluções diferentes, conforme descrito acima (isto é, o tipo intracelular e o tipo extracelular). As duas soluções conterão um agente que reduz ou previne a perda de propriedades da matriz extracelular do biomaterial e a solução de tipo intracelular pode conter, opcionalmente, um coquetel de nutrientes. Após colocação dos biomateriais idênticos nas duas soluções diferentes, os biomateriais nas duas soluções diferentes serão armazenados de uma maneira similar (isto é, na mesma temperatura, durante o mesmo período de tempo, etc.). Após um período de tempo, os biomateriais idênticos que foram colocados em duas soluções diferentes podem ser removidos do armazenamento e as propriedades do biomaterial serão testadas (por exemplo, viabilidade celular, permeabilidade da matriz extracelular, etc.) e comparados para determinar quais métodos e composições reduzem ou previnem melhor a perda de viabilidade do biomaterial. Em alguns aspectos, os métodos e técnicas serão aplicados a condrócitos e/ou cartilagem para determinar ainda qual solução reduz ou previne melhor uma perda de integri-dade do biomaterial durante armazenamento.

[00038] Em algumas modalidades, a presente invenção se refere a uma composição compreendendo um biomaterial colocado em uma solução que inclui pelo menos um agente que reduz ou previne uma perda de propriedades do biomaterial. As propriedades do biomaterial podem compreender integridade da matriz extracelular, viabilidade celular ou uma combinação das mesmas. A integridade da matriz extra- celular pode incluir, por exemplo, permeabilidade da matriz extracelu- lar, teor de água da matriz extracelular, teor de glicosaminoglicanas da matriz extracelular ou qualquer combinação dos mesmos. O biomaterial pode incluir um tecido eucariota. Em algumas modalidades, o biomaterial pode compreender cartilagem. Em algumas modalidades, o biomaterial compreende condrócitos em uma matriz extracelular. Em algumas modalidades, o biomaterial compreende um material de enxerto com células viáveis. Em algumas modalidades, o biomaterial pode compreender um material de enxerto com células viáveis e uma matriz extracelular e em que o agente reduz ou previne a perda de integridade da matriz extracelular, viabilidade celular ou uma combinação das mesmas. Em tais modalidades, o material de enxerto pode ser cartilagem. Em modalidades, a solução pode ser uma solução sem produtos de origem animal, tal como uma solução que não inclui soro fetal bovino. Em algumas modalidades, a solução pode ser uma solução de tipo extracelular, tal como uma solução de tipo extracelular iso- tônica. Em algumas modalidades, a solução pode ser uma solução de tipo intracelular, tal como uma solução de tipo intracelular isotônica.

[00039] Em algumas modalidades, o pelo menos um agente que reduz ou previne uma perda de propriedades do biomaterial está presente na solução em uma concentração que varia de 100 pM a 1 mM. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente é um inibidor en- zimático, tal como um inibidor enzimático que minimiza uma atividade enzimática para reduzir ou impedir a perda de propriedades de bioma- teriais, em que as propriedades do biomaterial incluem integridade da matriz extracelular. Por exemplo, o inibidor enzimático pode inibir pelo menos uma das metaloproteinases da matriz, tal como uma ou mais de MMP 1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP 19, MMP20, MMP21, MMP23A, MMP23B, MMP24, MMP25, MMP26, MMP27, MMP28 ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o inibidor enzimático pode estar presente em uma concentração na solução varia de 1,0 nM a 1000 μM. Em algumas modalidades, o inibidor enzimático pode ser selecionado do grupo que consiste em doxiciclina, TIMPs, um composto que regula positivamente TIMPs endógenas, PCK3145, BB-2516 e BB-94.

[00040] Em algumas modalidades, a presente invenção se refere a uma composição compreendendo um biomaterial colocado em uma solução que inclui pelo menos um agente que reduz ou previne a perda de propriedades de biomateriais, em que a solução é uma solução sem produtos de origem animal que compreende um solução de tipo extracelular que é isotônica, em que o biomaterial compreende con- drócitos em uma matriz extracelular ou cartilagem e em que o pelo menos um agente compreende um inibidor enzimático de metalopro- teinase da matriz em uma concentração que varia de 1,0 nM a 1 mM. Em algumas modalidades, a presente invenção se refere a uma composição que compreende um biomaterial colocado em uma solução que inclui pelo menos um agente que reduz ou previne a perda de propriedades de biomateriais, em que a solução é uma solução sem produtos de origem animal que compreende uma solução de tipo intracelular que é isotônica, em que o biomaterial compreende condrócitos em uma matriz extracelular ou cartilagem e em que o pelo menos um agente compreende um inibidor enzimático de metaloproteinase da matriz em uma concentração que varia de 1,0 nM a 1 mM.

[00041] Em algumas modalidades, a presente invenção se refere a um método para armazenamento de um biomaterial compreendendo colocação de um biomaterial em uma solução que inclui pelo menos um agente que reduz ou previne uma perda de propriedades do biomaterial. Em algumas modalidades, o biomaterial pode compreender um tecido de eucariota artificial ou natural. Em algumas modalidades, o biomaterial pode compreender cartilagem. Em algumas modalidades, o biomaterial pode compreender condrócitos em uma matriz ex- tracelular. Em algumas modalidades, o biomaterial pode compreender um material de enxerto com células viáveis. Em algumas modalidades, o biomaterial pode compreender um material de enxerto com células viáveis e uma matriz extracelular intacta. Em algumas modalidades, o material de enxerto pode ser cartilagem. Em algumas modalidades, a solução pode ser uma solução sem produtos de origem animal. Em algumas modalidades, a solução pode ser uma solução de tipo extra- celular, tal como uma solução de tipo extracelular que é isotônica. Em algumas modalidades, a solução pode ser uma solução de tipo intracelular, tal como uma solução de tipo intracelular que é isotônica. Em algumas modalidades, a solução não inclui soro fetal bovino. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente pode estar presente na solução em uma concentração que varia de 1,0 nM a 1 mM. Em algumas modalidades, o pelo menos um agente pode ser um inibidor en- zimático, tal como um inibidor enzimático que minimiza uma atividade enzimática para reduzir ou impedir a perda de propriedades de bioma- teriais, em que as propriedades do biomaterial incluem integridade da matriz extracelular. Em algumas modalidades, o inibidor enzimático pode inibir pelo menos uma das metaloproteinases da matriz, tal como pelo menos uma das metaloproteinases da matriz selecionadas grupo que consiste em MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP19, MMP20, MMP21, MMP23A, MMP23B, MMP24, MMP25, MMP26, MMP27, MMP28 e qualquer combinação das mes- mas. Em algumas modalidades, o inibidor enzimático pode ser selecionado do grupo que consiste em doxiciclina, TIMPs, um composto que regula positivamente TIMPs endógenas, PCK3145, BB-2516 e BB-94. Em algumas modalidades, o método pode ainda compreender armazenamento do biomaterial colocado na solução em uma temperatura que varia entre -25 °C + 35 °C. Em algumas modalidades, a solução é uma solução sem produtos de origem animal que compreende uma solução de tipo extracelular, em que a solução de tipo extracelular é isotônica, em que o biomaterial é condrócitos em uma matriz extrace- lular ou cartilagem e em que o pelo menos um agente compreende um inibidor enzimático de metaloproteinase da matriz em uma concentração que varia de 1,0 nM a 1 mM. Em algumas modalidades, a solução é uma solução sem produtos de origem animal que compreende uma solução de tipo intracelular, em que a solução de tipo intracelular é iso- tônica, em que o biomaterial é condrócitos em uma matriz extracelular ou cartilagem e em que o pelo menos um agente compreende um inibidor enzimático de metaloproteinase da matriz em uma concentração que varia de 1,0 nM a 1 mM.

[00042] Em algumas modalidades, a presente invenção se refere a uma composição compreendendo uma solução sem produtos de origem animal, em que a solução compreende pelo menos um inibidor de metaloproteinase da matriz. Em algumas modalidades, a solução sem produtos de origem animal inclui um meio de cultura celular. Em algumas modalidades, a solução sem produtos de origem animal é uma solução de tipo intracelular que não inclui um meio de cultura celular. Em algumas modalidades, o inibidor de metaloproteinase da matriz reduz ou inibe a atividade enzimática de pelo menos uma de MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP19, MMP20, MMP21, MMP23A, MMP23B, MMP24, MMP25, MMP26, MMP27, MMP28 ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o pelo menos um inibidor de metaloproteinase da matriz reduz ou inibe a atividade enzimática de pelo menos uma de MMP1, MMP8, MMP9, MMP13 ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o pelo menos um inibidor de metaloproteinase da matriz reduz ou inibe a atividade enzimática de pelo menos duas de MMP1, MMP8, MMP9, MMP13 ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o pelo menos um inibidor de metaloproteinase da matriz reduz ou inibe a atividade enzimática de pelo menos três de MMP1, MMP8, MMP9, MMP13 ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o pelo menos um inibidor de metaloprotei- nase da matriz está presente na solução sem produtos de origem animal em concentrações que variam de 1,0 nM a 1000 μM. Em algumas modalidades, o pelo menos um inibidor de metaloproteinase da matriz está presente na solução sem produtos de origem animal em concentrações que variam de 100 nM a 100 μM. Em algumas modalidades, o pelo menos um inibidor de metaloproteinase da matriz está presente na solução sem produtos de origem animal em concentrações que varia de 1 pM a 30 μM. Em algumas modalidades, o pelo menos um inibidor de metaloproteinase da matriz está presente na solução sem produtos de origem animal em concentrações que variam de 100 pM a 20 μM. Em algumas modalidades, o pelo menos um inibidor de meta- loproteinase da matriz está presente na solução sem produtos de origem animal em concentrações que variam de 500 pM a 10 μM. Em algumas modalidades, o pelo menos um inibidor de metaloproteinase da matriz está presente na solução sem produtos de origem animal em concentrações que variam de 1 μM a 5 μM. Em algumas modalidades, o pelo menos um inibidor de metaloproteinase da matriz é selecionado do grupo que consiste em doxiciclina, TIMPs, um composto que regula positivamente TIMPs endógenas, PCK3145, BB-2516 e BB-94. Em algumas modalidades, o inibidor de metaloproteinase da matriz de pelo menos um é selecionado do grupo que consiste em doxiciclina, TIMPs, um composto que regula positivamente TIMPs endógenas, PCK3145, BB-2516 e BB-94. Em algumas modalidades, o inibidor de metaloproteinase da matriz é uma doxiciclina que varia de 1,0 nM a 1000 μM. Em algumas modalidades, a solução de tipo intracelular compreende ainda um coquetel de nutrientes que inclui pelo menos um dos seguintes componentes: D-glicose, glicina, cloridrato de L- arginina, cloridrato de L-cistina, L-glutamina, cloridrato de L-histidina, L isoleucina, L-leucina, cloridrato de L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina, colina, D- pantotenato de cálcio, ácido fólico, niacinamida, piridoxina, riboflavina, tiamina, inositol, qualquer um de seus sais ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a solução de tipo intracelular compreende ainda um coquetel de nutrientes que inclui pelo menos um dos seguintes componentes: D-glicose, glicina, cloridrato de L- arginina, cloridrato de L-cistina, L-glutamina, cloridrato de L-histidina, L isoleucina, L-leucina, cloridrato de L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina, colina, D- pantotenato de cálcio, ácido fólico, niacinamida, piridoxina, riboflavina, tiamina, inositol, qualquer um de seus sais ou qualquer combinação dos mesmos.

[00043] Em algumas modalidades, a presente invenção se refere a uma composição que compreende um biomaterial em uma solução que promove a retenção de integridade da matriz extracelular e a viabilidade celular, em que a solução inclui um inibidor enzimático. Em algumas modalidades, a presente invenção se refere a um método que compreende armazenamento de um biomaterial em temperaturas hi- potérmicas em uma solução de tipo intracelular com pelo menos um aditivo que promove a retenção de integridade da matriz extracelular e a viabilidade celular. Em algumas modalidades, o pelo menos um aditivo compreende um inibidor enzimático, um aminoácido, uma pluralidade de aminoácidos, um açúcar, uma pluralidade de açúcares, um lipídio, uma pluralidade de lipídios, uma vitamina, uma pluralidade de vitaminas ou qualquer combinação dos mesmos.

[00044] O precedente é adicionalmente ilustrado por meio de referência aos exemplos a seguir, os quais são apresentados para fins de ilustração e não se destinam a limitar o âmbito da presente descrição.

EXEMPLOS

[00045] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a fornecer àqueles versados na técnica uma divulgação e descrição completas de como as composições e os métodos descritos e reivindicados aqui são feitos e avaliados e se destinam a ser meramente exemplifi- cativos e não se destinam a limitar o âmbito daquilo que os inventores consideram como sua invenção. Esforços foram feitos esforços para assegurar precisão em relação aos números (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas erros e desvios normais deverão ser considerados. Salvo indicação em contrário, as partes são partes em peso, a temperatura é em °C ou está em temperatura ambiente e a pressão é a atmosférica ou próxima da mesma. Há numerosas variações e combinações das condições de reação, por exemplo, as concentrações dos componentes desejados, solventes, misturas de solventes, temperaturas, pressões e outras faixas de reação e condições que podem ser usadas para otimizar a pureza do produto e o rendimento obtido a partir do processo descrito.

Investigação Preliminar

[00046] As amostras foram armazenadas hipotermicamente em várias soluções (por exemplo, DMEM, SPS, PBS e UHK) durante 28 dias. Estas amostras foram subsequentemente removidas do armazenamento e a viabilidade e permeabilidade de cartilagem e condrócitos (isto é, integridade da matriz extracelular da cartilagem) foram avaliadas. Conforme mostrado na Figura 1, a viabilidade e proliferação de condrócitos foram avaliadas em amostras armazenadas durante 28 dias em quatro soluções diferentes. Células armazenadas em DMEM demonstraram viabilidade de condrócitos consideravelmente maior do que aquela das amostras armazenadas em SPS, PBS e UHK, conforme mostrado pela avaliação de viabilidade com o ensaio metabólico de redução de resazurina. Especificamente, os dados na Figura 1 são expressos como a RFU média/tampão de 6 mm ± 1se e * indica diferenças significativas em p <0,05. Foram observadas diferenças estatisticamente significativas na viabilidade celular entre células armazenadas em DMEM e as outras soluções começando no dia 2. DMEM alcançou níveis de controle após 4 dias em cultura. Os valores de controle não tratados são mostrados como a média (linha tracejada) ± 1se (hachurado) na parte superior da figura. O coeficiente de correlação (R2) entre estes resultados e a perda de permeabilidade da matriz da cartilagem (mostrada na Figura 3) aumentou ao longo de 4 dias de cultura tecidual após recuperação de armazenamento (Figura 1). Estes dados demonstram que meios de cultura complexos de tipo extracelu- lar (por exemplo, DMEM) são melhores para manutenção de funções de condrócitos (Figura 1), o que se correlaciona com a sobrevivência celular (isto é, viabilidade celular). Além disso, armazenamento destas amostras durante cerca de um mês em ambas as soluções de tipo intracelular (isto é, SPS e UHK) resultou em menos metabólitos durante proliferação pós-recuperação sob condições de cultura tecidual fisiológicas (Figura 1). Similarmente, armazenamento destas amostras em solução salina tamponada com fosfato (Phosphate-Buffered Saline - PBS), uma formulação extracelular sem nutrientes, também mostrou uma menor proliferação durante cultura tecidual após recuperação. Estas observações sugerem que os nutrientes são responsáveis pelo desempenho significativamente melhor (isto é, viabilidade de condróci- tos) dos tampões de cartilagem armazenados em DMEM (Figura 1).

[00047] Curiosamente, cartilagem armazenado em DMEM demonstrou a maior viabilidade celular (isto é, valores de viabilidade RFU), mas a menor condutividade elétrica (mS/cm) após 4 dias de recuperação pós-armazenamento. Embora este resultado indicasse que DMEM promoveu a maior viabilidade celular, este resultado também indica que a maior perda de permeabilidade da matriz da cartilagem ocorreu enquanto a cartilagem foi armazenada em DMEM. Esta observação levou à hipótese de que retenção de viabilidade celular resultou em liberação de materiais derivados de células que influenciaram a permeabilidade da matriz extracelular. Especificamente, estes estudos demonstraram uma forte correlação (R2 = 0,90) entre a retenção de viabilidade celular e a perda de permeabilidade da matriz da cartilagem (Figura 2). A Figura 2 mostra especificamente o coeficiente de correlação (R2) entre viabilidade celular elevada e perda de cartilagem e permeabilidade da matriz e a condutividade em virtude de armazenamento a frio em 4 soluções diferentes aumentou de 0,78 para 0,90 durante 4 dias de cultura tecidual após recuperação de armazenamento.

[00048] Com base nos dados das Figuras 1 e 2, a permeabilidade da cartilagem foi ainda avaliada em amostras armazenadas em diferentes soluções. As amostras armazenadas em DMEM durante 28 dias (isto é, DMEM 28) exibiram condutividade significativamente menor do que as amostras armazenadas em outras soluções (isto é, PBS, UHK e SPS). A Figura 3 demonstra o impacto de armazenamento hi- potérmico sobre a permeabilidade da cartilagem avaliado medindo-se a condutividade elétrica em solução salina hipotônica. Os dados são expressos como a média ± 1se e * indica diferenças significativas em p <0,05 entre um controle de DMEM no dia um comparado com grupos de armazenamento após 28 dias, n = 5 amostras por doador suíno. O grupo com DMEM 28 dias foi significativamente menor em quatro experimentos independentes. Assim, estes dados demonstram ainda a correlação entre a viabilidade celular elevada e baixa permeabilidade quando a cartilagem foi armazenada em DMEM. Exemplos Exemplo 1: Avaliação do impacto de inibição de metaloproteinase da matriz (MMP) sobre as propriedades da cartilagem durante ar-mazenamento em solução de tipo extracelular

[00049] Meios de cultura sem produto de origem animal são formulados com concentrações variadas de um inibidor de MMP (por exemplo, doxiciclina). Propriedades de biomateriais, incluindo viabilidade de condrócitos, química da cartilagem, permeabilidade e outras propriedades de biomateriais, são comparadas ao longo de períodos de armazenamento hipotérmicos de pelo menos um mês. Testagem de biomaterial é realizada usando métodos estabelecidos [Yao, 2002; Gu, 2004; Brockbank, 2011 (vide lista de referência abaixo)].

[00050] A doxiciclina é usada clinicamente para o tratamento de doença periodontal e é o único inibidor de MMP amplamente disponível para uso clínico. Foi mostrado que a doxiciclina tem efeitos in vivo benéficos sobre a cartilagem, tais como redução de atividade de MMP 8, 9 e 13, em modelos animais e seres humanos. Além disso, estudos in vitro sugerem que a doxiciclina pode inibir a síntese de MMP, bem como a atividade das MMPs.

[00051] Inibidores de MMP adicionais incluindo, por exemplo, TIMPs, PCK3145, um peptídeo sintético que corresponde aos aminoá- cidos 31-45 da proteína 94 secretora da próstata e Marimastat (BB- 2516), também podem ser eficazes. Tanto PCK3145 quanto Marimas- tat foram bem tolerados em ensaios clínicos em fase inicial. Também é provável que troca da solução em intervalos semanais não seja reque- rida, contudo, pode ser necessário explorar a proporção de massa de cartilagem para volume de solução. Altas concentrações de doxiciclina podem ser necessárias para armazenamento a longo prazo sem troca da solução.

Design Experimental:

[00052] Tampões de cartilagem suína são obtidos e estes tampões são armazenados a 4 °C (condições hipotérmicas) em DMEM sem produtos de origem animal suplementado com doxiciclina a 0 a 300 μM . Em determinadas amostras, o meio é trocado semanalmente, conforme em estudos anteriores (Figuras 1-3) e, para outras amostras, os meios não são trocados durante armazenamento. Estes dois conjuntos de amostras (isto é, (1) meios trocados semanalmente e (2) nenhuma troca de meios) são comparados. Em determinados aspectos, é desejável minimizar a necessidade de manipulação de aloenxertos uma vez que eles são colocados em armazenamento.

Métodos:

[00053] Joelhos de porco são adquiridos post-mortem de porcos Yorkshire domésticos adultos cruzados em fazenda (25 kg). Após obtenção dos joelhos, os joelhos são colocados em sacos zip-lock com solução de iodo e transportados sobre gelo para o laboratório para dissecção asséptica. Tampões em formato de disco de cartilagem da cabeça do fêmur são preparados usando perfuratrizes estéreis. Grupos de 5 tampoes são colocados em solução de armazenamento em recipientes esterilizados com e sem troca semanal de meios durante 12 meses.

Atividade Metabólica:

[00054] Um ensaio de redução de rezasurina é usado para avaliar a atividade metabólica de tampões de cartilagem de controle e tratados [O'Brien, 2000; Brockbank, 2011]. Tampões de tecido (n = 5/experimento/doador) foram incubados em 2 ml de meio de cultura de DMEM + FBS a 10% durante uma hora para equilibrar, seguido pela adição de uma solução de ensaio de redução de resazurina a 20% sob condições convencionais de cultura de células durante 3 horas. O reagente de ensaio de redução de resazurina é um indicador fluorimétrico com base em detecção de atividade metabólica. A quantidade de fluorescência é medida em duplicata pelo leitor de microplacas em multi- modo em um comprimento de onda de excitação de 544 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm. Esta avaliação é executada diariamente durante vários dias para permitir caracterização de células reaquecidas em tecidos (Figura 2). A resazurina não é citotóxi- ca na concentração empregada, de modo que as mesmas amostras de tecido podem ser testadas em múltiplas ocasiões. Os resultados pouco depois de reaquecimento (dia 0) demonstram viabilidade celular; após 1-2 dias, uma diminuição indica morte celular em virtude de apoptose e aumentos indicam proliferação celular. Os tampões tecidu- ais são, então, secos para se obter o peso seco. Para cada grupo experimental e controles não tratados, a atividade metabólica celular é expressa como unidades de fluorescência relativas (Relative Fluorescence Unit -RFU) por mg de peso seco ou por tampão tecidual.

Outros Métodos de Avaliação de Viabilidade:

[00055] O ensaio metabólico descrito acima é o método de avaliação de viabilidade primário; no entanto, ensaios de avaliação de viabilidade adicionais podem ser realizados. Por exemplo, a viabilidade celular pode ser adicionalmente determinada por meio de coloração vi- va/morta fluorescente de células. As células também podem ser avaliadas após liberação de tampões teciduais por meio de digestão enzi- mática e avaliadas usando o ensaio de exclusão de azul de tripano com base em integridade da membrana [Brockbank, 2011]. As células também podem ser cultivadas em DMEM durante pelo menos uma semana para verificar se as células, condrócitos, são realmente capa- zes de aderir e proliferar in vitro. Contagens de células e análise de imagem digital podem ser realizadas nas culturas.

Teor de Água, Proteoglicanas e Colágeno:

[00056] Após medições das propriedades do material, as amostras podem ser liofilizadas para determinar os teores de água (porosidade), proteoglicanas (S-GAG) e colágeno (hidroxiprolina). As amostras são analisadas quanto à porosidade com base no princípio de Arquimedes [Gu, 2004], S-GAG usando um método descrito por Farndale (1982) e, para o teor de hidroxiprolina, usando o método de Bergman e Loxley (1970). Condutividade Elétrica:

[00057] A condutividade tecidual é medida em condição de escoamento de fluido zero usando um aparelho padrão [Gu 2002a; 2002b], o qual consiste em eletrodos de corrente e tensão colocados em torno de uma câmara de Plexiglas contendo cada espécime. Empregando uma combinação de um método com 4 fios e um medidor Keithley Source, a resistência (R) através da amostra é medida em uma densidade de corrente muito baixa de 0,015 mA/cm2. Um micrometro de detecção de corrente é usado para medir as dimensões do espécime, a condutividade elétrica correspondente é gerada usando a equação a seguir:

onde A é a área da seção transversal e h é a espessura da amostra tecidual. As medições de condutividade elétrica são realizadas em qualquer solução salina tamponada com fosfato isotônica ou hipotôni- ca (PBS, pH de 7,4) em temperatura ambiente (22 °C).

Difusividade de Soluto:

[00058] Sob uma condição de escoamento de fluido zero, a condu- tividade elétrica (x) de um tecido em solução de NaCl está relacionada às difusividades de Na+ e Cl- (Dα, α = +, - ) por Maroudas (1968):

em que Fc é a constante de Faraday, 0 w é a fração volumétrica da água (porosidade), c+ é a concentração de cátions (Na+) e c- é a concentração de ânions (Cl-), R é a constante dos gases, T é a temperatura. Os valores de c+ e c- podem ser calculados usando a equação de Donnan [Maroudas, 1975]:

[00059] Aqui cF é a densidade de carga fixa (Fixed Charge Density - FCD) do tecido e c* é a concentração de NaCl da solução de banho. A FCD do tecido é determinada a partir do teor de proteoglicanas medido. Usando os dados da condutividade elétrica, FCD, porosidade e a concentração da solução de banho, as difusividades iônicas podem ser calculadas a partir da equação 3. Este método pode ser usado para o estudo de tecidos de cartilagem bovina e suína [Gu, 2004; Jackson, 2006]. Módulo Agregado Compressivo e Permeabilidade Hidráulica:

[00060] As propriedades mecânicas das amostras de cartilagem são determinadas usando o teste fluência por compressão confinada. O teste é aplicado na direção axial de suporte de carga em um Analisador Mecânico Dinâmico (Q800, TA Instruments, New Castle, DE). O espécime é deixado equilibrar em PBS em sua altura inicial medida sob uma carga compressiva tarada em minutos em uma câmara confinada (Figura 4). Após equilíbrio, o estresse de intumescimento é registrado na altura inicial e o espécime é submetido a uma tensão compressiva constante durante três horas. Dados de fluência são adaptados para a curva à teoria bifásica para obter o módulo agregado HA e a permeabilidade hidráulica [Yao, 2002].

Dados Experimentais

[00061] Em um experimento de armazenamento a frio usando os métodos descritos imediatamente acima no Exemplo 1, 45 pedaços de tampões de cartilagem suína foram coletados de um porco. 20 pedaços de tampões de cartilagem foram incluídos no teste de viabilidade (Figura 5). Neste teste de viabilidade, foram usados quatro tampões por concentração de doxiciclina. Outros 25 tampões foram usados para ensaio mecânico (Figura 6).

[00062] Para os dados mostrados na Figura 5, cada tampão tinha 6 mm de diâmetro. Uma forma injetável de doxiciclina (DOXY 100™) foi obtida da APP Pharmaceuticals, LLC, (Schaumberg, IL) com um peso molecular de 1.025,89 daltons. As soluções de armazenamento continham DMEM, 1,44 mg/ml de ácido ascórbico, 0,9 mg/ml de manitol e diferentes concentrações de doxiciclina (0 μM, 10 μM, 30 μM, 100 μM, 300 μM). A temperatura de armazenamento foi de 4°C. Conforme mostrado na Figura 5, os ensaios de viabilidade foram rastreados da semana 0 até a semana 4. Conforme mostrado na Figura 6, o ensaio mecânico foi realizado apenas na semana 4.

[00063] Avaliação de Viabilidade: atividade metabólica de condró- citos foi avaliada através do método de redução fr resazurina. O ensaio de redução de resazurina, comumente conhecido como o ensaio alamarBlue, incorpora um indicador de oxidação-redução de viabilidade fluorométrica solúvel em água (REDOX), que detecta a atividade metabólica tanto pela fluorescência quanto pela alteração de cor em resposta à redução química do meio de crescimento. Células metabo- licamente ativas reduzem a resazurina em resorufina fluorescente. Amostras de tecido de controle frescas e hipotermicamente armazenadas foram colocadas sob condições de cultura de 37 °C durante 1 hora para permitir juste às condições de cultura tecidual em DMEM mais FBS a 10%. Os tecidos foram, então, incubados durante três ho- ras com a solução de trabalho de resazurina, após o que alíquotas de meio foram colocadas em cavidades de placas de microtitulação e lidas em um espectrofluorômetro para placa de microtitulação em um comprimento de onda de 590 nm. Os dados são expressos como a média de unidades de fluorescência relativa ± 1se.

[00064] Testagem de Biomateriais: tampões de cartilagem também foram avaliados quanto à permeabilidade medindo-se sua condu- tividade elétrica para determinar se as características da matriz da cartilagem seriam alteradas durante armazenamento. As amostras foram preparadas cortando um tampão cilíndrico de 5 mm usando um trépano corneal a partir dos discos de cartilagem de 6 mm de diâmetro armazenados. As amostras foram testadas após 0 e 1 mês de armazenamento, as superfícies de cartilagem foram aparadas manualmente usando uma lâmina afiada. Então, a condutividade foi testada em solução salina hipotônica. A altura de cada amostra foi medida com um micrômetro de detecção de corrente elétrica. Todas as medições de condutividade elétrica foram realizadas em solução salina hipotônica em temperatura ambiente (22 °C). A condutividade elétrica é uma propriedade material de tecidos biológicos. Seu valor está relacionado à difusividade de pequenos íons no interior do tecido, a qual depende da composição e estrutura do tecido.

[00065] Métodos Estatísticos: ANOVA One-way (p <0,05 sendo considerado como significativo) foi realizada para determinar diferenças nos valores médios das unidades de fluorescência celular e con- dutividade elétrica.

[00066] A viabilidade foi influenciada pela presença de doxiciclina de uma maneira dependente da dose. Conforme mostrado na Figura 5, o grupo de 0 μM (isto é, o grupo com sem doxiciclina adicionada) era significativamente mais elevado do que todos os grupos de tratamento em todos os pontos de tempo (p <0,05). Conforme ainda mos- trado na Figura 5, o grupo de 10 μM foi significativamente mais elevado do que todos os outros grupos nas semanas 2-4 (Figura 5; p <0,05). Estes dados são expressos como a média ± 1 erro padrão da média, n = 4, usando análise de variância One-Way (ANOVA).

[00067] Conforme mostrado na Figura 6, a condutividade elétrica foi menor no grupo de 0 μM em um mês e todos os grupos com doxicicli- na (isto é, 10 μM , 30 μM, 100 μM e 300 μM) foram similares ao grupo no tempo zero (Figura 6; p <0,05). Estes dados são expressos como a média ± 1 erro padrão da média, n = 5, usando análise de variância One-Way (ANOVA).

[00068] Os resultados deste experimento com doxiciclina demonstram que inibição de MMPs promove a retenção de condutividade elétrica e permeabilidade na presença de células viáveis. Por exemplo, isto é demonstrado pela viabilidade do grupo de 10 μM (Figura 5) e os resultados de condutividade (Figura 6). Exemplo 2: Determinação do impacto dos principais componentes do meio de cultura sobre a cartilagem armazenada em uma solução hipotérmica de tipo intracelular.

[00069] Etapa I: solução de armazenamento hipotérmica sem produtos de origem animal é formulada com ou sem os nutrientes primários em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM).

[00070] Etapa II: Várias concentrações de doxiciclina são adicionadas à nova formulação de armazenamento de tipo intracelular do Exemplo 2 para minimizar a atividade de MMP. Design Experimental:

[00071] Etapa I: Um coquetel de nutrientes com base na formulação DMEM é adicionado à solução de Belzer, a formulação de preservação de órgãos clínica padrão comercializada como SPS-1 (Organ Recovery Systems, Itasca, IL). O coquetel de nutrientes consiste em D- glicose e aminoácidos (glicina, cloridrato de L-arginina, L-cistina 2HCl, L-glutamina, L-histidina H2O-cloridrato, L-isoleucina, L-leucina, clori- drato de L-lisina, L- metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L- triptofano, L-tirosina, sal dissódico di-hidratado e L-valina), em concentrações usadas para DMEM (Mediatech, Manassas, VA, Cat # 10-014CM). A formulação modificada é comparada com a formulação original.

[00072] Etapa II: Doxiciclina a 0-300 μM é adicionada à solução de Belzer modificada. A viabilidade celular, propriedades do biomaterial e bioquímica da cartilagem são avaliadas em tampões de cartilagem ao longo de um período de pelo menos um mês de armazenamento hipo- térmico. A melhor dose de doxiciclina é escolhida para comparação com a solução extracelular otimizada do Exemplo 1. O esquema de troca de solução também é avaliado, conforme descrito no Exemplo 1.

[00073] Solução de Belzer (SPS-1) e doxiciclina são selecionadas porque elas são produtos aprovados pelo FDA.

[00074] Etapa I: Os maiores valores de viabilidade obtidos empregando DMEM nos dados preliminares (Figura 2) são, muito provavelmente, em virtude dos componentes nutricionais que sustentam o baixo nível de metabolismo (<10%) permitido a 4 °C durante armazenamento hipotérmico.

[00075] Etapa II: Esta etapa pode ser útil porque síntese de MMP aumentada pode ocorrer quando a viabilidade dos condrócitos é aprimorada por suplementação de nutrientes na Etapa I. Exemplo 3: Comparação de Soluções de Tipo Extracelular e de Tipo Intracelular Design Experimental:

[00076] Propriedades de tampões de cartilagem são avaliadas após armazenamento nas formulações de preservação de tipo extracelular e de tipo intracelular descritas nos Exemplos 1 e 2. Tampões são avaliados durante um período de 2 meses (por exemplo, tempo 0 e após 1, 4 e 8 semanas de armazenamento) e a expressão gênica é avaliada, além dos ensaios usados nos exemplos anteriores. Duas amostras são avaliadas em cada ponto de tempo para cada grupo e o experimento é repetido quatro vezes (7 grupos x 2 réplicas x 4 experimentos = 56 amostras).

[00077] A finalidade deste exemplo é comparar a solução de tipo extracelular do Exemplo 1 com a solução de tipo intracelular do Exemplo 2. Além dos ensaios de viabilidade celular e ECM descritos acima, análise de expressão gênica é realizada para assegurar que os con- drócitos estão expressando genes pró-cartilagem apropriados em relação aos condrócitos na cartilagem não tratada fresca. Métodos: Expressão Gênica:

[00078] As amostras são congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C. O RNA celular total foi isolado (kit RNeasy, Qiagen, CA), transcrito de forma reversa para cDNA (kit Omniscript RT, Qiagen, CA, avaliado quanto à qualidade e as alterações na expressão gênica em virtude de armazenamento são quantificadas usando PCR em tempo real. Retenção de fenótipo (e/ou perda de fe- nótipo) é avaliada por análise de expressão de Sox9, agrecana, colá- geno de tipo II (versus desdiferenciação de colágeno de tipo I marcador), matriz oligomérica de cartilagem, marcador de reabsorção de ECM (MMP-9) mais proteína e genes marcadores hipertróficos (colá- geno de tipo 10 e fosfatase alcalina).

[00079] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados conforme normalmente entendidos por aqueles versados na técnica à qual a in-venção descrita pertence.

[00080] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção descri- tas aqui. Tais equivalentes se destinam a ser abrangidos pelas reivin-dicações. Referências: Citações na lista de referências a seguir são incorporadas na parte pertinente por referência durante pelo menos os motivos citados no texto. Allen RT, Robertson CM, Pennock AT, Bugbee WD, Harwood FL, Wong VW, Chen AC, Sah RL, Amiel D: Analysis of stored osteochondral allografts at the time of surgical implantation. Am J Sports Med 2005;33:1479-1484. American Academy of Orthopaedic Surgeons; The Burden of Musculoskeletal Diseases in the United States. Rosemont, IL: United States Bone and Joint Decade, 2008. Bakay A, Csonge L, Papp G, Fekete L: Osteochondral re-surfacing of the knee joint with allograft: clinical analysis of 33 cases. Int Orthop 1998;22:277-281. 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Claims (5)

1. Composição contendo um biomaterial colocado em uma solução que contém pelo menos um agente que reduz ou previne uma perda de propriedades do biomaterial, caracterizada pelo fato de que: a solução é uma solução sem produtos de origem animal, contendo Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), o biomaterial consiste em condrócitos numa matriz extrace- lular ou cartilagem e o pelo menos um agente consiste em doxiciclina presente em uma concentração de 10 μM a 30 μM , e em que as referidas pro-priedades do biomaterial são a viabilidade celular e a integridade da matriz extracelular, a referida integridade da matriz extracelular incluindo permeabilidade da matriz extracelular.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zada pelo fato de que a solução sem produtos de origem animal é iso- tônica.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca-racterizada pelo fato de que a doxiciclina é um inibidor enzimático ou uma metaloproteinase da matriz selecionada do grupo que consiste em MMP 1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP15 , MMP16, MMP17, MMP19, MMP20, MMP21, MMP23A, MMP23B, MMP24, MMP25, MMP26, MMP27 e MMP28.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a doxiciclina está presente em uma concentração de 10 μM.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a solução contém pelo menos um dos seguintes componentes selecionados do grupo que consiste em: D-glicose, glicina, cloridrato de L-arginina, cloridrato de L- cistina, L-glutamina, cloridrato de L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, cloridrato de L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina, colina, D-pantotenato de cálcio, ácido fólico, niacinamida, piridoxina, riboflavina, tiamina, inositol, qualquer sal dos mesmos ou qualquer combinação dos mesmos.

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