BR112013028257B1 - Composição de fármaco biológico compreendendo células vivas e seu método de manipulação, método de fornecer composições de células vivas para uso em imunoterapia e uso de células vivas. - Google Patents

Composição de fármaco biológico compreendendo células vivas e seu método de manipulação, método de fornecer composições de células vivas para uso em imunoterapia e uso de células vivas. Download PDF

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Abstract

methods for handling biological drugs containing living cells abstract of the disclosure the present invention includes methods for handling live cell compositions in non-nutritive buffer. the cells in the compositions maintain their identity and functional characteristics after being stored in non-nutrititive media up to about 72 hours. the storage method enables the cells to be manufactured at a processing facility and shipped to a point of care site. the invention also includes compositions that have been stored in non-nutritive buffer at storage temperatures while maintaining the functional characteristics. ********************************* tradução do resumo resumo patente de invenção: "métodos para a manipulação de medicamentos biológicos contendo células vivas". a presente invenção inclui métodos para a manipulação de composições de células vivas em tampão não nutritivo. as células nas composições mantêm a sua identidade e características funcionais após serem armazenadas em meios não nutritivos até cerca de 72 horas. o método de armazenagem permite que as células sejam fabricadas em uma instalação de processamento e enviadas até um ponto de atendimento local. a invenção também inclui composições que foram armazenadas em tampão não nutritivo em temperaturas de armazenamento, enquanto mantém as características funcionais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO DE FÁRMACO BIOLÓGICO COMPREENDENDO CÉLULAS VIVAS E SEU MÉTODO DE MANIPULAÇÃO, MÉTODO DE FORNECER COMPOSIÇÕES DE CÉLULAS VIVAS PARA USO EM IMUNOTERAPIA E USO DE CÉLULAS VIVAS.
CAMPO [001] Esta invenção refere-se aos métodos para a manipulação de fármacos biológicos contendo suspensões de células vivas formuladas em tampão não nutritivo. Mais especificamente, a presente invenção refere-se ao acondicionamento, expedição e distribuição de suspensões de células imunes em meios não nutritivos, por meio dos quais as células conservam as suas propriedades únicas de identidade, função e viabilidade.
ANTECEDENTES [002] A terapia celular é uma terapia potencialmente curativa contra tumores, vírus e bactérias patogênicas. A terapia celular também pode ser utilizada para tratar doenças auto-imunes (por exemplo, artrite reumatóide, esclerose múltipla e diabetes do tipo I), distúrbios neurológicos (tais como a doença de Alzheimer, ALS e de Parkinson), assim como um tratamento anti-envelhecimento, cicatrização de feridas e tratamento de distúrbios cardiovascular. O aproveitamento da energia do sistema imunitário para tratar ou prevenir doenças é um dos principais objetivos da imunoterapia. Uma variedade dos métodos e composições de imunoterapia foi desenvolvida a fim de iintensificar ou suprimir a resposta imune nos pacientes. Os métodos de terapia celular muitas vezes envolvem manipulações ex-vivo tais como proliferação, diferenciação e/ou ativação de células. As células que são mais do que minimamente manipuladas devem ser consideradas fármacos biológicos pela United States Food and Drug Administration (USFDA), assim como pelas agências reguladoras em outras jurisdições. Antes
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2/34 que tais fármacos biológicos possam ser comercializados para o tratamento ou prevenção de qualquer doença, estes produtos devem em primeiro lugar ser investigados em ensaios clínicos humanos sob uma Investigational New Drug Application (IND) ou equivalente.
[003] Para uso comercial, os processos utilizados para a fabricação de fármacos biológicos contendo células vivas devem ser padronizados de modo que as células resultantes tenham critérios de liberação predeterminados de identidade, funcionais e de viabilidade. Os processos para motivar a proliferação, diferenciação e/ou ativação de células destinadas para uso como um fármaco biológico geralmente ocorrem ex-vivo onde as células são mantidas em meios de cultura ricos em nutrientes. No entanto, antes da administração das células em seres humanos, as células devem ser transferidas para um tampão de infusão sem nutrientes. Visto que essas soluções tampão não contêm nutrientes, as células permanecem viáveis durante apenas curtos períodos de tempo. Além disso, mesmo que as células permaneçam viáveis após serem colocadas em tampão de infusão sem nutriente, elas rapidamente perdem as suas características únicas de identidade e funcionais. A perda das suas características únicas de identidade e funcionais desqualifica as células de serem usadas como um fármaco biológico. Esta limitação requer que as células destinadas para uso em fármacos biológicos devem ser formuladas no ou perto do ponto de tratamento. O requisito de que as células sejam formuladas no ponto de tratamento ou próximas a ele devido à vida útil limitada dos produtos de células vivas na formulação, limita gravemente a viabilidade comercial desta classe de produto.
[004] As células vivas são relativamente estáveis em meios de cultura ricos em nutrientes. Exemplos de meios de cultura ricos em nutrientes incluem, por exemplo, X-Vivol 5 (BioWhittaker, Walkersville, MD), RPMI 1640, DMEM, Ham's F12, McCoys 7A e Medium 199. O
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3/34 meio pode ser suplementado com ingredientes adicionais incluindo soro, proteínas do soro, supressão do crescimento e substâncias promotoras do crescimento, tais como anticorpos monoclonais mitogênicos e agentes seletivos para a seleção de células geneticamente planejadas ou modificadas. No entanto, a transferência das células para o tampão não nutritivo tal como é requerido para a administração a um paciente pode levar à rápida degradação da identidade celular, da viabilidade celular e das características funcionais das células. Exemplos de tampões sem nutrientes incluem, por exemplo, soluções isotônicas tais como a salina normal, a salina tamponada com fosfato, dextrose a 5 %, Plasma-Lyte (Baxter Scientific, Deerfield, IL) e Normasol (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Além disso, quando as células são transferidas para o tampão não nutritivo, geralmente acredita-se que os reagentes que fornecem a ativação e/ou sinais de diferenciação, assim como outros componentes tais como moléculas estimuladoras ou citocinas, devem ser removidos antes da transferência para o tampão não nutritivo (ver a Patente U.S. 6.867.041 de Berenson et al). Portanto, as células em tampão não nutritivo geralmente possuem uma vida útil limitada e podem, por exemplo, começar a perder as suas propriedades de identificação e atividade dentro de minutos e raramente mantêm as suas características funcionais e identidade durante mais do que algumas horas.
[005] Atualmente, as composições imunoterapêuticas que incluem células vivas são geralmente produzidas em uma instalação de cGMP próxima ao ponto de tratamento do paciente (Ver a Publicação de Patente US no. 2003/0175242 de Gruenberg). A formulação de fármacos biológicos com células vivas deve ser executada sob condições altamente controladas e estéril em instalações de cGMP. As células vivas são manipuladas na instalação de cGMP e formuladas para infusão em um paciente. Visto que as células são preparadas para
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4/34 infusão, as células são rapidamente transferidas para o ponto do local de tratamento e administradas ao paciente. A principal desvantagem deste processo é que as instalações de cGMP necessitam estar presentes perto de cada ponto do local de tratamento. As instalações de cGMP requerem capital monetário considerável para prover de auxiliares e operar sob as normas e regulamentos requeridos. A necessidade de estabelecer uma multiplicidade desses centros em cada ponto de tratamento ou próximo a ele é a de custo proibitivo e uma grave limitação para o potencial comercial desta classe de fármaco. Isto leva a uma difícil escolha de incorrer grande despesa através da construção de um grande número de instalações de cGMP a fim de aumentar a acessibilidade aos pacientes, ou fornecer acessibilidade limitada aos pacientes através da construção de apenas um número limitado de instalações de cGMP para minimizar as despesas de capital. Assim, existe uma necessidade no campo de produtos terapêuticos de células vivas para métodos que permitem as células em tampão não nutritivo terem uma vida útil mais prolongada. Além disso, é necessário um método que permita o acondicionamento, expedição e distribuição em massa de produtos celulares formulados colocados em suspensão em tampão de infusão não contendo nutrientes.
[006] Os problemas com a manutenção da identidade e função das células usadas na imunoterapia adotiva após a formulação são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. No. 2003/0175272 de Gruenberg. Esta publicação ensina que as células T devem ser reativadas imediatamente antes da administração ao paciente (não mais do que 4 horas antes da infusão) para manter as características funcionais da produção de citocinas. A função das células pode ser mantida até 48 horas apenas se a formulação inclui plasma autólogo. No entanto, a coleta de plasma de cada paciente planejado não é conducente para a distribuição e comercialização em
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5/34 massa.
SUMÁRIO [007] Em um primeiro aspecto, esta invenção inclui uma composição de fármaco biológico. A composição de fármaco compreende células vivas formulados em tampão não nutritivo. As células vivas, após serem armazenadas durante mais do que cerca de 6 horas no tampão não nutritivo, mantêm a sua identidade e pelo menos uma característica funcional que define as células vivas antes da formulação do tampão não nutritivo. Estas células vivas são úteis na imunoterapia após o armazenamento no tampão não nutritivo. Elas mantêm a sua identidade e pelo menos uma característica funcional que define as células vivas antes da formulação do tampão sem nutriente durante pelo menos 72 horas.
[008] Em outro aspecto, esta invenção inclui um método de manipulação de uma composição de fármaco biológico com células vivas. O método compreende a formulação das células vivas em um tampão não nutritivo e a manutenção das células vivas no tampão não nutritivo em uma temperatura de armazenamento abaixo de cerca de 20 oC. As células vivas mantêm a sua identidade e pelo menos uma das características funcionais das células que definem as células vivas antes da formulação no tampão não nutritivo. As células vivas são úteis para a imunoterapia depois de serem armazenadas durante mais do que cerca de 72 horas no buffer não nutritivo. De preferência, a temperatura de armazenamento está em uma faixa entre cerca de 4 °C e cerca de 8 °C e a concentração das células no tampão não nutritivo é de cerca de 107 células/ml ou maior. Nas composições de células T, as células vivas são preferivelmente formuladas em um estado ativado. A fim de ativar as células T, é preferível utilizar anticorpos monoclonais imobilizados reativos às moléculas da superfície celular. De preferência, as moléculas da superfície celular são uma combinação de primeiro um
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6/34 dos seguintes: CD3, MHCI, MHCII, CD2 e segundo uma molécula coestimuladora. De preferência, a molécula co-estimuladora é CD28. As células vivas são colocadas em um recipiente ou seringa flexível, em que o recipiente ou seringa flexível é acondicionado em um dispositivo de temperatura controlada que mantém as células vivas na temperatura de armazenagem. O método também inclui a expedição e distribuição do pacote no dispositivo de temperatura controlada para o ponto de tratamento.
[009] Em mais outro aspecto, a presente invenção inclui um método de fornecer composições de células vivas a um ponto de instalação de tratamento. O método compreende a formulação das células vivas em um tampão não nutritivo em uma instalação de processamento e o transporte das células para um ponto de instalação de tratamento em uma embalagem equipada para manter uma temperatura de armazenamento abaixo de cerca de 20 °C. As células vivas estão na temperatura de armazenagem durante até cerca de 72 horas enquanto mantém a sua identidade e pelo menos uma das características funcionais das células vivas úteis na imunoterapia.
[0010] Em um outro aspecto, esta invenção inclui um método de administração da imunoterapia a um paciente. O método compreende a administração de uma composição que inclui as células vivas formuladas em tampão não nutritivo, em que a composição foi armazenada durante até cerca de 72 horas no tampão não nutritivo, em que as células vivas mantêm a sua identidade e pelo menos uma das características funcionais das células que definem as células vivas antes da formulação do tampão não nutritivo, as células vivas úteis na imunoterapia.
[0011] Em mais um outro aspecto, esta invenção inclui outro método de administração de imunoterapia em um paciente. O método compreende a administração de uma composição que inclui as células
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7/34 vivas formuladas em tampão não nutritivo, em que a composição foi anteriormente armazenada em um estado congelado, por exemplo, em nitrogênio líquido, durante até 2 anos ou mais e foi descongelada e formulada e depois armazenada durante até cerca de 72 horas no tampão não nutritivo, em que as células vivas mantêm a sua identidade e pelo menos uma das características funcionais das células que definem as células vivas antes da formulação no tampão não nutritivo, as células vivas úteis na imunoterapia.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0012] A Fig. 1A é uma representação gráfica da variação de temperatura no recipiente durante o transporte onde o recipiente não foi pré-condicionado.
[0013] A Fig. 1B é uma representação gráfica da temperatura registrada dentro da caixa isolada com aerogel pré-condicionada.
[0014] A Fig. 1C é uma representação gráfica da temperatura do ar durante o transporte.
[0015] As Figs. 2A-2C mostram a expressão de CD40L para as células HTC273, HTC245, e HTC264, respectivamente, antes e após o acondicionamento e expedição.
[0016] As Figs. 3A-3C mostram a viabilidade celular das células
HTC273, HTC245, e HTC264, respectivamente, antes e após o acondicionamento e expedição.
[0017] As Figs. 4A-4C mostram a secreção de IFN-γ das células
HTC273, HTC245, e HTC264, respectivamente, antes e após o acondicionamento e expedição.
[0018] As Figs. 5A-5C mostram a secreção de IFN-γ das células
HTC273, HTC245, e HTC264, respectivamente, antes e após o acondicionamento e expedição seguido pela incubação a 37 °C durante 6 horas.
[0019] As Figs. 6A-6C mostram a expressão do CD40L das células
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HTC273, HTC264 e HTC245, respectivamente, e formuladas para a administração ID, IT e IV.
[0020] As Figs. 7A-7C mostram a viabilidade celular para as células
HTC273, HTC264 e HTC245, respectivamente, e formuladas para a administração ID, IT e IV.
[0021] As Figs. 8A-8C mostram a secreção de IFN-γ das células
HTC273, HTC264 e HTC245, respectivamente, e formuladas para a administração ID, IT e IV.
[0022] As Figs. 9A-9C mostram a expressão de CD40L de células
HTC273, HTC264 e HTC245, respectivamente, formuladas para a administração ID, IT e IV e armazenadas durante 24 e 48 horas.
[0023] As Figs. 10A-10C mostram a secreção de IFN-γ de células
HTC273, HTC264 e HTC245, respectivamente, formuladas para a administração ID, IT e IV e armazenadas durante 24 e 48 horas.
[0024] As Figs. 11A-11C mostram a viabilidade das células
HTC273, HTC264 e HTC245, respectivamente, formuladas para a administração ID, IT e IV e armazenadas durante 24 e 48 horas.
[0025] As Figs. 12A-12C mostram a expressão de CD40L, a viabilidade das células, IFN-γ através das células HTC264 após 24, 48 e 72 horas de armazenagem.
[0026] A Fig. 12D mostra a secreção de IFN-γ através das células
HTC264 após 72 horas de armazenagem e incubação a 37 oC durante 24 horas.
[0027] As Figs. 13A-13C mostram a expressão de CD40L, a viabilidade das células, IFN-γ através das células HTC245 após 24, 48 e 72 horas de armazenagem.
[0028] A Fig. 13D mostra a secreção de IFN-γ através das células
HTC245 após 72 horas de armazenamento e incubação a 37 oC durante 24 horas.
[0029] As Figs. 14A-14C mostram a expressão de CD40L, a
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9/34 viabilidade das células, IFN-γ através das células HTC273 após 24, 48 e 72 horas de armazenagem.
[0030] A Fig. 14D mostra a secreção de IFN-γ através das células
HTC273 após 72 horas de armazenamento e incubação a 37 °C durante 24 horas para 3 bateladas diferentes de células.
[0031] As Figs. 15A-15C mostram a expressão de CD40L para CAC e CFB após 48 horas para HTC245, HTC264 e HTC273, respectivamente.
[0032] As Figs. 16A-16C mostram a viabilidade celular para CAC e
CFB após 48 horas para HTC245, HTC264 e HTC273, respectivamente. [0033] As Figs. 17A-17C mostram a secreção de IFN-γ para CAC e
CFB após 48 horas para HTC245, HTC273 e HTC264, respectivamente. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS [0034] Esta invenção refere-se ao acondicionamento, armazenagem e distribuição de produtos de fármacos biológicos de células vivas formulados em tampão não nutritivo que podem apresentar características celulares úteis para a imunoterapia mesmo depois de períodos de tempo prolongados. Estes fármacos biológicos de células vivas podem manter a viabilidade assim como a identidade predeterminada e as características funcionais mesmo após cerca de 72 horas no tampão não nutritivo.
[0035] Em algumas modalidades exemplares, as células de memória Th1 imunológicas utilizadas como um produto de fármaco biológico podem manter a viabilidade, reter a identidade predeterminada (CD4+, CD45RO+, CD40Lhi, CD62Llo) e recuperar os critérios funcionais tais como secreção de IFN-gama > 1000 pg/106 células/4 h. Estas células de memória Th1 imunológicas podem apresentar essas características celulares durante até pelo menos cerca de 72 horas quando formuladas em um tampão não nutritivo com microglóbulos revestidos com CD3/C28 e mantidas em um estado refrigerado.
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10/34 [0036] Os produtos biológicos que incluem as células vivas podem ser acondicionados em condições ambientalmente controladas para manter as condições de armazenagem desejadas e expedidas quase para qualquer lugar do mundo até os pontos de tratamento por um serviço de correio expresso (por exemplo, Federal Express, United Parcel Service (UPS), e os correios internacionais semelhantes). De preferência, a embalagem com as células vivas é armazenada e transportada sob temperaturas de refrigeração. No ponto de tratamento, as células formuladas podem ser removidas da embalagem e administradas a um paciente. As células formuladas permanecem estáveis após a remoção da embalagem refrigerada durante até cerca de 6 horas. De preferência, as células são em primeiro lugar removidas da embalagem refrigerada no ponto de tratamento e deixadas equilibrar na temperatura ambiente de 1 a 2 horas antes da administração ao doente. As células transportadas são surpreendentemente estáveis e podem ser usadas para métodos semelhantes como as células que não foram armazenadas por períodos de tempo prolongados. Alternativamente, as células são armazenadas e transportadas em um estado congelado até um ponto de tratamento. As células podem ser armazenadas em um estado congelado em um ponto de tratamento e ser formuladas em um sistema estéril automatizado ou semiautomatizado fechado e depois armazenadas no local em um estado refrigerado durante até ao redor de 72 horas antes da administração a um paciente.
[0037] As células vivas podem ser qualquer célula que é mais do que minimamente manipulada quando este termo for utilizado pela FDA para determinar se o produto celular é um fármaco biológico que requer uma avaliação em seres humanos apenas sob uma Investigational New Drug (IND) Application ou equivalente e fabricado sob Manufacturing Practices (GMP) de acordo com 21 C.F.R. partes 211, 606 e 820
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11/34 conforme aplicável.
[0038] As células vivas podem ser de um único tipo ou uma mistura contanto que elas tenham os critérios definidos de identidade e funcionais. As células podem ser naturais ou planejadas, derivadas de doadores autólogas, alogênicos e/ou xenogênicos. Embora as células vivas sejam o ingrediente ativo do fármaco biológico, outras substâncias podem ser adicionadas às células, tais como as proteínas biologicamente ativas, peptídeos, produtos químicos, nucleotídeos (RNA, DNA) e/ou dispositivos. As células podem ser colocadas em suspensão livremente na formulação ou ligadas à uma superfície ou dispositivo ou encapsuladas em um dispositivo ou material. As células devem ser destinadas para tratar ou prevenir a ocorrência de uma doença ou condição. As células podem ser infundidas, injetadas ou implantadas em qualquer local do corpo.
[0039] Por características funcionais, pretende-se incluir uma variedade de funções, particularmente funções imunes e funções de diferenciação executadas pelas células e úteis na imunoterapia e terapia de células tronco. Estas funções imunes podem incluir, por exemplo, secreção de moléculas, expressão de componentes da superfície celular, reconhecimento das moléculas, a capacidade de responder às moléculas e desenvolver-se e/ou modificar-se em um tipo particular de célula ou fazer com que outras células no corpo cresçam, modifiquem, morram ou de alguma forma alterem a função normal ou da doença, assim como outras funções imunológicas e de diferenciação celular conhecidas na técnica. As funções imunológicas podem ser processos, ou cascatas de processos ou produção de moléculas que estão envolvidas na resposta do sistema imune inata e/ou adaptativa ou modulação da resposta imune adaptativa ou inata. As funções podem estar relacionadas com as funções imunológicas mediadas pelas células e/ou ao sistema humoral, funções tanto imunoestimulanes
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12/34 quanto imunossupressoras. As características funcionais podem estar relacionadas com a memória imunológica ou relacionadas com a distinção entre os próprios e outros antígenos, ou o reconhecimento de patógenos, tais como bactérias, vírus ou fungos, assim como tumores ou outras células ou tecidos anormais ou indesejados. Outras funções podem estar relacionadas com as moléculas de superfície que medeiam tais funções como o movimento para um órgão ou tecido ou local particular, moléculas superficiais, este bloco, promovem ou de outra forma modulam as respostas imunes ou permitem a diferenciação em um tipo de célula particular.
[0040] Esta divulgação descreve produtos fármacos biológicos que incluem células vivas formuladas em tampão não nutritivo como o ingrediente ativo. Em algumas modalidades, as células são células imunes vivas que podem ser utilizadas para a imunoterapia ou terapia de células tronco. As composições são estáveis em tampão não nutritivo durante pelo menos cerca de 6 horas na temperatura ambiente e durante pelo menos cerca de 24, preferivelmente pelo menos cerca de 48, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 72 horas nas temperaturas de refrigeração. Surpreendentemente, as células vivas nas composições podem manter as suas características de identidade, viabilidade e funcionais que elas apresentaram em meios contendo nutrientes mesmo após a formulação em tampão sem nutrientes. As composições aqui descritas podem ser acondicionadas e vantajosamente ser expedidas e distribuídas usando correios comerciais em recipientes que mantêm as condições adequadas de armazenamento a partir de uma unidade de processamento até um ponto de tratamento. Tais recursos podem resultar em economias substanciais de trabalho, tempo e dinheiro na produção e administração de composições terapêuticas contendo células vivas. Além disso, a acessibilidade das composições terapêuticas de células vivas para os
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13/34 pacientes é muito maior já que uma unidade de processamento pode produzir, acondicionar e distribuir as células em qualquer ponto de local de tratamento no mundo.
[0041] Esta divulgação também descreve os métodos de manutenção de suspensões de células vivas por longos períodos de tempo em tampão não nutritivo. Os métodos incluem a transferência das células vivas para dentro do tampão não nutritivo e o seu armazenamento em uma temperatura de armazenamento em refrigerador. Em algumas modalidades, as composições de células vivas são armazenadas sob condições de refrigeração. Quando desejável, as composições são removidas da armazenagem e colocadas na temperatura ambiente durante um período de tempo. Em algumas modalidades, as características funcionais das células vivas são substancialmente recuperadas após as suspensões de células vivas terem sido colocadas ao redor da temperatura ambiente durante um período de tempo. Em outras modalidades as características funcionais das células vivas são substancialmente recuperadas após as suspensões de células vivas terem sido colocadas em condições fisiológicas durante um período de tempo.
[0042] As composições terapêuticas aqui descritas incluem as células vivas. Por células vivas, entende-se que > 70 % das células são viáveis como determinado por técnicas de ensaio apropriadas tais como a extrusão de azul tripano, MTT ou detecção bioluminescente dos níveis de ATP de tal modo a que as células sejam capazes de manipulações ex vivo tais como a expansão, diferenciação e/ou ativação sob condições apropriadas. As composições, no entanto, podem incluir algumas células inativadas, células irradiadas e/ou células não viáveis. As células vivas podem ser derivadas de várias fontes incluindo, por exemplo, linhagens celulares imortalizadas, culturas de células primárias, fluidos biológicos, tecidos, sangue do cordão umbilical,
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14/34 sangue periférico, medula óssea, alíquotas congeladas de células e outros mais. As células vivas derivadas de outras fontes que são capazes de manipulações ex-vivo como descrito acima também estão dentro do escopo da invenção.
[0043] As células na composição terapêutica podem ser células alogênicas. As células derivadas, por exemplo, do sangue ou medula de dadores alogênicos podem ser processadas de uma maneira desejada e depois formuladas para infusão em um paciente. A formulação por infusão colocada em uma seringa ou embalagem de transferência ou outro dispositivo adequado para a sustentação de produtos de uso em seres humanos pode ser acondicionada e expedida até o ponto do local de tratamento para a administração no paciente. Alternativamente, as células na composição terapêutica podem ser células autólogas que foram manipuladas, formuladas, acondicionadas e expedidas e devem ser reinfundidas no mesmo paciente. As células vivas também podem ser derivadas de uma fonte não humana e foram manipuladas, formuladas, acondicionadas e expedidas para a administração em seres humanos (xenogênicas). As mesmas composições terapêuticas descritas para a administração humana também podem ser usadas na terapêutica não humana e configurações de prevenção de doenças.
[0044] Em uma modalidade onde as células vivas nas composições são células imunes, estas células imunes podem incluir células derivadas da medula óssea ou sangue do cordão umbilical, granulócitos, tais como neutrófilos, basófilos e eosinófilos. As células imunes também podem ser monócitos, macrófagos, células dendríticas, células assassinas naturais, linfócitos incluindo as células B, células T e células NKT. As células T podem ser, por exemplo, células CD4+ (incluindo células Th0, Th1, Th2, Th17 e Treg) e/ou células CD8+ (Tc1 e Tc2).
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15/34 [0045] Um método de imunoterapia para acentuar a resposta imune celular em indivíduos é um tipo de terapia celular chamado imunoterapia adoptiva. A terapia celular é um fármaco cujo ingrediente ativo é totalmente ou em parte uma célula viva. A imunoterapia adoptiva é uma terapia celular que envolve a remoção de células do sistema imunológico de um indivíduo, o processamento ex-vivo (isto é, ativação, purificação e/ou expansão das células) e a subseqüente infusão das células resultantes de volta para o mesmo indivíduo (terapia autóloga) ou em um indivíduo diferente (terapia alogênica).
[0046] O produto de fármaco biológico pode incluir células vivas que foram manipuladas utilizando uma variedade de manipulações ex vivo para a imunoterapia adoptiva. As células vivas que foram manipuladas ex vivo podem incluir, por exemplo, células LAK (Rosenberg U.S. Pat. No. 4,690,915), células TIL (Rosenberg U.S. Pat. No. 5,126,132), células T citotóxicas (Cai, et al U.S. Pat. No. 6,255,073; Celis, et al. U.S. Pat. No. 5,846,827), células do nódulos linfáticos de drenagem do tumor expandido (Terman U.S. Pat. No. 6,251,385), várias preparações de linfócitos (Bell, et al U.S. Pat. No 6,194,207; Ochoa, et al. U.S. Pat. No 5,443,983; Riddell, et al. U.S. Pat. No. 6,040,180; Babbitt, et al. U.S. Pat. No. 5,766,920; Bolton U.S. Pat. No. 6,204,058), células CD8+ TIL (Figlin et al. (1997) Journal of Urology 158:740), células T CD4+ ativadas com anticorpo monoclonal anti-CD3 na presence de IL-2 (Nishimura (1992) J. Immunol. 148:285), células T co-ativadas com anti-CD3 e anti-CD28 na presença de IL-2 (Garlie et al. (1999) Journal of Immunotherapy 22:336) células T CD8+ CTL específicas do antígeno produzidas ex-vivo e expanddidas com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 (mAb) na presença de IL-2 (Oelke et al. (2000) Clinical Cancer Research 6:1997), e injeção de células tumorais autólogas irradiadas misturadas com Bacille Calmette-Guerin (BCG) para vacinar indivíduos seguida sete dias mais tarde através da recuperação da drenagem de células T
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16/34 dos nódulos linfáticos que são ativadas com anti-CD3 mAb seguido pela expansão com IL-2 (Chang et al. (1997) Journal of Clinical Oncology 15:796).
[0047] Em uma modalidade exemplar, a composição terapêutica desta divulgação inclui pelo menos algumas células T, preferivelmente as células T alogênicas. Estas células T também são de preferência ativadas através da ativação da superfície celular para formar células de memória Th1 ativadas. As células T podem ser ativadas em uma variedade de formas, incluindo pelo uso de anticorpos monoclonais imobilizados específicos para moléculas da superfície das células T. As células T ativadas adequadas são, por exemplo, descritas na Patente U.S. No 7.435.592 e aqui incorporada por referência. As células de preferência possuem componentes da superfície celular que são reticulados através dos anticorpos monoclonais ou outros agentes de ligação. Estes anticorpos monoclonais e/ou agentes de ligação são de preferência reticulados, por exemplo, mediante a imobilização em uma superfície sólida a fim de ativar as células T. Estas são aqui referidas como células ativadas na cultura (CAC). Estas CAC preparadas ex vivo podem ser congeladas para uso futuro ou formuladas para infusão.
[0048] Nas modalidades preferidas, as CAC preparadas ex vivo são armazenadas congeladas até que necessitadas para a administração no paciente. Antes da administração ao paciente, as CAC são descongeladas, lavadas e reativadas em meio nutriente através da reticulação dos componentes de ligação da superfície celular tais como CD3 e CD28 como descrito, por exemplo, na Patente U.S. No 7.402.431 que é aqui incorporada por referência. As CAC, juntamente com o agente de reticulação, podem então ser lavadas e transferidas para um tampão não nutritivo tal como um tampão de formulação. As células reativadas em tampão de formulação são aqui referidas como células em tampão de formulação (CFB). As CFB podem ser administradas ao
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17/34 paciente para propósitos terapêuticos. Geralmente, estas células reativadas, logo que transferidas para o tampão não nutritivo possuem uma vida útil limitada. As células vivas podem ser formuladas em uma densidade de pelo menos cerca de 106 células por ml, de preferência ao redor de 107 células por ml ou superior. Em algumas modalidades, as células vivas podem ser formuladas em uma densidade ao redor de 108 células por ml ou mais elevadas. A concentração específica das células pode ser determinada pelo uso específico das células e pelo protocolo de tratamento.
[0049] A composição terapêutica também pode incluir vários outros componentes. Estes componentes podem incluir, por exemplo, agentes que mantêm as células vivas no estado de ativação desejado. Em uma modalidade exemplar, a composição terapêutica pode incluir agentes que mantêm as células T em um estado ativado tal como Dynabeads ClinExVivo™ descrito nos exemplos abaixo.
[0050] A presente invenção inclui métodos de armazenamento e manipulação das composições de células vivas para aumentar o prazo de validade. O prazo de validade como aqui usado é definido como a quantidade de tempo após o que a formulação de CFB mantém a viabilidade, a identidade pré-definida e as características funcionais. Geralmente, as células são transferidas para o tampão não nutritivo que é apropriado para infusão em um paciente. As células podem estar em uma variedade de tampões não nutritivos. O tampão não nutritivo, como aqui referido, é qualquer tipo de meio, tampão ou outro líquido que carece dos componentes adequados para sustentar a proliferação e/ou expansão celular. Os tampões não nutritivos geralmente são isotônicos, estéreis USP, livres de pirogênio e contêm os componentes apropriados e/ou o sistema tamponante para manter as células vivas intactas e são licenciados para uso parenteral humano. Em uma modalidade exemplar, o tampão não nutritivo é um tampão de formulação que é
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Plasmalyte A (Baxter Scientific, Deerfield, IL) com 1 % de albumina do soro humano (McKesson, San Francisco, California).
[0051] Nas modalidades com células ativadas, particularmente células Th1 ativadas, os sinais de ativação para as células são mantidos mesmo quando as células são transferidas para o tampão não nutritivo. Por exemplo, nas modalidades onde as células são ativadas através da reticulação dos componentes de ligação da superfície celular, a reticulação é preferivelmente mantida no tampão não nutritivo. A manutenção da reticulação durante a armazenagem pode ser decisiva para restaurar as características funcionais da composição após a remoção da armazenagem. As composições celulares em que os componentes de ativação são removidos em tampão não nutritivo não se recuperam da mesma forma como as células que mantiveram o estado ativado.
[0052] Os métodos aqui descritos incluem também a manipulação das células vivas após as células terem sido transferidas para um tampão não nutritivo. A composição de células vivas pode ser transferida para um ambiente com uma temperatura mais fria durante o armazenamento, a fim de aumentar a vida útil das composições. A temperatura mais fria a qual as células no tampão não nutritivo são transferidas é aqui referida como a temperatura de armazenamento. As células são geralmente transferidas na temperatura de armazenamento tão rapidamente quanto possível depois de serem colocadas no tampão não nutritivo. As células são de preferência transferidas para a temperatura de armazenamento em menos do que cerca de seis horas após de serem colocadas em tampão não nutritivo, mais preferivelmente em menos do que cerca de quatro horas após serem colocadas em tampão não nutritivo. Nas modalidades ainda mais preferidas, as células são transferidas para a temperatura de armazenamento em menos do que cerca de uma hora após serem colocadas no tampão não nutritivo.
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19/34 [0053] A temperatura de armazenagem em que as composições podem ser mantidas varia, mas está geralmente abaixo da temperatura fisiológica, isto é, abaixo de cerca de 37 °C. De preferência, as células são armazenadas nas temperaturas de refrigeração. As temperaturas de refrigeração podem estar entre a faixa de cerca de -2 °C e cerca de 12 °C. Mais preferivelmente, as células são armazenadas em uma temperatura acima de 0 °C e ao redor de 10 oC. O mais preferível, as células são armazenadas entre cerca de 4 °C e cerca de 8 °C.
[0054] As composições aqui descritas também podem ser acondicionadas, expedidas e distribuídas a partir de uma unidade de fabricação ou processamento até um ponto do local de tratamento. Uma unidade de fabricação ou processamento pode ser uma unidade tal como um hospital, clínica ou em qualquer unidade de produção capaz de manipular as células vivas para fármacos biológicos em conformidade com as diretrizes estabelecidas. Um ponto de tratamento pode ser um hospital, clínica ou qualquer outro local em que um paciente é geralmente administrado com o tratamento. As composições são geralmente acondicionadas para a expedição de uma maneira que mantém as composições dentro da faixa de temperatura de armazenagem acima mencionada. As células podem ser armazenadas e expedidas em uma variedade de recipientes. As células podem ser armazenadas e expedidas, por exemplo, em um recipiente flexível, seringa e outros mais. Quando da expedição, o recipiente tal como uma seringa pode ser colocado em uma embalagem tal como uma caixa isolada. A embalagem ou caixa é, de preferência, pré-condicionada na temperatura de armazenagem desejada antes que o recipiente com as células vivas seja colocado na embalagem. As composições, por exemplo, podem ser acondicionadas em caixas carreadas com gelo ou aerogel. As embalagens são de preferência caixas isoladas que são capazes de manter as temperaturas de armazenamento desejadas,
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20/34 independentemente da temperatura externa. As caixas também são de preferência pré-condicionadas, o que significa que elas foram armazenadas ou configuradas na temperatura desejada antes do recipiente com as células vivas que são colocadas no interior. Nas modalidades preferidas, as embalagens são pré-condicionadas antes da colocação do produto biológico e as embalagens são transportadas sob condições de refrigeração ou congelamento até o ponto de tratamento. Qualquer tipo de método de expedição pode ser usado, mas nas modalidades exemplares a expedição é através dos correios comerciais.
[0055] O prazo de validade das composições aqui descritas pode ser surpreendentemente prolongado quando as composições forem armazenadas dentro da faixa de temperatura de armazenamento. O prazo de validade das composições de células vivas pode ser prolongado para mais do que cerca de 6 horas. De preferência, o prazo de validade das composições de células vivas pode ser prolongado durante mais do que cerca de 24 horas, e mais preferivelmente durante mais do que cerca de 48 horas. Nas modalidades ainda mais preferidas, o prazo de validade das composições pode ser prolongado para até cerca de 72 horas. Na modalidade mais preferida, o prazo de validade pode ser prolongado para até cerca de 120 horas. O prazo de validade maior do que cerca de 120 horas também está dentro do escopo desta invenção.
[0056] As composições celulares em tampão não nutritivo armazenadas de acordo com os métodos aqui descritos podem manter a sua viabilidade, identidade e função durante o período de armazenamento e após a remoção do armazenamento. A viabilidade das células pode ser determinada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo as técnicas de ensaio tais como extrusão por azul de tripano, MTT, 7- amino-actinomicina D ou detecção
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21/34 bioluminescente dos níveis de ATP.
[0057] A identidade das células pode ser confirmada através de uma variedade de métodos. As células podem ser avaliadas com relação à uma variedade de marcadores celulares externos e internos que são indicativos do tipo de célula particular na composição. Os marcadores externos são classificados pela designação Cluster de anticorpos monoclonais (grupo de diferenciação (CD) designado do 1o a 8o grupos experimentais sobre os antígenos de diferenciação de leucócitos humanos internacionais com o número total de (247) CDs). Os leucócitos expressam variedades distintas de moléculas em sua superfície celular, muitos dos quais refletem diferentes estágios da sua diferenciação específica da linhagem ou diferentes estados de ativação ou inativação. As moléculas da superfície celular de leucócitos são rotineiramente detectadas com anticorpos monoclonais anti-leucócitos (mAbs). Usando a combinação diferente de mAbs, é possível representar por meio de gráfico os imunofenótipos da superfície celular de diferentes subpopulações de leucócito, incluindo as subpopulações de linfócitos maduros funcionalmente distintas de células B, células T auxiliares (Th), células T citotóxicas (Tc) e células assassinas naturais (NK).
[0058] Mesmo após ao armazenamento em meios não nutritivos, as células vivas na composição apresentam as características funcionais que estavam presentes antes da formulação nos meios não nutritivos. As características funcionais podem incluir uma variedade de atividades incluindo, por exemplo, a expressão de moléculas funcionais tais como CD40L, FasL, perforina e granzima B, moléculas co-estimuladoras 41BBL, CD28, CTLA4, e citoquina induzida por ativação relacionada com TNF (TRANCE), TWEAK, PD -1, família B7, moléculas de aderência tais como as integrinas, as caderinas, e as selectinas e secreção de uma variedade de citocinas e quimiocinas e expressão de receptores para
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22/34 estas citocinas e quimiocinas. As citocinas e quimiocinas são proteínas secretadas redundantes com as funções de crescimento, diferenciação e ativação que regulam e determinam a natureza das respostas imunes e controlam o movimento das células imunes e a disposição celular dos órgãos imunizados. As citocinas podem incluir, por exemplo, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, GMCSF, IFN-gama e outras mais.
[0059] Em algumas modalidades, as características funcionais são retidas após a formulação e durante todo o armazenamento e os níveis das enzimas ou dos marcadores podem ser analisados sem demora após a remoção da armazenagem e expedição. Por exemplo, a expressão de CD40L pode ser analisada após as composições terem sido removidas do armazenamento e deixadas incubar na RT durante cerca de 2 horas. A expressão de CD40L pode ser semelhante aos níveis de expressão de CD40L no momento da formulação e armazenagem. Ver, por exemplo, as Figs. 2A-2C. Similarmente, o número de células viáveis nas composições pode ser determinado após a remoção do armazenamento e incubação na RT durante cerca de 2 horas. O número de células viáveis pode ser semelhante aos níveis de viabilidade celular no momento da formulação e armazenagem. Ver, por exemplo, as Figs. 3A-3C.
[0060] Em outras modalidades, as características funcionais podem ser recuperadas depois que as células são expostas às condições fisiológicas. Isto pode indicar que as composições celulares, após a infusão em um paciente, podem funcionar como componentes planejados e secretados ou expressos característicos das células no momento da formulação. A secreção de IFN-γ, por exemplo, pode ser deprimida quando as células forem formuladas e colocadas no armazenamento. IFN-gama pode ser aqui referido como IFN-γ ou IFNg. O retorno das células para a temperatura ambiente não restaura a secreção de IFN-g, mas a incubação das células a 37 °C durante 24
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23/34 horas aumentam a secreção de IFN-γ para níveis semelhantes aos níveis no momento da formulação. Ver, por exemplo, as Figs. 12D, 13D e 14D. Vantajosamente, a diminuição nos níveis de IFN-γ durante o armazenamento pode evitar o esgotamento dos recursos celulares. Se os recursos celulares para secreção forem suficientemente conservados durante o armazenamento, então as células em geral podem reiniciar a secreção de IFN-γ sob condições fisiológicas apropriadas. Assim, a administração da composição a um paciente pode então ainda prover o paciente com o IFN-γ e outras citocinas inflamatórias derivadas como um resultado da administração da composição terapêutica, mesmo embora a composição tenha sido armazenada durante um período de tempo prolongado antes da administração.
[0061] A extensão do prazo de validade das composições pode ser demonstrada em uma variedade de maneiras. Como aqui utilizada, a extensão da vida útil pode referir-se às células vivas nas composições mantendo a sua viabilidade, identidade e suas características funcionais mesmo após os tempos de armazenagem prolongados descritos acima. Geralmente, após o armazenamento durante pelo menos 24 horas, as composições mantêm pelo menos cerca de 50 por cento da atividade de uma característica de definida em tampão não nutritivo em relação à atividade no momento da formulação. De preferência, pelo menos cerca de 75 por cento e mais preferivelmente pelo menos cerca de 85 por cento e ainda mais preferível pelo menos cerca de 90 por cento da atividade é mantida após o armazenamento em relação à atividade no momento da formulação.
[0062] Nas modalidades preferidas, após o armazenamento durante pelo menos 48 horas, as composições mantêm pelo menos cerca de 50 por cento da atividade de uma característica definida em tampão não nutritivo em relação à atividade no momento da formulação.
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De preferência, pelo menos cerca de 75 por cento e mais preferivelmente pelo menos cerca de 85 por cento e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 por cento da atividade são mantidas após o armazenamento em relação à atividade no momento da formulação.
[0063] Nas modalidades mais preferidas, após o armazenamento durante pelo menos 72 horas, as composições mantêm pelo menos cerca de 50 por cento da atividade de uma característica definida em tampão não nutritivo em relação à atividade no momento da formulação. De preferência, pelo menos cerca de 75 por cento e mais preferivelmente pelo menos cerca de 85 por cento e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 por cento da atividade são mantidos após o armazenamento em relação à atividade no momento da formulação.
[0064] As composições celulares podem ser administradas a um paciente utilizando uma variedade de métodos. As composições podem ser administradas por via intradérmica, intravenosa, intratecal, intratumoral, e outras mais.
EXEMPLOS [0065] Materiais: CD40L conjugado com PE foi adquirido da
Beckman Coulter, Brea, CA. 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD) (1000x) foi adquirido da Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI. PlasmaLyte A foi adquirido da Baxter Scientific, Deerfield, IL. Albumina do soro humano (HSA) foi adquirida da McKesson, San Francisco, California. Inibidor da Ligação FcR foi adquirido da eBioscience, San Diego, CA. Dynabeads ClinExVivo™ foi adquirido da Invitrogen, Carlsbad, CA.
[0066] Preparação de Células em Tampão de Formulação (CFB) As células ativadas em meios de cultura (CAC) foram colocadas em meio cRPMI para lavagem. O tempo foi registrado para indicar o início do protocolo de formulação. As células em meio cRPMI foram
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25/34 centrifugadas, o sobrenadante removido e as células colocadas novamente em suspensão em tampão de cRPMI. A viabilidade celular foi determinada mediante o uso de ensaios com azul de tripano. O número total de células e a concentração de células vivas foram usados para determinar a porcentagem das células viáveis . Se a amostra foi maior do que 80 por cento de viabilidade celular, então o processo continuou para a reativação e formulação das células.
[0067] As células CAC foram colocadas novamente em suspensão em uma concentração de 1 x 107 células/ml. A reativação foi executada em uma concentração de células vivas de 1 x 107 células/ml. A reativação foi executada com uma placa de 24 reservatórios, placa de 6 reservatórios ou um frasco de 75 cm3 dependendo do volume. Dynabeads ClinExVivo™ CD3/CD28 foram adicionados para reativar as células e incubadas em 36 a 38 oC e 5 % de CO2 durante 4 horas. Após a incubação durante cerca de 4 horas, então as células foram removidas e transferidas para um tubo de 50 ml com tampão de formulação final (FFB). O FFB é Plasmalyte A com 1 % HSA. As células reativadas foram centrifugadas, o sobrenadante removido e colocado novamente em suspensão com FFB. Estas são referidas como as células no tampão de formulação (CFB).
[0068] As CFB foram colocadas novamente em suspensão com
FFB em uma concentração 107 células por ml. As CFB foram novamente colocadas em suspensão para a administração ID, IT ou IV. 1 ml da suspensão celular foi adicionado a uma seringa de 3 ml como uma formulação ID. As formulações IT e IV foram de 3 ml e 5 ml, respectivamente. As seringas com as formulações apropriadas foram armazenadas em refrigeração com uma temperatura média ao redor de 4 °C.
[0069] Colheita das amostras após a armazenagem - As células e o sobrenadante foram coletados em momentos diferentes. Os
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26/34 momentos foram como se segue: 0 (inicial); 2 horas na temperatura ambiente (RT); 48 horas a 4 °C, e 48 horas a 4 °C seguido de 2 horas na RT.
[0070] Em cada momento, 100 μΙ de suspensões celulares foram coletados e as células foram girados em 400 g durante 5 min a 4 °C. O sobrenadante foi então transferido mais tarde para outro tubo para a detecção de IFN-γ utilizando ELISA. As células foram colocadas novamente em suspensão em tampão de manchamento de 150 μl por citometria de fluxo. Em algumas experiências, as células foram colocadas novamente em suspensão em 100 μl de meio cRPMI e cultivadas na incubadora a 37 °C durante 24 horas com 5 % CO2. O sobrenadante extraído após 24 h de incubação e o IFN-γ foi detectado por ELISA.
[0071] Citometria de fluxo (CD40L e 7-AAD) - 50 μl de suspensão de células foram transferidos a partir do acima (150 ul) em 3 tubos eppendorf, rotulados como não manchados, CD40L e 7-AAD, respectivamente. O tubo não manchado foi incubado em gelo durante 20 min. Para o tubo de CD40L, as células foram pré-incubadas com o inibidor de ligação FcR de acordo com as instruções do fabricante durante 20 minutos em gelo. Então 40 μl de tampão de manchamento (PBS + 1 % FBS) e 10 μl de anticorpo PE-CD40L foram adicionados na suspensão de células e incubados durante um adicional de 20 minutos em gelo no escuro.
[0072] A viabilidade celular foi testada pela citometria de fluxo de 7AAD. 7-AAD intercala dentro do DNA das células mortas ou danificadas, assim a determinação de células positivas 7-AAD é um indicador da viabilidade celular. Para tubos de 7-AAD, os tubos foram centrifugados em 400 g durante 5 min a 6 oC. Após a remoção do sobrenadante, grânulos de células foram colocados novamente em suspensão em 100 μl de 1x solução de 7-AAD. O tubo foi incubado em gelo durante 15 min
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27/34 no escuro. 1 ml de tampão de manchamento foi adicionado ao tubo de CD40L e depois os 3 tubos foram centrifugados em conjunto. Após descartar o sobrenadante, as pelotas de células foram colocadas novamente em suspensão em 0,4 ml de tampão de manchamento e FACS foi executado.
[0073] ELISA de IFN-γ - O IFN-γ secretado no sobrenadante foi determinado pelo kit ELISA intercalado por IFN-γ (R&D Systems, Mpls. MN) de acordo com as instruções do fabricante.
Exemplo 1 - Esta experiência foi executada para determinar se as células no tampão de formulação (CFB) eram estáveis em baixas temperaturas após o transporte. Bateladas de suspensões de células foram formuladas em FFB e transportadas através de um serviço de correio (Federal Express). A temperatura foi monitorada por um registrador de dados. A mudança de temperatura dentro de uma caixa que não foi pré-condicionada e uma caixa isolada com Aerogel précondicionada foi monitorada. A temperatura externa também foi monitorada. Três bateladas diferentes foram formuladas e transportadas. As mostras de sobrenadante foram extraídas de células ativadas em meios de cultura (CAC), CFB adequadas após a formulação, CFB após duas horas na temperatura ambiente (RT), CFB após 48 horas a 4 °C, e CFB depois de 48 horas a 4 °C e 2 horas na RT. As CAC foram testadas com relação à expressão de CD40L e as células remanescentes foram testadas com relação à expressão de CD40L, e a viabilidade das células.
[0074] A Fig. 1A e a Fig. 1B mostram a temperatura que as células foram submetidas durante o transporte. A Fig. 1A mostra que a temperatura variou de cerca de 5 °C a cerca de 13,7 °C dentro de aproximadamente 48 horas, quando as amostras não foram acondicionadas em uma caixa de pré-condicionada. As amostras eram estáveis, indicando que uma maior flutuação de temperatura é aceitável.
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A Fig. 1B mostra que a temperatura dentro da caixa pré-condicionada e isolada permanece razoavelmente estável. Variou de 0,2 °C a 2,2 °C. A Fig. 1C mostra a variação da temperatura externa durante o período de expedição.
[0075] As Figs. 2A-2C mostram que a expressão de CD40L não se alterou muito. As Figs. 3A-3C mostram que a viabilidade celular após o processo de expedição é semelhante à viabilidade celular antes da expedição. Estes resultados indicam que a manutenção das composições terapêuticas dentro de uma ampla faixa tal como de cerca de 2 °C a cerca de 13 °C dentro da embalagem não foi prejudicial.
Exemplo 2 - Este estudo foi executado para determinar se a baixa temperatura pode prolongar a expiração de CFB. A estabilidade de diferentes formulações de CFB na RT foi executada. As CFB foram formuladas para a administração intradérmica (ID), intratumoral (IT) ou intravenosa (IV) como descrita acima. A estabilidade destas formulações foi testada para ver se a estabilidade em temperatura baixa pode ser prolongada.
[0076] As bateladas HTC264, HTC245 e HTC273 foram formuladas
ID, IT e IV e testadas com relação à expressão de CD40L, viabilidade celular e secreção de IFN-γ durante 6 horas na RT após a formulação. As Figs. 6A-6C, Figs. 7A-7C e Figs. 8A-8C apresentam os resultados desses testes. Todos os três destes parâmetros são estáveis após 6 horas na RT. As Figs. 9A-9C mostram que a expressão de CD40L é estável após o armazenamento durante 48 horas a 4 °C. As Figs. 11A11C indicam que a viabilidade celular é estável após o armazenamento durante 48 horas a 4 °C. As Figs. 10A-10C indicam que a secreção de IFN-γ não recupera igualmente após 48 horas a 4 °C. No entanto, conforme mostrado abaixo isso pode ser recuperado através da transferência de volta para RPMI e incubação a 37 °C durante 24 horas. [0077] Três bateladas (HTC264, HTC245 e HTC273) foram
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29/34 formuladas como formulações ID, IV ou IT. 4 seringas totais de cada formulação foram produzidas e incubadas a 4 °C durante períodos de tempo diferentes (1 para a RT, 1 durante 24 h a 4 °C, 1 durante 48 horas a 4 °C, 1 durante 72 h a 4 °C). As amostras foram coletadas após a incubação de volta à RT durante 2 horas. A Tabela 1 abaixo mostra os momentos, as amostras e os testes que foram executados para cada batelada de células. Os níveis de IFN-γ também foram determinados quando as células foram incubadas a 37 °C durante 24 horas.
TABELA 1
Tempo Amostras Teste
-4 h CAC CD40L
0 CFB, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
2 h CFB, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
24 h 4 °C CFB, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
24 h 4 °C - 2 h RT CFB, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
48 h 4 °C CFB, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
48 h 4 °C - 2 h RT CFB, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
72 h 4 °C CFB, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
72 h 4 °C - 2 h RT CFB, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
[0078] As Figs. 12A-12D, Figs. 13A-13D e Figs. 16A-14D mostram os resultados para as bateladas HTC264 HTC245 e HTC273, respectivamente. As formulações intradérmicas destas bateladas foram testadas como indicado. Os resultados mostraram que mantendo as CFB a 4 °C pode-se manter a expressão de CD40L na superfície da célula mesmo após 72 horas (Fig. 12A, Fig. 13A e Fig. 16A). A viabilidade celular não foi muito afetada pela baixa temperatura de armazenamento (Fig. 12B, Fig. 13B e Fig. 16B). Os níveis de secreção de IFN-γ (Fig. 12C, Fig. 13C e Fig. 16C) se deprimem quando as células são devolvidas para a RT durante apenas 2 horas. No entanto, os níveis de IFN-γ se recuperam (Fig. 12E, Fig. 13D e Fig. 14D) quando as células são transferidas de volta para meio RPMI e incubadas na temperatura fisiológica (37 °C) durante 24 horas. Isso indica que as células são ainda
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30/34 capazes de secretar IFN-γ após manter a baixa temperatura durante 72 horas. Isto sugere que se estas células forem administradas terapeuticamente, o IFN-γ pode ser produzido no paciente em níveis semelhantes às células que não foram submetidas ao armazenamento longo.
Exemplo 3 - Esta experiência foi executada para comparar a estabilidade das células CAC e das células CFB. Três bateladas diferentes de células foram formuladas como seringa ID. Uma seringa para as CAC e uma seringa para as CFB para cada batelada. As CAC foram descongeladas e lavadas com cRPMI. Após a contagem das células, o grânulo de células foi colocado novamente em suspensão em 109 células/ml com FFB e 1 ml de suspensão de células foi transferido para uma seringa de 3 ml. Para as CFB, o grânulo de células foi colocado novamente em suspensão em 109 células/ml com cRPMI e misturado com os glóbulos anti-CD3/anti-CD28. A mistura de célula e glóbulo foi incubada durante 4 horas a 37 °C com 5 % CO2. As células foram lavadas com FFB e colocadas novamente em suspensão em 107 células/ml com FFB. A suspensão de células foi transferida para uma seringa de 3 ml. Em cada momento, 100 pl de amostras foram obtidos a partir da seringa com relação aos testes de CD40L, IFN-γ, viabilidade. Após incubação a 4 °C durante 48 horas, algumas amostras foram centrifugadas em 400 g durante 5 min. para remover o FFB. Após descartar o sobrenadante, o grânulo de células foi colocado novamente em suspensão em 100 pl de cRPMI e incubado a 37 °C com 5 % CO2 durante 2 horas. O sobrenadante foi coletado para detecção de IFN-γ. A Tabela 2 abaixo lista as amostras que foram coletadas e os testes que foram executados.
TABELA 2
Tempo Amostras Teste
0 CAC, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
2 h, RT CAC, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
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Tempo Amostras Teste
48 h, 4 °C CAC, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
48 h 4° C - 2 h RT CAC, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
0 CFB, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
2 h, RT CFB, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
48 h, 4 °C CFB, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
48 h, 4 °C - 2 h RT CFB, sobrenadante CD40L, IFN-γ, viabilidade
[0079] Os resultados indicaram que a incubação de CAC para 4 °C durante 48 horas, diminuiu a expressão de CD40L sobre a superfície celular significativamente. Ver as Figs. 15A-15C. No entanto, a incubação de CFB, a 4 °C durante 48 horas pode manter a expressão de CD40L, o que sugere que a reeticulação de CD3 e CD28 é essencial para a estabilidade das células. As CFB são capazes de manter a viabilidade e secretar grandes quantidades de IFN-γ, mesmo após 48 horas de incubação a 4 °C. Ver as Figs. 16A-C e as Figs. 17A-C.
Exemplo 4 - Este estudo foi executado para determinar a estabilidade das CFB formuladas após o acondicionamento e expedição de uma unidade de produção em Jerusalém, Israel, para um ponto de tratamento. Foi crucial confirmar que o produto de CFB continua a satisfazer a identidade preestabelecida e as características funcionais após 72 horas em trânsito, visto que no final do processo de formulação, as células são transferidas para um tampão de infusão sem nutrientes, em que as células podem perder a sua viabilidade e identidade única e as características funcionais. Sabe-se que as baixas temperaturas podem reduzir a expressão do gene e a atividade das células e que esta expressão do gene pode ser restaurada pelo retorno das células de volta para a temperatura fisiológica. Por esta razão, a expedição é feita utilizando recipientes pré-validados, refrigerados e de temperatura controlada.
[0080] As células CFB foram testadas para verificar se a sua identidade pré-definida e características funcionais são mantidas após
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32/34 horas em trânsito, através da comparação das características das células antes do trânsito (no valor de referência - seringas formuladas após 4 h de ativação = FF) com aquelas obtidas após a expedição para NY e de volta, no mínimo 72 horas após a FF concluída.
[0081] Os parâmetros pré-definidos de ponto final foram:
1. Teste de viabilidade: a viabilidade de CFB deve ser > 70 % de células vivas em todos os momentos testados.
2. Teste Rápido de Endotoxina: os níveis de endotoxina da amostra coletada no valor de referência e após 72 h a 40 oC devem ser < 0,5Eu/ml.
3. Mancha de Gram: nenhuma bactéria seria observada sobre a lâmina de amostras coletadas em todos os momentos testados.
4. Manchamento na superfície - CD40L AM (CFB-CAC) > 30:
5. Esterilidade USP: nenhum crescimento da amostra formulada em todos os meios testados.
6. Secreção de INFy testada por ELISA:
6.1. INFy acumulado durante 4 horas de ativação > 1000pg de IFNy por 1 x 106
6.2. INFy acumulado durante 24 h após o valor de referência > 6000 pg por 1 x 106 células
6.3. INFy acumulado durante 24 h após 72 h em 2 oC a 8 oC > 6000 pg por 1 x 106 células.
Resultados:
processos de formulação final separados foram executados em doses de batelada HTC300.
[0082] O produto formulado, acondicionado em seringas, foi expedido com Flying Cargo (FC) para NY, e de volta para Jerusalém Israel.
[0083] As seringas em trânsito foram mantidas em 2 a 8 oC, a partir do momento final da formulação até 72 horas como foi mostrado pelo
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33/34 registrador de temperatura dentro da embalagem de expedição. Todos os resultados são resumidos na Tabela 3.
[0084] Formatar tabela conforme original a partir da pag 24
TABELA 3
Número da Formulaç ão Tipo de Célula/Te mpo Viabili dade Celular CD40L AM CFBCAC IFNy (pg/10 6célula s) Endoto xina (EU/ml ) Manch a de Gram Este ri li dade Passo u/Falh ou
HTC300 T7-71+72 CAC 97,95 % Passo u
Valor de referência de CFB 90,91 % 143,60 8.027 < 0,2 Passo u Passo u
Após 24 horas a 37 °C em cRPMI 90,24 % 192,02 45.741
Após 72 h a 4 °C n 077 Passo
Após 24 I horas a 1 37 °C em 1 cRPMI 28 9
HTC300 T7-73+74 CAC 99,40 % Passo u
Valor de referência de CFB 98,23 % 117,64 6.215 0,219 Passo u Passo u
Após 24 horas a 37 °C em cRPMI Após 72 h a 4 °C Após 24 horas a 37 °C em cRPMI 95,65 % 166,52 31.155 i 13.Í 84 0,208 Passo u
HTC300 T7-77+78 CAC 98,45 % Passo u
Valor de referência de CFB 97,61 % 165,39 8.960 0,208 Passo u Passo u
Após 24 horas a 37 °C em cRPMI 42.520
Após 72 h a 4 °C 92,81 % 231,50 1 02 Passo u
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Número da Formulaç ão Tipo de Célula/Te mpo Viabili dade Celular CD40L AM CFBCAC IFNy (pg/10 6célula s) Endoto xina (EU/ml ) Manch a de Gram Este ri li dade Passo u/Falh ou
Após 24 I horas a 1 37 °C em 1 cRPMI 1 22.583
0085] Como pode ser visto na Tabela 3, todas as três bateladas formuladas passaram todos os critérios de aceitação pré-definidos, demonstrando, portanto, a estabilidade de CFB nas condições de distribuição sugeridas.
[0086] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência às modalidades preferidas, os trabalhadores versados na técnica irão reconhecer que alterações podem ser feitas na forma e no detalhe sem se afastar do espírito e escopo da invenção.

Claims (27)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composição de fármaco biológico, caracterizada pelo fato de que compreende células vivas criopreservadas, descongeladas e reativadas formuladas em tampão não nutritivo, em que as células vivas após serem armazenadas durante mais de 24 horas no tampão não nutritivo, mantêm a sua identidade e pelo menos uma característica funcional que definem as células vivas antes da formulação no tampão não nutritivo, as células vivas úteis na imunoterapia após o armazenamento no tampão não nutritivo; a pelo menos uma característica funcional é a expressão de CD40L, FasL, perforina e granzima B, expressão de moléculas co-estimulatórias, expressão de moléculas de adesão, secreção de citocinas, quimiocinas ou combinações das mesmas; e a citocina secretada é IFN-γ e o nível de secreção de IFN-γ após o armazenamento é recuperado para pelo menos cerca de 80% em comparação com o nível no momento da formulação.
  2. 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as células vivas são colocadas em um recipiente flexível ou seringa, em que o recipiente flexível ou seringa é acondicionado em um dispositivo de temperatura controlada que mantém as células vivas dentro de temperaturas de refrigeração, a faixa de temperaturas preferida estando entre cerca de 0 °C e 10 °C.
  3. 3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as células vivas são células CD4+ e quando ativadas são células Th1.
  4. 4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que as células Th1 são ativadas pelos anticorpos monoclonais imobilizados específicos para moléculas da superfície de células T ou são ativadas pelos anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 imobilizados.
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  5. 5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que os anticorpos monoclonais fazem ligação cruzada.
  6. 6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as células vivas no tampão não nutritivo são estáveis durante pelo menos cerca de 72 horas.
  7. 7. Método de manipulação de uma composição de fármaco biológica com células vivas para uso em imunoterapia, em que as células vivas são células T ativadas que foram ativadas por ligação cruzada de porções da superfície celular por anticorpos monoclonais ou outros agentes de ligação, caracterizado pelo fato de que compreende:
    reativar as células vivas;
    formular as células vivas em um tampão não nutritivo; e manter as células vivas no tampão não nutritivo em uma temperatura de armazenagem abaixo de cerca de 20 °C, por mais de cerca de 6 horas, em que as células vivas mantêm a sua identidade e pelo menos uma das características funcionais das células que definem as células vivas antes da formulação no tampão não nutritivo, as células vivas úteis para imunoterapia após serem armazenadas durante mais de 6 horas no tampão não nutritivo.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a temperatura de armazenamento está em uma faixa entre cerca de 0 °C e cerca de 10 °C.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a concentração das células no tampão não nutritivo é de cerca de 106 células/ml ou maior e/ou as células vivas são colocadas
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    3/6 em um recipiente flexível ou seringa, em que o recipiente flexível ou seringa é acondicionado em um dispositivo de temperatura controlada, que mantém as células vivas na temperatura de armazenagem.
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as células vivas são células CD4 + e quando ativadas são células Th1.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as células Th1 são ativadas por anticorpos monoclonais imobilizados que fazem ligação cruzada ou as células Th1 são ativadas por anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 imobilizados.
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a característica funcional é a expressão de CD40L, FasL, perforina e granzima B, a expressão de moléculas coestimulatórias, a expressão de moléculas de aderência, a secreção de citocinas, as quimiocinas ou suas combinações.
  13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as células vivas na composição expressam CD40L após armazenamento em uma quantidade de pelo menos cerca de 80 % em relação à expressão de CD40L no momento da formulação.
  14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a citocina inflamatória é IFN-γ e o nível de secreção está em uma quantidade de pelo menos cerca de 80 % em comparação com os níveis no momento da formulação.
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a secreção de IFN-γ após a armazenagem é recuperada após incubação a 37 °C durante pelo menos 24 horas.
  16. 16. Método, de acordo com a reivindicação7, em que as células vivas no tampão não nutritivo estão estáveis durante pelo menos cerca de 72 horas.
  17. 17. Método de fornecer composições de células vivas para
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    4/6 uso em imunoterapia em um ponto de instalação de tratamento, em que as células vivas são células T ativadas por ligação cruzada de porções da superfície celular por anticorpos monoclonais ou outros agentes de ligação, caracterizado pelo fato de que compreende:
    Reativar as células vivas;
    formular as células vivas com um tampão não nutritivo em uma instalação de processamento; e transportar as células até um ponto de instalação de tratamento em uma embalagem equipada para manter uma temperatura de armazenamento abaixo de 20 °C, em que as células vivas estão na temperatura de armazenamento durante mais de 6 horas, enquanto mantém a sua identidade e pelo menos uma das características funcionais que definem as células vivas antes da formulação no tampão não nutritivo.
  18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a colocação das células formuladas em um recipiente flexível ou seringa antes do transporte.
  19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que as células Th1 são ativadas pelos anticorpos monoclonais imobilizados, em que os anticorpos monoclonais fazem ligação cruzada.
  20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que as células vivas na composição expressam CD40L após o transporte e a remoção da temperatura de armazenamento em uma quantidade de pelo menos cerca de 80% em relação à expressão de CD40L no momento da formulação.
  21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que as células na composição secretam IFN-γ após o
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    5/6 transporte e a remoção da temperatura de armazenamento em uma quantidade de pelo menos cerca de 80% em comparação com os níveis no momento da formulação.
  22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a secreção de IFN-γ após transporte e armazenamento é recuperada após incubação a 37oC por pelo menos 24 horas.
  23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que as células vivas no tampão não nutritivo estão na temperatura de armazenamento por pelo menos cerca de 72 horas.
  24. 24. Uso de células vivas criopreservadas, descongeladas e reativadas formuladas em tampão não nutritivo, em que as células vivas após serem armazenadas durante mais de 24 horas no tampão não nutritivo, mantêm a sua identidade e pelo menos uma característica funcional que definem as células vivas antes da formulação no tampão não nutritivo, as células vivas úteis na imunoterapia após o armazenamento no tampão não nutritivo, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição de fármaco biológico para imunoterapia para administrar imunoterapia em um paciente, em que as células vivas são células Th1 ativadas; e em que as células vivas na composição expressam CD40L após armazenamento em uma quantidade de pelo menos cerca de 80% em relação à expressão de CD40L no momento da formulação.
  25. 25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a característica funcional é expressão de CD40L, FasL, perforina e granzima B, expressão de moléculas co-estimulatórias, expressão de moléculas de adesão, secreção de citocinas, quimiocinas ou combinações das mesmas.
  26. 26. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as células na composição secretam IFN-γ após armazenamento em uma quantidade de pelo menos cerca de 80% em
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    6/6 comparação com os níveis no momento da formulação e em que a secreção de IFN-γ após armazenamento é recuperada após incubação a 37oC por pelo menos 24 horas.
  27. 27. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as células vivas no tampão não nutritivo são armazenadas por pelo menos cerca de 72 horas.
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