ES2913155T3 - Procedimiento para el almacenamiento hipotérmico de tejido placentario - Google Patents

Abstract

Procedimiento de almacenamiento de tejido ex vivo que comprende almacenar de manera hipotérmica una membrana placentaria a una temperatura entre 0 °C y 20 °C en una solución que incluye medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), tampón HEPES para mantener el pH fisiológico y albúmina de plasma humano a una concentración de 2,0 g/l a 3,0 g/l.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para el almacenamiento hipotérmico de tejido placentario

Sector de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de almacenamiento de tejido ex vivo que comprende almacenar de manera hipotérmica una membrana placentaria a una temperatura entre 0 °C y 20 °C en una solución que incluye medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), tampón HEPES para mantener el pH fisiológico y albúmina de plasma humano a una concentración de 2,0 g/l a 3,0 g/l.

Estado de la técnica anterior

La placenta rodea a un feto durante la gestación y está compuesta, entre otros tejidos, por una capa amniótica interna que mira hacia el feto y una cubierta externa generalmente inelástica, o corion. La placenta ancla al feto a la pared uterina, lo que permite que se produzca la absorción de nutrientes, la eliminación de residuos y el intercambio de gases a través del suministro de sangre de la madre. Además, la placenta protege al feto de una respuesta inmunitaria de la madre. De la placenta, se puede separar de los otros tejidos una membrana placentaria intacta que comprende las capas de amnios y corion. El amnios es la capa más interna de la placenta y consiste en una membrana basal gruesa y una matriz estromal avascular.

Los médicos han utilizado membrana placentaria intacta, que comprende una capa de amnios y una capa de corion, en procedimientos médicos ya desde 1910 [Davis J.S., John Hopkins Med J, 15:307 (1910)]. La membrana amniótica, cuando se separa de la membrana placentaria intacta, también se puede utilizar por sus propiedades clínicas beneficiosas [Niknejad H., et al. Eur Cell Mater, 15:88-99 (2008)]. Determinadas características de la membrana placentaria la hacen atractiva para su utilización por parte de la comunidad médica. Entre estas características se incluyen, pero sin limitarse a las mismas: sus propiedades antiadherentes, antimicrobianas y antiinflamatorias; protección de heridas; su capacidad para inducir la epitelización; y reducción del dolor [Mermet I., et al. Wound Rep Regen, 15:459 (2007)].

Otras utilizaciones de la membrana placentaria incluyen su utilización para andamiaje o para proporcionar estructura para el nuevo crecimiento de células y tejidos. Una ventaja importante de la membrana placentaria en el andamiaje es que el amnios contiene una capa epitelial. Las células epiteliales derivadas de esta capa son similares a las células madre, lo que permite que las células se diferencien en células del tipo que las rodea. Las células multipotentes similares a las células madre también están contenidas dentro del cuerpo de la membrana amniótica. Además, la membrana amniótica contiene diversos factores de crecimiento y tróficos, tales como factores de crecimiento epidérmico, similar a la insulina y de fibroblastos, así como concentraciones elevadas de ácido hialurónico, que pueden ser beneficiosos para evitar la deformidad cicatricial y la inflamación y ayudar a la cicatrización. De este modo, la membrana placentaria ofrece una amplia variedad de utilizaciones médicas beneficiosas.

Las terapias basadas en células tienen un potencial considerable para la reparación y regeneración de tejidos. La adición de un andamio a estas terapias basadas en células ha producido mejores resultados [Krishnamurithy G., et al. J Biomed Mater Res Parte A, 99A:500-506 (2011)]. Idealmente, el material utilizado para el andamio será biocompatible, de manera que provoque poca o ninguna respuesta inmunitaria, se biodegrade y esté disponible en cantidades suficientes para que sea práctico. Aunque la membrana placentaria se ha identificado durante mucho tiempo como un material que potencialmente cumple esta función en la clínica, los esfuerzos se han limitado a estudios in vitro, técnicas in vivo poco prácticas o han producido resultados menos que óptimos. Además, las condiciones en las que se utiliza el andamio pueden tener un efecto drástico sobre la eficacia terapéutica.

Se han estudiado en la bibliografía y se han utilizado clínicamente varios productos de membrana placentaria, que se dividen en dos categorías principales. La primera categoría implica la utilización de la membrana intacta, ya sea fresca, seca, liofilizada, crioconservada o conservada en glicerol o alcohol. En esta formulación, la membrana es útil para una serie de propósitos, pero no es adecuada para otros, tales como aplicaciones que requieren inyección o el relleno de un espacio que no se ajusta a la forma plana delgada de la propia membrana.

La segunda categoría implica la molienda, pulverización y/u homogeneización de la membrana en partículas pequeñas que, a continuación, pueden resuspenderse en solución. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en las Patentes de US 11/528,902, 11/528,980, 11/529,658 y 11/535,924. Esta molienda se puede realizar en seco o en húmedo, y la temperatura durante la molienda puede controlarse o no, tal como en el caso de la criomolienda. Los productos producidos utilizando este procedimiento son útiles para una serie de aplicaciones y pueden inyectarse en las condiciones apropiadas. Sin embargo, presentan varias deficiencias para determinadas aplicaciones. En primer lugar, las células contenidas en las membranas placentarias serán destruidas durante el proceso de molienda. En segundo lugar, las proteínas y los factores de crecimiento de la membrana pueden filtrarse o perderse durante este proceso, que incluye cualquier lavado posterior u otro tratamiento de las partículas molidas. De hecho, la eliminación de factores potencialmente angiogénicos, tales como los factores de crecimiento, puede ser un objetivo de este tipo de procesamiento. En tercer lugar, la resuspensión de estas partículas pequeñas en soluciones fisiológicas habituales, tales como solución salina, da lugar a un fluido de flujo libre con baja viscosidad. Tras la inyección o colocación, este fluido puede disiparse en lugar de permanecer en el lugar de tratamiento deseado. En cuarto lugar, los fragmentos resultantes pueden no ser lo suficientemente grandes para permitir el injerto y la proliferación celular, si así se desea.

Sin embargo, se ha demostrado que las preparaciones de membrana amniótica tienen una bioactividad beneficiosa significativa. Muchas de las células contenidas en estas membranas son multipotentes o pluripotentes. Las membranas también contienen una fuente rica en factores de crecimiento, así como ácido hialurónico, colágeno y otros factores, que se ha demostrado que favorecen la cicatrización de los tejidos. Se ha demostrado que la membrana amniótica atrae y estimula la proliferación de células implicadas en la cicatrización de tejidos, tales como las células madre mesenquimatosas (MSC, mesenchymal stem cells) y los fibroblastos.

El cartílago articular, ubicado en los extremos articulares de los huesos en las articulaciones de todo el cuerpo, está compuesto por cartílago hialino y contiene relativamente pocos condrocitos que están incrustados en materiales de la matriz extracelular, tales como el colágeno tipo II y los proteoglicanos [Moriya T., et al. J Orthop Sci, 12:265-273 (2007)]. El cartílago articular tiene una capacidad limitada de autorreparación, en parte debido a las características avasculares del cartílago, lo que plantea un desafío significativo para el tratamiento de lesiones y enfermedades articulares. Por lo tanto, la reparación de defectos del cartílago en humanos puede ser una tarea difícil y existen múltiples opciones para que el cirujano trate tales defectos. El cirujano puede optar por influir en el defecto con microfractura, abrasión u otras técnicas de estimulación de la médula, que estimulan el sangrado del hueso subcondral y la generación de un coágulo y, en última instancia, un parche de fibrocartílago que rellena el defecto. Otras opciones permiten el relleno del defecto con condrocitos de fuentes variables, de origen tanto de autoinjerto como de aloinjerto.

Una ventaja clave de las técnicas de estimulación de la médula sobre la mayoría de las otras terapias disponibles es que la estimulación de la médula puede llevarse a cabo de manera artroscópica utilizando una técnica quirúrgica relativamente simple, con una alteración mínima de la articulación y los tejidos circundantes [Mithoefer K., et al. J Bone Joint Surg Am, 88(Supl. 1 Pt 2):294-304 (2006)]. La técnica también es rentable. Por lo tanto, se han realizado esfuerzos para mejorar el resultado de las técnicas de estimulación de la médula. El cartílago molido, ya sea de autoinjerto o de aloinjerto (por ejemplo, el producto disponible en el mercado como BioCartilage), se ha propuesto para este propósito [Xing L., et al. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 21:1770-1776 (2013)]. Sin embargo, la utilización de cartílago de autoinjerto requiere etapas quirúrgicas adicionales y morbilidad del sitio donante. Además, la utilización de cartílago de aloinjerto no ha producido resultados satisfactorios.

Los tratamientos actuales, que incluyen terapias basadas en células, han dado lugar a la generación de tejido fibrocartilaginoso indeseable en lugar de cartílago hialino [Díaz-Prado S.M., et al. BIOMEDICAL ENGINEERiNg , TRENDS, RESEARCH, AND TECHNOLOGIES, págs. 193-216 (2011)]. Por tanto, sigue existiendo una necesidad clínica significativa de terapias capaces de reparar el cartílago articular dañado mediante la regeneración específica del cartílago de tipo hialino.

Existe una necesidad similar de soluciones para la reparación de defectos meniscales. Un menisco es una estructura fibrocartilaginosa en forma de media luna que, a diferencia de los discos articulares, solo divide parcialmente una cavidad articular. En los seres humanos están presentes en las articulaciones de la rodilla, acromioclavicular, esternoclavicular y temporomandibular. En general, el término “menisco” se refiere al cartílago de la rodilla, ya sea al menisco lateral o medial. Ambos son tejidos cartilaginosos que proporcionan integridad estructural a la rodilla cuando se somete a tensión y torsión. Son cóncavos por la parte superior y planos por la parte inferior, y se articulan con la tibia. Están unidos a las pequeñas depresiones (fosas) entre los cóndilos de la tibia (fosa intercondílea), y hacia el centro están sueltos y su forma se estrecha hacia una repisa delgada. El flujo sanguíneo del menisco es desde la periferia hasta el menisco central. El flujo sanguíneo disminuye con la edad y el menisco central es avascular en la edad adulta, lo que conduce a tasas de curación muy bajas. Los defectos meniscales se reparan utilizando suturas u otros procedimientos de fijación. Las meniscectomías parciales también se utilizan habitualmente [Kon E., et al. Tissue Eng Parte A, 18(15-16):1573-1582 (2012); Florentino G., et al. Arthrosc Tech, 2(4):e355-e359 (2013); Scotti C., et al. Eur Cell Mater, 26:150-170 (2013)].

Otro problema relacionado implica la regeneración del disco intervertebral humano. Los discos intervertebrales son tejidos fibrocartilaginosos que ocupan el espacio entre los cuerpos vertebrales de la columna vertebral. Transmiten fuerzas de una vértebra a la siguiente, al tiempo que permiten la movilidad de la columna. Las propiedades estructurales del disco dependen en gran medida de su capacidad para atraer y retener agua. Los proteoglicanos en el disco ejercen una “presión de hinchamiento” osmótica que resiste las cargas de compresión. La degeneración del disco intervertebral es un proceso fisiológico que es característico del envejecimiento en seres humanos. Con la edad, el disco sufre una serie de cambios, el más destacado es la pérdida del contenido de proteoglicanos que da lugar a una presión osmótica reducida y a una reducción en la altura del disco y la capacidad de transmitir cargas [Park S.H., et al., Tissue Eng Parte A, 18(5-6):447-458 (2012)]. La degeneración del disco es una causa importante y directa de las afecciones de la columna que causan la mayoría de los dolores de cuello y espalda. Como es el caso de las células de cartílago relacionadas, los componentes de la membrana amniótica pueden promover la curación y recuperación del disco intervertebral y las células asociadas.

El almacenamiento y transporte de membranas placentarias están sujetos a numerosos esquemas regulatorios. Por ejemplo, las membranas deben almacenarse durante un período de tiempo específico antes de su utilización en un sujeto (es decir, catorce días antes de la utilización), tiempo durante el cual se analiza periódicamente para detectar la contaminación por bacterias, virus y otros tipos de células no placentarias. El retraso adicional está provocado por el transporte de la membrana al centro médico apropiado. Este retraso puede reducir la viabilidad de las células de la membrana placentaria. Para mantener la viabilidad celular dentro de la membrana amniótica, debe almacenarse y transportarse en medios de cultivo celular que contengan los suplementos adecuados. Estos suplementos deben seleccionarse para maximizar la viabilidad celular y alargar el tiempo en el que el tejido puede almacenarse de manera fiable. Los medios de almacenamiento de membrana deben cumplir con los estándares clínicos existentes actualmente para garantizar la seguridad de los productos y asegurar el cumplimiento normativo. Por lo tanto, los medios deben estar definidos químicamente/cumplir con cGMP (Current Good Manufacturing Practices) y deben estar libres de componentes derivados de xenoorganismos y seres humanos.

El almacenamiento tradicional de tejidos implica, en general, procedimientos de conservación criogénica mediante los cuales las células o tejidos completos se conservan enfriándolos a temperaturas bajo cero. Las bajas temperaturas detienen de manera eficaz cualquier actividad enzimática o química que pueda causar daño a los tejidos. Los procedimientos de crioconservación buscan alcanzar bajas temperaturas sin causar daño adicional por la formación de hielo durante la congelación. Las técnicas tradicionales de crioconservación se basan en recubrir las células o tejidos con un crioprotector para evitar la formación de hielo intracelular. Sin embargo, aún puede producirse una formación macroscópica de hielo que provoque una perforación que afecte a la integridad del tejido.

El almacenamiento hipotérmico de tejido, en general, tiene lugar a temperaturas por encima del punto de congelación, por ejemplo, entre 0 °C y 20 °C, lo que evita la formación de cristales de hielo. Muchos problemas relacionados con la función y viabilidad celular están asociados con el almacenamiento hipotérmico de tejido, tales como la osmolalidad, la isquemia, la hipoxia y los radicales libres derivados del oxígeno, tal como se describe a continuación.

Osmolalidad. En equilibrio, está presente una mayor concentración de iones inorgánicos en el espacio intracelular en lugar del espacio extracelular, un fenómeno conocido como el Efecto Donna [Dick, D.A.T., Relation between water and solutes: Theory of osmotic pressures, en CELL WATER, E.E. Bittar, Editor 1966, Butterworths: Londres. págs. 15-43.]. Por lo tanto, en el equilibrio, las células tienden a absorber agua. Las células gestionan su osmolalidad a través del transporte activo de iones, en el que los iones, tales como el sodio y el cloruro, son transportados fuera de la membrana a través de bombas para evitar la entrada de agua y la posterior lisis. La osmolalidad es una propiedad coligativa y depende de la cantidad de iones presentes en la solución en lugar de su tamaño o naturaleza [Taylor M.J., Physico-chemical principles in low temperature biology, en THE EFFECTS OF LOW TEMPERATURES ON BIOLOGICAL SYSTEMS, B.W.W. Grout y G.J. Morris, Editors. 1987, Edward Arnold: Londres. págs. 3-71]. El consumo de ATP requerido para realizar las reacciones de transporte activo se adapta para que tenga lugar a la temperatura corporal normal. A temperaturas hipotérmicas, las bombas de transporte activo son incapaces de unirse al ATP para procesarlo como energía. Además, en condiciones de hipotermia, las altas reservas de energía se agotan cuando falla la transducción de energía mitocondrial (producción de ATP). La actividad de las bombas de sodio y potasio a 5 °C es aproximadamente el 1 % de sus niveles normales a temperaturas fisiológicas [Ellory J.C. y Willis J.S., Phasing out the sodium pump, en EFFECTS OF LOW TEMPERATURES ON BIOLOGICAL MEMBRAn Es , G.J. Morris y A. Clarke, Editors. 1981, Academic Press: Londres. págs. 107-120]. La osmolalidad normal del líquido extracelular es de aproximadamente 280 a 310 mOsmol/l. Debido a que las bombas de sodio y potasio fallan en condiciones hipotérmicas, los medios de almacenamiento hipotérmico deben ser ligeramente hipertónicos para contrarrestar este cambio.

Isquemia/Hipoxia. Una consecuencia inmediata del cese del suministro de sangre a un órgano es la pérdida del suministro de oxígeno al tejido. El oxígeno es necesario para el proceso de respiración aeróbica y la producción de adenosín trifosfato (ATP), la principal fuente de energía utilizada por las células. En ausencia de oxígeno, el ATP se agota en pocos minutos. Este agotamiento conduce a un cambio de metabolismo aeróbico a anaeróbico que es autolimitante y provoca la producción de lactato y protones. Esto conduce a una cascada que finalmente culmina en necrosis y muerte celular.

Por cada descenso de 10 °C de temperatura, el consumo de oxígeno celular disminuye un 50 % [Taylor M.J., Biology of Cell Survival in the Cold: The Basis for Biopreservation of Tissues and Organs, en ADVANCES IN BIOPRESERVATION, J.G. Baust y J.M. Baust, Editors. 2007, CRC Press: Boca Ratón, FL]. Esto produce velocidades de reacción más lentas y una disminución en el metabolismo celular.

Radicales libres derivados del oxígeno (ODFR, Oxygen-derived free radicals). El enfriamiento de las células aumenta su susceptibilidad para producir radicales libres mientras atenúa los mecanismos por los cuales las células normalmente se ocupan de la formación de radicales libres [Fuller B.J., Gower J.D. y Green C.J., Cryobiology, 25(5):377-393 (1988)]. Bajas concentraciones de oxígeno molecular, tales como las que se encuentran en las soluciones de conservación de tejidos, son suficientes para el desarrollo de ODFR. Por esta razón, los secuestrantes farmacológicos naturales, tales como la SOD, la catalasa o el manitol, pueden mejorar la viabilidad de los órganos almacenados de manera hipotérmica [Fuller, et al. Criobiology, 23(4):358-365 (1986)].

La crioconservación por congelación de productos placentarios es conocida en la técnica.

La Patente US 2011/206776 describe un producto placentario que comprende una membrana amniótica inmunocompatible. Dichos productos placentarios se pueden crioconservar para que contengan células terapéuticas viables después de la descongelación.

La Patente CN 103789262 describe un procedimiento de preparación de células madre hematopoyéticas placentarias a nivel de aplicación clínica.

La Patente US 2014/011743 da a conocer composiciones que comprenden colágeno de telopéptido placentario humano, procedimientos para preparar las composiciones, procedimientos para su utilización y kits que comprenden las composiciones.

La Patente US 2004/048372 describe un procedimiento para extraer y recuperar células madre de tipo embrionario de una placenta humana exanguinada. Se trata una placenta para eliminar la sangre residual del cordón umbilical mediante la perfusión de una placenta exanguinada, de manera preferente, con una solución anticoagulante, para eliminar las células residuales. Se recogen las células residuales y el líquido de perfusión de la placenta exanguinada, y las células madre de tipo embrionario se separan de las células residuales y del líquido de perfusión. También se describe un procedimiento para utilizar la placenta aislada y perfundida como biorreactor en el que propagar células endógenas, que incluyen, pero sin limitación a las mismas, células madre de tipo embrionario.

La Patente US 2012/207717 se refiere a procedimientos para tratar lesiones por inhalación, utilizando composiciones celulares, tales como células extraembrionarias secretoras de citocinas (ECS, extraembryonic cytokine secreting) y células progenitoras multipotentes derivadas de amnios (AMP, Amnion-derived Multipotent Progenitor) y composiciones de soluciones que contienen factores celulares, tales como solución de citocinas celulares derivadas de células extraembrionarias, solución de citocinas celulares derivadas de amnios (ACCS, Amnion-derived Cellular Cytokine Solution) y composiciones de soluciones de citocinas fisiológicas (PCS, physiologic cytokine solution).

Las Patentes WO 2015/171143 y WO 2015/171144 describen un producto de membrana placentaria que comprende una membrana coriónica inmunocompatible, que puede crioconservarse para contener factores terapéuticos y células viables después de la descongelación.

Características de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de almacenamiento ex vivo para almacenar la membrana placentaria, tal como se define en las reivindicaciones.

Se obtendrá una mayor comprensión de la naturaleza y las ventajas de la presente invención con referencia a las partes restantes de la memoria descriptiva y los dibujos de la presente solicitud.

Descripción breve de los dibujos

La divulgación puede entenderse mejor con referencia a los siguientes dibujos. Los elementos de los dibujos no están necesariamente a escala entre sí, sino que se hace hincapié en ilustrar claramente los principios de la divulgación. Además, números de referencia similares designan partes correspondientes a lo largo de las diversas vistas.

La figura 1A es un gráfico que ilustra la evaluación preliminar de la viabilidad celular.

La figura 1B es una imagen cuantitativa de la viabilidad celular.

La figura 1C es una imagen cuantitativa adicional de la viabilidad celular.

La figura 1D es una imagen cuantitativa adicional de la viabilidad celular.

La figura 2A es un gráfico que muestra la viabilidad de células de la membrana placentaria a los 42 días.

La figura 2B es un gráfico adicional que muestra la viabilidad de células de la membrana placentaria a los 42 días. La figura 2C es un gráfico adicional que muestra la viabilidad de células de la membrana placentaria a los 42 días. La figura 3 es una ilustración de la evaluación cualitativa de la viabilidad celular a lo largo del tiempo.

La figura 4A es una ilustración de las características de manipulación macroscópica de tejido almacenado en una solución de DMEM.

La figura 4B es una ilustración de las características de manipulación macroscópica de tejido almacenado en una solución de DMEM albúmina humana recombinante (rhA).

La figura 5A es una ilustración de la tinción histológica de tejidos almacenados en una solución de DMEM durante cuatro semanas.

La figura 5B es una ilustración de la tinción histológica de tejidos almacenados en una solución de DMEM rhA durante cuatro semanas.

La figura 5C es una ilustración de la tinción histológica de tejidos almacenados en una solución de DMEM durante seis semanas.

La figura 5D es una ilustración de la tinción histológica de tejidos almacenados en una solución de DMEM rhA durante seis semanas.

La figura 5E es un gráfico que ilustra el contenido de proteínas totales de células de la membrana placentaria.

La figura 5F es un gráfico que ilustra la concentración de metaloproteinasas de matriz inhibidoras de tejido en células de membrana placentaria.

La figura 6A es un gráfico que ilustra la prueba de esfuerzo en células incubadas en la solución de almacenamiento durante nueve semanas.

La figura 6B es un gráfico que ilustra la prueba de deformación en células incubadas en la solución de almacenamiento durante nueve semanas.

La figura 6C es un gráfico que ilustra la prueba del módulo en células incubadas en la solución de almacenamiento durante nueve semanas.

La figura 7A es una guía que ilustra la colocación de las membranas placentarias experimentales sobre heridas. La figura 7B es una ilustración de heridas tratadas con membranas placentarias experimentales nueve días después del procedimiento.

La figura 7C es una ilustración adicional de heridas tratadas con membranas placentarias experimentales nueve días después del procedimiento.

La figura 7D es una ilustración adicional de heridas tratadas con membranas placentarias experimentales nueve días después del procedimiento.

La figura 8 es un cuadro que enumera los resultados del examen histológico de heridas tratadas con membranas placentarias experimentales nueve días después del procedimiento.

La figura 9A es una ilustración de heridas tratadas con membranas placentarias experimentales veintiún días después del procedimiento.

La figura 9B es una ilustración adicional de heridas tratadas con membranas placentarias experimentales veintiún días después del procedimiento.

La figura 9C es una ilustración adicional de heridas tratadas con membranas placentarias experimentales veintiún días después del procedimiento.

La figura 9D es una ilustración adicional de heridas tratadas con membranas placentarias experimentales veintiún días después del procedimiento.

La figura 10 es un cuadro que enumera los resultados del examen histológico de heridas tratadas con membranas placentarias experimentales veintiún días después del procedimiento.

La figura 11A es una ilustración del examen histológico de una herida tratada con amnios deshidratado veintiún días después del procedimiento.

La figura 11B es una ilustración del examen histológico de una herida tratada con membrana placentaria fresca almacenada de manera hipotérmica veintiún días después del procedimiento.

La figura 11C es una ilustración del examen histológico de una herida no tratada veintiún días después del procedimiento.

La figura 11D es una ilustración del examen histológico de una herida tratada con malla deshidratada veintiún días después del procedimiento.

La figura 12A es una ilustración adicional del examen histológico de una herida tratada con malla deshidratada veintiún días después del procedimiento.

La figura 12B es una ilustración adicional del examen histológico de una herida tratada con malla deshidratada veintiún días después del procedimiento.

La figura 12C es una ilustración adicional del examen histológico de una herida tratada con amnios deshidratado veintiún días después del procedimiento.

La figura 12D es una ilustración adicional del examen histológico de una herida tratada con amnios deshidratado veintiún días después del procedimiento.

La figura 13A es una cuantificación de tejido anormal en heridas tratadas con membranas placentarias experimentales a los nueve y veintiún días después del procedimiento.

La figura 13B es una cuantificación de la matriz de cesta entretejida (“basket-weave”) en heridas tratadas con membranas placentarias experimentales a los nueve y veintiún días después del procedimiento.

La figura 13C es una cuantificación de la formación de folículos/glándulas en heridas tratadas con membranas placentarias experimentales a los nueve y veintiún días después del procedimiento.

Descripción detallada de la invención

A. Definiciones

En esta memoria descriptiva, y en las reivindicaciones que siguen, se hace referencia a una serie de términos que se definirán para que tengan los siguientes significados:

Tal como se utilizan en el presente documento, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a “la herida” incluye dos o más de dichas heridas.

Tal como se utiliza en el presente documento, “tejido amniótico” significa células de líquido amniótico, membrana placentaria, tejido amniótico o combinaciones de los mismos.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos “opcional” y “de manera opcional” significan que el evento o circunstancia descritos posteriormente puede tener lugar o no, y que la descripción incluye casos en los que dicho evento o circunstancia tiene lugar y casos en los que no tiene lugar.

Tal como se utilizan en el presente documento, las frases “membrana placentaria” y “tejido amniótico” se refieren a una o más capas de la membrana placentaria. Por ejemplo, membrana placentaria o tejido amniótico pueden referirse a una membrana placentaria que comprende las capas amniótica y coriónica. En otro ejemplo, membrana placentaria o tejido amniótico pueden referirse a una membrana placentaria en la que se ha extraído el corion. En otro ejemplo, membrana placentaria o tejido amniótico pueden referirse a una membrana placentaria en la que se ha extraído la capa epitelial.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos “tratamiento” y “tratar” incluyen cualquier efecto deseable sobre los síntomas o la patología de una enfermedad o afección, y pueden incluir incluso reducciones mínimas en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que se está tratando. “Tratamiento” no indica necesariamente la erradicación o cura completa de la enfermedad o afección, o los síntomas asociados a las mismas. El sujeto que recibe este tratamiento es cualquier animal que lo necesite, incluyendo primates, en particular seres humanos y otros mamíferos que incluyen, pero no se limitan a los mismos, equinos, ganado vacuno, cerdos, ovejas, aves de corral y mascotas en general.

B. Fabricación de la preparación de membrana placentaria (no pertenece a la presente invención)

Las membranas placentarias que utilizan la presente solución de almacenamiento hipotérmico se pueden preparar, tal como se ha descrito anteriormente en la Patente US 14/212,010 (Patente US 2014-0271776 A1), titulada “Preparations Derived From Placental Materials and Methods of Making and Using the Same”, la Patente US 13/754,742 (Patente US 2015-0224147 A1), titulada “Placental Membrane Preparation and Methods of Making and Using the Same” y la Patente US 13/754,716 (Patente US 2014-0212390 A1), titulada “Placental Membrane Preparation and Methods of Making and Using the Same”. De manera resumida, la preparación de membrana placentaria incluye tejido amniótico y, de manera opcional, células de líquido amniótico. El componente de tejido amniótico de la preparación de membrana placentaria se fabrica a partir de placentas recogidas de donantes que dieron su consentimiento de acuerdo con las directrices actuales de buenas prácticas de tejidos promulgadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos. En particular, poco después del nacimiento de un bebé humano a través de un parto por cesárea, se recupera la placenta intacta y se disecciona la membrana placentaria de la placenta. Posteriormente, la membrana placentaria se limpia de sangre residual, se coloca en un baño de solución estéril, se almacena en hielo y se envía para su procesamiento. Una vez recibida por el procesador, la membrana placentaria se enjuaga para eliminar cualquier coágulo de sangre restante y, si se desea, se enjuaga adicionalmente con un enjuague con antibiótico [Díaz-Prado S.M., et al. Cell Tissue Bank, 11:183-195 (2010)].

El enjuague antibiótico puede incluir, pero sin limitarse a los mismos, los antibióticos: amikacina, aminoglucósidos, amoxicilina, ampicilina, ansamicinas, arsfenamina, azitromicina, azlocilina, aztreonam, bacitracina, capreomicina, carbacefem, carbapenémicos, carbenicilina, cefaclor, cefadroxilo, cefalexina, cefalotina, cefamandol, cefazolina, cefdinir, cefditoren, cefepima, cefixima, cefoperazona, cefotaxima, cefoxitina, cefpodoxima, cefprozil, ceftarolina fosamil, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftobiprol, ceftriaxona, cefuroxima, cloranfenicol, ciprofloxacina, claritromicina, clindamicina, clofazimicina, cloxacilina, colistina, cicloserina, dapsona, daptomicina, demeclociclina, dicloxacilina, diritromicina, doripenem, doxiciclina, enoxacina, ertapenem, eritromicina, etambutol, etionamida, flucloxacilina, fosfomicina, furazolidona, ácido fusídico, gatifloxacina, geldanamicina, gentamicina, glicopéptidos, grepafloxacina, herbimicina, imipenem o cilastatina, isoniazida, kanamicina, levofloxacina, lincomicina, lincosamidas, linezolida, lipopéptido, lomefloxacina, loracarbef, macrólidos, mafenida, meropenem, meticilina, metronidazol, mezlocilina, minociclina, monobactámicos, moxifloxacina, mupirocina, nafcilina, ácido nalidíxico, neomicina, netilmicina, nitrofuranos, nitrofurantoína, norfloxacina, ofloxacina, oxacilina, oxitetraciclina, paromomicina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, platensimicina, polimixina B, pirazinamida, quinolonas, quinupristina/dalfopristina, rifabutina, rifampicina o rifampina, rifapentina, rifaximina, roxitromicina, sulfadiazina de plata, esparfloxacina, espectinomicina, espiramicina, estreptomicina, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfametizol, sulfametoxazol, sulfanilamida, sulfasalazina, sulfisoxazol, sulfonamidocrisoidina, teicoplanina, telavancina, telitromicina, temafloxacina, temocilina, tetraciclina, tianfenicol, ticarcilina, tigeciclina, tinidazol, tobramicina, trimetoprima, trimetoprima-sulfametoxazol (cotrimoxazol) (TMP-SMX) y troleandomicina, trovafloxacina o vancomicina.

El enjuague antibiótico también puede incluir, pero sin limitarse a los mismos, los antimicóticos: abafungina, albaconazol, amorolfina, anfotericina B, anidulafungina, bifonazol, butenafina, butoconazol, caspofungina, clotrimazol, econazol, fenticonazol, fluconazol, isavuconazol, isoconazol, itraconazol, ketoconazol, micafungina, miconazol, naftifina, nistatina, omoconazol, oxiconazol, posaconazol, ravuconazol, sertaconazol, sulconazol, terbinafina, terconazol, tioconazol, voriconazol u otros agentes o compuestos con una o más características antifúngicas.

Aunque las membranas placentarias poseen muchas ventajas y aplicaciones, la disponibilidad de las membranas ha limitado su utilización. La cantidad de membrana placentaria generada a partir de un solo nacimiento es pequeña. Tal como sería de esperar, debido a que el suministro de membranas placentarias es relativamente pequeño, el coste de las membranas placentarias limita su utilización solo a procedimientos que superan un determinado precio o complejidad. Las Patentes US 13/250,096 (Patente US 2013-0136773 A1) y US 13/647,525 (US 2013-0084314 A1) describen una membrana placentaria que incluye una pluralidad de ranuras para aumentar la capacidad de expansión de las membranas. Las ranuras están dispuestas a través de la membrana y se proporcionan en un número suficiente para producir un patrón similar a una malla que permite que la membrana se estire y, por lo tanto, aumente su longitud y anchura.

La membrana placentaria puede procesarse para extraer una o más capas particulares de la membrana. El corion puede extraerse de la membrana placentaria por medios mecánicos bien conocidos por los expertos en la materia. El corion puede extraerse, por ejemplo, despegando cuidadosamente el corion del resto de la membrana placentaria utilizando una disección roma [Jin C.Z., et al. Tiss Eng, 13: 693-702 (2007)]. La extracción de la capa epitelial de la membrana placentaria se puede conseguir utilizando varios procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. La capa epitelial puede conservarse o, si se desea, puede eliminarse, por ejemplo, utilizando tripsina para inducir necrosis en las células epiteliales [Díaz-Prado S.M., et al. Cell Tissue Bank, 11: 183-195 (2010)]. La eliminación de la capa epitelial puede comprender, por ejemplo, el tratamiento con una solución de tripsina-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,1 % a 37 °C durante 15 minutos, seguido de la eliminación física utilizando un raspador de células [Jin C.Z., et al. Tiss Eng, 13: 693-702 (2007)]. De manera preferente, la membrana placentaria utilizada para el componente de tejido amniótico de la preparación de membrana placentaria es la membrana amniótica que incluye las capas de células epiteliales amnióticas, pero que excluye el corion.

Las membranas placentarias se pueden moler utilizando técnicas conocidas en el sector y las partículas resultantes pueden resuspenderse en el medio de almacenamiento hipotérmico descrito en el presente documento o secarse. Dicho procesamiento se puede llevar a cabo para conservar, en la medida de lo posible, el contenido de proteínas de la membrana, incluyendo los factores de crecimiento. De manera preferente, la molienda debe realizarse en condiciones de temperatura controlada, tal como en un molino criogénico. De manera preferente, dichos trozos molidos de tejido deben tener un tamaño de partícula de menos de 1 mm. De manera alternativa, las membranas pueden triturarse utilizando técnicas conocidas en el sector, creando, por ejemplo, pequeños cubos de tejido de membrana. De manera preferente, dichos trozos triturados de tejido tienen tamaños de partícula que varían de 0,1 mm a 5 mm. Las partículas de tejido triturado pueden tener forma cuadrada, redondeada, oblonga o irregular.

La membrana placentaria molida o triturada incluye tejido amniótico que contiene matriz extracelular (ECM, extracelular matrix) amniótica organizada, células de tejido amniótico y factores de crecimiento contenidos dentro de la ECM y células de tejido amniótico. La ECM incluye colágeno derivado del amnios, fibronectina, laminina, proteoglicanos y glicosaminoglicanos. El colágeno derivado del amnios puede derivar de una capa de epitelio, una capa de membrana basal, una capa compacta, una capa de fibroblastos, una capa intermedia y una capa esponjosa del tejido del amnios.

La preparación de membrana placentaria se puede combinar con células madre prenatales, si se desea. Por ejemplo, la preparación puede incluir células de líquido amniótico que derivan del líquido amniótico que se recoge durante la amniocentesis o de la cesárea programada de donantes que lo consienten. El líquido amniótico se centrifuga, sedimentando de este modo las células de líquido amniótico. Las células de líquido amniótico resultantes pueden combinarse con membrana placentaria molida y crioconservarse en una solución que contiene aproximadamente del 5 al 10 % v/v de dimetilsulfóxido (DMSO) y del 15 al 25 % vol/vol de proteína, siendo el resto cristaloides.

Las partículas de membrana triturada, molida o fragmentada pueden liofilizarse y esterilizarse, o almacenarse en una solución de almacenamiento crioconservante o hipotérmica, tal como se describe en el presente documento, lo que permite la conservación de la viabilidad de algunas células de membrana. NuTech Medical, Inc. de Birmingham, Alabama, comercializa una preparación adecuada de membrana placentaria molida, que incluye células de líquido amniótico, con el nombre de NuCel™.

La preparación de membrana placentaria puede incluir un cartílago procesado seleccionado del grupo que consiste en un cartílago molido, un cartílago triturado, una pasta de cartílago y combinaciones de los mismos. El cartílago procesado puede ser un cartílago de autoinjerto, un cartílago de aloinjerto o combinaciones de los mismos. Cuando se añade cartílago procesado a una preparación de membrana placentaria triturada o molida, el cartílago procesado se proporciona, de manera preferente, en una proporción en volumen entre 3:1 y 1:3, con respecto a la preparación de membrana original. En una realización adicional, las partículas de membrana triturada, molida o fragmentada pueden tener un tamaño de partícula promedio de menos de 1,5 mm y se absorben en una matriz de colágeno. La matriz de colágeno puede utilizarse, a continuación, en un procedimiento para tratar heridas, tal como se describirá con más detalle a continuación.

La preparación de membrana placentaria puede incluir ácido hialurónico, solución salina o una combinación de los mismos. El ácido hialurónico y la solución salina pueden incluirse con la preparación de membrana placentaria cuando se desea inyectar la preparación en una articulación esquelética. Cuando se añade ácido hialurónico o solución salina a una preparación de membrana placentaria, el ácido hialurónico o la solución salina se proporciona, de manera preferente, en una proporción de 2:1 o 1:1 en volumen, con respecto a la preparación de membrana original.

La preparación de membrana placentaria puede incluir uno o más pegamentos biocompatibles. Los pegamentos biocompatibles son materiales poliméricos naturales que actúan como adhesivos. Los pegamentos biocompatibles pueden formarse sintéticamente a partir de monómeros biológicos, tales como azúcares, y pueden consistir en una variedad de sustancias, tales como proteínas y carbohidratos. Las proteínas, tales como la gelatina y los carbohidratos, tales como el almidón, se han utilizado como pegamentos de uso general durante muchos años. De manera preferente, el pegamento biocompatible es pegamento de fibrina, tal como Tisseel. La fibrina se compone de fibrinógeno (concentrado humano combinado liofilizado) y también puede incluir trombina (que puede reconstituirse con cloruro de calcio).

C. La solución de almacenamiento hipotérmico como se utiliza en el procedimiento de la reivindicación 1

La membrana se puede almacenar en una solución de almacenamiento hipotérmico mediante el procedimiento definido en la reivindicación 1 que permite la conservación de la viabilidad de las células de la membrana. El procedimiento reivindicado en el presente documento es eficaz para almacenar tejidos a temperaturas por encima del punto de congelación, a una temperatura que varía entre 0 °C y 20 °C. En una realización adicional, el procedimiento es eficaz a temperaturas que varían entre más de 0 °C y menos de 10 °C. En una realización de ejemplo, la solución de almacenamiento hipotérmico utilizada en el procedimiento puede incluir un medio de cultivo de tejidos disponible en el mercado con los suplementos apropiados. Todos los componentes de la solución están químicamente definidos/cumplen con cGMP y no contienen componentes derivados de xenoorganismo ni seres humanos. El medio de cultivo de tejidos comprende DMEM. El DMEM contiene aminoácidos, sales (cloruro de calcio, cloruro de potasio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio y fosfato monosódico) y concentraciones elevadas de glucosa y vitaminas (ácido fólico, nicotinamida, riboflavina, B12). Además, contiene hierro y rojo fenol. El DMEM es adecuado para la mayoría de los tipos de células, que incluyen células humanas, de mono, de hámster, de rata, de ratón, de pollo y de pez. DMEM está disponible en el mercado de varios proveedores, por ejemplo, Corning, Inc. (Tewksbury Ma , Catálogo # 15-018).

La solución de almacenamiento hipotérmico utilizada en el procedimiento de la presente invención incluye la suplementación con tampones apropiados para mantener el pH fisiológico a pesar de los cambios en la concentración de dióxido de carbono producidos por la respiración celular. El tampón añadido es el tampón HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico), un agente tampón químico orgánico zwitteriónico. E1 HEPES se utiliza ampliamente en cultivos celulares, en gran parte porque es mejor para mantener el pH fisiológico en comparación con tampones de bicarbonato. El tampón HEPES se puede utilizar a una concentración, tal como conocerá un experto en la materia, por ejemplo, de 20 mM a 30 mM. En una realización, la solución contiene una concentración de HEPES 25 mM.

La albúmina es albúmina de plasma humano. En una realización adicional, la albúmina de plasma humano es albúmina humana recombinante (rhA), por ejemplo, rhA Cellastim fabricada por InVitria (Junction City, KS). La albúmina de plasma humano se utiliza a una concentración de 2,0 g/l a 3,0 g/l. En una realización, la solución contiene una concentración de 2,5 g/l de rhA.

D. Almacenamiento de la membrana placentaria

En una realización, el procedimiento incluye colocar la membrana en un recipiente estéril que incluye una solución de almacenamiento hipotérmico. En una realización, la solución de almacenamiento utilizada en el procedimiento contiene DMEM, tampón HEPES a una concentración entre 20 mM y 30 mM y rhA a una concentración entre 2,0 g/l y 3,0 g/l. En una realización adicional, el recipiente estéril se sella con un volumen de aire en contacto con las soluciones de almacenamiento, de manera que la proporción de solución de almacenamiento y aire está entre 2:1 y 5:1 (volumen de solución:volumen de aire).

En este procedimiento, la preparación de membrana placentaria se puede almacenar y transportar en la solución de almacenamiento hipotérmico utilizada en la presente invención. En una realización, la membrana y la solución de almacenamiento se colocan en un recipiente estéril, tal como un frasco o una bandeja, y se sellan para evitar la contaminación. Se incluye un volumen de aire dentro del recipiente sellado para permitir el metabolismo continuo de las células dentro de la membrana. La proporción del volumen de la solución de almacenamiento con respecto al aire puede variar, tal como sabrá un experto en la materia. En una realización, esta proporción puede estar entre 2:1 y 5:1 (volumen de solución:volumen de aire). En otra realización, la proporción es 3:1. El recipiente se puede colocar y sellar dentro de un segundo recipiente para proporcionar una mayor protección contra los contaminantes. Por ejemplo, la membrana se puede almacenar de manera hipotérmica entre dos bandejas anidadas estériles (la configuración “bandeja en bandeja” ( “tray-in-tray’)) o se puede almacenar entre un frasco estéril y una bandeja estéril (la configuración “frasco en bandeja” (“jar-in-tray’)).

La albúmina humana contenida en la solución de almacenamiento descrita en el presente documento mantiene la viabilidad de las células de la membrana placentaria durante un período de tiempo prolongado. La membrana placentaria almacenada dentro de la solución de almacenamiento hipotérmico muestra una proporción de células vivas con respecto a células muertas después de un período prolongado de almacenamiento, tal como se ilustra en la tabla 1 a continuación.

T abl 1. Pr r i n l l viv n r l l m r i m r l n lm n miento.

La membrana placentaria muestra una viabilidad celular en el intervalo del 45 % al 85 % después de mil horas de estar almacenada de manera hipotérmica en la solución.

En una realización, la solución de almacenamiento del procedimiento aumenta de manera significativa la integridad de la membrana, reduce el hinchamiento osmótico y conserva la viabilidad celular a lo largo del tiempo en comparación con las soluciones que no contienen albúmina humana. Por ejemplo, la inclusión de albúmina humana en la solución conserva el grosor, reduce el hinchamiento, reduce el daño a la capa de células epiteliales y promueve la retención de células dentro de la matriz extracelular de la membrana placentaria. El aumento de la integridad de la membrana y la conservación de la viabilidad celular se pueden conseguir mediante la adición de una cantidad eficaz de albúmina de plasma humano a la solución de almacenamiento hipotérmico. Además, la albúmina de plasma humano actúa conservando el contenido de proteínas totales de la membrana placentaria. En una realización, la solución de almacenamiento hipotérmico utilizada en el procedimiento descrito en el presente documento mantiene un contenido de proteínas totales de más de 450 ng de proteína por mg de membrana placentaria después de veinticuatro horas de almacenamiento hipotérmico en la solución. En una realización adicional, la solución de almacenamiento utilizada en el procedimiento descrito en el presente documento mantiene un contenido de proteínas totales de más de 300 ng de proteína por mg de membrana placentaria después de mil horas de almacenamiento hipotérmico en la solución (véase la figura 5E).

En una realización adicional del procedimiento, la adición de albúmina de plasma humano actúa manteniendo la actividad de las metaloproteinasas de matriz inhibidoras de tejido (TIMP, tissue inhibiting matrix metalloproteinases) 1,2 y 4. Las TIMP son inhibidores conocidos de metaloproteinasas de matriz (MMP, matrix metalloproteinases), que son responsables de descomponer enzimáticamente diversas proteínas de la ECM. El mantenimiento de la actividad de TIMP y la reducción de las proteínas de la matriz extracelular podrían actuar conservando la actividad de la membrana a lo largo del tiempo. En esta realización, la membrana placentaria conservada en la solución de almacenamiento descrita en el presente documento tiene una concentración total de TIMP 1, 2 y 4 de más de 400 ng por mg de membrana placentaria después de veinticuatro horas de almacenamiento en la solución de almacenamiento hipotérmico de la presente invención. En una realización adicional, la membrana placentaria conservada en la solución de almacenamiento descrita en el presente documento tiene una concentración total de TIMP 1, 2 y 4 de más de 250 ng por mg de membrana placentaria después de mil horas de almacenamiento en la solución de almacenamiento hipotérmico de la presente invención (véase la figura 5F descrita en el presente documento).

En una realización adicional, la membrana placentaria del procedimiento se puede triturar, moler o fragmentar antes del almacenamiento en la solución de almacenamiento hipotérmico, tal como se describe en el presente documento, lo que permite la conservación de la viabilidad de algunas células de la membrana. Además, la preparación de la membrana placentaria puede incluir, además, un cartílago procesado seleccionado del grupo que consiste en un cartílago molido, un cartílago triturado, una pasta de cartílago y combinaciones de los mismos. El cartílago procesado puede ser un cartílago de autoinjerto, un cartílago de aloinjerto o combinaciones de los mismos. Cuando se añade cartílago procesado a una preparación de membrana placentaria triturada o molida, el cartílago procesado se proporciona, de manera preferente, en una proporción en volumen entre 3:1 y 1:3 con respecto a la preparación de membrana original. En una realización adicional, la membrana triturada, molida o fragmentada puede disponerse en partículas con un tamaño de menos de 1,5 mm y absorberse en la matriz de colágeno antes del almacenamiento en la solución de almacenamiento hipotérmico. A continuación, la matriz de colágeno puede utilizarse en un procedimiento para tratar heridas, tal como se describirá con más detalle a continuación. Además, el tejido de membrana placentaria se sumerge, como mínimo, parcialmente, en la solución de almacenamiento que incluye DMEM y, como mínimo, el 0,025 % p/v de albúmina de plasma humano.

El recipiente estéril utilizado en el procedimiento para contener la membrana placentaria y la solución se puede sellar para evitar la contaminación. Se incluye un volumen de aire dentro del recipiente sellado para permitir el metabolismo continuo por las células dentro de la membrana. La proporción del volumen de la solución de almacenamiento con respecto al aire puede variar, tal como sabrá un experto en la materia. Esta proporción puede estar entre 2:1 y 5:1 (volumen de solución:volumen de aire). La proporción es 3:1. El recipiente se puede colocar y sellar dentro de un segundo recipiente para proporcionar una mayor protección contra los contaminantes. El sistema puede incluir, además, tampón HEPES como componente de la solución de almacenamiento, donde el tampón HEPES está a una concentración entre 20 mM y 30 mM.

La albúmina humana contenida en la solución de almacenamiento del sistema descrita en el presente documento mantiene la viabilidad de las células de la membrana placentaria durante un período prolongado de tiempo. La membrana placentaria almacenada en la solución de almacenamiento hipotérmico muestra una proporción de células vivas con respecto a células muertas después de un período prolongado de almacenamiento, tal como se ilustra en la tabla 1. La inclusión de albúmina humana en la solución conserva el grosor, reduce el hinchamiento, reduce el daño a la capa de células epiteliales y promueve la retención celular dentro de la matriz extracelular de la membrana placentaria aumentando de manera significativa la integridad de la membrana, reduciendo el hinchamiento osmótico y conservando la viabilidad celular a lo largo del tiempo en comparación con las soluciones que no contienen albúmina humana. La albúmina de plasma humano actúa conservando el contenido de proteínas totales de la membrana placentaria. En una realización, la solución de almacenamiento hipotérmico del sistema mantiene un contenido de proteínas totales de más de 450 ng de proteína por mg de membrana placentaria después de veinticuatro horas de almacenamiento de manera hipotérmica en la solución. La solución de almacenamiento utilizada en el procedimiento mantiene un contenido de proteínas totales de más de 300 ng de proteína por mg de membrana placentaria después de mil horas de almacenamiento de manera hipotérmica en la solución (véase la figura 5E).

La adición de la albúmina de plasma humano a la solución de almacenamiento utilizada en el procedimiento actúa manteniendo la actividad de TIMPS 1, 2 y 4. La membrana placentaria conservada en la solución de almacenamiento del sistema tiene una concentración total de TIMP 1,2 y 4 de más de 400 ng por mg de membrana placentaria después de veinticuatro horas de almacenamiento. La membrana placentaria conservada en la solución de almacenamiento del sistema tiene una concentración total de TIMP 1,2 y 4 de más de 250 ng por mg de membrana placentaria después de mil horas de almacenamiento (véase la figura 5F, descrita en el presente documento).

La preparación de membrana placentaria utilizada en el procedimiento puede incluir un cartílago procesado seleccionado del grupo que consiste en un cartílago molido, un cartílago triturado, una pasta de cartílago y combinaciones de los mismos, tal como se ha descrito en detalle anteriormente. Las partículas de membrana triturada, molida o fragmentada pueden tener un tamaño de partícula promedio de menos de 1,5 mm y, a continuación, pueden absorberse en una matriz de colágeno. Además, la membrana placentaria del sistema puede ponerse en forma de malla de manera que pueda estirarse para aumentar su longitud y anchura. La membrana del sistema puede comprender tanto la capa amniótica como la coriónica. La capa esponjosa del tejido amniótico puede extraerse o puede permanecer intacta dependiendo de la aplicación prevista para el tejido conservado. En otro ejemplo, se ha extraído el corion de la membrana placentaria. En otro ejemplo, se ha extraído la capa epitelial de la membrana placentaria.

E. Tratamiento de heridas y defectos (no pertenece a la presente invención)

La membrana placentaria se puede utilizar para regenerar tejidos dañados. La solución de almacenamiento y los procedimientos se pueden utilizar con membranas placentarias utilizadas en una serie de afecciones clínicas que incluyen, pero sin limitarse a las mismas, lesión traumática, tal como laceraciones o quemaduras.

La membrana placentaria en la solución de almacenamiento hipotérmico puede actuar como andamiaje o matriz para el injerto y crecimiento celular. De este modo, las membranas conservadas pueden actuar como una matriz integral con células intactas en su ubicación normal y sin cultivo. Las membranas placentarias también proporcionan un reservorio de factores de crecimiento que atraen MSC, condrocitos y otras células reparadoras que son transportadas por la sangre entrante.

En un ejemplo, que no pertenece a la presente invención, se describe un procedimiento para tratar una herida que comprende la aplicación a una herida del tejido de membrana placentaria almacenado, tal como se ha descrito anteriormente. La membrana placentaria puede comprender una membrana amniótica. En este caso, la superficie del estroma del tejido se aplica a la herida para promover la cicatrización. De manera alternativa, el tejido de la membrana puede comprender cartílago.

La membrana placentaria se puede moler, triturar o fragmentar utilizando técnicas conocidas en el sector, antes de almacenar de manera hipotérmica la membrana placentaria en la solución de almacenamiento. Dichas membranas pueden combinarse, además, con cartílago de autoinjerto o de aloinjerto molido o triturado para la implantación en la herida o el defecto.

La membrana placentaria se puede almacenar dentro de la solución hipotérmica durante un período de tiempo prolongado sin congelar la membrana. La membrana no se congela antes o después de ser almacenada de manera hipotérmica en la solución.

En un ejemplo adicional que no pertenece a la presente invención, hay un sistema para tratar una herida que comprende una membrana placentaria almacenada de manera hipotérmica dentro de un recipiente. El sistema incluye una solución de almacenamiento de DMEM y albúmina de plasma humano. En un ejemplo adicional que no pertenece a la presente invención, la albúmina de plasma humano es albúmina humana recombinante. La membrana placentaria del sistema muestra proporciones de células vivas con respecto a células muertas después de tiempos prolongados de almacenamiento, tal como se ilustra en la tabla 1. En el ejemplo adicional, la adición de albúmina de plasma humano a la solución dentro del sistema actúa manteniendo la actividad de TIMP 1, 2 y 4. Las TIMP son inhibidores conocidos de las MMP, que son responsables de descomponer enzimáticamente diversas proteínas de la ECM. El mantenimiento de la actividad de TIMP y la reducción de las proteínas de la matriz extracelular podrían actuar conservando la actividad de la membrana a lo largo del tiempo.

La membrana placentaria dentro del sistema se puede moler, triturar o fragmentar utilizando técnicas conocidas en el sector, antes de almacenar de manera hipotérmica la membrana placentaria en la solución de almacenamiento. Dichas membranas se pueden combinar adicionalmente con cartílago de autoinjerto o de aloinjerto molido o triturado para la implantación en un defecto.

Parte experimental

A. Definiciones

La “viabilidad celular” se define como el porcentaje de células supervivientes del total de células en una suspensión celular. Se define como

V = —— * 100%

, donde V es el porcentaje de viabilidad, L es el número de células vivas y D es el número de células muertas en una suspensión.

La “tinción con H&E” se define como tinción con hematoxilina y eosina.

“Módulo” se define como el grado en que un objeto resiste la deformación en respuesta a una fuerza aplicada. Se define como

a

m = e

“Deformación” se define como la medida normalizada de la deformación definida como el cambio de longitud dividido por la longitud original; e = AL/L.

F

“Esfuerzo” se define como 1, donde F es la fuerza (N) que actúa sobre el área (A, cm2).

El “contenido de proteínas totales” se define como el nivel total de 40 citocinas conocidas. Para eliminar el sesgo, los niveles de proteína se normalizaron según el peso del tejido. Los niveles se definen como

Z j Proteína ...

donde T es el contenido de proteínas totales, P es la concentración de cada proteína y W es el peso de la muestra de tejido.

B. Estudio de viabilidad celular preliminar

Los estudios preliminares que evaluaron el almacenamiento de la membrana amniótica en condiciones hipotérmicas se realizaron utilizando los siguientes grupos:

(1) Cellgenix CellGro

(2) Hypothermosol

(3) RPMI

(4) DMEM (que contiene tampón HEPES 25 mM)

(5) DMEM completamente suplementado (que contiene tampón HEPES 25 mM, insulina, transferrina, selenio, L-glutamina 2 mM y rhA al 0,25 % p/v)

(6) DMEM (que contiene tampón HEPES 25 mM y rhA al 0,25 % p/v).

En este estudio preliminar, se utilizó un kit de viabilidad Multitox Fluor para determinar la viabilidad de las células vivas a lo largo del tiempo para servir como indicación de la integridad de la membrana. La figura 1A ilustra los resultados, representados gráficamente como una proporción de células vivas Multitox con respecto al recuento de ADN total (determinado mediante un ensayo Picogreen con ADN de doble cadena). La solución de DMEM albúmina humana recombinante (rhA) fue más eficaz en la retención de la viabilidad celular a lo largo del tiempo. Las figuras 1B - 1D ilustran imágenes cualitativas de las tres condiciones con la mejor viabilidad en sus puntos finales. Tal como se ilustra en estas imágenes, la solución DMEM rhA tiene una viabilidad considerable a los 42 días. Estos resultados muestran que la solución de almacenamiento hipotérmico que contiene DMEM rhA muestra una viabilidad superior en comparación con los otros medios de almacenamiento.

C. Viabilidad celular como medida de la integridad de la membrana

1. Ensayo Multitox

En este experimento se utilizó la viabilidad celular como medida de la integridad de la membrana. Los datos preliminares sugirieron que DMEM rhA sería la mejor combinación para conservar la integridad de la membrana. Se investigaron DMEM solo y DMEM rhA contenidos dentro de una disposición de (a) “frasco en bandeja” o (b) “bandeja en bandeja”. Se mantuvieron proporciones similares de oxígeno con respecto a medio de almacenamiento para ambos grupos. Por lo tanto, la principal variable entre las condiciones de almacenamiento fue el volumen de los medios de almacenamiento utilizados. La configuración de “frasco en bandeja” permitió un volumen de solución de almacenamiento de 12 ml de medio en un frasco de 15 cm3, mientras que la configuración de “bandeja en bandeja” permitió un volumen significativamente mayor de medio de almacenamiento de 30 ml de medio en una bandeja de 40 cm3.

En los días 1 y 42, las membranas almacenadas en los diferentes medios de almacenamiento y configuraciones de envasado se sometieron a un enjuague con PBS, seguido de digestión en colagenasa para liberar las células de la membrana. A continuación, se evaluó directamente la viabilidad de las células utilizando el ensayo de viabilidad Multitox. La figura 2A ilustra la viabilidad de células aisladas de membranas placentarias recogidas de cuatro donantes. La línea negra continua con una viabilidad aproximada del 55 % indica la viabilidad promedio en el día 1, mientras que las líneas discontinuas y el área sombreada indican la desviación estándar. Varias tendencias fueron evidentes en la evaluación de estos datos. Los datos demuestran que DMEM rhA retuvo una viabilidad celular más elevada que DMEM solo en ambas condiciones de almacenamiento y la configuración de “bandeja en bandeja” tendió hacia una viabilidad más elevada en comparación con la configuración de “frasco en bandeja”. La membrana almacenada en solución de DMEM rhA en la configuración de “bandeja en bandeja” retuvo el mayor valor de viabilidad a los 42 días. Las muestras de “bandeja en bandeja” y “frasco en bandeja” se combinaron para evaluar si había una diferencia significativa entre las condiciones de almacenamiento. La figura 2B ilustra que la solución de DMEM rhA tenía una viabilidad significativamente más elevada que DMEM solo. Hubo una diferencia significativa entre las dos condiciones de envasado con la configuración de “bandeja en bandeja” que dio lugar a una viabilidad significativamente más elevada que la configuración de “frasco en bandeja”, probablemente debido a un volumen más elevado del medio de almacenamiento (figura 2C).

2. Obtención de imágenes celulares

Como medición secundaria para verificar la viabilidad celular después de la digestión de la membrana a los 42 días de almacenamiento, se sembraron las células restantes después de la prueba de viabilidad Multitox en una placa de 24 pocillos y se cultivaron (37 °C, 5 % de CO2) en medio de cultivo estándar (DMEM con penicilina al 1 %, estreptomicina al 1 % y anfotericina al 1 %, L-glutamina 2 mM y FBS al 20 %). Después de 48-72 horas, las células se tiñeron usando Calceína AM y se obtuvieron imágenes con un microscopio fluorescente para analizar de manera cualitativa la viabilidad celular. Las tendencias de los estudios de viabilidad multitox se mantuvieron de manera positiva para la evaluación cualitativa de la densidad celular después de 42 días de almacenamiento hipotérmico. De manera específica, se demostró que en el día 42, la configuración de envasado de “bandeja en bandeja” mostró una viabilidad mejorada sobre la configuración de envasado de “frasco en bandeja” y la solución de DMEM rhA mostró una viabilidad celular mejorada sobre DMEM solo (figura 3).

D. Tinción con H&E e inspección microscópica de la integridad de la membrana

Además de las comparaciones cuantitativas de la integridad de la membrana, se evaluaron las características de manipulación macroscópica y se realizó la tinción con H&E para evaluar la conservación de la integridad de la membrana después de períodos prolongados de almacenamiento hipotérmico. Algunas características de manipulación cualitativas de las muestras de membrana amniótica almacenadas durante 42 días fueron: (1) las muestras en DMEM rhA eran consistentemente más gruesas y más parecidas al tejido en el día 1; y (2) las muestras de membrana amniótica almacenadas en DMEM solo parecían más delgadas.

Para examinar con más detalle la integridad de la membrana, la membrana amniótica almacenada en DMEM o DMEM rhA durante 4 o 6 semanas se seccionó transversalmente y se tiñó con hematoxilina y eosina (H&E). Cabe indicar que la tinción de la membrana amniótica a las 4 y 6 semanas se realizó en diferentes momentos; por lo tanto, la intensidad de tinción varía entre muestras de 4 y 6 semanas. Hubo diferencias claras en las membranas amnióticas almacenadas en DMEM (figuras 5A y 5C) y las almacenadas en DMEM rhA (figuras 5B y 5D) en los puntos de tiempo de las 4 y 6 semanas. Estas diferencias incluían: (1) más daño a la capa epitelial de las membranas almacenadas en la solución de DMEM solo; (2) el grosor de la membrana amniótica se conservó de manera más eficaz en las membranas almacenadas en la solución de DMEM rhA; y (3) se retuvieron más células dentro de la ECM de las membranas amnióticas almacenadas en la solución de DMEM rhA. En general, los tejidos almacenados en la solución de DMEM rhA parecían más grandes y gruesos en comparación con los tejidos almacenados en DMEM solo.

E. Ensayo de proteómica para evaluar el contenido de proteína

A continuación, se evaluó el contenido de proteína total de las células de membrana placentaria almacenadas para determinar si las condiciones de almacenamiento afectaban al contenido de factor de crecimiento de las membranas a lo largo del tiempo. Los tejidos de membrana se pesaron en puntos de tiempo predeterminados. A continuación, los tejidos se criohomogeneizaron y se extrajo el contenido de proteínas totales utilizando un tampón de extracción de proteínas totales. A continuación, se midieron las proteínas totales utilizando una micromatriz de anticuerpos personalizada para evaluar de manera cuantitativa 40 citocinas separadas de manera simultánea para cada muestra. Para cada muestra, se sumaron los niveles de las 40 citocinas y se normalizaron por el peso de la muestra para determinar la cantidad total de proteína en picogramos por miligramo de membrana (figura 5E), evaluando cada condición por duplicado.

Según las medias de los datos proteómicos, se observaron tendencias similares a las observadas con histología, viabilidad celular y obtención de imágenes para la viabilidad celular. Las concentraciones de las TIMP inhibidoras de tejido 1, 2 y 4 se sumaron para cada muestra y se promediaron para cada condición de solución de almacenamiento (figura 5F). Las TIMP son inhibidores conocidos de las MMP, que son responsables de descomponer enzimáticamente diversas proteínas de la ECM. En general, parece que el mantenimiento de la actividad de TIMP podría ser un mecanismo potencial para la conservación de la integridad de la membrana a lo largo del tiempo.

F. Pruebas mecánicas para evaluar la integridad de la membrana

Se completaron pruebas mecánicas sobre muestras almacenadas en la solución de almacenamiento de DMEM en el día 1. Estos valores se compararon con los datos recogidos para las membranas almacenadas en DMEM y DMEM rhA a las 9 semanas. De manera resumida, se utilizó un MTS para informar sobre el tiempo, el desplazamiento y la fuerza cada 1/100° de segundo. Los valores máximos de fuerza y el desplazamiento máximo se calcularon en el momento de la rotura de la membrana. Utilizando el desplazamiento máximo y la distancia inicial entre las abrazaderas, se calculó la deformación: e= (Lf - Li)/Li (figura 6B). El esfuerzo se define como y se calculó utilizando los máximos de los datos recogidos durante el ensayo de tracción (figura 6A). Finalmente, el módulo de elasticidad ('Módulo' = esfuerzo/deformación) es la descripción matemática de la tendencia de un objeto a deformarse manera elástica cuando se le aplica una fuerza (figura 6C).

Se calcularon y evaluaron el esfuerzo, la deformación y el módulo para todos los puntos de datos. De manera interesante, para todas las propiedades mecánicas hubo diferencias significativas entre las muestras de membrana amniótica almacenadas en la solución de DMEM y las almacenadas en la solución de DMEM rhA. Además, las muestras de membrana amniótica almacenadas de manera hipotérmica en la solución de DMEM rhA no fueron significativamente diferentes en sus propiedades mecánicas en comparación con las propiedades mecánicas de la membrana amniótica en el día 1. Las células almacenadas en la solución de DMEM rhA pudieron soportar el mayor esfuerzo, se sometieron a una menor deformación y tenían un módulo mayor que las almacenadas en la solución de DMEM. De manera destacada, estas características coincidieron con lo que se observó en el tejido almacenado durante solo 1 día. Estos resultados implican que las muestras almacenadas en DMEM rhA tenían menos degradación tisular que las almacenadas en DMEM solo. Estos datos sugieren que la solución de almacenamiento de DMEM rhA da lugar a una menor destrucción y/o una mejor conservación de la membrana que el DMEM solo.

Conclusión

Todas las pruebas realizadas indican que la integridad de la membrana amniótica cuando se somete a condiciones de almacenamiento hipotérmicas se conserva mejor cuando se utiliza la solución de DMEM rhA en comparación con la solución de DMEM. Esta conclusión está respaldada por datos de estudios de viabilidad celular, tinción con H&E, micromatrices proteómicas y pruebas mecánicas.

G. Estudios con animales (no pertenece a la presente invención)

Parte experimental

Se examinaron muestras de membrana placentaria en cuanto a su eficacia para promover la cicatrización de heridas. Se crearon cuatro heridas de un grosor total de 15 mm de diámetro sobre la superficie dorsal de la piel (es decir, el lomo) de tres ratas de laboratorio. Se colocaron cuatro tipos de preparaciones de membrana placentaria con la cara del estroma hacia abajo sobre las heridas de cada animal, un tipo de membrana en cada herida. Se utilizaron los siguientes tipos de membranas:

(1) Membrana placentaria fresca almacenada en una solución hipotérmica que contiene DMEM, HEPES 25 mM y rhA 2,5 g/l después de 25 días de almacenamiento;

(2) Preparación de células placentarias malladas deshidratadas;

(3) Amnios completamente intacto deshidratado; y

(4) Control (sin membrana)

Se aseguró un vendaje primario (cuticerin) a la piel utilizando grapas para cubrir las heridas.

Las heridas se inspeccionaron nueve y veintiún días después del procedimiento y se recogieron muestras histológicas de las heridas y se evaluó la cicatrización de las heridas.

Resultados

Nueve días después del procedimiento, las heridas tratadas con la membrana fresca almacenada, la malla deshidratada y el amnios deshidratado parecían más pequeñas que las del grupo de control (figuras 7B - 7D). La figura 7A proporciona una guía que indica la colocación de las membranas sobre las heridas. Con referencia ahora a la figura 8, el examen histológico indica que las heridas tratadas con la membrana fresca almacenada y las muestras de malla deshidratada mostraron más tejido de granulación celular y reepitelización en comparación con el control. De manera específica, con referencia a la figura 13A, las heridas tratadas con membrana fresca almacenada mostraron sustancialmente menos tejido anormal en comparación con las heridas tratadas con malla deshidratada, amnios deshidratado y control. Por el contrario, con referencia a la figura 13B, las heridas tratadas con la membrana fresca almacenada mostraron una matriz de cesta entretejida más grande que los otros tres grupos de tratamiento, aunque el número de folículos y glándulas sebáceas en heridas tratadas con membrana fresca almacenada no fue significativamente diferente al de los otros grupos de tratamiento a los nueve días (figura 13C).

Veintiún días después del procedimiento, las heridas tratadas con la membrana fresca almacenada eran más pequeñas en comparación con las heridas de los grupos de malla deshidratada, amnios deshidratado y control (figuras 9A - 9D). Los resultados del examen histológico 21 días después del procedimiento se ilustran en las figuras 10 - 12. Tal como se muestra en la figura 10, la herida tratada con membrana placentaria fresca almacenada mostró una mayor cicatrización de la herida en comparación con las otras muestras. Con referencia a la figura 11C, el análisis histológico de la herida no tratada mostró tejido de granulación y un área delgada de epitelización. Las heridas tratadas con las preparaciones de malla deshidratada (figura 11D) y amnios deshidratado (figura 11A) mostraron sólo una granulación y epitelización ligeramente aumentadas en comparación con el control. Por el contrario, la herida tratada con la membrana placentaria fresca almacenada (figura 11B) mostró un aumento de la deposición de colágeno y un extenso desarrollo de folículos pilosos y glándulas sebáceas. Estos cambios son una indicación de cicatrización regenerativa de heridas sin deformidad cicatricial. La figura 12D ilustra este mayor desarrollo de folículos pilosos y glándulas sebáceas, así como la deposición de colágeno nuevo y la formación de tejido de granulación en la herida tratada con la membrana placentaria fresca almacenada. Por el contrario, estos desarrollos no están presentes en las heridas tratadas con las preparaciones de control (figura 12A), malla deshidratada (figura 12B) o amnios deshidratado (figura 12C). Además, con referencia a la figura 13A, aunque todos los grupos de tratamiento mostraron menos tejido anormal a los veintiún días en comparación con los nueve días, las heridas tratadas con membrana fresca almacenada continuaron mostrando menos tejido anormal en comparación con las heridas tratadas con malla deshidratada, amnios deshidratado y control. De manera similar, con referencia a la figura 13B, aunque las heridas de todos los grupos de tratamiento mostraron una matriz de cesta entretejida más grande, las heridas tratadas con membrana fresca almacenada mostraron una matriz de cesta entretejida más grande que con los otros tres grupos de tratamiento. A diferencia de a los nueve días, a los veintiún días, las heridas tratadas con membrana fresca almacenada mostraron un mayor número de folículos y glándulas sebáceas que en las heridas tratadas con malla deshidratada y control (figura 13C).

Conclusión

Queda claro a partir de las imágenes histológicas representativas (figuras 10 - 12) y de la cuantificación de las mismas (figuras 13A - 13C) que el tratamiento de la herida con el andamiaje de membrana placentaria fresca almacenada dio lugar a la mejor respuesta de regeneración de la piel en comparación con las preparaciones de amnios deshidratado y malla deshidratada. Las heridas tratadas con la membrana fresca almacenada mostraron evidencias de reepitelización a los nueve días. La capa epitelial en estas heridas se convirtió en una epidermis estratificada gruesa con proyecciones en forma de dedos que se extendían hacia la capa dérmica, lo que representa una cicatrización epidérmica sana. Por el contrario, las otras preparaciones mostraron solo una reepitelización limitada a lo largo del lecho de la herida nueve días después del procedimiento.

La presencia de vasos sanguíneos pareció ser mayor en el punto de tiempo de nueve días en comparación con el punto de tiempo de veintiún días para todos los grupos. El amnios deshidratado parecía proporcionar el mayor nivel de formación de vasos. Es evidente que el tejido se estaba remodelando y los vasos se estaban rompiendo a medida que avanzaba el proceso de cicatrización de la herida.

Estos datos sugieren que las membranas placentarias frescas almacenadas de manera hipotérmica aceleraron el proceso de cicatrización de heridas. Además, los injertos frescos almacenados mejoraron la capacidad del cuerpo para regenerar el tejido de la piel que se parece mucho a la piel sana. Esto es evidente por la formación epidérmica temprana de folículos pilosos y glándulas, así como por el alto grado de matriz de cesta entretejida. Las preparaciones de placenta frescas almacenadas de manera hipotérmica ilustraron una respuesta sorprendentemente mayor en la cicatrización de heridas.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de almacenamiento de tejido ex vivo que comprende almacenar de manera hipotérmica una membrana placentaria a una temperatura entre 0 °C y 20 °C en una solución que incluye medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), tampón HEPES para mantener el pH fisiológico y albúmina de plasma humano a una concentración de 2,0 g/l a 3,0 g/l.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la membrana placentaria se almacena de manera hipotérmica a una temperatura entre más de 0 °C y menos de 10 °C en la solución.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la albúmina de plasma humano es albúmina humana recombinante (rhA).

4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la membrana placentaria y la solución se almacenan de manera hipotérmica en un recipiente sellado.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la membrana placentaria se almacena de manera hipotérmica entre bandejas anidadas.

6. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende fragmentar la membrana placentaria antes de almacenar de manera hipotérmica la membrana placentaria en la solución.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, que comprende adsorber la membrana placentaria fragmentada en una matriz de colágeno de mamífero antes de almacenar de manera hipotérmica la membrana placentaria en la solución.

8. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende añadir cartílago triturado a la solución.

9. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la membrana placentaria no se congela antes o durante el almacenamiento hipotérmico en la solución.

10. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el tampón HEPES está presente a una concentración de 20 mM a 30 mM.