TWI682996B - 處理含有活細胞之生物藥物的方法 - Google Patents

Abstract

本發明包含處理非營養緩衝液中的活細胞組成物之方法。該等組成物中的細胞在儲存於非營養培養基中多達約72小時之後仍維持其身份及功能特徵。該儲存方法使細胞能夠在處理機構製造且運送至照護地點。本發明亦包含已在儲存溫度下儲存於非營養緩衝液中，同時維持功能特徵之組成物。

Description

處理含有活細胞之生物藥物的方法

本發明係關於處理含有於非營養緩衝液中調配之活細胞懸浮液之生物藥物的方法。更詳言之，本發明係關於於非營養培養基中的活免疫細胞懸浮液之包裝、運送及配送，從而細胞維持其獨特身份、功能及存活力性質。

細胞療法為一種針對腫瘤、病毒及細菌病原體之潛在治癒性療法。細胞療法亦可用於治療自體免疫性疾病(例如類風濕性關節炎、多發性硬化症及I型糖尿病)、神經病症(諸如阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、ALS及帕金森氏病(Parkinson's disease))以及抗衰老治療、傷口癒合及心血管病症治療。管理免疫系統之效力以治療或預防疾病為免疫療法之一個主要目標。已開發多種免疫療法方法及組成物以增強或抑制患者的免疫反應。細胞療法方法常涉及對細胞進行活體外操作，諸如增殖、分化及/或活化。超過最低限度操作之細胞被美國食品及藥物管理局(United States Food and Drug Administration，USFDA)以及其他管轄區域內之管理機構視為生物藥物。在此等生物藥物可經銷售用於治療或預防任何疾病之前，此等產品必須首先根據研究性新藥申請(Investigational New Drug Application，IND)或等效方案在人類臨床試驗中加以研究。

對於商業使用，用於製造含有活細胞之生物藥物之方法必須經標準化以使所得細胞具有預定身份、功能性及存 活力發佈準則。引起意欲用作生物藥物之細胞之增殖、分化及/或活化的方法通常活體外進行，其中使細胞保持在富含養分之培養基中。然而，在向人類投予細胞之前，細胞必須轉移至無養分輸注緩衝液中。因為此等緩衝溶液不含有養分，所以細胞僅在較短時期內保持活力。此外，即使細胞在置於無養分輸注緩衝液中之後保持活力，其亦快速喪失其獨特身份及功能特徵。喪失其獨特身份及功能特徵使細胞不適合用作生物藥物。此限制要求意欲為生物藥物所用之細胞必須處於或接近照護點加以調配。因為調配物中活細胞產品之保存期限有限，所以要求細胞處於或接近照護點加以調配，從而使此類產品之商業存活力受到嚴重限制。

活細胞在富含養分之培養基中相對穩定。富含養分之培養基之實例包含例如X-Vivol 5(BioWhittaker,Walkersville,MD)、RPMI 1640、DMEM、漢姆氏F12(Ham's F12)、McCoys 7A及培養基199。培養基可補充有其他成分，包含血清、血清蛋白、生長抑制物質及生長促進物質(諸如促有絲分裂單株抗體)及用於選擇經基因工程改造或修飾之細胞之選擇性藥劑。然而，諸如為向患者投予所需之向非營養緩衝液中轉移細胞可導致細胞之細胞身份、細胞存活力及功能特徵快速降解。無養分緩衝液之實例包含例如等張溶液，諸如生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、5%右旋糖、Plasma-Lyte(Baxter Scientific,Deerfield,IL)及Normasol(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)。此外， 當細胞轉移至非營養緩衝液中時，通常咸信提供活化及/或分化信號之試劑以及諸如刺激分子或細胞激素之其他組分應在轉移入非營養緩衝液中之前加以移除。(參見Berenson等人之美國專利6,867,041。)因此，細胞在非營養緩衝液中通常具有有限之保存期限且可例如在數分鐘內開始喪失其鑒別性質及活性並很少維持其功能及身份特徵超過數小時。

當前，包含活細胞之免疫治療組成物通常在接近患者之照護點之cGMP機構中生產(參見Gruenberg之美國專利公開案第2003/0175242號)。調配含活細胞之生物藥物必須在cGMP機構中在受高度控制且無菌之條件下進行。在cGMP機構操作及調配活細胞以向患者輸注。一旦細胞經製備以供輸注，細胞即快速轉移至照護地點且向患者投予。此方法之主要缺點在於cGMP機構需要存在於每一照護地點附近。cGMP機構需要可觀的貨幣資金來雇用職員及在所需規則及規章下運作。對處於或接近每一照護點建立許多此等中心之需要係為成本所禁止且為對此類藥物之商業潛力的嚴重限制。此導致以下艱難選擇：因建造許多cGMP機構以增加患者可及性而引起巨大花費或因建造僅有限數目之cGMP機構以將資金支出減到最少而為患者提供有限可及性。因此，在活細胞治療劑領域中需要使非營養緩衝液中的細胞能夠具有更加延長之保存期限之方法。此外，需要將使懸浮於不含有養分之輸注緩衝液中的經調配細胞產品能夠包裝、運送及大量配送之方法。

關於維持授受免疫療法中使用之細胞在調配後之身份及功能的問題例如描述於Gruenberg之美國專利公開案第2003/0175272號中。此公開案教示T細胞必須恰好在患者投予之前(在輸注之前不超過4小時)經再活化以維持細胞激素產生之功能特徵。只有當調配物包含自體血漿時，細胞功能方可維持多達48小時。然而，自每個預定患者收集血漿並不有助於大量配送及商業化。

在第一方面，本發明包含一種生物藥物組成物。該藥物組成物包括於非營養緩衝液中調配之活細胞。活細胞在非營養緩衝液中儲存大於約6小時之後維持其在非營養緩衝液中調配之前的身份及至少一種定義該等活細胞之功能特徵。此等活細胞在非營養緩衝液中儲存之後適用於免疫療法。其維持其在無養分緩衝液中調配之前的身份及至少一種定義該等活細胞之功能特徵至少72小時。

在另一方面，本發明包含一種處理含活細胞之生物藥物組成物之方法。該方法包括於非營養緩衝液中調配活細胞及在低於約20℃之儲存溫度下於非營養緩衝液中維持活細胞。活細胞維持其在非營養緩衝液中調配之前的身份及該等細胞之至少一種定義該等活細胞之功能特徵。該等活細胞在非營養緩衝液中儲存大於約72小時之後適用於免疫療法。較佳地，儲存溫度在介於約4℃與約8℃之間的範圍內且非營養緩衝液中細胞之濃度為約10⁷個細胞/毫升或大於10⁷個細胞/毫升。在T細胞之組成物中，活細胞較佳以 活化狀態調配。為活化T細胞，較佳的是使用對細胞表面分子具有反應性之經固定的單株抗體。較佳地，細胞表面分子為以下之第一者與第二共刺激分子之組合：CD3、MHCI、MHCII、CD2。共刺激分子較佳為CD28。將活細胞置於可撓性容器或注射器中，其中該可撓性容器或注射器包裝在將活細胞維持在儲存溫度下之溫度控制裝置中。該方法亦包括將溫度控制裝置中的包裝運送及配送至照護點。

在又一方面，本發明包含一種向照護機構點提供活細胞組成物之方法。該方法包括在處理機構於非營養緩衝液中調配活細胞及將細胞於經配備以將儲存溫度維持於約20℃以下之包裝中運送至照護機構點。活細胞在儲存溫度下持續多達約72小時，同時維持該等活細胞適用於免疫療法之身份及至少一種功能特徵。

在另一方面，本發明包含一種向患者投予免疫療法之方法。該方法包括投予包含於非營養緩衝液中調配之活細胞之組成物，其中該組成物已在非營養緩衝液中儲存多達約72小時，其中該等活細胞維持其在非營養緩衝液中調配之前的身份及該等細胞之至少一種定義該等活細胞之功能特徵，該等活細胞適用於免疫療法。

在又一方面，本發明包含向患者投予免疫療法之另一方法。該方法包括投予包含於非營養緩衝液中調配之活細胞之組成物，其中該組成物先前以冷凍狀態儲存，例如儲存於液氮中多達2年或2年以上且已解凍及調配且接著於 非營養緩衝液中儲存多達約72小時，其中該等活細胞維持其在非營養緩衝液中調配之前的身份及該等細胞之至少一種定義該等活細胞之功能特徵，該等活細胞適用於免疫療法。

本發明係關於在非營養緩衝液中調配之可甚至在長時期之後亦展現適用於免疫療法之細胞特徵之活細胞生物藥物產品的包裝、儲存及配送。此等活細胞生物藥物甚至在非營養緩衝液中約72小時之後亦可維持存活力以及預定身份及功能特徵。

在一些例示性實施方式中，用作生物藥物產品之免疫Th1記憶細胞可維持存活力、保留預定身份(CD4+、CD45RO+、CD40L^hi、CD62L^lo)且恢復功能準則，諸如分泌IFN-γ>1000 pg/10⁶個細胞/4小時。當與CD3/C28塗佈之微珠粒一起調配於非營養緩衝液中且維持冷藏狀態時，此等免疫Th1記憶細胞可展現此等細胞特徵多達至少約72小時。

包含活細胞之生物產品可在環境控制條件下包裝以維持所要儲存條件且由快遞信使服務(例如Federal Express、United Parcel Service(UPS)及類似國際信使)自世界上幾乎任何地方運送至照護點。較佳地，含活細胞之包裝在冷藏溫度下儲存及運送。在照護點，經調配細胞可自包裝移出且向患者投予。經調配細胞在自冷藏包裝移出之後保持穩定多達約6小時。較佳地，細胞首先在照護點自冷藏包 裝移出且在向患者投予之前1-2小時使其平衡至室溫。所運送之細胞驚人地穩定且可用於與未長時期儲存之細胞類似之方法。或者，細胞以冷凍狀態儲存並運送至照護點。細胞可以冷凍狀態儲存在照護點且於自動或半自動密閉無菌系統中調配且接著以冷藏狀態就地儲存多達約72小時，隨後向患者投予。

活細胞可為超過最低限度操作之任何細胞，因為FDA使用彼術語以確定細胞產品為需要根據研究性新藥(IND)申請或等效方案僅在人類中評估且依照如可適用之21C.F.R.部分211、606及820根據優良製造規範(Good Manufacturing Practices，GMP)製造之生物藥物。

活細胞可具有單一類型或為混合物，只要其具有規定身份及功能準則即可。細胞可為天然的或經工程改造的，源於自體、同種異體及/或異種供體。儘管活細胞為生物藥物之活性成分，但亦可將其他物質添加至細胞中，諸如生物活性蛋白質、肽、化學物質、核苷酸(RNA、DNA)及/或裝置。細胞可自由懸浮於調配物中或附著於表面或裝置或囊封於裝置或材料中。細胞應意欲治療或預防疾病或病狀發生。細胞可輸注、注射或植入身體之任何位置。

功能特徵意謂包含由細胞進行且適用於免疫療法及幹細胞療法之多種功能，特定言之免疫功能及分化功能。此等免疫功能可包含例如分泌分子、表現細胞表面部分、識別分子、能夠對分子起反應及生長及/或變成特定細胞類型或導致體內其他細胞生長、變化、死亡或以某一方式改變 正常或疾病功能以及此項技術中已知之其他免疫功能及細胞分化功能之能力。免疫功能可為先天及/或繼承免疫系統反應或繼承或先天免疫反應調節中涉及之過程、過程級聯或分子產生。功能可與細胞介導之免疫功能及/或與體液系統相關，包含免疫刺激功能與免疫抑制功能。功能特徵可與免疫記憶相關或與自體抗原與非自體抗原之間的區分、或識別病原體(諸如細菌、病毒或真菌)以及腫瘤或其他異常或非所要細胞或組織相關。其他功能可與介導諸如向特定器官或組織或位置輸送之功能之表面分子；阻斷、促進或另外調節免疫反應或實現分化成特定細胞類型之表面分子相關。

本揭示案描述包含於非營養緩衝液中調配之活細胞作為活性成分之生物藥物產品。在一些實施方式中，細胞為可用於免疫療法或幹細胞療法之活免疫細胞。組成物在室溫下於非營養緩衝液中穩定至少約6小時且在冷藏溫度下穩定至少約24小時、較佳至少約48小時、且更佳至少約72小時。驚人的是，組成物中的活細胞甚至在調配於無養分緩衝液中之後亦可維持其在含養分培養基中展現之身份、存活力及功能特徵。本文所述之組成物可經包裝且有利地使用商業信使於維持適當儲存條件之容器中自處理機構運送及配送至照護點。此等能力可使得在含有活細胞之治療組成物之生產及投予中實質性節約勞動力、時間及金錢。此外，因為處理機構可生產、包裝細胞及將其配送至世界上任何照護地點，所以患者對活細胞治療組成物之可 及性大幅增強。

本揭示案亦描述於非營養緩衝液中長時期維持活細胞懸浮液之方法。該方法包括將活細胞轉移入非營養緩衝液中且在較冷儲存溫度下將其儲存。在一些實施方式中，活細胞組成物在冷藏條件下儲存。需要時，組成物自儲存庫移出且在室溫下置放一段時間。在一些實施方式中，在活細胞懸浮液已在約室溫下置放一段時間之後，活細胞之功能特徵實質上得到恢復。在其他實施方式中，在活細胞懸浮液已在生理條件下置放一段時間之後，活細胞之功能特徵實質上得到恢復。

本文所述之治療組成物包含活細胞。活細胞意謂如藉由適當分析技術(諸如錐蟲藍擠壓(trypan blue extrusion)、MTT或生物發光偵測ATP含量)所測定，>70%細胞具有活力，以使細胞能夠在適當條件下進行活體外操作，諸如擴增、分化及/或活化。然而，組成物可包含一些不活化的細胞、經輻射細胞及/或非活細胞。活細胞可源於許多來源，包含例如永生化細胞株、初代細胞培養物、生物流體、組織、臍帶血、周邊血液、骨髓、冷凍細胞等分試樣及其類似物。源於其他來源之能夠進行如上所述之活體外操作的活細胞亦在本發明之範疇內。

治療組成物中的細胞可為同種異體細胞。例如源於同種異體供體之血液或骨髓之細胞可以所要方式處理且接著調配用於向患者輸注。置於注射器或轉移包裝或適用於容納人類使用產品之其他裝置中的輸注調配物可經包裝且運 送至照護地點以向患者投予。或者，治療組成物中的細胞可為已經操作、調配、包裝及運送之自體細胞且欲再輸注入相同患者中。活細胞亦可源於非人類來源且已經操作、調配、包裝及運送以便人類投予(異種)。針對人類投予所述之相同治療組成物亦可用於非人類治療及疾病預防背景中。

在組成物中的活細胞為免疫細胞之一個實施方式中，此等免疫細胞可包含源於骨髓或臍帶血之細胞；顆粒球，諸如嗜中性白血球、嗜鹼性白血球及嗜酸性白血球。免疫細胞亦可為單核球、巨噬細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、淋巴細胞，包含B細胞、T細胞及NKT細胞。T細胞可為例如CD4+細胞(包含Th0、Th1、Th2、Th17及Treg細胞)及/或CD8+細胞(Te1及Tc2)。

一種用於增強個體體內細胞免疫反應之免疫療法方法為稱為授受免疫療法之一種類型之細胞療法。細胞療法為活性成分完全或部分為活細胞之藥物。授受免疫療法為一種細胞療法，其涉及自個體移出免疫細胞、活體外處理(亦即活化、純化及/或擴增細胞)及隨後將所得細胞輸注回同一個體(自體療法)或不同個體(同種異體療法)中。

生物藥物產品可包含已使用用於授受免疫療法之多種活體外操作加以操作之活細胞。已經活體外操作之活細胞可包含例如LAK細胞(Rosenberg之美國專利第4,690,915號)、TIL細胞(Rosenberg之美國專利第5,126,132號)、細胞毒性T細胞(Cai等人之美國專利第6,255,073號；Celis 等人之美國專利第5,846,827號)、擴增之腫瘤引流淋巴結細胞(Terman之美國專利第6,251,385號)、各種淋巴球製劑(Bell等人之美國專利第6,194,207號；Ochoa等人之美國專利第5,443,983號；Riddell等人之美國專利第6,040,180號；Babbitt等人之美國專利第5,766,920號；Bolton之美國專利第6,204,058號)、CD8+ TIL細胞(Figlin等人，(1997)Journal of Urology 158：740)、在IL-2存在下用抗CD3單株抗體活化之CD4+ T細胞(Nishimura(1992)J.Immunol.148：285)、在IL-2存在下用抗CD3與抗CD28共活化之T細胞(Garlie等人，(1999)Journal of Immunotherapy 22：336)、活體外產生且在IL-2存在下用抗CD3及抗CD28單株抗體(mAb)擴增之抗原特異性CD8+ CTL T細胞(Oelke等人，(2000)Clinical Cancer Research 6：1997)及注射與卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)混合之經輻射自體腫瘤細胞以對個體進行接種，七天後繼之以回收引流淋巴結T細胞，其係用抗CD3 mAb活化，隨後於IL-2中擴增(Chang等人，(1997)Journal of Clinical Oncology 15：796)。

在一個例示性實施方式中，本揭示案之治療組成物包含至少一些T細胞，較佳為同種異體T細胞。此等T細胞亦較佳經由細胞表面活化來活化以形成活化的Th1記憶細胞。T細胞可以多種方式活化，包含藉由使用對T細胞表面分子具有特異性之經固定的單株抗體。適合之活化T細胞例如描述於美國專利第7,435,592號中且以引用方式納入本 文中。該等細胞較佳具有藉由單株抗體或其他結合劑交聯之細胞表面部分。此等單株抗體及/或結合劑較佳藉由例如固定在固體表面上來交聯以活化T細胞。此等細胞在本文中稱為培養物中活化之細胞(CAC)。此等活體外製備之CAC可經冷凍以供未來使用或經調配用於輸注。

在較佳實施方式中，活體外製備之CAC經冷凍儲存直至需要向患者投予為止。在向患者投予之前，CAC經解凍、洗滌且藉由交聯細胞表面結合部分(諸如CD3及CD28)在培養基中再活化，例如美國專利第7,402,431號中所述，該專利以引用方式納入本文中。CAC連同交聯劑一起可接著經洗滌且轉移至諸如調配緩衝液之非營養緩衝液中。調配緩衝液中的再活化的細胞在本文中稱為調配緩衝液中的細胞(CFB)。CFB可出於治療目的向患者投予。一般而言，此等再活化的細胞一旦轉移至非營養緩衝液中即具有有限保存期限。活細胞可以每毫升至少約10⁶個細胞、較佳每毫升約10⁷個細胞或10⁷個以上細胞之密度調配。在一些實施方式中，活細胞可以每毫升約10⁸個細胞或10⁸個以上細胞之密度調配。細胞之比濃度可根據特定細胞用途及療法方案來確定。

治療組成物亦可包含許多其他組分。此等組分可包含例如將活細胞維持所要活化狀態之藥劑。在一個例示性實施方式中，治療組成物可包含將T細胞維持活化狀態之藥劑，諸如以下在實施例中所述之Dynabeads ClinExVivo^TM。

本發明包含儲存及處理活細胞組成物以增加保存期限 之方法。如本文所用之保存期限定義為在調配之後CFB維持存活力、預定身份及功能特徵之時間長度。一般而言，將細胞轉移至適於向患者輸注之非營養緩衝液中。細胞可處於多種非營養緩衝液中。如本文提及之非營養緩衝液為任何類型之缺乏支持細胞增殖及/或擴增之適當組分之培養基、緩衝液或其他液體。非營養緩衝液通常為等張、USP無菌、無熱原質且含有維持活細胞完整且經許可供人類非經腸使用之適當組分及/或緩衝系統。在一個例示性實施方式中，非營養緩衝液為調配緩衝液，其為含1%人類血清白蛋白之Plasmalyte A(Baxter Scientific,Deerfield,IL)。(McKesson,San Francisco,California)

在含活化的細胞，特定言之活化的Th1細胞之實施方式中，甚至當細胞轉移至非營養緩衝液中時，細胞之活化信號亦得以維持。舉例而言，在細胞藉由交聯細胞表面結合部分而活化之實施方式中，交聯較佳在非營養緩衝液中維持。在儲存期間維持交聯可對在自儲存庫移出之後恢復組成物之功能特徵至關重要。活化組分在非營養緩衝液中移除之細胞組成物不以與已維持活化狀態之細胞相同之方式恢復。

本文所述之方法亦包括在細胞轉移入非營養緩衝液中之後處理活細胞。活細胞組成物可轉移至儲存溫度較冷之環境中以增加組成物之保存期限。非營養緩衝液中的細胞所轉移到之較冷溫度在本文中稱為儲存溫度。細胞在置於非營養緩衝液中之後通常盡可能快速地被轉移至儲存溫度 中。細胞較佳在置於非營養緩衝液中之後小於約六小時內、更佳在置於非營養緩衝液中之後小於約四小時內轉移至儲存溫度中。在甚至更佳實施方式中，細胞在置於非營養緩衝液中之後在小於約一小時內轉移至儲存溫度中。

可保存組成物之儲存溫度會變化但通常低於生理溫度，亦即低於約37℃。較佳地，細胞在冷藏溫度下儲存。冷藏溫度可在約-2℃與約12℃之間的範圍內。更佳地，細胞在0℃以上與約10℃之間的溫度下儲存。最佳地，細胞在約4℃與約8℃之間儲存。

本文所述之組成物亦可經包裝，自製造或處理機構處運送及配送至照護地點。製造或處理機構可為諸如醫院、診所或能夠依照公認指導方針處理用於生物藥物的活細胞之任何生產機構之機構。照護點可為醫院、診所或通常向患者投予照護所處之任何其他場所。組成物通常經包裝以便以將組成物維持在上述儲存溫度範圍內之方式運送。細胞可於多種容器中儲存及運送。細胞可於例如可撓性容器、注射器及其類似物中儲存及運送。當運送時，諸如注射器之容器可置於諸如絕熱盒之包裝中。包裝或盒較佳在含活細胞之容器被置於包裝中之前在所要儲存溫度下預條件化(preconditioned)。組成物例如可包裝在經冰或氣凝膠填裝之盒中。包裝較佳為無論外部溫度如何皆能夠維持所要儲存溫度之絕熱盒。盒亦較佳經預條件化，意謂其已在含活細胞之容器被置於內部之前經儲存或安置在所要溫度下。在較佳實施方式中，在置放生物產品之前，包裝經預 條件化且包裝在冷藏或冷凍條件下運送至照護點。可使用任何類型之運送方法，但在例示性實施方式中，運送由商業信使進行。

當組成物在儲存溫度範圍內儲存時，本文所述之組成物之保存期限可驚人地延長。活細胞組成物之保存期限可延長大於約6小時。較佳地，活細胞組成物之保存期限可延長大於約24小時，且更佳大於約48小時。在甚至更佳實施方式中，組成物之保存期限可延長多達約72小時。在最佳實施方式中，保存期限可延長多達約120小時。大於約120小時之保存期限亦在本發明之範疇內。

根據本文所述之方法儲存之非營養緩衝液中的細胞組成物可在儲存階段期間及在自儲存庫移出之後維持其存活力、身份及功能。細胞存活力可藉由此項技術中已知之多種方法測定，包含分析技術，諸如錐蟲藍擠壓、MTT、7-胺基-放線菌素D(7-Amino-Actinomycin D)或生物發光偵測ATP含量。

細胞身份可藉由多種方法確認。可分析細胞之指示組成物中特定細胞類型之多種外部及內部細胞標記。外部標記根據單株抗體之叢集名稱(根據關於國際人類白血球分化抗原之第1屆至第8屆研討會命名之分化叢集(CD)，總數有(247)個CD)來分類。白血球表現其細胞表面上獨特種類之分子，其中許多反映其譜系特異性分化之不同階段或不同活化或不活化狀態。白血球細胞表面分子用抗白血球單株抗體(mAb)常規偵測。使用mAb之不同組合， 有可能圖示不同白血球亞族群，包含B細胞、輔助T細胞(Th)、細胞毒性T細胞(Tc)及自然殺手(NK)細胞之功能上獨特之成熟淋巴球亞族群的細胞表面免疫表型。

甚至在非營養培養基中儲存之後，組成物中的活細胞亦展現在非營養培養基中調配之前存在之功能特徵。功能特徵可包含多種活性，包含例如表現功能性分子，諸如CD40L、FasL、穿孔素(perforin)及粒酶B(granzymeB)、共刺激分子4-1BBL、CD28、CTLA4及TNF相關之活化誘導之細胞激素(TRANCE)、TWEAK、PD-1、B7家族、黏著分子，諸如整合素(integrin)、鈣黏著蛋白(cadherin)及選擇素(selectin)；及分泌多種細胞激素及趨化激素以及表現此等細胞激素及趨化激素之受體。細胞激素及趨化激素為冗餘之分泌蛋白質，其具有調控及決定免疫反應之性質且控制免疫細胞輸送及免疫器官之細胞排列的生長、分化及活化功能。細胞激素可包含例如IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、GMCSF、IFN-γ及其類似物。

在一些實施方式中，在調配之後及在整個儲存期間，功能特徵得以保留且可在自儲存庫移出及運送之後不久分析酶或標記之含量。舉例而言，可在自儲存庫移出組成物且使其在室溫下培育約2小時之後分析CD40L表現。CD40L表現可類似於在調配及儲存時之CD40L表現量。參見例如圖2A-2C。類似地，可在自儲存庫移出且在室溫下培育約2小時之後測定組成物中活細胞之數目。活細胞數目可類似於在調配及儲存時之細胞存活力程度。參見例如圖3A-3C。

在其他實施方式中，功能特徵可在細胞暴露於生理條件之後恢復。此可指示細胞組成物在輸注入患者體內後可如預定起作用且分泌或表現細胞在調配時之組分特徵。當細胞經調配且置於儲存庫中時，例如IFN-γ之分泌可受抑制。IFN-γ(IFN-gamma)在本文中可稱為IFN-γ或IFN-g。細胞返回至室溫不會恢復IFN-g分泌，但在37℃下培育細胞24小時會使IFN-γ分泌增加至類似於調配時含量之含量。參見例如圖12D、13D及14D。有利的是，在儲存期間IFN-γ含量降低可防止細胞資源耗盡。若用於分泌之細胞資源在儲存期間充分保留，則細胞通常可在適當生理條件下再開始IFN-γ分泌。因此，向患者投予組成物可接著仍向該患者提供IFN-γ及其他發炎性細胞激素(由於投予治療組成物得到之結果)，即使組成物已在投予之前長時期儲存。

組成物保存期限之延長可以多種方式證明。如本文所用，保存期限之延長可指組成物中的活細胞甚至在上述延長儲存時間之後亦維持其存活力、身份及其功能特徵。一般而言，在儲存至少24小時之後，相對於調配時活性，組成物在非營養緩衝液中維持定義性特徵之至少約50%活性。相對於調配時活性，儲存之後維持較佳至少約75%且更佳至少約85%且甚至更佳至少約90%活性。

在較佳實施方式中，在儲存至少48小時之後，相對於調配時活性，組成物在非營養緩衝液中維持定義性特徵之至少約50%活性。相對於調配時活性，儲存之後維持較佳至少約75%且更佳至少約85%且甚至更佳至少約90%活性。

在更佳實施方式中，在儲存至少72小時之後，相對於調配時活性，組成物在非營養緩衝液中維持定義性特徵之至少約50%活性。相對於調配時活性，儲存之後維持較佳至少約75%且更佳至少約85%且甚至更佳至少約90%活性。

可使用多種方法向患者投予細胞組成物。組成物可皮內、靜脈內、鞘內(intrathecally)、腫瘤內及以類似方式投予。

實施例

材料：PE結合之CD40L購自Beckman Coulter,Brea,CA。7-胺基-放線菌素D(7-AAD)(1000×)購自Cayman Chemical Co.,Ann Arbor,MI。PlasmaLyte A購自Baxter Scientific,Deerfield,IL。人類血清白蛋白(HSA)購自McKesson,San Francisco,California。FcR結合抑制劑購自eBioscience,San Diego,CA。Dynabeads ClinExVivo^TM購自Invitrogen,Carlsbad,CA。

製備調配緩衝液中的細胞(CFB)-將於培養基中活化之細胞(CAC)置入cRPMI培養基中以進行洗滌。記錄時間以指示調配方案之開始。離心cRPMI培養基中的細胞，移除上清液且將細胞再懸浮於cRPMI緩衝液中。藉由使用錐蟲藍分析來測定細胞存活力。總細胞數及活細胞濃度用於確定活細胞之百分比。若樣品具有大於80%之細胞存活力，則繼續程序以再活化及調配細胞。

CAC細胞在1×10⁷個細胞/毫升之濃度下再懸浮。在1×10⁷個細胞/毫升之活細胞濃度下進行再活化。視體積而 定，在24孔盤、6孔盤或75 cm³燒瓶中進行再活化。添加Dynabeads ClinExVivo^TM CD3/CD28以再活化細胞且在36-38℃及5% CO₂下培育4小時。在培育約4小時之後，接著移除細胞且轉移至含最終調配緩衝液(FFB)之50 ml管中。FFB為含1% HSA之PlasmaLyte A。離心再活化的細胞，移除上清液且再懸浮於FFB中。此等細胞稱為調配緩衝液中的細胞(CFB)。

CFB在每毫升10⁷個細胞之濃度下再懸浮於FFB中。再懸浮CFB以用於ID、IT或IV投予，將1 ml細胞懸浮液添加至3 ml注射器中作為ID調配物。IT及IV調配物分別為3 ml及5 ml。含適當調配物之注射器以平均溫度約4℃冷藏儲存。

在儲存之後收集樣品-在不同時間點收集細胞及上清液。時間點如下：0(初始)；在室溫(RT)下2小時；在4℃下48小時；及在4℃下48小時，隨後為2小時室溫。

在各時間點，收集100 μl細胞懸浮液且在4℃下在400g下將細胞旋轉5分鐘。上清液接著轉移至另一管中以便隨後使用ELISA偵測IFN-γ。將細胞再懸浮於150 μl染色緩衝液中以便流動式細胞測量。在一些實驗中，將細胞再懸浮於100 μl cRPMI培養基中且在37℃下在5% CO₂下於培育箱中培養24小時。在培育24小時之後獲取上清液且藉由ELISA偵測IFN-γ。

流動式細胞測量術(CD40L及7-AAD)-50 μl細胞懸浮液自以上(150 μl)轉移入3個分別標記為未染色、CD40L 及7-AAD之eppendorf管中。未染色管在冰上培育20分鐘。對於CD40L管，根據製造商之說明書將細胞與FcR結合抑制劑一起在冰上預培育20分鐘。接著將40 μl染色緩衝液(PBS+1% FBS)及10 μl PE-CD40L抗體添加入細胞懸浮液中且在黑暗中在冰上再培育20分鐘。

藉由對7-AAD進行流動式細胞測量來測試細胞存活力。7-AAD插入死細胞或受損細胞之DNA中，因此7-AAD陽性細胞之確定為細胞存活力之指標。對於7-AAD管，在6C下在400g下將管離心5分鐘。在移除上清液之後，將細胞沈澱物再懸浮於100 μl 1×7-AAD溶液中。管在黑暗中在冰上培育15分鐘，將1 ml染色緩衝液添加至CD40L管中，接著一起離心3個管。在棄置上清液之後，將細胞沈澱物再懸浮於0.4 ml染色緩衝液中且運作FACS。

IFN-γ ELISA-根據製造商說明書藉由IFN-γ三明治ELISA套組(R&D Systems,Mpls.MN)測定分泌在上清液中的IFN-γ。

實施例1-進行此實驗以確定調配緩衝液中的細胞(CFB)在運送之後在低溫下是否穩定。各批細胞懸浮液於FFB中調配且經由郵遞服務(Federal Express)運送。藉由資料記錄器監測溫度。監測未經預條件化之盒及經預條件化之氣凝膠絕熱盒內部之溫度變化。亦監測外部溫度。調配且運送三個不同批次。獲取以下之上清液樣品：於培養基中活化之細胞(CAC)、剛調配後之CFB、在室溫(RT)下2小時後之CFB、在4℃下48小時後之CFB、及在4℃ 下48小時及在室溫下2小時後之CFB。測試CAC之CD40L表現且測試剩餘細胞之CD40L表現及細胞存活力。

圖1A及圖1B顯示細胞在運送期間所經受之溫度。圖1A顯示當樣品未包裝在經預條件化之盒中時，溫度在約48小時內自約5℃變化至約13.7℃。樣品為穩定的，指示可接受溫度較寬廣波動。圖1B顯示在經預條件化且絕熱之盒內部之溫度保持相當穩定。其自0.2℃變化至2.2℃。圖1C顯示在運送階段期間外部溫度之變化。

圖2A-2C顯示CD40L表現並不大幅變化。圖3A-3C顯示運送過程後之細胞存活力類似於運送前之細胞存活力。此等結果指示在如約2℃至約13℃之寬廣範圍內在包裝內保持治療組成物不為不利的。

實施例2-進行此研究以確定低溫是否可延長CFB之失效期。進行不同CFB調配物在室溫下之穩定性。調配CFB以用於如上所述之皮內(ID)、腫瘤內(IT)或靜脈內(IV)投予。測試此等調配物之穩定性以觀察低溫穩定性是否可延長。

調配批次HTC264、HTC245及HTC273以用於ID、IT及IV且在室溫下測試其在調配後之CD40L表現、細胞存活力及IFN-γ分泌持續6小時。圖6A-6C、圖7A-7C及圖8A-8C顯示此等測試之結果。此等參數中的全部三者在室溫下6小時之後皆穩定。圖9A-9C顯示在4℃下儲存48小時之後，CD40L表現穩定。圖11A-11C指示在4℃下儲存48小時之後，細胞存活力穩定。圖10A-圖10C指示在4℃下48小時 之後，IFN-γ分泌亦不恢復。然而，如下所示，此可藉由轉移回至RPMI中且在37℃下培育24小時得以恢復。

將三個批次(HTC264、HTC245及HTC273)調配成ID、IV或IT調配物。製備各調配物之總計4個注射器(1個針對室溫、1個針對24小時4℃、1個針對48小時4℃、1個針對72小時4℃)且在4℃下培育不同時期。在返回室溫下培育2小時之後收集樣品。下表1顯示對各批細胞所進行之時間點、樣品及測試。當細胞在37℃下培育24小時時，亦測定IFN-γ含量。

圖12A-12D、圖13A-13D及圖16A-14D分別顯示批次HTC264、HTC245及HTC273之結果。如所指示測試此等批次之皮內調配物。結果顯示在4℃下保持CFB甚至在72小 時之後亦可維持細胞表面上之CD40L表現(圖12A、圖13A及圖16A)。細胞存活力不受低溫儲存大幅影響(圖12B、圖13B及圖16B)。當細胞返回至室溫僅2小時時，IFN-γ分泌含量(圖12C、圖13C及圖16C)受抑制。然而，當細胞轉移回至RPMI培養基中且在生理溫度(37℃)下培育24小時時，IFN-γ含量恢復(圖12D、圖13D及圖14D)。此指示在保持低溫72小時之後，細胞仍能夠分泌IFN-γ。此表明若治療性投予此等細胞，則IFN-γ可在患者中以與尚未經受漫長儲存之細胞類似之含量產生。

實施例3-進行此實驗以比較CAC細胞與CFB細胞之穩定性。將三個不同批次細胞調配成ID注射器。對於各批次，一個注射器針對CAC且一個注射器針對CFB。解凍CAC且用cRPMI洗滌。在細胞計數之後，用FFB以10⁹個細胞/毫升再懸浮細胞沈澱物且將1 ml細胞懸浮液轉移入3 ml注射器中。對於CFB，用cRPMI以10⁹個細胞/毫升再懸浮細胞沈澱物且與抗CD3/抗CD28珠粒混合。在37℃下在5% CO₂下培育細胞及珠粒混合物4小時。細胞用FFB洗滌且用FFB以10⁷個細胞/毫升再懸浮。將細胞懸浮液轉移入3 ml注射器中。在各時間點，自注射器獲得100 μl樣品以便用於CD40L、IFN-γ、存活力測試。在4℃下培育48小時之後，在400g下離心一些樣品5分鐘以移除FFB。在棄置上清液之後，將細胞沈澱物再懸浮於100 μl cRPMI中且在37℃下在5% CO₂下培育2小時。收集上清液以便IFN-γ偵測。下表2列出收集之樣品及進行之測試。

結果指示以4℃培育CAC 48小時使CD40L在細胞表面上之表現顯著降低。參見圖15A-15C。然而，在4℃下培育CFB 48小時可維持CD40L表現，表明CD3與CD28之交聯為細胞穩定性所必需。甚至在4℃下培育48小時之後，CFB亦能夠維持存活力且分泌高量IFN-γ。參見圖16A-C及圖17A-C。

實施例4-進行此研究以測定經調配CFB在包裝及自Jerusalem,Israel之生產機構運送至照護點後之穩定性。確認CFB產品在運送72小時之後繼續滿足預定身份及功能特徵是關鍵的，因為在調配過程結束時，細胞經轉移至無養分輸注緩衝液中，其中細胞可能喪失其存活力及獨特身份以及功能特徵。已知低溫可減緩細胞之基因表現及活性且 此基因表現可藉由使細胞返回至生理溫度而恢復。出於此原因，使用經預驗證之冷藏溫度控制容器進行運送。

測試CFB細胞以藉由比較運送前之細胞特徵(在基線時-在活化4小時後調配之注射器=FF)與在FF完成之後最少72小時、運送至NY且返回之後獲得之細胞特徵來檢查在運送72小時後其預定身份及功能特徵是否保持。

預定終點參數為：

1.存活力測試：在所有測試之時間點，CFB存活力必須皆為>70%活細胞。

2.快速內毒素測試(Rapid Endotoxin Test)：在基線及在4℃下72小時之後收集之樣品之內毒素含量必須<0.5 Eu/ml。

3.格蘭氏染色(Gram’s Stain)：在所有測試時間點收集之樣品之載片上皆不應觀測到細菌。

4.表面染色-CD40L AM(CFB-CAC)

30：

5. USP無菌性：於所有測試之培養基中調配之樣品皆無生長。

6.藉由ELISA測試之IFNγ分泌：

6.1在4小時活化期間累積之IFNγ>每1×10⁶個1000 pg IFNγ

6.2在基線之後24小時期間累積之IFNγ>每1×10⁶個細胞6,000 pg

6.3在2℃-8℃下72小時之後在24小時期間累積之IFNγ>每1×10⁶個細胞6,000 pg

結果：

對來自批次HTC300之劑進行3次分別之最終調配過程。

包裝在注射器中的調配產品用Flying Cargo(FC)運送至NY，且返回Jerusalem Israel。

自調配結束時間直至72小時，如藉由運送包裝內部之溫度記錄器所顯示，所運送之注射器保持在2-8℃下。所有結果皆概述於表3中。

如在表3中可見，所有三個經調配批次皆通過所有預定接受準則，因此證明CFB在所表明之配送條件下具有穩定性。

儘管本發明已參考較佳實施方式加以描述，但熟習該項技術者將認識到可在不脫離本發明之精神及範疇下在形式及細節方面作出變化。

圖1A為在運送期間容器中溫度變化之圖，其中容器未經預條件化。

圖1B為在經預條件化之氣凝膠絕熱盒內部記錄之溫度之圖。

圖1C為在運送期間空氣溫度之圖。

圖2A-2C分別顯示在包裝及運送之前及之後HTC273、HTC245及HTC264細胞之CD40L表現。

圖3A-3C分別顯示在包裝及運送之前及之後HTC273、HTC245及HTC264細胞之細胞存活力。

圖4A-4C分別顯示在包裝及運送之前及之後HTC273、HTC245及HTC264細胞之IFN-γ分泌。

圖5A-5C分別顯示在包裝及運送，隨後在37℃下培育6小時之前及之後HTC273、HTC245及HTC264細胞之IFN-γ分泌。

圖6A-6C分別顯示HTC273、HTC264及HTC245細胞及調配用於ID、IT及IV投予之CD40L表現。

圖7A-7C分別顯示HTC273、HTC264及HTC245細胞 及調配用於ID、IT及IV投予之細胞存活力。

圖8A-8C分別顯示HTC273、HTC264及HTC245細胞及調配用於ID、IT及IV投予之IFN-γ分泌。

圖9A-9C分別顯示調配用於ID、IT及IV投予且儲存24及48小時之HTC273、HTC264及HTC245細胞之CD40L表現。

圖10A-10C分別顯示調配用於ID、IT及IV投予且儲存24及48小時之HTC273、HTC264及HTC245細胞之IFN-γ分泌。

圖11A-11C分別顯示調配用於ID、IT及IV投予且儲存24及48小時之HTC273、HTC264及HTC245細胞之存活力。

圖12A-12C顯示在儲存24、48及72小時後HTC264細胞之CD40L表現、細胞存活力、IFN-γ。

圖12D顯示在儲存72小時且在37℃下培育24小時後HTC264細胞之IFN-γ分泌。

圖13A-13C顯示在儲存24、48及72小時後HTC245細胞之CD40L表現、細胞存活力、IFN-γ。

圖13D顯示在儲存72小時且在37℃下培育24小時後HTC245細胞之IFN-γ分泌。

圖14A-14C顯示在儲存24、48及72小時後HTC273細胞之CD40L表現、細胞存活力、IFN-γ。

圖14D顯示3個不同批次細胞在儲存72小時且在37℃下培育24小時後HTC273細胞之IFN-γ分泌。

圖15A-15C分別顯示在48小時後HTC245、HTC264及HTC273之CAC及CFB之CD40L表現。

圖16A-16C分別顯示在48小時後HTC245、HTC264及HTC273之CAC及CFB之細胞存活力。

圖17A-17C分別顯示在48小時後HTC245、HTC273及HTC264之CAC及CFB之IFN-γ分泌。

Claims (15)

1. 一種處理含有用於免疫療法的活細胞之生物藥物組成物之方法，其包括：於非營養緩衝液中調配該等活細胞，該等活細胞為經活化的Th1細胞且已經經過冷凍保存、解凍及在該非營養緩衝液中藉由經固定的單株抗體再活化；及在低於約20℃之儲存溫度下在該非營養緩衝液中維持該等活細胞，其中該等活細胞維持其在該非營養緩衝液中調配之前的身份及該等細胞之至少一種定義該等活細胞之功能特徵，該等活細胞在該非營養緩衝液中儲存大於約24小時之後適用於免疫療法；且其中相對於調配時之CD40L表現，該組成物中的活細胞在儲存之後以至少約80%之量表現CD40L。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該儲存溫度在介於約0℃與約10℃之間的範圍內。
3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等細胞在非營養緩衝液中之濃度為約10⁶個細胞/毫升或大於10⁶個細胞/毫升及/或將該等活細胞置於可撓性容器或注射器中，其中該可撓性容器或注射器包裝在將該等活細胞維持在該儲存溫度下之溫度控制裝置中。
4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等Th1細胞由經固定的抗CD3及抗CD28單株抗體活化。
5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該功能特徵為表現CD40L、FasL、穿孔素及粒酶B，表現共刺激分子， 表現黏著分子，分泌細胞激素、趨化激素或其組合。
6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中分泌之發炎性細胞激素為IFN-γ且相較於在調配時之量，分泌量為至少約80%之量。
7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中在37℃下培育至少24小時之後，儲存後之IFN-γ分泌恢復。
8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該非營養緩衝液中的活細胞穩定至少約72小時。
9. 一種向照護機構點提供活細胞組成物之方法，其包括：在處理機構於非營養緩衝液中調配該等活細胞，該等活細胞為經活化的Th1細胞且已經經過冷凍保存、解凍及在該非營養緩衝液中藉由經固定的單株抗體再活化；及將該等細胞於經配備以將儲存溫度維持於低於約20℃之包裝中運送至照護機構點，其中該等活細胞處於該儲存溫度大於約24小時，同時維持其適用於免疫療法之該等活細胞的身份及至少一種功能特徵；其中相對於調配時之CD40L表現，該組成物中的活細胞在運送及自儲存溫度移出之後以至少約80%之量表現CD40L。
10. 如申請專利範圍第9項之方法，其進一步包括在運送之前將該等經調配細胞置於可撓性容器或注射器中。
11. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該等活細胞為CD4+細胞且當活化時為Th1細胞。
12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該等Th1細胞在該非營養緩衝液中藉由經交聯的抗CD3及抗CD28單株抗體活化。
13. 如申請專利範圍第9項之方法，其中相較於調配時之量，該組成物中的細胞在運送及自儲存溫度移出之後以至少約80%之量分泌IFN-γ。
14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中在37℃下培育至少24小時之後，在運送及儲存後之IFN-γ分泌恢復。
15. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該非營養緩衝液中的活細胞處於該儲存溫度下至少約72小時。

Images