CN108261423B - 用于加工含有活细胞的生物药物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括用于加工在无营养的缓冲液中的活细胞组合物的方法。在所述组合物中的所述细胞被储存在无营养的培养基超过约72小时后维持其特性和功能性特征。所述储存方法使得所述细胞可以在加工设施处生产并被运送到医疗点现场。本发明还包括组合物，所述组合物在储存温度下被储存于无营养的缓冲液中的同时维持所述功能性特征。

Description

用于加工含有活细胞的生物药物的方法
技术领域
本发明涉及用于加工生物药物的方法，该含有活细胞悬浮液的生物药物被配制在无营 养的缓冲液中。更具体地，本发明涉及在无营养的培养基中活的免疫细胞悬浮液的包装、 运送和配送，从而所述细胞维持其独特特性、功能和活性的属性。
背景技术
细胞治疗对于肿瘤、病毒和细菌性病原体是一个潜在的根治性治疗。细胞治疗也可以 被用于治疗自身免疫型疾病(如类风湿性关节炎、多发性硬化症和I型糖尿病)，神经系统 疾病(例如老年痴呆症(Alzheimer’s)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和帕金森氏病)，以及抗衰老治疗，心血管障碍的创伤修复和治疗。利用免疫系统的力量治疗或预防疾病是免疫疗法的一个主要的目的。为了增强或抑制在患者中的免疫应答，多种免疫治疗方法和组合物被开发出来。细胞治疗方法一般包含如细胞增殖、分化和/或激活的体外操作。对其操作多于最低限度的细胞被美国食品和药品监督管理局(USFDA)或在其他司法管辖区的监管机构认为是生物药物。在这种可以用于治疗或预防各种疾病的生物药物在市场上被销售前， 这些产品必须在试验性新药申请(IND)下首先在人体临床试验中被研究，或等同的研究。
对于商业用途，用于生产含有活细胞的生物药物的方法必须是标准化的，从而所获得 的细胞具有预定特性、功能和活性释放标准。设计作为生物药物使用的细胞的增殖、分化 和/或激活的方法通常在所述细胞被保持在营养丰富培养基中的体外发生。然而，在对人体 给药所述细胞前，所述细胞必须被转移至无营养的输注缓冲液中。由于这些缓冲溶液不含 有营养成分，所述细胞只在短时期内保持活性。此外，即使所述细胞在被置于无营养的输 注缓冲液中后保持活性，它们快速丧失其独特特性和功能性特征。丧失其独特特性和功能 性特征使得所述细胞不能作为生物药物使用。这个限制需要所述作为生物药物使用的细胞 必须被配制在所述医疗点或接近所述医疗点。由于在制剂中所述活细胞产品有限的保存期 限，细胞被配制在所述医疗点或接近所述医疗点的需求严重地限制了这类产品的所述商业 活性。
活细胞在营养丰富的培养基中是比较稳定的。营养丰富的培养基的示例包括：例如， X-Vivol 5(Bio Whittaker,Walkersville,DM)、PRMI 1640、DMEM、Ham’s F12、McCoys7A 和Medium 199。所述培养基可以补充以添加剂，所述添加剂包括血清、血清蛋白、生长抑制和生长促进物质，例如促有丝分裂单克隆抗体和用于选择基因设计或修饰细胞的选择性试剂。然而，例如对患者给药所需要的将所述细胞向无营养的缓冲液的转移可导致所述细胞的特性、细胞活性和所述细胞的所述功能性特征的快速降解。无营养的缓冲液的示例包括：例如，如生理盐水、磷酸盐缓冲液、5％右旋糖、Plasma-Lyte(Baxter Scientific,Deerfield, IL)和Normasol(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)的等渗溶液。此外，当细胞被转移 至无营养的缓冲液中时，通常认为提供激活和/或分化信号以及如刺激分子或细胞因子的其 他成分的试剂应该被在所述转移至无营养的缓冲液中前去除(参见Berenson等的美国专利 6,867,041)。因此，在无营养的缓冲液中的细胞通常具有有限的保存期限并且可以，例如， 在数分钟内开始丧失其标识属性和活力，以及很难维持其功能性和特性特征超过几个小时。
目前，包括活细胞的免疫治疗的组合物通常是在临近患者的治疗点的cGMP设施中被 生产的(参见Gruenberg的美国专利公开号2003/0175242)。包含活细胞的生物药物的配制 必须在高度控制和无菌条件的cGMP设施中完成。所述活细胞在cGMP设施处被操作并且被配制用于输注到患者体内。一旦所述细胞被制备用于输注，所述细胞被快速转移至所述医疗点现场并对所述患者给药。该方法的主要缺陷在于cGMP设施需要出现在每个医疗点现场附近。所述cGMP设施需要给职员大量的货币资本，并且所述cGMP设施在所述需要 的规章制度下运行。在每个医疗点现场或附近建立大量这些中心的需求是成本高昂的，并 且对于这类药物的所述商业潜力是严重的限制。这导致了一个艰难的抉择：通过建设大量 cGMP设施以增加对患者可利用率所承担巨大的费用，或通过只建立有限数量的cGMP设 施以最小化资本支出而给患者提供有限可利用率。因此，在活细胞治疗领域，使细胞在无 营养的缓冲液中具有更长保存期限的方法是必要的。此外，可以使得悬浮于无营养成分的 输注缓冲液中经过配制的细胞产品包装、运送和大规模配送的方法是必要的。
维持所述配制后用于适应性免疫治疗的细胞的特性和功能的问题被描述于，例如， Gruenberg的美国专利公开号2003/0175272。该公开教导T细胞必须在对患者给药前(输注 前不超过4小时)被再激活，以便维持细胞因子产生的功能性特征。所述细胞的功能可以 被维持多达48小时，只要所述制剂包括自体同源的血浆。然而，从每个目的患者收集的血 浆不利于大规模配送和商业化。
发明内容
在第一方面，本发明包括一种生物药物组合物。所述药物组合物包括配制于无营养的 缓冲液中的活细胞。所述活细胞，在所述无营养的缓冲液中被储存超过约6小时后，维持 其在配制于所述无营养的缓冲液中前的特性和定义所述活细胞的至少一种功能性特征。这 些活细胞在储存于所述无营养的缓冲液中后可用于免疫治疗。它们维持其在配制于所述无 营养的缓冲液中至少72小时前的特性和定义所述活细胞的至少一种功能性特征。
在另一个方面，本发明包括一种用活细胞加工生物药物组合物的方法。所述方法包括 将所述活细胞配制在无营养的缓冲液中；以及在低于约20摄氏度的储存温度下，将所述活 细胞维持在所述无营养的缓冲液中。所述活细胞维持其在配制于所述无营养的缓冲液中前 的特性和定义所述活细胞的至少一种功能性特征。所述活细胞被储存于所述无营养的缓冲 液中超过约72小时后可用于免疫治疗。优选地，所述储存温度在约4摄氏度和约8摄氏度 之间的范围内，并且在所述无营养的缓冲液中的所述细胞的浓度为约107个细胞/毫升以上。 在T细胞的组合物中，所述活细胞被优选地配制为被激活的状态。为了激活所述T细胞， 优选使用对细胞表面分子有反应的固定化的单克隆抗体。优选地，所述细胞表面分子为第 一下列中的一个：CD3、MHCI、MHCII、CD2，和第二共刺激分子的组合。优选地，所述共刺激分子为CD28。所述活细胞被置于软质容器或注射器中，其中所述软质容器或注射器被包装于使所述活细胞维持在储存温度的温度控制装置中。所述方法还包括将在温度控制装置中的所述包装运送和配送至所述医疗点。
在另一个方面，本发明包括一种提供活细胞组合物至医疗设施点的方法。所述方法包 括在加工设施处将所述活细胞配制在无营养的缓冲液中；和将所述细胞在包装中运输至所 述医疗设施点，所述包装被装备成维持低于约20摄氏度的储存温度。所述活细胞处于所述 储存温度多达约72小时，并维持其可用于免疫治疗的活细胞的特性和至少一种功能性特 征。
在另一个方面，本发明包括一种对患者给药免疫治疗的方法。所述方法包括给药包含 配制于无营养的缓冲液中的活细胞的组合物，其中所述组合物已经被储存于所述无营养的 缓冲液中多达约72小时，其中所述活细胞维持其在配制于所述无营养的缓冲液中前的特性 和定义所述活细胞的所述细胞的至少一种功能性特征，所述活细胞可用于免疫治疗。
在另一个方面，本发明包括另一种对患者给药免疫治疗的方法。所述方法包括给药包 含配制在无营养的缓冲液中的活细胞的组合物，其中所述组合物被预先以冷冻的状态被储 存，例如在液氮中储存多达2年以上并已经被复苏和配制并储存在所述无营养的缓冲液中 多达约72小时，其中所述活细胞维持其在配制于所述无营养的缓冲液中前的特性和定义所 述活细胞的至少一种功能性特征，所述活细胞可用于免疫治疗。
附图说明
图1中：A图是运输过程中容器内的温度变化图，其中所述容器没有经过预处理；B图是在经过预处理的气凝胶保温箱内部记录的温度的绘图；C图是运输过程中空气温度的绘图。
图2A-2C显示了细胞包装和运送之前和之后，HTC273、HTC245和HTC264各自的CD40L表达。
图3A-3C显示了细胞包装和运送之前和之后，HTC273、HTC245和HTC264各自的细胞活性。
图4A-4C显示了细胞包装和运送之前和之后，HTC273、HTC245和HTC264各自的IFN-γ分泌。
图5A-5C显示了细胞包装和运送后接着在37摄氏度下孵育6小时的之前和之后，HTC273、HTC245和HTC264各自的IFN-γ分泌。
图6A-6C显示了细胞被配制为用于ID、IT和IV给药，HTC273、HTC264和HTC245 各自的CD40L表达。
图7A-7C显示了细胞被配制为用于ID、IT和IV给药，HTC273、HTC264和HTC245 各自的细胞活性。
图8A-8C显示了细胞被配制为用于ID、IT和IV给药，HTC273、HTC264和HTC245 各自的IFN-γ分泌。
图9A-9C显示了细胞被配制为用于ID、IT和IV给药并储存24和48小时，HTC273、HTC264和HTC245各自的CD40L表达。
图10A-10C显示了细胞被配制为用于ID、IT和IV给药并储存24和48小时，HTC273、HTC264和HTC245各自的IFN-γ分泌。
图11A-11C显示了细胞被配制为用于ID、IT和IV给药并储存24和48小时，HTC273、HTC264和HTC245各自的细胞活性。
图12A-12C显示了HTC264细胞储存24、48和72小时后CD40L的表达、细胞的活性 以及IFN-γ的分泌。
图12D显示了HTC264细胞储存72小时并在37摄氏度孵育24小时后IFN-γ的分泌。
图13A-13C显示了HTC245细胞储存24、48和72小时后CD40L的表达、细胞的活性 以及IFN-γ的分泌。
图13D显示了HTC245细胞储存72小时并在37摄氏度孵育24小时后IFN-γ的分泌。
图14A-14C显示了HTC273细胞储存24、48和72小时后CD40L的表达、细胞的活性 以及IFN-γ的分泌。
图14D显示了针对3批不同的HTC273细胞储存72小时并在37摄氏度孵育24小时后IFN-γ的分泌。
图15A-15C显示了HTC245、HTC264和HTC273细胞CAC和CFB 48小时后各自的 CD40L表达。
图16A-16C显示了HTC245、HTC264和HTC273细胞CAC和CFB 48小时后各自的 细胞活性。
图17A-17C显示了HTC245、HTC264和HTC273细胞CAC和CFB 48小时后各自的 IFN-γ分泌。
具体实施方式
本发明涉及配制在无营养的缓冲液中的活细胞生物药物产品的包装、储存和配送，所 述活细胞生物药物即使在较长的时间后也可以表现出可用于免疫治疗的细胞特征。该活细 胞生物药物即使在所述无营养的缓冲液中约72小时后也可以维持活性以及预定的特性和 功能性特征。
在一些示例性的实施例中，作为生物药物产品使用的免疫Th1记忆细胞可以维持活性、 保持预定的特性(如CD4+、CD45RO+、CD40Lhi、CD62Llo)和恢复功能性特征(例如IFN-伽马的分泌大于1,000pg/106个细胞/4小时)。这些免疫Th1记忆细胞当与CD3/CD28-包被的微珠配制在无营养的缓冲液中并保持在冷冻状态时，可以表现出这些细胞特征长达至少约72小时。
所述包含活细胞的生物产品可以在环境受控的条件下进行包装以便维持所期望的储存 条件，并且通过快件速递服务(例如，联邦快递、联合包裹服务(UPS)、和类似的国际快 递)几乎从世界各地被运送到医疗点。优选地，具有所述活细胞的所述包装在冷冻的条件 下进行储存并运输。在所述医疗点，所述经过配制的细胞可以从所述包装中取出并对患者 给药。所述经过配制的细胞在从所述冷冻的包装中取出后维持稳定长达约6小时。优选地， 所述细胞首先在所述医疗点从冷冻包装中取出，并在对患者给药前被允许平衡至室温1至 2小时。所运输的细胞惊人地稳定，并且所运输的细胞能够用于与未经较长时间储存的细 胞类似的方法。
可选地，所述细胞在冷冻状态被储存并运输至医疗点。在医疗点所述细胞可以以冷冻 状态被储存，并且所述细胞可以被配制于自动化或半自动化的密封的、无菌系统中而后在 对患者给药前以冷藏的状态被现场储存长达约72小时。
活细胞可以是任何细胞，其不仅是经过最少操作的细胞，因为FDA使用该术语是用于 确定细胞产品是生物药物，其只需要根据新药临床研究(IND)申请或相当在人中进行评估，并且根据C.F.R 21中适用的211、606和820部分根据在药品生产质量规范(GMP)进 行制造。
所述活细胞可以是单一类型的或者是混合型，只要它们具有经过定义的特性和功能性 标准。所述细胞可以是天然的或者是经过设计的，可以是来自于自体同源的、同种异体的 和/或异种的供体。当所述活细胞为所述生物药物的活性成分时，其他物质可以被加入到所 述细胞，例如生物活性蛋白、肽、化学制品、核苷酸(RNA、DNA)和/或装置。所述细胞可以游离地悬浮于制剂中、附着在表面或装置上、或封装于装置或材料中。所述细胞旨在于治疗或预防疾病或状况的发生。所述细胞可以在机体的任何部位进行输注、注射或植入。
功能性特征，其是指包括由所述细胞进行并且可用于免疫治疗和干细胞治疗的各种功 能，特别是免疫功能和分化功能。这些免疫功能可以包括，例如，分子分泌、细胞表面部 分的表达、分子识别、对分子产生应答的能力和生长和/或改变成特定细胞类型或引起所述 机体内其他细胞生长、改变、死亡或以某种方式改变正常或疾病功能以及其他本领域已知 的免疫和细胞分化功能。所述免疫功能可以为参与先天免疫和/或适应性免疫系统应答或参 与适应性或先天性免疫应答调节的过程、或过程的级联或分子的产生。所述功能可能涉及 细胞介导的免疫功能和/或涉及体液免疫系统，涉及免疫刺激和免疫抑制功能。所述功能性 特征可能涉及免疫记忆或涉及在自身和非自身抗原间进行区分、或者识别病原体(例如细 菌、病毒或真菌以及肿瘤)或其他异常或不期望的细胞或组织。其他功能可能涉及表面分 子，所述表面分子介导的功能包括：例如，将阻断、促进或以其他方式调节免疫应答或使 分化为特定细胞类型的表面分子转运至特定器官或组织或部位。
本发明描述了生物药物产品，所述生物药物产品包括作为活性成分配制在无营养的缓 冲液中的活细胞。在一些实施例中，所述细胞为可以用于免疫治疗或干细胞治疗的活免疫 细胞。在无营养的缓冲液中，所述组合物在室温下稳定至少约6小时，且在冷冻温度下稳 定至少约24小时，优选地至少约48小时，和更优选地至少约72小时。令人惊奇地，所述组合物中的所述活细胞即使配制在无营养的缓冲液中后也可以维持其在含有营养成分的培 养基中所表现出的特性、活性和功能性特征。本文所述的组合物可以被包装并利用商业快 递在维持适当储存条件的容器中有利地从加工设施运送和配送至医疗点。这样的能力可以 大量节省生产和给药包含活细胞的治疗组合物中的人力、时间和金钱。此外，由于加工设 施可以生产、包装并配送所述细胞至世界上任何医疗点现场，活细胞治疗组合物对于患者 的可达性大大提高了。
本发明还描述了将活细胞悬浮液维持在无营养的缓冲液中一段较长时间的方法。所述 方法包括将所述活细胞转移到无营养的缓冲液中并将它们储存在冷却器储存温度。在一些 实施例中，所述活细胞组合物被储存在冷冻条件下。当需要时，将所述组合物从储存中取 出，并在室温下放置一段时间。在一些实施例中，所述活细胞悬浮液在大约室温下经过一 段时间的放置后，所述活细胞的所述功能性特征可以大体上被恢复。在另一些实施例中， 所述活细胞悬浮液在生理条件下经过一段时间的放置后，所述活细胞的所述功能性特征可 以大体上被恢复。
本文所述的治疗组合物包括活细胞。活细胞，是指经由诸如台盼蓝凸显(trypanblue extrusion)、MTT或ATP水平的生物性发光检测的适当测定技术所确定的多于70％的细胞 是存活的，由此所述细胞能够在适当的条件下进行诸如扩增、分化和/或激活的体外操作。 然而，所述组合物可以包括一些未激活的细胞、经过照射的细胞和/或无活性的细胞。所述 活细胞可以来自多种来源包括，例如：永生化细胞株、原代细胞培养、生物体液、组织、 脐带血、外周血、骨髓、细胞的等量分装冻存等。能够进行如上所述的体外操作的来自其 他来源的活细胞也在本发明的范围内。
所述治疗组合物中的所述细胞可以为同种异体细胞。例如，来自于同种异体供体的血 液或骨髓的细胞可以以期望的方式进行加工，然后配制成用于输注到患者体内。被置于用 于保持人体使用产品的注射器或转移包装或其他合适装置中的所述输注制剂可以被包装并 运送至医疗点现场为患者给药。可选地，所述治疗组合物中的所述细胞可以为自体同源细 胞，所述自体同源细胞经过操作、配制、包装和运送，并且被回输到同一个患者体内。所 述活细胞也可以来自于非人体来源，并经过操作、配制、包装和运送用于人体给药(异种)。 所述用于对人体给药的相同的治疗组合物也可以用于非人类治疗和预防疾病的方案。
在所述组合物中的所述活细胞为免疫细胞的实施例中，这些免疫细胞可以包括来自于 骨髓或脐带血、粒细胞(诸如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)的细胞。所 述免疫细胞也可以为单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、天然杀伤细胞、淋巴细胞(B细胞、T细胞和NKT细胞)。T细胞可以为，例如，CD4+细胞(包括Th0、Th1、Th2、Th17和 Treg细胞)和/或CD8+细胞(Tc1和Tc2)。
一种用于增强受试者中细胞免疫应答的免疫治疗方法是被称为适应性免疫治疗的细胞 治疗的类型。细胞治疗是活性成分全部或部分为活细胞的药物。适应性免疫治疗是涉及从 受试者去除免疫细胞、体外加工(即，细胞的激活、纯化和/或扩增)和随后将所获得的细 胞输注回到相同的受试者体内(自体同源治疗)或到不同的受试者体内(同种异体治疗) 的细胞治疗。
所述生物药物产品可以包括经过操作的活细胞，所述操作利用各种用于适应性免疫治 疗的体外操作。经过体外操作的活细胞可以包括，例如，LAK细胞(Rosenberg美国专利号4,690,915)，TIL细胞(Rosenberg美国专利号5,126,132)，细胞毒性T细胞(蔡等，美 国专利号6,255,073；Celis等，美国专利号5,846,827)，扩增的肿瘤引流淋巴结细胞(Terman 美国专利号6,251,385)，淋巴细胞的各种制剂(Bell等，美国专利号6,194,207；Ochoa等， 美国专利号5,443,983；Riddell等，美国专利号6,040,180；Babbitt等，美国专利号5,766,920； Bolton美国专利号6,204,058)，CD8+TIL细胞(Figlin等(1997)Journal of Urology158：740)，在IL-2存在下以抗CD3单克隆抗体激活的CD4+T细胞(Nishimura(1992)J.Immunol. 148:285)，在IL-2存在下用抗CD3和抗CD28共激活的T细胞(Garlie等，(1999)Journal of Immunotherapy 22:336)，在IL-2存在下体外产生并以抗CD3和抗CD28单克隆抗体 (mAb)扩增的抗原特异性CD8+T细胞(Oelke等，(2000)Clinical Cancer Research 6:1997)， 和注射混有卡介苗(BCG)的经过照射的自体同源肿瘤细胞以便对受试者进行接种，7天 后引流淋巴结T细胞随后恢复，引流淋巴结T细胞以抗CD3单克隆抗体激活，接着在IL-2中扩增(Chang等，(1997)Journal of Clinical Oncology 15:796)。
在一个示例性的实施例中，本发明的治疗组合物包括至少一些T细胞，优选地包括同 种异体T细胞。这些T细胞还优选通过细胞表面激活而被激活，以形成激活的Th1记忆细胞。所述T细胞可以以各种方式被激活，包括通过使用特异性针对T细胞表面分子的固定 化单克隆抗体。适当经过激活的T细胞，例如描述于美国专利号7,435,592中并以通过参照 并入本文。所述细胞优选地具有细胞表面部分，所述细胞表面部分通过单克隆抗体或其他 结合试剂而交联。这些单克隆抗体和/或结合试剂优选地通过，例如固定在固体表面上而交联，从而激活所述T细胞。这些在本文中被称为在培养基中激活的细胞(CAC)。这些体外 制备的CAC可以进行冷冻以供将来使用或配制成用于输注。
在优选的实施例中，所述体外制备的CAC冷冻储存，直到对患者给药所需。对患者给 药前，所述CAC被复苏、洗涤并在营养培养基中通过所述细胞表面结合部分的交联而再激 活，其中所述细胞表面结合部分(诸如CD3和CD28)被描述于例如美国专利号7,402,431(通过参照并入本文)中。所述CAC与所述交联剂一起然后可以被洗涤并转移至无营养的 缓冲液，例如制剂缓冲液。所述制剂缓冲液中再激活的细胞在此称为制剂缓冲液中的细胞(CFB)。所述CFB可以为了治疗目的对患者给药。通常地，这些再激活的细胞，一旦被 转移至无营养的缓冲液中，具有有限的保存期限。活细胞可以以至少约106个细胞/毫升的 密度进行配制，优选地以至少约107个细胞/毫升以上的密度进行配制。在一些实施例中， 所述活细胞可以以至少约108个细胞/毫升以上的密度进行配制。所述细胞的具体浓度可以 通过细胞的具体用途和治疗方案确定。
所述治疗组合物还可以包括许多其他成分。这些成分可以包括，例如，使所述活细胞 保持在所期望的激活状态的试剂。在一个示例性的实施例中，所述治疗组合物可以包括使 所述T细胞保持在被激活的状态的试剂，例如以下描述于实施例中的DynabeadsClinExVivoTM。
本发明包括储存和加工所述活细胞组合物以增加所述保存期限的方法。本文所使用的 保存期限被定义为配制后所述CFB维持活性、预定义的特性和功能性特征的时间量。通常 地，所述细胞被转移至适合输注至患者体内的无营养的缓冲液中。本文所提到的无营养的 缓冲液是任何类型的缺少适当的成分以支持细胞增殖和/或扩增的培养基、缓冲液或其他液 体。所述无营养的缓冲液通常是等渗的USP无菌且无热源的，含有所述适当的成分和/或缓 冲系统以维持活细胞完整，并且被获许用于人体非胃肠道用途。在一个示例性实施例中， 所述无营养的缓冲液为由Plasmalyte A(Baxter Scientific,Deerfield,IL)和1％人血清白蛋白 (McKesson,San Francisco,California)组成的制剂缓冲液。
在具有被激活的细胞(特别是被激活的Th1细胞)的实施例中，即使在所述细胞被转 移至所述无营养的缓冲液中时，对细胞的激活信号也会维持。例如，在所述细胞通过细胞 表面结合部分交联而被激活的实施例中，所述交联优选地维持在无营养的缓冲液中。在储 存过程中所述交联的维持对于从储存中取出后所述组合物功能性特征的恢复可以是决定性 的。无营养的缓冲液中去除了激活成分的细胞组合物不能以与维持被激活状态的细胞相同 的方式恢复。
本文所述的方法也包括在活细胞被转移至无营养的缓冲液中后该细胞的加工方法。所 述活细胞组合物可以被转移至具有用于储存的冷却器温度的环境中，以便增加所述组合物 的保存期限。在无营养的缓冲液中的所述细胞被转移至的冷却器温度在本文中称为储存温 度。通常地所述细胞在被置于所述无营养的缓冲液中后尽可能迅速地被转移至储存温度。 优选地，所述细胞在被置于所述无营养的缓冲液中后在小于约6小时内，更优选地在被置 于所述无营养的缓冲液中后在小于约4小时内被转移至所述储存温度。在甚至更优选的实 施例中，所述细胞在被置于所述无营养的缓冲液中后在小于约1小时内被转移至所述储存 温度。
所述组合物可以保持的储存温度是不同的，但通常低于生理温度，即低于约37摄氏度。 优选地，所述细胞被储存在冷藏温度下。冷藏温度可以在约-2摄氏度和约12摄氏度的范围 内。更优选地，所述细胞被储存在约0摄氏度以上和约10摄氏度范围的温度下。最优选地， 所述细胞被储存在约4摄氏度和约8摄氏度范围的温度下。
本文所述的组合物也可以被包装，并且从制造或加工设施运送和配送至医疗点现场。 制造或加工设施可以为诸如医院、诊所或任何遵守既定准则可以处理用于生物药物的活细 胞的生产设施的设施。医疗点可以是医院、诊所或任何其它通常给予患者护理的场所。通 常地，用于运送的组合物以维持所述组合物在如上所述的储存温度范围内的方式进行包装。 所述细胞可以储存于各种容器中并进行运送。所述细胞可以被储存于，例如软质容器、注 射器等，并进行运送。在运送时，所述诸如注射器的容器可以被置于例如保温盒的包装中。 在所述具有活细胞的容器被置于所述包装中前，优选地，所述包装或保温盒在所述期望的 储存温度下进行预处理。例如，所述组合物可以被包装于冰或气凝胶包装盒中。优选地， 所述包装为能够维持所述期望储存温度的保温盒，而不受外部温度的影响。优选地，预处 理所述保温盒，所述预处理是指将所述具有活细胞的容器置于所述保温盒内前，所述保温 盒已经被储存或设置在所述期望的储存温度下。在优选的实施例中，放置所述生物产品前 所述包装进行预处理，并且所述包装在冷藏或冷冻条件下被运输至所述医疗点。可以使用 任何形式的运送方法，而在示例性的实施例中是通过商业快递运送的。
当所述组合物被储存于所述储存温度范围内时，本文所述的组合物的保存期限可以令 人惊奇地延长。所述活细胞组合物的保存期限可以延长至超过约6小时。优选地，所述活 细胞组合物的保存期限可以延长至超过约24小时，更优选地，至超过约48小时。在甚至更优选的实施例中，所述组合物的保存期限可以延长至长达约72小时。在最优选的实施例中，所述保存期限可以延长至长达约120小时。超过约120小时的保存期限也在本发明的 范围内。
在无营养的缓冲液中根据本文所述方法储存的细胞组合物可以在储存期间和从储存中 取出后维持其活性、特性和功能。所述细胞的活性可以通过本领域已知的各种方法确定， 该方法包括诸如台盼蓝凸显、MTT、7-氨基-放线菌素D或ATP水平的生物性发光检测的 测定技术。
所述细胞的特性可以通过各种方法确定。在所述组合物中的细胞可以用指示该特定细 胞类型的各种外部和内部细胞标记物进行测定。外部标记物依据单克隆抗体的聚类设计进 行分类(在第一届到第八届的国际人类白细胞分化抗原研讨会上分化聚类(CD)被指定为 总共有247个CD)。白细胞在其细胞表面表达不同的分子种类，其中许多分子种类反映其 不同阶段的谱系特异性分化或不同状态的激活或灭活。白细胞表面分子通常用抗白细胞-单 克隆抗体(mAbs)进行检测。利用单克隆抗体的不同组合，可以绘制出不同白细胞亚群的 细胞表面免疫表型，包括B细胞、辅助T细胞(Th)、细胞毒性T细胞(Tc)和天然杀伤(NK)细胞的在功能性上不同的成熟淋巴细胞亚群。
即使储存于无营养的培养基中后，所述组合物中的活细胞也表现出配制在所述无营养 的培养基前所出现的功能性特征。功能性特征可以包括各种活性，包括：例如，诸如CD40L、 FasL、穿孔素和粒酶B的功能性分子，共刺激分子4-1BBL、CD28、CTLA4和肿瘤坏死因子-相关的激活诱导的细胞因子(TRANCE)，TWEAK，PD-1，B7家族，诸如整合素、钙 粘素和选择素的粘附分子的表达；以及各种细胞因子和趋化因子的分泌；和这些细胞因子 和趋化因子受体的表达。细胞因子和趋化因子是具有生长、分化和激活功能的过多分泌的 蛋白，其中该蛋白可以调节和确定免疫应答性质并控制免疫细胞转运和免疫器官的细胞排 列。细胞因子可以包括，例如，IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、GMCSF、IFN-伽马等。
在一些实施例中，在配制后和整个储存期间所述功能性特征被保持，并且在从储存中 取出或运送后所述酶或标记物的水平可以迅速被测定。例如，所述CD40L的表达可以在所 述组合物从储存中取出并允许在室温下孵育约2小时后进行测定。所述CD40L的表达量可 以与配制和储存时的CD40L表达水平相近似。例如，参见图2A-2C。类似地，所述组合物中存活细胞的数量可以在从储存中取出并在室温下孵育约2小时后进行确定。所述存活细胞的数量可以与配制和储存时的细胞活性水平相近似。例如，参见图3A-3C。
在另一些实施例中，所述功能性特征可以在将所述细胞暴露于生理条件后恢复。这可 以表明，输注到患者体内时，所述细胞组合物可以实现预期的功能，并且分泌或表达在配 制时所述细胞的成分特征。例如，当所述细胞被配制并置于储存状态下时，IFN-γ的分泌可 以被抑制。IFN-伽马在本文中被称为IFN-γ或IFN-g。所述细胞返回到室温并不能恢复IFN-g 的分泌，然而将所述细胞在37摄氏度孵育24小时增加了所述IFN-γ的分泌水平，该分泌 水平类似于配制时的水平。例如，参见图12D、13D和14D。有利地，储存过程中所述IFN-γ 水平的降低可以阻止细胞资源的衰竭。如果在储存过程中所述用于分泌的细胞资源被充分 保留，那么所述细胞通常可以在适当的生理条件下重新启动所述IFN-γ的分泌。由此，尽 管所述组合物在给药前已经被储存了较长的时间，对患者给药所述组合物后仍然可以为患 者提供所述IFN-γ和由于给药所述治疗组合物所获得的其他炎性细胞因子。
所述组合物的保存期限的延长可以通过各种方式证明。如本文所使用的，保存期限的 延长可以指所述组合物中的活细胞即使在如上所述较长的储存时间后维持其活性、特性和 其功能性特征。通常地，在储存至少24小时后，所述组合物在无营养的缓冲液中维持定义 性特征的相对于配制时所述活性的至少约50％的活性。在储存后相对于配制时的所述活性， 优选地维持至少约75％的活性，更优选地维持至少约85％的活性，再更优选地维持至少约 90％的活性。
在优选的实施例中，储存至少48小时后，所述组合物在无营养的缓冲液中维持定义性 特征的相对于配制时所述活性的至少约50％的活性。在储存后相对于配制时的所述活性， 优选地维持至少约75％的活性，更优选地维持至少约85％的活性，甚至更优选地维持至少 约90％的活性。
在更优选的实施例中，储存至少72小时后，所述组合物在无营养的缓冲液中维持定义 性特征的相对于配制时所述活性的至少约50％的活性。在储存后相对于配制时的所述活性， 优选地维持至少约75％的活性，更优选地维持至少约85％的活性，甚至更优选地维持至少 约90％的活性。
所述细胞组合物可以通过各种方法对患者给药。所述组合物可以通过皮下、静脉内、 鞘内、肿瘤内和其他类似途径进行给药。
实施例
材料：PE缀合的CD40L购自Beckman Coulter，Brea，CA。7-氨基-放线菌素D(7-AAD)(1000x)购自Cayman Chemical Co.，Ann Arbor，MI。PlasmaLyte A购自BaxterScientific， Deerfield，IL。人血清白蛋白(HSA)购自McKesson，San Francisco，California。FcR结 合抑制剂购自eBioscience，San Diego，CA。免疫磁珠ClinExVivoTM购自Invitrogen,Carlsbad， CA。
制剂缓冲液中的细胞(CFB)的制备-培养基中激活的细胞(CAC)被置于cRPMI 培养基中进行洗涤。记录表示所述配制方案的开始时间。将cRPMI培养基中的细胞进行离 心，去除上清液并将所述细胞重悬在cRPMI缓冲液中。利用台盼蓝测定法确定细胞活性。 所述活细胞的总细胞数和浓度被用于确定存活细胞的百分比。如果所述样品具有超过80％ 的细胞活性，那么用于细胞再激活和配制的程序继续进行。
所述CAC细胞以1×107个细胞/毫升的浓度进行重悬。以1×107个细胞/毫升的活细胞浓 度进行再激活。根据体积在24孔板、6孔板或75厘米3的培养瓶中进行再激活。加入免疫 磁珠ClinExVivoTM CD3/CD28以便再激活所述细胞，并且在36～38摄氏度和5％CO2条件下孵育4小时。在孵育约4小时后，将所述细胞取出并转移至50毫升的管子中，其中所述 50毫升的管子具有最终配制的缓冲液(FFB)。FFB为PlasmaLyte A与1％的HAS。将所述 经过再激活的细胞进行离心，去除上清液后重悬在FFB中。这些被称为配制缓冲液中的细 胞(CFB)。
将CFB以107个细胞/毫升的浓度重悬于FFB中。将所述CFB重悬用于ID、IT或IV 给药。将1毫升的所述细胞悬浮液加入到3毫升规格的注射器中作为ID制剂。IT和IV制 剂分别为3毫升和5毫升。具有适当制剂的所述注射器储存于约4摄氏度的平均冷藏温度。
收集储存后的样品-在不同的时间点收集所述细胞和上清液。所述时间点如下：0(起 始)、室温(RT)下2小时、4摄氏度下48小时、和4摄氏度下48小时以及随后的室温下 2小时。
在每一个时间点，收集100微升细胞悬浮液，然后将所述细胞在4摄氏度下以400g的 速度旋转5分钟。然后将上清液转移至另一个管子中用于稍后利用ELISA检测IFN-γ。将所述细胞重悬于150微升染色缓冲液中用于流式细胞术。在一些实验中，将所述细胞重悬于100微升cRPMI培养基并在37摄氏度5％CO2的培养箱中培养24小时。24小时后取出 上清液，通过ELASA检测IFN-γ。
流式细胞术(CD40L和7-AAD)-将以上获得的150微升细胞悬浮液中的50微升转 移至3只离心管中，并将3只离心管分别标记为未染色、CD40L和7-AAD。将标记为未染 色的离心管在冰上孵育20分钟。对于标记为CD40L的离心管，依据生产商的说明书将所 述细胞与FcR结合抑制剂在冰上预先孵育20分钟。然后将40微升染色缓冲液(PBS+1％FBS)和10微升PE-CD40L抗体加入至所述细胞悬浮液中，并于暗室中在冰上 再孵育20分钟。
利用7-AAD的流式细胞术检测细胞活性。7-AAD嵌入到死细胞或受损细胞的DNA中，由此，确定7-AAD阳性细胞是细胞活性的指标。对于标记为7-AAD的离心管，该离心管 在6摄氏度下以400g的速度离心5分钟。去除上清液后，将所获得的细胞颗粒重悬于100 微升1×的7-AAD溶液中。将该离心管于暗室中在冰上孵育15分钟。将1毫升染色缓冲液 加入到标记为CD40L的离心管，然后将3个离心管一起进行离心。去除上清液后，将所获 得的细胞颗粒重悬于0.4毫升的染色缓冲液，并运行FACS。
INF-γELISA–利用IFN-γsandwich ELISA试剂盒(R&D Systems,Mpls.MN)，依据生 产商的说明书确定所述上清液中分泌的IFN-γ。
实施例1–进行本实验是为了确定配制缓冲液中的细胞(CFB)运输后在低温下是否稳定。将几批细胞悬浮液配制于FFB中，并通过邮递服务(联邦快递)进行运输。利用数 据记录仪监测温度。监测没有经过预处理的盒内和经过预处理的气凝胶保温盒内的温度变 化。同时监测其外部的温度。配制并运输不同的3批。上清液样品取自在培养基中激活的 细胞(CAC)、配制后即刻的CFB、室温(RT)下2小时后的CFB、4摄氏度下48小时后 的CFB、和4摄氏度下48小时然后室温(RT)下2小时后的CFB。检测CAC的CD40L 表达，并检测剩余细胞的CD40L表达和细胞活性。
图1中的A图和B图显示了所述细胞在运输过程中所处于的温度。图1中的A图显示出当样品没有被包装于预处理的盒中时，其温度在约48小时内从约5摄氏度变化至约13.7摄氏度。所述样品是稳定的，说明温度的较大波动是可接受的。图1中的B图显示出所述 预处理保温盒内部的温度保持得相当稳定。该温度从0.2摄氏度变化至2.2摄氏度。图1中 的C图显示了在所述运送期间外部温度的变化。
图2A-2C显示了CD40L的表达并没有太大变化。图3A-3C显示出运送过程后的细胞活性与运送前的细胞活性相似。这些结果表明将所述治疗组合物保持在如约2摄氏度至约13摄氏度的宽范围内的包装中是没有伤害的。
实施例2-进行这项研究是为了确定所述低温是否可以延长CFB的有效期。在室温下 进行CFB不同制剂的稳定性研究。将CFB配制成如上所述的用于皮下给药(ID)、肿瘤内给药(IT)和静脉内给药(IV)。检测这些制剂的稳定性是为了看出低温稳定性是否可以被延长。
将几批HTC264、HTC245和HTC273配制为用于ID、IT和IV，并在配制后室温下6 小时后检测其CD40L的表达、细胞活性和IFN-γ的分泌。图6A-6C、图7A-7C和图8A-8C 显示了这些检测的结果。所有这三个参数在室温下6小时后是稳定的。图9A-9C显示了在4摄氏度下储存48小时后CD40L的表达是稳定的。图11A-11C表明在4摄氏度下储存48 小时后所述细胞活性是稳定的。图10A-10C表明在4摄氏度下储存48小时后IFN-γ的分泌 并不恢复。然而如下所示其可以通过转移回RPMI并在37摄氏度孵育24小时而恢复。
将3批HTC264、HTC245和HTC273配制为ID、IT或IV制剂形式。每种制剂形式制 备成总共4个注射器(1只室温、1只4摄氏度下储存24小时、1只4摄氏度下储存48小 时、1只4摄氏度下储存72小时)，并在4摄氏度下孵育不同的时间。孵育后收集上述样 品，并回到室温下2小时。以下表1显示了时间点、样品和对每一批细胞进行的检测。并 且当所述细胞在37摄氏度下孵育24小时后确定IFN-γ水平。
表1
时间 样品 检测
-4h CAC CD40L
0 CFB,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
2h CFB,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
24h 4℃ CFB,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
24h 4℃-2h RT CFB,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
48h 4℃ CFB,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
48h 4℃-2h RT CFB,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
72h 4℃ CFB,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
72h 4℃-2h RT CFB,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
图12A-12D、图13A-13D和图16A-14D分别显示了几批HTC264、HTC245和HTC273 的结果。对这几批的皮下给药制剂进行如上所示的检测。该结果显示了将所述CFB保持在 4摄氏度可以在72小时后于所述细胞表面维持CD40L的表达(图12A、图13A和图16A)。 该细胞活性并没有受到低温储存的太大影响(图12B、图13B和图16B)。当所述细胞回到 室温仅仅2小时后，所述IFN-γ分泌的水平被抑制(图12C、图13C和图16C)。然而，当 所述细胞被转移回RPMI培养基中并在生理温度(37摄氏度)下孵育24小时后，所述IFN-γ 水平恢复(图12D、图13D和图14D)。这表明了所述细胞在低温下保持72小时后仍然可 以分泌IFN-γ。这暗示了如果治疗性给药这些细胞，可以在患者体内产生IFN-γ，其水平与 没有经过长期储存的细胞相似。
实施例3–进行本实验是为了比较CAC细胞和CFB细胞的稳定性。将三批不同的细胞配制为ID注射器。对于每一批细胞，一个注射器用于CAC，而另一个注射器用于CFB。 复苏CAC，并用cRPMI进行洗涤。细胞计数后，用FFB以109个细胞/毫升的密度重悬所 获得的细胞颗粒，并将1毫升的细胞悬浮液转移至3毫升的注射器中。对于CFB，用cRPMI 以109个细胞/毫升的密度重悬所获得的细胞颗粒，并与抗-CD3/抗-CD28珠子混合。将上述 细胞和珠子的混合物在37摄氏度5％CO2条件下孵育4小时。用FFB洗涤所述细胞，并用 FFB以107个细胞/毫升的密度进行重悬。将上述细胞悬浮液转移至3毫升的注射器中。在 每个时间点，从所述注射器中获取100微升的样品用于CD40L、IFN-γ、活性检测。在4 摄氏度下孵育48小时后，以400g的速度将一些样品进行离心5分钟以去除FFB。弃上清 液后，将所获得的细胞颗粒重悬于100微升的cRPMI中，并在37摄氏度5％CO2条件下孵 育2小时。所收集的上清液用于IFN-γ检测。下表2列出了所收集的样品和进行的检测。
表2
时间 样品 检测
0 CAC,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
2h,RT CAC,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
48h,4℃ CAC,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
48h 4℃-2h RT CAC,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
0 CFB,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
2h,RT CFB,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
48h,4℃ CFB,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
48h,4℃-2h RT CFB,上清液 CD40L,IFN-γ,活性
上述结果表明在4摄氏度下对CAC孵育48小时显著降低细胞表面上的CD40L表达，参见图15A-15C。然而，在4摄氏度下对CFB孵育48小时可以维持所述CD40L表达，这 暗示了CD3和CD28的交联对于所述细胞的稳定性是至关重要的。即使在4摄氏度下孵育 48小时后，CFB也可以维持活性并分泌大量的IFN-γ。参见图16A-C和图17A-C。
实施例4–进行这项研究是为了确定经过配制的CFB在包装和从处于耶路撒冷，以色 列的生产设施运送至医疗点后的稳定性。确定CFB产品在72小时运输过程后满足预先确定的特性和功能性特征是非常重要的，因为在所述配制过程结束时，上述细胞被转移至无营养的输注缓冲液中，而所述细胞在该无营养的输注缓冲液中可能丧失其活性和独特特性以及功能性特征。已知的是低温可以减缓基因表达和细胞活性，并且该基因表达可以通过将细胞返回生理温度而恢复。出于这个原因，利用预先验证的、冷藏的、控温的容器进行 运送。
通过将运输前细胞特征(在基线–激活4小时后配制的注射器＝FF)与运送至纽约并返回后获得的(在FF完成后最少72小时)相比较，检测CFB细胞以检查在72小时运 输过程后是否维持其预先定义的特性和功能性特征。
预先定义的终点参数为：
1、活性检测：在所有检测时间点CFB活性必须大于70％活细胞。
2、内毒素快速检测：在基线和于4摄氏度下储存72小时后所收集的样品的内毒素水 平必须低于0.5Eu/ml。
3、革兰氏染色：在所有检测时间点所收集的样品的载玻片上不能观察到细菌。
4、表面染色：CD40L AM(CFB-CAC)≥30。
5、USP无菌：所有检测的培养基中配制的样品没有生长。
6、通过ELISA检测IFNγ分泌：
6.1在4小时激活过程中积累的IFNγ大于1000pg IFNγ每1×106个细胞；
6.2基线后在24小时过程中积累的IFNγ大于6000pg每1×106个细胞；
6.3在2摄氏度至8摄氏度储存72小时后在24小时过程中积累的IFNγ大于6000pg每1×106细胞。
结果：
依剂量将每批HTC300进行3种独立的最终配制过程。包装于注射器中所配制的 产品以Flying Cargo(FC)运送至NY并返回耶路撒冷，以色列。
将运输中的注射器从配制结束的时间长达72小时保持在2-8摄氏度，如运送包装内的温度记录器所显示的。所有结果总结在表3中。
表3
Figure BDA0001588046520000171
可以从表3中看出，所有配制的三批都通过了预先定义的验收标准，因此证明了在所 建议的配送条件下CFB的稳定性。
尽管本发明已经参照优选的实施方式进行了描述，本领域的技术人员将能认识到在不 脱离本发明的精神和范围的情况下在形式和细节上进行变化。

Claims (15)

1.一种体外加工生物药物组合物的方法，所述生物药物组合物含有用于在免疫治疗中使用的活细胞，其中所述活细胞是通过抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体包被的微珠与细胞表面部分交联而已经被激活的激活态T细胞（CAC），所述方法包括：
以培养基洗涤所述CAC细胞，随后进行第一离心以去除上清液并且将所述CAC细胞以第一所需浓度重新悬浮在培养基中，其中将细胞活力大于80%的重新悬浮的CAC细胞用于细胞的再激活和配制；
用所述抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体包被的微珠再激活重新悬浮的CAC细胞并且孵育足以再激活的时间；
将再激活的CAC细胞配制在无营养缓冲液P1asma-Lyte A中，随后进行第二离心以去除上清液并且重新悬浮于所述非营养缓冲液P1asma-Lyte A中，从而获得在配制缓冲液中的细胞（CFB）；
将所述CFB细胞以第二所需浓度重新悬浮在所述非营养缓冲液P1asma-Lyte A中；
使交联有包被在所述微珠上的所述抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体的重新悬浮的CFB细胞维持在储存温度低于20℃的所述无营养缓冲液P1asma-Lyte A中超过6小时，
其中维持在所述无营养缓冲液P1asma-Lyte A中的活细胞维持其在配制于所述无营养缓冲液P1asma-Lyte A中前的特性和定义所述活细胞的至少一种功能性特征，所述活细胞在被储存于所述无营养缓冲液P1asma-Lyte A中超过6小时后可用于免疫治疗，
其中在储存后所述活细胞表达CD40L，所述CD40L的表达量为相对于配制时CD40L的表达量的至少80%，和
在储存后所述活细胞分泌细胞因子，分泌的细胞因子是IFN-γ，并且分泌的IFN-γ的含量为相比于配制时IFN-γ含量的至少80%。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述储存温度在0℃和10℃的范围内。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述活细胞的所述第一所需浓度和所述第二所需浓度为106个细胞/毫升以上，和/或所述活细胞被置于软质容器或注射器中，其中所述软质容器或注射器被包装于使所述活细胞维持在所述储存温度范围内的温度控制装置中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述活细胞为被固定化抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体包被的微珠激活的Th1细胞，其中所述抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体是交联的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述活细胞还表达FasL、穿孔素和粒酶B，表达共刺激分子，表达粘附分子，分泌趋化因子或其组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中储存后的IFN-γ的分泌在37℃下孵育至少24小时后恢复。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述无营养缓冲液P1asma-Lyte A中的所述活细胞稳定至少72小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体包被的微珠是Dynabeads ClinExVivoTM CD3/CD28。
9.一种提供活细胞组合物至医疗设施点的体外方法，所述活细胞组合物用于在免疫治疗中使用，其中所述活细胞是通过抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体包被的微珠与细胞表面部分交联而已经被激活的激活态T细胞（CAC），所述方法包括：
以培养基洗涤所述CAC细胞，随后进行第一离心以去除上清液并且将所述CAC细胞以第一所需浓度重新悬浮在培养基中，其中将细胞活力大于80%的重新悬浮的CAC细胞用于细胞的再激活和配制；
用所述抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体包被的微珠再激活重新悬浮的CAC细胞并且孵育足以再激活的时间；
在加工设施处将再激活的CAC细胞配制在无营养缓冲液P1asma-Lyte A中，随后进行第二离心以去除上清液并且重新悬浮于所述非营养缓冲液P1asma-Lyte A中，从而获得在配制缓冲液中的细胞（CFB）；
将所述CFB细胞以第二所需浓度重新悬浮在所述非营养缓冲液P1asma-Lyte A中；和
将交联有包被在所述微珠上的所述抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体的重新悬浮的CFB细胞在设置为维持低于20℃的储存温度的包装中运输至所述医疗设施点，其中所述活细胞处于所述储存温度下超过6小时，并维持其在配制于所述无营养缓冲液P1asma-Lyte A中前的特性和定义所述活细胞的至少一种功能性特征，
其中所述组合物中的所述活细胞在运输且从所述储存温度移出后表达CD40L，所述CD40L的表达量为相对于配制时CD40L的表达量的至少80%，
所述组合物中的所述活细胞在运输且从所述储存温度移出后分泌IFN-γ，并且分泌的IFN-γ的含量为相比于其配制时含量的至少80%。
10.根据权利要求9所述的方法，进一步包括在运输前将配制后的所述活细胞置于软质容器或注射器中。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述活细胞为被固定化的抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体包被的微珠激活的Th1细胞，其中所述抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体是交联的。
12.根据权利要求9所述的方法，其中在运输和储存后所述IFN-γ的分泌在37℃下孵育至少24小时后恢复。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述无营养缓冲液P1asma-Lyte A中的所述活细胞在所述储存温度下维持至少72小时。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述活细胞的所述第一所需浓度和所述第二所需浓度为106个细胞/毫升以上。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体包被的微珠是Dynabeads ClinExVivoTM CD3/CD28。
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