JP2022533949A - 高濃度細胞のパッケージングおよび輸送 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞療法のための治療用細胞をパッケージングおよび輸送するためのプロセスおよび製品に関する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年５月１５日に提出された米国仮出願第６２／８４８，２３０号の優先権を主張する。本出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、細胞療法のための治療用細胞をパッケージングおよび輸送するためのプロセスおよび製品に関する。

幹細胞または多能性細胞などの細胞を患者に投与することを含む細胞療法は、様々な状態を治療するために使用されてきた。幹細胞または多能性細胞は、有糸分裂細胞分裂によって自らを再生し、多様な範囲の特定の細胞型に分化する能力を特徴とする細胞の種類である。したがって、そのような細胞は、神経系の外傷、悪性腫瘍、遺伝病、異常ヘモグロビン症、および免疫不全を含む、多種多様な疾患および損傷の治療に使用される可能性がある。

しかし、幹細胞（胎盤や臍帯血細胞など）を凍結解除後すぐに処理しないと、機能的な前駆細胞が失われることが示されている（Ｉｖａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，２０１１ Ｓｅｐ；５１（９）：２０４４－５）。したがって、これらの細胞の適用は、多くの場合、物流の問題によって妨げられる。例えば、幹細胞（臍帯血細胞など）は、収集されると、保管施設（細胞バンクなど）でルーチン的に凍結保存され、必要に応じて施設から病院に輸送される。細胞または組織が、氷点下の低い温度（通常は７７Ｋまたは－１９６℃（液体窒素の沸点））に冷却することによって保存されるこの凍結保存プロセスには、特定のリスクが伴う。例えば、保存された細胞は、低温への凍結の過程または室温への加温により損傷を受ける可能性があり得る。このような細胞移植における最も重要な側面の１つは、生存可能な幹細胞／多能性細胞の数と移植時のそれらの発生能であるため、これらのリスクは幹細胞または多能性細胞にとって特に深刻である。この懸念から、幹細胞／多能性細胞は、可能な限り短い期間にわたって凍結保存された状態で日常的に輸送される。実際、ドライアイスまたは液体窒素シッパーでの夜間輸送は業界標準であり、温度を監視するために特別な注意を払う必要がある。しかし、この慣行はリスクを排除するものではない。

より低いまたはより高い細胞濃度で凍結された細胞は、多くの場合、より少ない生存率を有する傾向があるので、凍結保存のために、１ｍＬ当たり１０^６～１０^７個の細胞の範囲の生存細胞の最終濃度まで細胞および凍結保護剤を混合することは標準プロトコルである（Ｋｉｅｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ－Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｔｅｃｈ Ｎｏｔｅ Ｎｏ．１４，２０１０ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，ｈｔｔｐｓ：／／ａｓｓｅｔｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ＴＦＳ－Ａｓｓｅｔｓ／ＬＳＧ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ＮｏｔｅｓＤ１９５７５．ｐｄｆ）。しかし、これらの細胞の治療用途は、多くの場合、１０^７細胞／ｍＬよりも多い量および濃度を伴う。その結果、臨床医はこれらの細胞をさらに処理して濃度を上げる必要があり、それによって追加の物流およびコンプライアンスの問題が発生する。

したがって、それは非常に費用がかかり、幹細胞の長距離（例えば、大陸横断）輸送には実用的ではない。高濃度および室温／周囲温度で幹細胞を輸送するプロセスまたは方法が必要である。

本発明は、いくつかの態様において上述の必要性に対応する。

一態様では、本発明は、（ｉ）約１×１０^７～１×１０^９／ｍｌ（例えば、２×１０^７～１×１０^９／ｍｌ、５×１０^７～１×１０^９／ｍｌ、１ｘ１０^８／ｍｌ、２ｘ１０^８／ｍｌ、３ｘ１０^８／ｍｌ、４ｘ１０^８／ｍｌ、５ｘ１０^８／ｍｌ）の治療用細胞および（ｉｉ）薬学的に許容される担体溶液、を含む治療用組成物を提供する。薬学的に許容される担体溶液は、（ａ）約２５～３０ｍＭ（例えば、２６～２８ｍＭおよび２７ｍＭ）の酢酸塩および約２０～２５ｍＭ（例えば、２１～２４ｍＭおよび２３ｍＭ）のグルコン酸塩を含み、（ｂ）約２７０～３２０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ（例えば、２８０～３１０、２８０～３００、２９０～３００、および約２９４または２９５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ）の重量モル浸透圧濃度を有する。薬学的に許容される担体溶液は、１２６～１５４ｍＥｑ／Ｌのナトリウムを有することができる。

いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体溶液は、以下のうちの１つ以上を含み得る：約１２０～１６０ｍＭ（例えば、１３０～１５０および１４０ｍＭ）のＮａ^＋、約３～７ｍＭ（例えば、４～６および５ｍＭ）のＫ^＋、約１．０～２．０ｍＭ（例えば、１．２～１．８および１．５ｍＭ）のＭｇ^２＋、および約９０～１１０（例えば、約９５～１００および９８ｍＭ）のＣｌ^－。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体溶液は、Ｃａ^２＋、もしくは乳酸塩、またはそれらの両方を含まない。

一例では、薬学的に許容される担体溶液は、約１４０ｍＭのＮａ＋、約５ｍＭのＫ^＋、約１．５ｍＭのＭｇ^２＋、約９８ｍＭのＣＴ、約２７ｍＭの酢酸塩、および約２３ｍＭのグルコン酸塩を含む。その場合には、薬学的に許容される担体溶液は、約９０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、約５ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、約１．５ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ）、約２７ｍＭの酢酸ナトリウム三水和物（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２．３Ｏ）、および約２３ｍＭのグルコン酸ナトリウム（Ｃ_６Ｈ_１１ＮａＯ_７）を含有することができる。

治療用組成物または薬学的に許容される担体溶液は、約４．０～８．０のｐＨを有することができる（例えば、約５．５～約８．０、約６．０～約７．５、約６．０、および約７．４）。治療用組成物は、ＤＭＳＯを含まないか、または微量のＤＭＳＯ（すなわち、０．５％以下）を含む。上記の治療用組成物は、約０．５％～約５％（例えば、約１％～約５％、約１～３％、約１～２．５％、または約１％）の血清または血清アルブミンを含むことができる。例としては、ヒト血清またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が挙げられる。治療用組成物は、約１～１０℃、約２～８℃、または約３～５℃の範囲内の温度を有することができる。好ましくは、組成物は約４℃の温度を有する。

治療用細胞の例には、単核細胞、臍帯血細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、末梢血細胞、骨髄細胞、または胎盤血細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、治療用組成物または細胞は、ＣＤ１３^＋、ＣＤ３４^＋、またはＣＤ１３４^＋細胞を含む。一実施形態では、上記の細胞は、凍結および解凍された細胞、例えば、血液バンクから得られた細胞であり得る。その場合、組成物は、約１０～１００Ｕ／ｍｌ、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００Ｕ／ｍｌのＤＮＡｓｅ（例えば、ヒトＤＮＡｓｅ）を含むことができる。あるいは、細胞はドナーから新たに入手でき、凍結されておらず、この場合、ＤＮＡｓｅは必要ではなく、組成物はＤＮＡｓｅを含まなくてもよい。

第２の態様では、本発明は、基材を含む容器内に上記の組成物を含むパッケージング製品を特徴とし、基板にはポリマーを有する。いくつかの例では、ポリマーは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレン、またはポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）であり得、これらは、低摩擦または非粘着性の特性を有する。ポリマーはまた、超低密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、線状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、同軸配向ポリプロピレン（ＣＯＰＰ）、二軸配向ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ナイロンなどのポリミド樹脂、エチレンビニルアルコールポリマー（ＥＶＯＨ）、およびそれらの金属化バージョンなど、生物学に適した他のポリマーであり得る。

パッケージング製品は、バッグ、シリンジ、または注射器用のバイアルを含むがこれらに限定されない、任意の適切な形状であり得る。一例では、製品は、臨床使用のために多能性細胞で事前に充填されている。多能性細胞は、造血幹細胞または間葉系幹細胞などの幹細胞であり得る。組成物は、末梢血細胞、臍帯血細胞、または骨髄細胞を含むことができる。

本発明は、上記のパッケージング製品を製造するための方法を特徴とする。この方法は、（ａ）細胞（多能性細胞など）を含む組成物を準備するステップ、（ｂ）ポリマーを含む基材を含む容器を準備するステップ、（ｃ）組成物を容器に配置するステップ、および（ｄ）容器を密封するステップ、を含む。

第３の態様では、本発明は、多能性細胞または単核細胞などの治療用細胞を貯蔵または輸送するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）上記の治療用組成物を準備することと、（ｉｉ）組成物を約２４～９６時間、例えば１～１０℃の範囲内の温度で約２４～約７２時間貯蔵または輸送することとを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、上記のパッケージング製品を提供し、パッケージング製品を、宅配便業者、代理店、または受け入れ病院の職員などの受領者に配送するステップを含む。

配送工程中、温度は、１～７℃、２～６℃、３～５℃、または約４℃などの１～１０℃の範囲内であり得る。この方法を使用して、細胞は、１２～９６時間、例えば、少なくとも２４、３６、３８、６０、７２、８４、または９６時間にわたって配送することができる。一例では、治療用組成物は、約７２時間貯蔵または輸送される。

配送時に、多能性細胞または単核細胞は、４０％（例えば、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％）を超える総有核細胞（ＴＮＣ）回収率を有することができる。さらに、配送時に、多能性細胞は、６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％）を超える生存率（本明細書に開示されるＡＯ／ＰＩ法によって決定される）を有することができる。

一実施形態では、配送時に、多能性細胞または単核細胞は、少なくとも０．２５％（例えば、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．５５％、０．６％、０．６５％、０．７％、０．７５％、０．８％、０．８５％、０．９％、０．９５％、１．０％、１．１％、１．１５％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５。％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９。％、または２．０％）のＣＤ３４^＋ＣＤ４５^＋細胞を有することができる。

別の実施形態では、配送時に、多能性細胞または単核細胞は、少なくとも０．１０％（例えば、０．１０％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．５５％、０．６％、０．６５％、０．７％、０．７５％、０．８％、０．８５％、０．９％、０．９５％、１．０％、１．１％、１．１５％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５。％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９。％、または２．０％）のＣＤ１３３^＋細胞を有することができる。

さらに別の実施形態では、配送時に、多能性細胞または単核細胞は、プレートごとに多数のコロニー形成単位（ＣＦＵ）コロニーを形成することができる。例えば、図１に示されるように、細胞は、約２～約８℃で７２時間貯蔵または輸送された後に播種された３×１０^４細胞当たり少なくとも３０（例えば、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、１００、または１１０）のＣＦＵコロニーを形成することができる。

上記の値は、当技術分野で知られている方法、または以下の実施例に記載されている方法に従って決定することができる。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の明細書に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

生理食塩水または本発明の組成物を室温または４℃で貯蔵または輸送した後の細胞の安定性研究の結果を示す一連の図である。

本発明は、幹細胞／多能性細胞（例えば、臍帯血）またはそのような細胞を含む調製物を、室温または周囲温度（すなわち、１～２５℃）などの条件下で、長期間（例えば、１２～７２時間）にわたって高濃度でパッケージングおよび／または輸送することに関する。予想外にも、このようにパッケージングされて輸送された幹細胞／多能性細胞および調製物は、臨床使用のための満足のいく生存率および発生の可能性を有していた。

上記のように、幹細胞（胎盤または臍帯血細胞など）が凍結のために除去された後すぐに処理されない場合、機能的前駆細胞の喪失が起こることが当技術分野で知られている（Ｉｖａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，２０１１ Ｓｅｐ；５１（９）：２０４４－５）。しかし、多くの場合、特に臍帯血細胞が収集、増殖、濃縮、または処理される場所（病院や産科クリニックなど）が、細胞が患者の治療に使用される場所から遠く離れている場合は、２４時間以内に治療を行うことは困難である。さらに、製造プロセスに関係なく、治療用細胞組成物は厳格な規制ガイドラインを満たす必要がある。例えば、治療用細胞組成物は、十分に高い細胞濃度（例えば、１×１０^７／ｍｌ、１×１０^８／ｍｌ）を有するべきである。そのために、従来の幹細胞／多能性細胞のパッケージングおよび輸送は、そのような高い細胞濃度で細胞を輸送することを可能にしない。そのような高い細胞濃度を有する治療用組成物を得るために、臨床医は、細胞をさらに処理して、細胞数および／または濃度を増加させる必要がある。

しかし、細胞の増殖または濃縮は最小限の操作以上のものであると考えられているため、増殖または濃縮された細胞は、単にドナーから得られ、最小限の操作のみでレシピエントに与えられる細胞よりも厳密に規制される。米国では、治療用細胞は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって施行されている現在の適正製造基準（ｃＧＭＰ）規制に準拠した方法で製造する必要がある。治療センターはｃＧＭＰに準拠している場合と準拠していない場合があるため、従来の幹細胞／多能性細胞のパッケージングと輸送により、これらの細胞の用途が制限される。

本明細書に開示される本発明は、少なくとも幹細胞および造血前駆細胞の生存能力および機能性を維持しながら、周囲温度下で長期間にわたって十分に高い濃度で幹細胞／多能性細胞を保存および輸送することを可能にする。したがって、本発明は、幹細胞を高濃度で室温／周囲温度下で輸送するプロセスまたは方法の必要性に対処する。

治療用組成物
本発明の一態様は、治療用細胞組成物に関する。組成物は、（ｉ）約１×１０^７～１×１０^９／ｍｌの治療用細胞と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体溶液とを含む。薬学的に許容される担体溶液は、（ａ）約２５～３０ｍＭ（例えば、２６～２８ｍＭおよび２７ｍＭ）の酢酸塩および約２０～２５ｍＭ（例えば、２１～２４ｍＭおよび２３ｍＭ）のグルコン酸塩を含み、（ｂ）約２７０～３２０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの重量モル浸透圧濃度（例えば、２８０～３１０、２９０～３００および約２９４または２９５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ）を有する。

治療用細胞
様々な幹細胞または多能性細胞を使用して、本発明を実施することができる。細胞の例には、臍帯血細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、末梢血幹細胞、胎盤血、および機能細胞、例えば神経細胞またはグリア細胞に分化することができる他の幹細胞が含まれる。本発明のそのような治療用細胞は、骨髄、臍帯血、臍帯、ウォートンゼリー、末梢血、リンパ組織、子宮内膜、栄養芽細胞由来組織、胎盤、羊膜液、脂肪組織、筋肉、肝臓、軟骨、神経組織、心臓組織、歯髄組織、剥離した歯、胚性幹（ＥＳ）細胞もしくは人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせから単離または得ることができる。

「幹細胞」という用語は、いくつかの最終的な分化した特殊な細胞型に分化することができる任意の細胞を指す。幹細胞は、すべての胚葉（すなわち、外胚葉、中胚葉、および内胚葉）から発出する。幹細胞の典型的な供給源には、胚、骨髄、末梢血、臍帯血、胎盤血、筋肉組織、および脂肪組織が含まれる。

幹細胞は全能性または多能性であり得る。全能性幹細胞は通常、あらゆる細胞型に発達する能力を持っている。全能性幹細胞は、胚性および非胚性の両方の起源である可能性があり得る。多能性細胞は通常、いくつかの異なる最終分化細胞タイプに分化することができる細胞である。例えば、多能性幹細胞は、神経系、皮膚、肝臓、腎臓、血液、筋肉、骨などの細胞を生じさせることができる。多能性幹細胞の例には、臍帯血幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉系幹細胞、胎盤由来幹細胞、剥離歯由来幹細胞、毛包幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。対照的に、多能性または成体幹細胞は通常、限られた種類の細胞を生じさせる。本明細書で使用される幹細胞という用語は、特に断りのない限り、前駆細胞を含む。単能性幹細胞は１つの細胞型しか生成できないが、非幹細胞と区別する自己複製の特性を持っている。これらの幹細胞は、血液、神経、筋肉、皮膚、腸、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺などを含むがこれらに限定されない様々な組織または器官系に由来し得る。本発明によれば、幹細胞は、成人または新生児の組織または器官に由来することができる。

本発明に記載の細胞は、実質的に純粋であり得る。「実質的に純粋な」という用語は、幹細胞またはそれに由来する細胞（例えば、分化した細胞）に関して使用される場合、特定の細胞が調製物中の細胞の実質的な部分または大部分を構成することを意味する（すなわち、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％超）。例えば、実質的に精製された細胞集団は、調製物中の細胞の少なくとも約７０％、通常は調製物中の細胞の約８０％、特に調製物中の細胞の少なくとも約９０％を構成する（例えば、９５％、９７％、９９％または１００％）。

好ましい実施形態では、臍帯血細胞が使用される。これらの細胞は、以下の実施例セクションに記載されるように、または当技術分野で知られている方法によって得られ、次いで標準的な技術によって試験され得る。細胞の分化能を確認するために、当技術分野で知られている方法によって、それらを誘導して、例えば、様々なコロニー形成単位を形成することができる。このように確認された細胞は、自発的分化、老化、形態学的変化、成長速度の増加、またはニューロンへと分化する能力の変化を示すことなく、１０、２０、５０、または１００を超える集団倍加のために非分化培地培養でさらに増殖させることができる。細胞は、使用前に標準的な方法で貯蔵できる。

造血幹細胞
造血幹細胞は多能性であり、最終的にはすべてのタイプの最終分化した血液細胞を生じさせる。造血幹細胞は、自己複製するか、よりコミットされた前駆細胞に分化することができ、前駆細胞は、たった数種類の血液細胞の祖先であると不可逆的に決定される。例えば、造血幹細胞は、（ｉ）骨髄前駆細胞に分化することができ、骨髄前駆細胞は最終的に、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞、を生じさせ、または（ｉｉ）リンパ球前駆細胞に分化することができ、リンパ球前駆細胞は最終的に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）と呼ばれるリンパ球様細胞を生じさせる。幹細胞が骨髄系前駆細胞に分化すると、その子孫はリンパ系の細胞を生じさせることができず、同様に、リンパ系前駆細胞は骨髄系の細胞を生じさせることができない。造血および造血幹細胞の分化に関する一般的な議論については、Ｃｈａｐｔｅｒ １７，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅｓ，Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ ２００６の第２章、およびＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００９，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓの第５章を参照されたい。

造血幹細胞を特徴づけるために、インビトロおよびインビボアッセイが開発されており、例えば、免疫不全マウスにおける脾臓コロニー形成（ＣＦＵ－Ｓ）アッセイおよび再構成アッセイである。さらに、モノクローナル抗体認識によって定義される細胞表面タンパク質マーカーの有無は、造血幹細胞を認識および単離するために使用されてきた。このようなマーカーには、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、およびＨＬＡ ＤＲ、およびそれらの組み合わせが含まれる。Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ ２００６の第２章およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。

臍帯血細胞
ヒト臍帯血および／またはヒト胎盤血は、臍帯血幹細胞の供給源である。そのような血液は、当技術分野で知られている任意の方法によって得ることができる。幹細胞の供給源として臍帯血または胎盤血を使用することは、臍帯血または胎盤血がドナーへの外傷なしに容易に得られることを含む多くの利点を提供する。例えば、米国特許第５，００４，６８１号および米国特許第７，１４７，６２６を参照されたい。収集は無菌条件下で行うべきである。採取後すぐに、臍帯血または胎盤血の液を抗凝固剤と混合することができる。そのような抗凝固剤は、ＣＰＤ（クエン酸リン酸デキストロース）、ＡＣＤ（酸性クエン酸デキストロース）、オルシーバー液（Ａｌｓｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９４１，Ｎ．Ｙ．Ｓｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．４１：１２６）、Ｄｅ Ｇｏｗｉｎ液（Ｄｅ Ｇｏｗｉｎ，ｅｔ ａｌ．，１９４０，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓ．１１４：８５０）、Ｅｄｇｌｕｇａｔｅ－Ｍｇ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９５９，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３８：５７３）、Ｒｏｕｓ－Ｔｕｒｎｅｒ溶液（Ｒｏｕｓ ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ，１９１６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２３：２１９）、他のグルコース混合物、ヘパリン、ビスクマ酢酸エチルなどを含む、当技術分野で知られているものであればどれでもよい。例えば、Ｈｕｍ，１９６８，Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６－１６０を参照されたい）。臍帯血は、臍帯からの直接排液および／または娩出された胎盤の根および膨張した静脈からの針吸引によって得ることができる。一般的に、米国特許第５，００４，６８１号を参照されたい。

特定の実施形態では、収集された血液試料に対する以下の試験は、日常的に、または臨床的必要とされる場合に実施することができる：（ｉ）微生物汚染がないことを確実にするための細菌培養、好気性および嫌気性条件下での日常的な細菌の病院培養など、確立されたアッセイを実施することができる、および（ｉｉ）特定の病原性微生物が存在しないことを確認するための病原性微生物の診断スクリーニングでは、様々な診断試験を採用することができる。血液を介して伝染する多数の病原体のいずれかの診断スクリーニングは、標準的な手順で行うことができる。一例として、収集された血液試料は、ビリオン、ウイルスにコードされたタンパク質、ＨＩＶ特異的核酸、ＨＩＶタンパク質に対する抗体などの検出に基づく多数のアッセイシステムのいずれかを使用して、ヒト免疫不全ウイルス－１または２（ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２）の存在について診断スクリーニングに供することができる。収集された血液は、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルスＩおよびＩＩ（ＨＴＬＶ－ＩおよびＨＴＬＶ－ＩＩ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、サイトメガロウイルス、梅毒、ウェストナイルウイルス、および米国食品医薬品局などの関連規制当局によって指定されたその他の感染性病原体などの他の感染症についても検査できる。

好ましくは、臍帯血を採取する前に、臍帯血細胞ががん、白血病、免疫障害、神経障害、肝炎またはＡＩＤＳなどの遺伝性または感染性疾患を伝播する際にもたらす可能性のあるリスクを特定するために、母体の健康履歴を決定する。収集された臍帯血試料は、細胞生存率、ＨＬＡタイピング、ＡＢＯ／Ｒｈタイピング、ＣＤ３４^＋細胞数、および総有核細胞数の１つ以上の試験を受けることができる。

出産時に一人のヒトから臍帯血および／または胎盤血が収集されると、血液を処理して、濃縮された造血幹細胞集団、または濃縮された造血幹細胞集団および前駆細胞集団を生成し、臍帯血幹細胞の集団を形成することができる。造血幹細胞、または造血幹細胞および前駆細胞は、他のタイプの造血細胞と比較して、造血幹細胞または造血幹細胞および前駆細胞上で増加したレベルで発現される特定のマーカーに対して陽性である可能性がある。例えば、そのようなマーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ ＤＲ、またはそれらの組み合わせであり得る。造血幹細胞、または造血幹細胞および前駆細胞も、他のタイプの造血細胞と比較して、特定のマーカーに対して陰性である可能性があり得る。例えば、Ｌｉｎは、陰性マーカーとして機能する系統特異的抗体の組み合わせである。ＣＤ３８もまた、陰性マーカーの例である。好ましくは、造血幹細胞、または造血幹細胞および前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。

必要に応じて、単核細胞（ＭＮＣ）、造血幹細胞、または造血幹細胞と前駆細胞を濃縮する前に、臍帯血の赤血球（ＲＢＣ）と白血球（ＷＢＣ）を分離することができる。赤血球と白血球の分離が行われると、赤血球画分を廃棄することができ、白血球画分を上記のように磁気細胞分離器で処理することができる。白血球画分と赤血球画分の分離は、遠心分離技術を含む、当技術分野で知られている任意の方法によって実施することができる。使用できる他の分離方法には、市販の製品ＦＩＣＯＬＬまたはＦＩＣＯＬＬ－ＰＡＱＵＥまたはＰＥＲＣＯＬＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）の使用が含まれる。ＦＩＣＯＬＬ－ＰＡＱＵＥは通常、コニカルチューブの底に配置され、全血がその上に成層される。遠心分離後、コニカルチューブ中で次の層が、上から下に見ることができるであろう：血漿およびその他の成分、末梢血単核細胞（白血球）を含むハッフィーコートと呼ばれるＭＮＣの層、ＦＩＣＯＬＬ－ＰＡＱＵＥ、ならびに赤血球および顆粒球（赤血球および顆粒球はペレットの形で存在するはずである）。この分離技術により、末梢血単核細胞を簡単に採取できる。

必要に応じて、ＣＤ３４＋細胞を選択する前に、新鮮な臍帯血ユニットのアリコートを確認して、総有核細胞数および／またはＣＤ３４＋含有量を確認できる。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞選択後、ＣＤ３４＋（「ＣＢ幹細胞」）およびＣＤ３４細胞画分の両方が回収される。必要に応じて、患者へのＨＬＡマッチングが行われていなくても、最初のＨＬＡタイピングおよび将来のキメラ化研究のために、ＣＤ３４細胞画分の試料からＤＮＡを抽出することができる。ＣＤ３４＋に富む幹細胞画分はその後、増殖前に処理することができ、例えば、幹細胞は、輸送または貯蔵のために適切な細胞培養培地に懸濁することができる。

特定の実施形態では、臍帯血および／または胎盤血液試料は赤血球が枯渇しており、赤血球枯渇画分中のＣＤ３４＋細胞の数が計算される。

製薬上許容される担体
本明細書に記載の治療用組成物は、約２５～３０ｍＭ（例えば、２６～２８ｍＭおよび２７ｍＭ）の酢酸塩および約２０～２５ｍＭ（例えば、２１～２４ｍＭおよび２３ｍＭ）のグルコン酸塩を含む薬学的に許容される担体または保存溶液を含み、（ｂ）は重量モル浸透圧濃度が約２７０～３２０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ（例えば、約２８０～３１０、２８０～３００、２９０～３００、２９４、または２９５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ）である。

いくつかの実施形態では、担体／保存溶液は、電解質の溶液または細胞または組織の保存溶液を含む。いくつかの特定の実施形態において、担体／保存溶液は、細胞増殖培地ではない。つまり、この溶液には、細胞増殖に必要な１つ以上の栄養素（アミノ酸および窒素または炭素源など）が不足している。例えば、保存溶液は、電解質のみの溶液を含むことができる。電解質の溶液は、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化物、亜鉛、鉄および／またはマグネシウムイオンを含むことができる。

好ましくは、薬学的に許容される担体または保存溶液は、静菌剤または抗菌剤または添加された緩衝液を含まない等張性の無菌の非発熱性溶液である。その場合、例として、電解質の含有量、重量モル浸透圧濃度、およびｐＨにおいてヒト血漿を厳密に模倣する限り、複数の異なる製剤を含む生理学的にバランスの取れた晶質液が含まれる。これらの溶液には追加の緩衝能力もあり、重炭酸塩、ＣＯ２、および水に変換される酢酸塩、グルコン酸塩、さらには乳酸塩などの陰イオンが含まれている。通常の生理学的等張性の範囲は約２８０～３１０ｍＯｓｍｏｌ／リットルである。そのような電解質溶液は、例えば、約２９４または２９５ｍＯｓｍｏｌ／リットルの容積モル浸透圧濃度を有するＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ ＡまたはＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ １４８であり得る。ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ ＡまたはＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ １４８は、約９０ｍＭのＮａＣｌ、約５ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、約２７ｍＭの酢酸ナトリウム三水和物、および２３約ｒｎＭのグルコン酸ナトリウムを含む。ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ ＡのｐＨは約７．４であるが、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ １４８のｐＨは約６．０である。

変形例として、担体／保存溶液はまた、緩衝液および／または１種またはいくつかの抗酸化剤を含み得る。緩衝液は、例えば、生理学的緩衝液（硫酸塩、リン酸塩または炭酸塩）または合成緩衝液（ＨＥＰＥＳ）の中から選択することができる。抗酸化剤の例には、フリーラジカル捕捉剤、デフェロキサミンなどの鉄キレート剤、ビタミンＥ、ビタミンＣまたはエリソルビン酸ナトリウム、およびＮ－アセチルシステイン、グルタチオンまたは還元型グルタチオンなどのチオール化誘導体が含まれる。

本明細書に開示される組成物は、少なくとも幹細胞および造血前駆細胞の生存率および機能性を維持しながら、周囲温度下で長期間にわたって幹細胞／多能性細胞を保存および輸送することを可能にする。特に、組成物は、臨床使用のために十分に高い細胞濃度を有することができる。

本明細書に開示されるように、いくつかの例では、輸送または貯蔵の約７２時間（３日）後、組成物は、除去直後の胎盤血液ユニット内の生存可能なＣＤ３４＋細胞の数に対して、少なくとも８０％、特に少なくとも９０％に等しい、さらに特に１００％近い生存可能なＣＤ３４＋造血幹細胞の含有量をもたらすことができる。３日間の貯蔵／輸送後、貯蔵／輸送方法は、除去直後の胎盤血液単位中の生存可能な前駆細胞の数に対して、少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、さらにより特に少なくとも９０％に等しい生存可能な造血前駆細胞の含有量をもたらすことができる。

パッケージング製品
別の局面において、本発明は、高濃度で長期間にわたって、室温または周囲温度などの条件下で、上記の治療用幹細胞または調製物をパッケージングおよび／または輸送することに関する。予想外にも、このようにパッケージングされて輸送された細胞および調製物は、臨床使用のための満足のいく生存率および発生の可能性を有していた。

一例では、臍帯血細胞は、病院の現場で収集するか、または臍帯血バンク（ＳＴＥＭＣＹＴＥ Ｉｎｃ．によって管理されているものなど）から取得することができる。収集および保管のための任意の当技術分野で認められた手順を使用することができるが、好ましい手順は、以下の実施例およびＷＯ２０１２／１１２５７２に記載されている。

一般的に、様々な感染マーカーの滅菌テストが実施されるべきである。さらに、凍結保存のために凍結する前に、総細胞数、ＣＤ３４＋細胞数、および単位体積を決定して記録する必要があり得る。凍結保存された採取血液にはＲＢＣが含まれており、それは凍結および融解中に分解する傾向がある。その場合、一度溶解されると、ＲＢＣのＤＮＡは収集された臍帯血細胞の粘度を増加させ、臨床使用のための臍帯血細胞のさらなる取り扱いを妨げる。これを防ぐために、凍結保存する前に、ＤＮＡを分解するために、収集した細胞にＤＮＡｓｅを加えることができる。そうすることで、細胞の粘着性と凝集を減らし、それによって浸透圧勾配（例えば、ＦＩＣＯＬＬ）で細胞をより良く分離することができる。多くの市販のＤＮＡｓｅを使用できる。例としては、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨが販売しているＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（登録商標）がある。

あるいは、臍帯血を処理して赤血球を除去し、赤血球を実質的に枯渇させることができる。所望であれば、臍帯血は、浸透圧勾配（例、ＦＩＣＯＬＬ）によって、または以下の実施例１で説明する方法で、いくつかの有用な単位（例、全単核細胞（ＴＭＮ）、白血球、リンパ球、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、マクロファージ、およびその他の細胞）に分離できる。また、前述のように、輸送される臍帯血細胞は、ドナーから新たに入手することができ、凍結されていない。これらのアプローチでは、そのような新鮮な単位をパッケージングおよび／または輸送する際にＤＮＡｓｅは必要ない。さらに、血漿は、当技術分野で知られている方法、例えば、米国特許出願第２００８／０１６６３２４号（その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）に記載されている方法に従って枯渇させることができる。

次に、収集された細胞はパッケージングされ、病院の敷地内または上記の血液銀行などの敷地外のいずれかの処理施設で輸送するために準備される。細胞が凍結保存されている場合は、ＷＯ２０１２／１１２５７２に記載されている方法で解凍することができる。この場合も、様々な感染マーカーの滅菌テストを実施でき、総細胞数、ＣＤ３４＋細胞数、濃度、および単位体積を決定して記録するべきである。次に、細胞を上記の容器に入れて、指定された運送業者が輸送するためのパッケージを形成する。

上記のように、多くの薬学的に許容される担体または保存溶液を使用することができるが、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａなどの等張または生理学的にバランスされた塩の溶液が好ましい。これらの溶液は、細胞を非常に高濃度で保存し、細胞の生存率を向上させる。さらに、大気中のＣＯ_２（０．０４％）がなくても、長期間のｐＨ安定性を維持できる。このようにパッケージングされて輸送された細胞は、さらなる処理（例えば、さらなる濃縮）なしに、それを必要とする対象に薬学的組成物として直接投与することができる。

本明細書に開示されるように、容器の材料は、任意の適切な材料、好ましくは臨床使用のために承認されたものであり得る。一般に、材料は、摩擦が低い、または細胞に対して非粘着性であり、細胞に対して毒性がなく、または幹細胞レシピエントに対して有害ではないポリマーであり得る。適切なポリマーの例には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、ポリフィニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリエチレン、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）、超低密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、線状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、同軸配向ポリプロピレン（ＣＯＰＰ）、二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ナイロンなどのポリミド樹脂、エチレンビニルアルコールポリマー（ＥＶＯＨ）、およびそれらの金属化バージョンが含まれるが、それに限定されない。（研磨鋼に対する）摩擦係数が上記のポリマーの摩擦係数と同等かそれよりも低い場合は、他のポリマーも使用できる。上記のポリマーの摩擦係数は当技術分野で知られており、参照により組み込まれる。例えば、摩擦係数は０．５未満、例えば０．４、０．３、０．２、または０．１にすることができる。好ましい実施形態では、デュポンがＴＥＦＬＯＮ、ＨＹＣＬＯＮＥのポリエチレンベースの容器、またはＴＥＲＵＭＯのＰＶＣベースの容器のブランドで販売しているＰＴＦＥ、ＰＦＡ、ＰＥＰ、またはＰＶＤＦベースの容器を使用することができる。

容器の基材は、細胞を受け入れて保持するのに適した任意の形状に形成することができる。形状の例には、バッグ、チューブ、シリンジ、または注射器用のバイアルが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、基材は、培養、または幹細胞移植またはＣＮＳなどの様々な組織への移植の部位に適した形状に形成される。例としては、テープ、膜、糸、スライド、マイクロビーズ、マイクロ粒子、細胞培養プレート、マルチウェルプレート、バイオリアクターなどがあり、これらはすべて細胞を受け入れることができる。

本明細書に記載されるように、輸送中、パッケージ内の細胞は、より低い温度に保たれる必要はなく、例えば、凍結保存されるか、または一晩で配送される必要はない。代わりに、セルは、室温を含むかなり広い温度範囲内で、かなり長い期間（例えば、１～８日）にわたって輸送できる。これらのそれほど厳しくない条件にもかかわらず、パッケージは温度保護されたコンテナで輸送されるか、および／または必要に応じて荷送人または受取人に情報を提供するために温度プローブで監視されることが好ましい。条件がそれほど厳しくないため、凍結保存された細胞の輸送に関連するコストが回避される。また、発送までに１～８日程度かかる場合があり得るので、大陸横断などの長距離輸送が実用的となる。その結果、特定の幹細胞の供給源から遠く離れている患者（例えば、まれな、一致したＨＬＡ型を有する患者）は、幹細胞移植の恩恵を受けることができる。

宅配便業者から細胞を受け取ると、以下の実施例に記載されている方法で細胞を処理し、移植への適合性を試験することができる。この目的のために、以下の４つの基準を使用して、輸送された単核細胞が移植に適しているかどうかを判断できる。

細胞数
移植と分析のために十分な生細胞がなければならない。好ましくは、細胞を分析するのに十分な残りの細胞が存在するように、移植（例えば、脊髄への）に必要な細胞の数の少なくとも２倍が好ましい。輸送に含まれる細胞が少ない場合、その輸送は移植に適していないはずである。

生存率
調製物中に死んだ細胞が多すぎることは避けるべきである。この目的のために、トリパンブルー排除（ＴＢＥ）を使用した手動カウントを生存率の基準として使用できる。パーセンテージで表される細胞懸濁液のＴＢＥは、青色に染色されていない細胞を染色された細胞と染色されていない細胞の総数で割ったものである。移植用に指定された細胞の場合、ＴＢＥは少なくとも７０％である必要がある。一般に、以下の実施例で説明する洗浄手順では、死んだ細胞が排除され、細胞懸濁液は通常、移植直前に９０％を超えるＴＢＥを示す。

汚染
汚染の証拠またはリスクはすべて報告されるべきである。これには、例えば、輸送用バッグ内の液体の漏れの存在、細胞懸濁液の異常な濁り、顕微鏡下で見える細菌または真菌、または以前の汚染の報告が含まれる。本明細書に開示されるように、母体のＢ型肝炎コア抗原に陽性である臍帯血単位、ならびに通常は臍帯血単位を国立骨髄ドナープログラム（ＮＭＤＰ）の下での登録から除外する他のすべての感染性病原体を除外するように注意を払うべきである。

単核細胞
最終的な調製物は９５％以上の単核細胞を有するべきである。細胞の生存率カウントが５％以上の赤血球または好中球などの他の細胞を示している場合、その細胞は移植に使用されないであろう。臍帯血には未熟な赤い有核細胞が存在する可能性があることに注意されたい。

上記の手順では、抗生物質を細胞調製物に加えることができる。例えば、ゲンタマイシンを細胞処理の開始時に追加して、処理および輸送中の汚染のリスクを減らすことができる。ゲンタマイシンは、過去の複数の培地充填試験で汚染が導入されていないと指示したとしても、細菌の増殖を抑制する可能性があり得る。

上記の手順では、臍帯血幹細胞をさらに処理して、つまり、その内容はその全体が参照により組み込まれる、米国特許出願第２０１０／０１８９６９６号、２０１０／０３２３９２０号、２００８／０２２７１９７号、および２００８／０１６６３２４号などに記述される方法を使用して、インビトロ増殖によって幹細胞のプールを増殖することができる。「インビトロ増殖」という用語は、実験室での幹細胞の培養を指す。そのような細胞は、哺乳動物から抽出することができ、適切な環境、例えば、リチウム塩を含む培地での培養によって生成される追加の量の細胞を得ることができる。可能であれば、安定した細胞株を確立して、細胞の継続的な増殖を可能にする。

用途
本発明の実施形態はまた、米国ＦＤＡまたは米国以外の国における同等の規制当局によって施行されるｃＧＭＰ規制の下で治療用細胞を製造、貯蔵、または輸送する可能性の商業的提供に関する。治療用細胞および組成物は、様々な疾患および障害を治療するために有用である。障害の例には、変性疾患、虚血状態（例えば、肢虚血、うっ血性心不全、心臓虚血、腎臓虚血およびＥＳＲＤ、脳卒中、および眼の虚血）、器官または組織の再生を必要とする状態（例えば、肝臓、膵臓、肺、唾液腺、血管、骨、皮膚、軟骨、腱、靭帯、脳、毛、腎臓、筋肉、心筋、神経、および肢の再生）、炎症性疾患（例えば、心臓疾患、糖尿病、脊髄損傷、関節リウマチ、骨関節炎、人口股関節置換または修正による炎症、クローン病、および移植片対宿主疾患）自己免疫疾患（例えば、１型糖尿病、乾癬、全身性ループス、および多発性硬化症）、貧血、好中球減少症、血小板減少症、骨髄増殖性障害または血液新生物などの先天性疾患の血液学的障害、ならびに白血病およびリンパ腫などのがんが含まれるが、これらに限定されない。

定義
本明細書で使用される場合、「治療用細胞」は、患者の状態、疾患、および／または損傷を改善する細胞集団を指す。治療用細胞は、自家（すなわち、患者に由来する）、同種異系（すなわち、患者とは異なる同じ種の個体に由来する）、または異種（すなわち、患者とは異なる種に由来する）であり得る。治療用細胞は、同種（すなわち、単一の細胞型からなる）または異種（すなわち、複数の細胞型からなる）であり得る。「治療用細胞」という用語は、治療的に活性な細胞と、治療的に活性な細胞に分化することができる前駆細胞の両方を含む。

「増殖培地」は、微生物または細胞の増殖をサポートするように設計された固体、液体、または半固体を指す。増殖培地には、少なくとも、炭素源（グルコースなどの糖、またはコハク酸などのエネルギーの少ないソース）、様々な塩（マグネシウム、窒素、リン、硫黄などの必須の元素を提供し得る）、および水など、コロニーまたは細胞の成長に可能な最小限の栄養素が含まれている。

本明細書で使用される場合、「生理学的にバランスされた」塩溶液は、溶液または培地がヒト細胞と等張であり、容積モル浸透圧濃度が約２８０～３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、約ｐＨ７．３～７．４の生理学的ｐＨとなるように塩および他の成分の濃度が調整される溶液または培地を指す。生理学的にバランスされた溶液の例には、Ｈａｎｋの基本塩溶液、アルファ最小必須培地（ａＭＥＭ）、ダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、およびＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ ＡなどのＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ溶液が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「高張」、「等張」、および「低張」は、例えば、２つの区画（血漿および細胞内液（ＩＣＦ）など）間の浸透圧差または勾配に関する生理学的重量モル浸透圧濃度に関連する相対的な用語である。したがって、「等張」溶液は、生理学的重量モル浸透圧濃度に関して等張である任意の生理学的および／または薬学的に許容される溶液を指す。

薬学的調製物が血液に関して高張、等張、低張であるかどうかを判断するには、希釈剤を含む溶液のすべての化学成分の容積モル浸透圧濃度を計算する。張度は、流体および溶解または希釈された薬剤について計算することができ、流体１リットル当たり（ｍＯｓｍ／Ｌ）または溶媒１キログラム当たり（ｍＯｓｍ／ｋｇ）のミリオスモルの数値で表される。これらの２つの値は、それぞれ容積モル浸透圧濃度および重量モル浸透圧濃度としても知られている。血液の容積モル浸透圧濃度は２８５～３１０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲であり、血液の重量モル浸透圧濃度は２７５～２９９ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である。

溶液の容積モル浸透圧濃度は、浸透性および浸透圧の概念に一部基づいている。浸透性は、溶質（溶解した粒子）の拡散、または血管もしくは細胞膜等の半透膜を通した流体の移動である。膜を横切る分子の輸送を促進する浸透圧は、オスモル濃度で表され、血液または血漿等の生体液と比較した場合に、低浸透圧（低張）、等浸透圧（等張）、または高浸透圧（高張）と称される。「張度」および「浸透圧」という用語は、しばしば同義語とみなされる。

浸透圧は、「浸透圧勾配」（すなわち、膜の両側で異なる粒子濃度）に応答して半透膜を通過する水の動きに対抗するために必要な静水圧（または水圧）である。血清重量モル浸透圧濃度は、浸透圧計を使用して測定することができるか、または溶液中に存在する溶質の濃度の合計として計算することができる。

本明細書で使用される場合、張度と浸透圧は同義であるとみなされるべきであり、広義に理解されるべきである。張度は、有効重量モル浸透圧濃度を意味することができ、細胞膜を含む膜を横切る浸透力を発揮する能力を有する溶液中の溶質の濃度の合計に等しい。厳密な意味では、重量モル浸透圧濃度は特定の溶液の特性であり、いずれの膜からも独立している。張度は、特定の膜に関する溶液の特性である。しかしながら、本発明は、血液または血漿等の生体溶液に関して等張、高張、または低張である溶液を指し、この言及は、特定の溶液が、血液もしくは血漿または他の生体溶液中の細胞の細胞膜に関して血液または血漿と等張、高張、または低張であるという意味を含むものとする。

張度の操作上の定義は、この用語を説明するために使用することができる。これは、全血に試験溶液を添加して結果を観察する実験に基づき得る。全血中のＲＢＣが膨潤して破裂した場合、試験溶液は正常な血漿と比較して低張であると言われる。ＲＢＣが収縮して円鋸歯状になる場合、試験溶液は正常な血漿と比較して高張であると言われる。ＲＢＣが同じ状態のままである場合、試験溶液は血漿と等張であると言われる。ＲＢＣ細胞膜は参照膜であり得る。例えば、生理食塩水（すなわち、０．９％塩化ナトリウム）中に入れられた全血は膨潤しないため、生理食塩水は等張であると言われる。

細胞に関して本明細書で交換可能に使用される「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」および「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」という用語は、分裂による同じタイプの細胞の数の増加を指す。「分化」という用語は、細胞が特定の機能に特化するようになる発達過程を指し、例えば、細胞は、最初の細胞型のものとは異なる１つ以上の形態学的特徴および／または機能を獲得する。臍帯血幹細胞増殖の方法は当技術分野で知られている。このような増殖技術には、米国特許第７，３９９，６３３号、ＷＯ／２０１３／０８６４３６、ＷＯ／２０１３／１７９６３３、米国特許出願第２０１８／０３５３５４１号、Ｄｅｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１６（２）：２３２－２３６、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｏｄ １１１：３４１５－３４２３、およびＨｉｍｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１６，４７５－４８２に記載されているものが含まれる。

「分化」という用語には、分化系列決定および最終分化プロセスの両方が含まれる。分化は、例えば、免疫組織化学または当業者に知られている他の手順を使用して、系統マーカーの存在または不在を監視することによって評価することができる。前駆細胞に由来する分化した子孫細胞は、必ずしもそうである必要はないが、幹細胞の供給源組織と同じ胚葉または組織に関連している可能性がある。例えば、神経前駆細胞と筋肉前駆細胞は造血細胞系統に分化することができる。

本明細書で交換可能に使用される「分化系列決定」および「仕様」という用語は、幹細胞が受けるプロセスを指し、幹細胞は、特定の限定された範囲の分化細胞型を形成することをコミットする前駆細胞を生じさせる。コミットされた前駆細胞は、しばしば自己複製または細胞分裂が可能である。

「最終分化」という用語は、細胞が成熟した完全に分化した細胞に最終的に分化することを指す。例えば、造血前駆細胞および筋肉前駆細胞は、神経またはグリア細胞系統に分化することができ、その最終分化は成熟ニューロンまたはグリア細胞につながる。通常、最終分化は細胞周期からの離脱と増殖の停止に関連している。

本明細書で使用される「前駆細胞」という用語は、特定の細胞系統にコミットし、一連の細胞分裂によってこの系統の細胞を生じさせる細胞を指す。前駆細胞の例には、ニューロン、肝臓、腎形成、脂肪生成、骨芽細胞、破骨細胞、肺胞、心臓、腸、または内皮系統の前駆細胞が含まれる。

「培養」という用語は、幹細胞が増殖し、老化を回避できる条件下で幹細胞を維持することを指す。例えば、本発明では、幹細胞は、リチウム塩および任意選択で１つ以上の成長因子、すなわち成長因子カクテルを含む培地で培養される。

「臍帯血」という用語は、出産後に残った臍帯の血液から得られる多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）および多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）の幹細胞の供給源を指す。臍帯血に見られる幹細胞の例には、間葉系幹細胞、造血幹細胞、および前駆細胞が含まれるが、これらに限定されない。間葉系幹細胞および前駆細胞は、通常、神経細胞、骨髄間質細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、腱細胞、および靭帯細胞に分化することができる。造血幹細胞は、通常、リンパ系、骨髄系、および赤血球系の細胞を生じさせる可能性があり得る。臍帯血を収集および処理する方法の詳細な説明を以下に示す。

「臍帯血単位」という用語は、単一のドナーから収集される臍帯血の体積を指す。本発明の方法では、通常、単一の臍帯血単位が使用されるが、幹細胞数を増加させるために、複数の臍帯血単位、例えば、２倍の臍帯血単位を使用することもできる。

「臍帯血幹細胞」という用語は、出産時に収集されたヒト臍帯血および／またはヒト胎盤血に由来する、造血幹細胞に富む、または造血幹細胞および前駆細胞に富む集団を指す。造血幹細胞、または造血幹細胞と前駆細胞は、他のタイプの造血細胞と比較して、造血幹細胞または造血幹細胞と前駆細胞で増加したレベルで発現される特定のマーカーに対して陽性であり得る。例えば、そのようなマーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ ＤＲ、またはそれらの組み合わせであり得る。さらに、造血幹細胞、または造血幹細胞と前駆細胞は、他のタイプの造血細胞と比較して、発現されたマーカーに対して陰性であり得る。例えば、そのようなマーカーは、Ｌｉｎ、ＣＤ３８、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、造血幹細胞、または造血幹細胞および前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。

本明細書で使用される場合、「血漿が実質的に枯渇している」および「血漿が枯渇している」という用語は、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を超える血漿の体積が取り除かれた処理された臍帯血単位を指す。例えば、血漿は、臍帯血を遠心分離し、細胞画分を血漿画分から分離することによって実質的に枯渇させることができる。実質的な枯渇後に残っている血漿の体積は、典型的には、約０体積％から約３０体積％、好ましくは約１０体積％から約３０体積％である。

本明細書で使用される「非赤血球枯渇」および「赤血球が枯渇していない」という用語は、赤血球の体積の約３０％、２５、％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が取り除かれた、処理された臍帯血液単位を指す。本明細書で使用される場合、「赤血球が実質的に枯渇している」および「赤血球が枯渇している」という用語は、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を超える赤血球の体積が取り除かれた処理された臍帯血液単位を指す。

「有核細胞」とは、核を有する細胞、すなわち染色体ＤＮＡを含む細胞小器官を指す。有核細胞には、例えば、白血球および幹細胞が含まれる。「無核細胞」には、例えば、成体赤血球が含まれる。

製剤内の細胞の治療有効量は、１０^２細胞を超える、１０^３細胞を超える、１０^４細胞を超える、１０^５細胞を超える、１０^６細胞を超える、１０^７細胞を超える、１０^８細胞を超える、１０^９細胞を超える、１０^１０細胞を超える、または１０^１１細胞を超える。特定の実施形態では、製剤は、対象に投与されたときに１キログラム当たり１００万～２０００万の細胞を提供するように較正することができる。

本明細書に開示される製剤において、細胞は、一般に、１リットル以下、５００ｍｌ以下、２５０ｍｌ以下、または１００ｍｌ以下の体積である。したがって投与された細胞の密度は、典型的には１０^７細胞／ｍｌ超または１０^８細胞／ｍｌ以上（例えば、１０^９細胞／ｍＬ）である。

本明細書に開示される製剤は、例えば、注射、注入、灌流、または洗浄による投与のために調製することができる。製剤はさらに、骨髄、静脈内、皮内、動脈内、結節内、リンパ管内、腹腔内、病変内、前立腺内、膣内、直腸内、局所、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、小胞内、および／または皮下注射用に処方することができる。

「有効量」は、対象に所望の生理学的変化をもたらすのに必要な細胞の量である。「予防的治療」は、状態の兆候または症状を示さない対象に施される治療を含み、その状態の発症のリスクを減少、予防、または減少させる目的で治療が施される。「治療的治療」は、状態の症状または徴候を示す対象に投与される治療を含み、状態の重症度または進行を軽減する目的で対象に投与される。治療的治療はまた、状態を部分的または完全に解決することができる。

「治療用組成物」または薬学的組成物」という用語は、組成物をインビボまたはエクスビボでの診断または治療用途に特に適したものにする、活性薬剤と不活性または活性な担体との組み合わせを指す。

「薬学的に許容される」という句は、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適した、これらの化合物、材料、組成物および／または剤形を指すように、本明細書で使用される。「薬学的に許容される担体」は、対象に投与された後、または対象において、望ましくない生理学的効果を引き起こさない。薬学的組成物中の担体は、活性成分に適合性があり、それを安定化させることができるという意味においても「許容」されなければならない。１つ以上の可溶化剤を、活性化合物の送達のための薬学的担体として利用することができる。薬学的に許容される担体の例として、限定されないが、剤形として使用可能な組成物を得るための生体適合性のビヒクル、アジュバント、添加剤、および希釈剤が挙げられる。他の担体の例として、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、およびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。

「対象」という用語は、ヒトおよびヒト以外の動物を含む。治療の好ましい対象はヒトである。本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、対象が何らかの形態の治療を受けてきているかまたは現在受けているかに関係なく、交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、ギニアピッグ、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）およびヒト）を含むがこれらに限定されない任意の脊椎動物を指し得る。一実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は、実験的な非ヒト動物または疾患モデルとして好適な動物である。

本明細書で使用される場合、「治療すること」または「治療」は、障害、障害の症状、障害に続発する病態、または障害に対する素因を、治癒する、軽減する、緩和する、治療する、その発症を遅延する、予防する、または改善する目的での、障害を有する、または障害を発症するリスクがある対象への化合物または薬剤の投与を指す。「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」等の用語は、障害または状態を発症していないが、発症するリスクがあるかまたは発症しやすい対象において障害または状態を発症する可能性を低減することを指す。「改善する」とは、一般に、疾患または障害の徴候または症状の数または重症度の低下を指す。

「投与する」という用語は、生物学的作用の所望の部位に薬剤、化合物、または組成物を送達する方法を指す。これらの方法は、限定されないが、局所送達、非経口送達、静脈内送達、皮内送達、筋肉内送達、髄腔内送達、結腸送達、直腸送達、または腹腔内送達を含む。

本明細書に開示されるように、いくつかの範囲の値が提供される。文脈上明確に別段の指示のない限り、下限の単位の１０分の１までの、その範囲の上限と下限との間にある各介在値もまた具体的に開示されることを理解されたい。任意の記載される値または記載される範囲内の介在値と、その記載される範囲内の任意の他の記載される値または介在値との間の各小さい範囲は、本発明に含まれる。これらのより小さい範囲の上限および下限は、その範囲に独立して含まれてもまたは除外されてもよく、記載される範囲内に任意の具体的に除外される限界があることを条件として、より小さい範囲にいずれか一方もしくは両方の限界が含まれるか、またはどちらも含まれていない各範囲も本発明に包含される。記載される範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外した範囲も本発明に含まれる。

「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界に一部依存する。例えば、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、なおもより好ましくは最大１％の範囲を意味することができる。特に記載されない限り、「約」という用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する。

実施例１
この実施例は、凍結されたＳＴＥＭＣＹＴＥ臍帯血液単位（ＵＣＢＵ）から新たに収集または解凍された臍帯血細胞をパッケージングするための例示的な手順を説明する。手短に言えば、臍帯血細胞は、当技術分野で知られている標準的な方法を使用して収集された。あるいは、凍結ＵＣＢＣの１つ以上のバッグを、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１２／１１２５７２に記載された手順に従って解凍した。次に、細胞を、血液溶解物手順またはＷＯ２０１２／１１２５７２に記載されているＭＮＣ単離手順のいずれかに供した。次に、細胞を、約１％のＨＡＳを含む薬学的に許容される担体／保存溶液と混合した。ここで使用された２つの薬学的に許容される担体／保存溶液は生理食塩水およびＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａであった。細胞の濃度は約１ｘ１０^９／ｍｌに調整された。このようにパッケージングされた細胞は、室温または４℃で、１２時間から９６時間（４日）の期間にわたって別の場所に輸送された。

実施例２
この実施例では、アッセイを実施して、上記の実施例１に記載された方法でパッケージングおよび輸送された細胞を検査した。簡単に説明すると、細胞パッケージは、ＷＯ２０１２／１１２５７２に記載されている方法で検査および開梱された。細胞生存率アッセイ、ＵＣＢ－ＭＮＣの細胞数、およびＣＦＵアッセイは、ＷＯ２０１２／１１２５７２に記載されている方法で実施した。結果を図１Ａ～１Ｄに示す。

図に示すように、４℃でＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａにパッケージングされて輸送された細胞（「Ｐ－低温」）は、より高い生存率（アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム（ＡＯ／ＰＩ）染色による）、総ＣＦＵ数、総有核細胞（ＴＮＣ）の回収率を示し、細胞は、室温でのＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（「Ｐ－ｒｔ」）、室温での生理食塩水（「Ｓ－ｒｔ」）、２－８℃（「Ｓ－低温」）での生理食塩水など、他の条件よりもＣＤ３４／ＣＤ４５マーカーを発現する。例えば、約７２時間（３日）の輸送または保管後、２～８℃のＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（「Ｐ－低温」）でパッケージングおよび輸送された細胞は、８０％を超える生存率、８０％を超えるＴＮＣ回収率、９０ＣＦＵ／プレートを超える（播種された３ｘ１０^４細胞当たり）、および０．５％以上のＣＤ３４^＋／ＣＤ４５^＋細胞を示した

前述の実施例および好ましい実施形態の記載は、特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものではなく、例示するものとして解釈されるべきである。容易に理解されるように、上記の特徴の多数の変形例および組み合わせは、特許請求の範囲に記載される本発明から逸脱することなく用いられ得る。そのような変形例は、本発明の範囲からの逸脱とはみなされず、そのようなすべての変形例は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。本明細書において言及されるすべての参考文献は、その全体が参考により組み込まれる。

Claims (23)

1. （ｉ）約１×１０^７～１×１０^９／ｍｌの治療用細胞と、（ｉｉ）（ａ）約２５～３０ｍＭの酢酸塩および約２０～２５ｍＭのグルコン酸塩を含有し、（ｂ）重量モル浸透圧濃度が約２７０～３２０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌである薬学的に許容される担体溶液と、を含む、治療用組成物。
2. 前記薬学的に許容される担体溶液が、約１２０～１６０ｍＭのＮａ^＋、約３～７ｍＭのＫ^＋、約１．０～２．０ｍＭのＭｇ^２＋、および約９０～１１０ｍＭのＣｌ^－、のうちの１つ以上を含有する、請求項１に記載の治療用組成物。
3. 前記薬学的に許容される担体溶液が、Ｃａ^２＋もしくは乳酸塩、またはそれらの両方を含まない、請求項２に記載の治療用組成物。
4. 前記薬学的に許容される担体溶液が、約１４０ｍＭのＮａ^＋、約５ｍＭのＫ^＋、約１．５ｍＭのＭｇ^２＋、約９８ｍＭのＣＴ、約２７ｍＭの酢酸塩、および約２３ｍＭのグルコン酸塩を含有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の治療用組成物。
5. 前記薬学的に許容される担体溶液が、約９０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、約５ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、約１．５ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）、約２７ｍＭの酢酸ナトリウム三水和物（Ｃ_２Ｈ_３ＮａＯ_２．３Ｈ_２Ｏ）、および約２３ｍＭのグルコン酸ナトリウム（Ｃ_６Ｈ_１１ＮａＯ_７）を含有する、請求項４に記載の治療用組成物。
6. 前記薬学的に許容される担体溶液が、１２６～１５４ｍＥｑ／Ｌのナトリウムを有する、請求項１に記載の治療用組成物。
7. 前記薬学的に許容される担体溶液が、５．５～８．０のｐＨを有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の治療用組成物。
8. 前記治療用組成物が、ＤＭＳＯを含まないか、または微量のＤＭＳＯを含有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の治療用組成物。
9. 前記治療用組成物が、約１×１０^８／ｍｌの治療用細胞を含有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の治療用組成物。
10. 前記治療用細胞が単核細胞を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の治療用組成物。
11. 前記細胞が、臍帯血細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、末梢血細胞、骨髄細胞、または胎盤血細胞を含む、請求項１０に記載の治療用組成物。
12. 前記細胞が、ＣＤ１３^＋、ＣＤ３４^＋、またはＣＤ１３４^＋細胞を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の治療用組成物。
13. 前記治療用組成物が、約０．５％～約５％の血清または血清アルブミンを含有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の治療用組成物。
14. 前記血清または血清アルブミンが、ヒト血清またはヒト血清アルブミンである、請求項１３に記載の治療用組成物。
15. 前記組成物が、約１～１０℃、約２～８℃、または約３～５℃の範囲内の温度を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の治療用組成物。
16. 前記組成物が約４℃の温度を有する、請求項１５に記載の治療用組成物。
17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物と、
    前記組成物を保持し、基材を含む容器であって、前記基材がポリマーを含む容器と、を含む、パッケージング製品。
18. 前記容器が、バッグ、チューブ、シリンジ、または注射器用のバイアルである、請求項１７に記載のパッケージング製品。
19. 前記容器が封止されている、請求項１７または１８に記載のパッケージング製品。
20. 細胞を貯蔵または輸送するための方法であって、（ｉ）請求項１～１９のいずれか一項に記載の治療用組成物またはパッケージング製品を準備することと、（ｉｉ）前記組成物を、１～１０℃の範囲内の温度で約２４～９６時間貯蔵または輸送することと、を含む、方法。
21. 前記細胞が単核細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記貯蔵または輸送した後、前記細胞は、
    ３０ＣＦＵ／３ｘ１０^４細胞超を形成すること、
    回収率が４０％超であるか、または生存率が４０％超であること、のうちの１つ以上が可能である、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 前記治療用組成物が、約７２時間貯蔵または輸送される、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
    

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