KR20190090030A - 생세포를 포함하는 생물학적 약물을 처리하기 위한 방법 - Google Patents
생세포를 포함하는 생물학적 약물을 처리하기 위한 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 비-영양 버퍼 내의 생세포 조성물들을 처리하기 위한 방법들을 포함한다. 조성물들 내의 세포들은 약 72시간 동안까지 비-영양 배지 내지 저장된 후에도 그것들의 본질 및 기능 특성들을 유지한다. 저장 방법은 세포들이 처리 시설에서 제조되고 치료 시설로 운송되는 것을 가능하게 한다. 본 발명은 또한 저장 온도로 비-영양 배지 내에 저장되었으나 기능 특성들을 유지하는 조성물들을 포함한다.
Description
본 발명은 비-영양 버퍼(non-nutritive buffer) 내에서 제형화된(formulated) 생세포 현탁액들을 처리하기 위한 방법들에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 비-영양 배지 내의 살아있는 면역 세포 현탁액의 패키징, 운송, 및 분배(distribution)에 관한 것으로서, 세포들은 그들의 독특한 본질(identity), 기능 및 생존 특성들을 유지한다.
세포 치료는 종양들, 바이러스들, 및 박테리아 병원균에 대항하는 잠재적인 치유 요법이다. 세포 치료는 또한 자가면역(autoimmune) 질환들(예를 들면, 류머티스성 관절염, 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 1형 당뇨병), 신경 질환들(알츠하이머병, 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS) 및 파킨슨병)뿐만 아니라, 노화방지 치료, 상처 치료 및 심혈관 질환들을 치료하도록 사용될 수 있다. 질환들을 치료하거나 예방하기 위한 면역 시스템의 활용이 면역치료의 중요한 목적이다. 환자 내의 면역 반응을 향상시키거나 또는 억제하기 위하여 다양한 면역치료 방법들과 조성물들이 개발되어 왔다. 세포 치료 방법들은 때때로 세포들의 증식, 분화 및/또는 활성과 같은 생체외(ex- vivo) 조작들을 포함한다. 최소로 조작된 것보다 많은 세포들이 미국 식품의약국(USFDA)뿐만 아니라 다른 관할권의 관리 기관들에 의해 생물학적 약물로 여겨진다. 어떠한 질환의 치료 또는 예방을 위하여 그러한 약물들이 판매될 수 있기 전에, 이러한 제품들은 우선 임상시험계획승인제도(Investigational New Drug Application, IND) 또는 동등한 제도 하에서 인간 임상 실험으로 조사되어야만 한다.
상업적 사용을 위하여, 살아있는 세포들을 포함하는 생물학적 약물을 제조하기 위하여 사용되는 과정들은 결과로서 생기는 세포들이 미리 결정된 본질, 기능 및 생존 방출 기준을 갖도록 표준화되어야 한다. 생물학적 약물로서의 사용을 위하여 의도된 세포들의 증식, 분화 및/또는 활성을 야기하기 위한 과정은 일반적으로 세포들이 영양 풍부 배양 배지 내에 유지되는 생체외에서 발생한다. 그러나, 세포들을 인간들에 투여하기 전에, 세포들은 반드시 비-영양 주입 버퍼로 이동시켜야만 한다. 이러한 버퍼 용액들은 영양분을 포함하지 않기 때문에, 세포들은 단지 단시간 동안만 생존한다. 게다가, 비-영양 주입 버퍼 내로 위치된 후에 세포들이 생존하더라도, 세포들은 그것들의 독특한 본질 및 기능 특성을 빠르게 상실한다. 그것들의 독특한 본질 및 기능 특성의 상실은 세포들이 생물학적 약물로서 사용되지 못하도록 한다. 이러한 제한은 생물학적 약물의 사용을 위하여 의도된 세포들이 반드시 치료 시설에서 또는 근처에서 제형화되어야만 하도록 요구한다. 제형화된 생세포 제품들의 한정된 유통 기한 때문에 생세포들이 치료 시설에서 또는 근처에서 제형화되어야 하는 필수조건은 이러한 형태의 제품의 상업적 실행가능성을 심각하게 제한한다.
생세포들은 영양 풍부 배양 배지 내에서 상대적으로 안정적이다. 영양 풍부 배양 배지의 예들은 예를 들면, X-Vivol5(BioWhitaker사, 메릴랜드주 워커스빌), RPMI 1640, DMEM, Han's F12, McCoys 7A 및 Medium 199를 포함한다. 배지는 혈청, 혈청 단백질, 성장 억제 물질과 분열촉진 단일클론 항체들과 같은 성장 촉진 물질 및 유전자 조작 또는 변형된 세포들의 선택을 위한 선택적 제제들을 포함하는 부가적인 성분들이 보충될 수 있다. 그러나, 환자로의 투여에 필요한 것과 같은 비-영양 버퍼로의 세포들의 이동은 세포 본질, 세포 생존 및 세포들의 기능 특성의 급속한 저하에 이르게 할 수 있다. 비-영양 버퍼들의 예들은 예를 들면, 생리 식염수, 인산 완충 식염수, 5% 덱스트로오스(dextrose), PlasmaLyte(Baxter Scientific사, 일리노이주 디어필드) 및 Normasol(Abbot Laboratories사, 일리노이주 애벗 파크)과 같은 등장액을 포함한다. 게다가, 일반적으로, 세포들이 비-영양 버퍼 내로 이동될 때, 활성 및/또는 분화 신호들을 제공하는 시약뿐만 아니라 자극 분자들 또는 사이토카인들과 같은 다른 성분들이 제거되어야만 하는 것으로 알려져 있다(Berenson 등의 미국특허 제 6,867,041 참조). 따라서, 비-영양 버퍼 내의 세포들은 일반적으로 한정된 유통 기한을 가지며 예를 들면, 수분 내로 그것들의 본질 특성과 활성을 잃기 시작할 수 있으며 수시간 이상 동안 그것들의 기능 및 본질 특성을 거의 유지할 수 없다.
현재, 생세포들을 포함하는 면역치료 조성물들은 일반적으로 환자의 치료 지점에 가까운 최신 의약품 제조 및 품질관리기준(cGMP, 이하 cGMP로 표기) 시설에서 생산된다(Gruenberg의 미국특허공보 제 2003/0175242 참조). 생세포들을 갖는 생물학적 약물의 제형화는 cGMP 시설들 내에서 고도로 제어되고 멸균의 조건들 하에서 실행되어야만 한다. 생세포들은 환자로의 주입을 위하여 cGMP 시설에서 조작되고 제형화된다. 일단 주입을 위하여 세포들이 제조되면, 세포들은 신속하게 치료 시설로 운송되고 환자에 투여된다. 이러한 과정의 중요한 단점은 cGMP 시설들이 모든 치료 시설의 근처에 존재할 필요가 있다는 것이다. 모든 치료 시설에 또는 근처에 이러한 다수의 시설을 설립하기 위한 필요성은 엄두도 못 낼 정도가 비용이 들고 이러한 약물 분야의 상업적 잠재력에 대한 심각한 제한을 가져온다. 이는 환자들에 대한 접근성을 증가시키기 위하여 다수의 cGMP 시설들을 건설함으로써 막대한 지출을 초래하거나 또는 자본 지출을 최소화하기 위하여 한정된 수의 cGMP 시설을 건설함으로써 환자들을 위한 제한된 접근을 제공하는 어려운 선택에 이르게 한다. 따라서, 생세포 치료 분야에서 비-영양 버퍼 내의 세포들을 더 연장된 유동 기한을 갖는 것을 가능하게 할 수 있는 방법들을 위한 필요성이 존재한다. 게다가, 비-영양 함유 주입 버퍼 내에 현탁된 제형화된 세포 제품들의 패키징, 운송 및 대량 분배를 가능하게 할 수 있는 방법이 필요하다.
제형화 후에 입양 면역치료(adoptive immunotherapy)에서 사용되는 세포들의 본질과 기능을 유지하는 문제들은 예를 들면, Gruenberg의 미국특허공보 제 2003/0175272에서 설명된다. 본 공보는 사이토카인 생산의 기능 특성을 유지하기 위하여 T-세포들이 환자 투여 바로 전에(겨우 주입 전 4시간) 재활성화되어야만 한다고 설명한다. 세포들의 기능은 제형이 자가 혈장(autologous plasma)을 포함할 때만 48시간까지 유지될 수 있다. 그러나 모든 의도된 환자로부터의 혈장의 수집은 대량 분배와 상업화로 유도되지 않는다.
첫 번째 양상에서, 본 발명은 생물학적 약물 조성물을 포함한다. 약물 조성물은 비-영양 버퍼로 제형화된 생세포들을 포함한다. 비-영양 버퍼 내에서 6시간 이상 저장된 후에, 생세포들은 그것들의 본질 및 비-영양 버퍼 내의 제형화 이전에 생세포들을 규정한 적어도 하나의 기능적 특성을 유지한다. 생세포들은 비-영양 버퍼 내의 저장 후에 면역치료에 유용하다. 그것들은 그것들의 본질 및 적어도 72시간 동안 비-영양 버퍼 내의 제형화 이전에 생세포들을 규정한 적어도 하나의 기능적 특성을 유지한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 생세포들을 갖는 생물학적 약물을 처리하는 방법을 포함한다. 방법은 비-영양 버퍼 내에 생세포들을 제형화하는 단계 및 비-영양 버퍼 내의 생세포들을 약 20℃ 이하의 저장 온도에서 유지하는 단계를 포함한다. 생세포들은 그것들의 본질 및 비-영양 버퍼 내의 제형화 이전에 생세포들을 규정한 세포들의 적어도 하나의 기능적 특성을 유지한다. 생세포들은 비-영양 버퍼 내에서 72시간 이상 동안 저장된 후에 면역치료에 유용하다. 바람직하게는, 저장 온도는 약 4℃ 내지 약 8℃ 사이의 범위이며 비-영양 버퍼 내의 세포들의 농도는 약 107 cells/㎖ 또는 그 이상이다. T-세포들의 조성물에 있어서, 생세포들은 바람직하게는 활성 상태로 제형화된다. T-세포들을 활성화하기 위하여, 세포 표면 분자들에 반응하는 고정화 단일클론 항체들을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 세포 표면 분자들은 다음의 첫 번째: CD3, MHCⅠ, MHCⅡ, CD2 중의 하나 및 두 번째 공동자극 분자(costimulatory molecule)의 조합이다. 바람직하게는, 공동자극 분자는 CD28이다. 생세포들은 유연성 컨테이너(flexible container) 또는 주사기(syringe) 내에 위치되며, 유연성 컨테이너 또는 주사기는 저장 온도로 생세포들을 유지하는 온도 제어 장치 내에 패키징된다. 방법은 또한 온도 제어 장치 내의 패키지를 치료 시설 지점으로 운송하는 단계 및 분배하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 생세포 조성물을 치료 시설 지점으로 제공하는 방법을 포함한다. 방법은 처리 시설에서 비-영양 버퍼 내의 생세포들을 제형화하는 단계 및 세포들을 약 20℃ 이하의 저장 온도를 유지하도록 구비된 패키지로 치료 시설 지점으로 운송하는 단계를 포함한다. 생세포들은 약 72시간 동안까지 저장 온도로 존재하며 그것들이 본질 및 적어도 하나의 면역치료에 유용한 생세포들의 기능적 특성을 유지한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 면역치료를 환자에 투여하는 방법을 포함한다. 방법은 비-영양 버퍼 내에 제형화된 생세포들을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 비-영양 버퍼 내에 약 72시간 동안까지 저장되었으며, 생세포들은 그것들의 본질 및 비-영양 버퍼 내의 제형화 이전에 생세포들을 면역치료에 유용한 세포들로 규정한 세포들의 적어도 하나의 기능적 특성을 유지한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 면역치료를 환자에 투여하는 또 다른 방법을 포함한다. 방법은 비-영양 버퍼 내에 제형화된 생세포들을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 이전에 2년 또는 그 이상 동안까지 예를 들면, 액체 질소 내에 냉동 상태에서 저장되었고 융해되고 제형화되었으며 그리고 나서 비-영양 버퍼 내에 약 72시간 동안까지 저장되며, 생세포들은 그것들의 본질 및 비-영양 버퍼 내의 제형화 이전에 생세포들을 면역치료에 유용한 세포들로 규정한 세포들의 적어도 하나의 기능적 특성을 유지한다.
도 1a는 운송 동안에 컨테이너 내의 온도 변화의 도표이며 컨테이너는 사전처리되지 않았다.
도 1b는 사전처리된 에어로젤 절연 박스 내부에 기록된 온도의 도표이다.
도 1c는 운송 동안에 공기 온도의 도표이다.
도 2a-2c는 패키징과 운송 전과 후의, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들을 위한 CD40L의 발현을 도시한다.
도 3a-3c는 패키징과 운송 전과 후의, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 세포 생존율을 도시한다.
도 4a-4c는 패키징과 운송 전과 후의, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 5a-5c는 패키징과 운송 전과 후에 뒤이어 6시간 동안 37℃에서 배양의, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 6a-6c는 피내(ID), 종양내(IT) 및 정맥내(IV) 투여를 위하여 제형화된, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 CD40L의 발현을 도시한다.
도 7a-7c는 피내, 종양내 및 정맥내 투여를 위하여 제형화된, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들을 위한 세포 생존율을 도시한다.
도 8a-8c는 피내, 종양내 및 정맥내 투여를 위하여 제형화된, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 9a-9c는 피내, 종양내 및 정맥내 투여를 위하여 제형화되고 24시간 및 48시간 동안 저장된, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 CD40L의 발현을 도시한다.
도 10a-10c는 피내, 종양내 및 정맥내 투여를 위하여 제형화되고 24시간 및 48시간 동안 저장된, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 11a-11c는 피내, 종양내 및 정맥내 투여를 위하여 제형화되고 24시간 및 48시간 동안 저장된, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 생존율을 도시한다.
도 12a-12c는 24시간, 48시간 및 72시간의 저장 후에 HTC264 세포들에 의한 CD40L의 발현, 세포 생존율, 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 13d는 24시간 동안 37℃에서 72시간의 저장과 배양 후에 HTC264 세포들에 의한 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 13a-13c는 24시간, 48시간 및 72시간의 저장 후에 HTC245 세포들에 의한 CD40L의 발현, 세포 생존율, 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 13d는 24시간 동안 37℃에서 72시간의 저장과 배양 후에 HTC245 세포들에 의한 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 14a-14c는 24시간, 48시간 및 72시간의 저장 후에 HTC273 세포들에 의한 CD40L의 발현, 세포 생존율, 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 14d는 3가지 서로 다른 세포들 배치(batch)를 위하여 24시간 동안 37℃에서 72시간의 저장과 배양 후에 HTC273에 의한 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 15a-15c는 각각 HTC245, HTC273, 및 HTC264를 위한 48시간 후의배양 내에 활성화된 세포들(CAC)과 제형 버퍼 내의 세포들(CFB)을 위한 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 16a-16c는 각각 HTC245, HTC273, 및 HTC264를 위한 48시간 후의 배양 내에 활성화된 세포들과 제형 버퍼 내의 세포들을 위한 인터페론-감마의 세포 생존율을 도시한다.
도 17a-17c는 각각 HTC245, HTC273, 및 HTC264를 위한 48시간 후의 배양 내에 활성화된 세포들과 제형 버퍼 내의 세포들을 위한 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 1b는 사전처리된 에어로젤 절연 박스 내부에 기록된 온도의 도표이다.
도 1c는 운송 동안에 공기 온도의 도표이다.
도 2a-2c는 패키징과 운송 전과 후의, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들을 위한 CD40L의 발현을 도시한다.
도 3a-3c는 패키징과 운송 전과 후의, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 세포 생존율을 도시한다.
도 4a-4c는 패키징과 운송 전과 후의, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 5a-5c는 패키징과 운송 전과 후에 뒤이어 6시간 동안 37℃에서 배양의, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 6a-6c는 피내(ID), 종양내(IT) 및 정맥내(IV) 투여를 위하여 제형화된, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 CD40L의 발현을 도시한다.
도 7a-7c는 피내, 종양내 및 정맥내 투여를 위하여 제형화된, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들을 위한 세포 생존율을 도시한다.
도 8a-8c는 피내, 종양내 및 정맥내 투여를 위하여 제형화된, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 9a-9c는 피내, 종양내 및 정맥내 투여를 위하여 제형화되고 24시간 및 48시간 동안 저장된, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 CD40L의 발현을 도시한다.
도 10a-10c는 피내, 종양내 및 정맥내 투여를 위하여 제형화되고 24시간 및 48시간 동안 저장된, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 11a-11c는 피내, 종양내 및 정맥내 투여를 위하여 제형화되고 24시간 및 48시간 동안 저장된, 각각 HTC273, HTC245, 및 HTC 264 세포들의 생존율을 도시한다.
도 12a-12c는 24시간, 48시간 및 72시간의 저장 후에 HTC264 세포들에 의한 CD40L의 발현, 세포 생존율, 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 13d는 24시간 동안 37℃에서 72시간의 저장과 배양 후에 HTC264 세포들에 의한 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 13a-13c는 24시간, 48시간 및 72시간의 저장 후에 HTC245 세포들에 의한 CD40L의 발현, 세포 생존율, 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 13d는 24시간 동안 37℃에서 72시간의 저장과 배양 후에 HTC245 세포들에 의한 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 14a-14c는 24시간, 48시간 및 72시간의 저장 후에 HTC273 세포들에 의한 CD40L의 발현, 세포 생존율, 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 14d는 3가지 서로 다른 세포들 배치(batch)를 위하여 24시간 동안 37℃에서 72시간의 저장과 배양 후에 HTC273에 의한 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 15a-15c는 각각 HTC245, HTC273, 및 HTC264를 위한 48시간 후의배양 내에 활성화된 세포들(CAC)과 제형 버퍼 내의 세포들(CFB)을 위한 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
도 16a-16c는 각각 HTC245, HTC273, 및 HTC264를 위한 48시간 후의 배양 내에 활성화된 세포들과 제형 버퍼 내의 세포들을 위한 인터페론-감마의 세포 생존율을 도시한다.
도 17a-17c는 각각 HTC245, HTC273, 및 HTC264를 위한 48시간 후의 배양 내에 활성화된 세포들과 제형 버퍼 내의 세포들을 위한 인터페론-감마의 분비를 도시한다.
본 발명은 장기간 후에도 면역치료에 유용한 세포 특성들을 나타낼 수 있는 비-영양 버퍼 내에 제형화된 생세포 생물학적 약물 제품들의 패키징, 저장 및 분배에 관한 것이다. 이러한 생세포 생물학적 약물들은 비-영양 버퍼 내에서 약 72시간 후에서도 생존율뿐만 아니라 미리 결정된 본질과 기능적 특성들을 유지할 수 있다.
일부 바람직한 실시 예들에서, 생물학적 약물로서 사용되는 면역 Th1 기억 세포들은 생존을 유지할 수 있고, 미리 결정된 세포 본질(CD4+, CD45RO+, CD40Lhi, CD62Llo)을 유지할 수 있으며 1000 pg/106 cells/4h 인터페론-감마의 분비와 같은 기능 기준을 회복할 수 있다. 이러한 면역 Th1 기억 세포들은 CD3/C28로 코팅된 마이크로비드들로 비-영양 버퍼 내에 제형화되고 냉장 상태에서 유지될 때 적어도 약 72시간 동안까지 이러한 세포 특성들을 나타낼 수 있다.
생세포들을 포함하는 생물학적 제품들은 원하는 저장 상태를 유지하기 위하여 환경적으로 제어되는 조건들 내에 패키징될 수 있으며 특급 택배 서비스(express courier service, 예를 들면, 페더럴 익스프레스(Federal Express), United Parcel Service(UPS))에 의해 거의 세계 어떤 곳이라도 시설 지점으로 발송될 수 있다. 바람직하게는, 생세포들을 갖는 패키지는 냉장 온도 하에서 저장되고 운송된다. 제형화된 세포들은 약 6시간 동안까지 냉장 패키징으로부터 제거된 후에 안정적으로 유지된다. 바람직하게는, 세포들은 우선 현장에서 냉장 패키징으로부터 제거되고 환자 투여 이전 1-2시간부터 실온(room temperature, RT)으로 유지하도록 허용한다. 운송된 세포들은 놀랍게도 안정적이고 장시간 동안 저장되지 않은 세포들과 유사한 방법들로 사용될 수 있다. 대안으로서, 세포들은 현장에 동결 상태로 저장되고 운송된다. 세포들은 현장에서 동결 상태로 저장될 수 있고 자동화 또는 반자동화 폐쇄, 멸균 시스템 내에 제형화될 수 있으며 그리고 나서 환자로의 투여 전에 약 72시간 동안까지 냉장 상태로 현장에서 저장될 수 있다.
생세포들은 최소로 조작되는 것 이상의 어떠한 세포일 수 있는데 그 이유는 세포 제품이 우선 임상시험계획승인제도 또는 동등한 승인제도 하에서만 인간에 대한 평가를 필요로 하고, 적용가능하면 21 C.F.R. parts 211, 606과 820에 따라 의약품품질관리기준(GMP) 하에서 제조되는 생물학적 약물인 것을 결정하기 위하여 미국 식품의약국에 의해 용어가 사용되기 때문이다.
생세포들은 단일 형태일 수 있거나 또는 그것들이 정의된 본질 및 기능 기준을 갖는 한 혼합물일 수 있다. 세포들은 자가의(autologous), 동종(allogeneic) 및/또는 이종(xenogeneic) 기증자로부터 유래하는, 천연 또는 생체공학적일 수 있다.
생세포들이 생물학적 약물의 활성 성분이나, 생물학적으로 활성인 단백질들, 펩티드들, 화학물질들, 뉴클레오티드들(RNA, DNA) 및/또는 장치들과 같이, 다른 물질들이 세포들에 첨가될 수 있다. 세포들은 제형 내에 자유롭게 현탁되거나 또는 표면 혹은 장치에 부착되거나 또는 장치 혹은 물질에 캡술화될 수 있다. 세포들은 질환 또는 질병의 발생을 치료하거나 예방하도록 의도되어야만 한다. 세포들은 신체의 어떠한 위치 내에도 주입되거나, 주사되거나 또는 이식될 수 있다.
기능 특성들에 의해, 이는 다양한 기능들, 특히 세포들에 의해 실행되고 면역치료와 줄기 세포 치료에 유용한 면역 기능들 및 분화 기능들을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 면역 기능들은 예를 들면, 분자들의 분비, 세포 표면 모이어티(moiety)의 발현, 분자들의 인식, 분자들에 반응하고 특정 세포형으로 성장하거나 및/또는 변화하거나 또는 체내의 다른 세포들이 성장하거나 변화하거나 사멸하거나 혹은 다른 방식으로 정상 또는 질환 기능을 변경하도록 야기하는 능력뿐만 아니라 종래에 알려진 다른 면역학적 및 세포 분화 기능들을 포함할 수 있다. 면역학적 기능들은 선천성 및/또는 적응 면역 시스템 반응 혹은 적응 또는 선천성 면역 반응의 조절과 관련된 분자들의 처리 또는 생산의 과정 혹은 단계일 수 있다. 기능들은 세포 매개 면역학적 기능 및/또는 체액성 시스템, 면역자극 및 면역 억제 모두와 관련될 수 있다. 기능 특성들은 면역학적 기억과 관련될 수 있거나 또는 자가와 비-자가 항원들 사이의 구별, 또는 박테리아, 바이러스, 균류와 같은 병원체뿐만 아니라 종양들 또는 다른 비정상 혹은 원치 않는 세포들 또는 조직들의 인식과 관련될 수 있다. 다른 기능들은 면역 반응들을 차단하거나 또는 촉진하거나 또는 그렇지 않으면 조절하거나 혹은 특정 세포형으로의 분화를 가능하게 하는 특정 기관 또는 조직 또는 위치의 세포 분자들에 대한 트래피킹(trafficking)으로서의 그러한 기능들을 매개하는 표면 분자들과 관련될 수 있다.
본 발명은 활성 성분으로서 비-영양 버퍼 내에서 제형화된 생세포들을 포함하는 생물학적 약물 제품을 설명한다. 일부 실시 예들에서, 세포들은 면역 치료 또는 줄기 세포 치료를 위하여 사용될 수 있는 살아 있는 면역 세포들이다. 조성물들은 실온에서 적어도 약 6시간 동안 비-영양 버퍼 내에서 안정적이며 냉장 온도에서 적어도 약 24시간 동안, 바람직하게는 적어도 약 48시간 동안, 및 더 바람직하게는 적어도 약 72시간 동안 안정적이다. 놀랍게도, 조성물들 내의 생세포들은 비-영양 버퍼 내에서의 제형화 후에도 세포들이 영양분 함유 배지에서 나타낸 그것들의 본질, 생존 및 기능 특성을 유지할 수 있다. 여기에 설명되는 조성물들은 패키징될 수 있고 처리 시설로부터 치료 시설로 적절한 저장 조건들을 유지하는 컨테이너들 내에서 상업적 택배를 사용하여 운송되고 분배될 수 있다. 그러한 능력은 생세포들을 포함하는 치료 조성물들을 생산하고 투여하는데 실질적인 노동, 시간과 경비의 절약을 야기할 수 있다. 게다가, 생세포 치료 조성물들의 접근성이 상당히 향상되는데 그 이유는 처리 시설이 전세계 어느 치료 시설로도 세포들을 생산하고, 패키징하고 분배할 수 있기 때문이다.
본 발명은 또한 비-영양 버퍼 내에서 연장된 시간 동안 생세포 현탁액을 유지하는 방법을 설명한다. 방법은 생세포들을 비-영양 버퍼 내로 이동시키는 단계 및 냉장 조건들 하에서 그것들을 저장하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예들에서, 생세포 조성물들은 냉장 조건들 하에서 저장된다. 원할 때, 조성물들은 저장으로부터 제거되고 일정 시간 동안 실온에서 위치된다. 일부 실시 예들에서, 생세포들의 기능 특성들은 생세포 현탁액들이 일정 시간 동안 거의 실온에서 위치된 후에 실질적으로 회복된다. 다른 실시 예들에서, 저장으로부터 제거되고 일정 시간 동안 실온에서 위치된다. 일부 실시 예들에서, 생세포들의 기능 특성들은 생세포 현탁액들이 일정 시간 동안 생리학적 조건들에 위치된 후에 실질적으로 회복된다.
여기에 설명되는 치료 조성물은 생세포들을 포함한다. 생포들에 의해, 이는 세포들이 적절한 조건들 하에서 세포들이 증식, 분화 및/또는 활성과 같은 생체외 조작들을 할 수 있는 것과 같이 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion), MTT 또는 ATP 레벨들의 생물발광 검출과 같은 적절한 분석 기술들에 의해 결정되는 것과 같이 ＞70%의 세포들이 생존하는 것을 의미한다. 그러나, 조성물들은 일부 불활성 세포들, 조사된 세포들 및/또는 비-생존 세포들을 포함할 수 있다. 생세포들은 예를 들면, 불멸화 세포 라인(immoralized cell line), 일차 세포 배양, 생물학적 유체, 조직, 제대혈, 말초 혈액, 골수, 세포들의 동결 앨리쿼트(aliquot)들을 포함하는 다수의 소스로부터 유래할 수 있다. 위에서 설명된 것과 같은 생체외 조작을 할 수 있는 다른 소스로부터 유래하는 생세포들도 또한 본 발명의 범위 내에 존재한다.
치료 조성물 내의 세포들은 동종의 세포들이다. 예를 들면, 동종 기증자들의 혈액 또는 골수로부터 유래하는 세포들이 원하는 방식으로 처리될 수 있고 그리고 나서 환자 내로의 주입을 위하여 제형화된다. 주사기 또는 운송 팩 또는 인간 사용 제품의 유지를 위한 다른 적절한 장치 내에 위치되는 주입 제형은 환자 주입을 위하여 패키징되고 치료 시설 현장으로 운송될 수 있다. 대안으로서, 치료 조성물 내의 세포들은 조작되고, 제형화되고 패키징되고 운송되며 동일한 환자 내로 재주입되려는 자가 세포들일 수 있다. 생세포들은 또한 비-인간 소스로부터 유래할 수 있고 인간 투여(이종의)를 위하여 조작되고, 제형화되고 패키징되며 운송될 수 있다. 인간 주입을 위하여 설명된 동일한 치료 조성물들이 또한 비-영양 버퍼 내에서 그리고 질환 예방 환경에서 사용될 수 있다.
조성물들 내의 생세포들이 면역 세포들인 일 실시 예에서, 이러한 면역 세포들은 골수 또는 제대혈로부터 유래하는 세포들, 호종구(neutrophil) 호염구(basophil), 및 호산구(eosinphil)들과 같은, 과립구(granulocyte)들을 포함할 수 있다. 면역 세포들은 또한 단핵구들, 대식세포들, 자연 살해 세포들, B 세포들, T 세포들과 자연 살해 T 세포들을 포함하는 림프구들일 수 있다. T-세포들은 예를 들면, CD4+ 세포들(Th0, Th1, Th2, Th17 및 Treg 세포들을 포함하는) 및/또는 CD8+ 세포들(Tc1과 Tc2)일 수 있다.
대상에 대한 세포 면역 반응을 향상시키기 위한 한가지 방법은 적응 면역치료라 불리는 세포 치료의 형태이다. 세포 치료는 활성 성분이 전체 또는 일부분 생세포인 약물이다. 적응 면역치료는 대상으로부터 면역 세포들의 제거, 생체외 처리(즉, 세포들의 활성화, 정제 및/또는 증식) 및 동일한 대상(자가 치료) 또는 다른 대상(동종 치료) 내로 결과로서 생기는 세포들의 뒤따르는 주입을 포함한다.
생물학적 제품은 약물 적응 면역치료를 위하여 다양한 생체외 조작을 사용하여 조작된 생세포들을 포함한다. 생체외 조작된 생세포들은 예를 들면, 림포카인 활성화 살해(LAK) 세포들(Rosenberg 미국특허 제 4,690,915), 종양 침윤 림프구(TIL) 세포들(Rosenberg 미국특허 제 5,126,132), 세포독성 T-세포들(Cai 등 미국특허 제 6,255,073; Celis 등 미국특허 제 5,846,827), 증식된 배출(draining) 림프절 세포들(Terman 미국특허 제 6,251,385), 다양한 림프구 제제들(Bell 등 미국특허 제 6,194,207; Ochoa 등 미국특허 제 5,443,983; Riddell 등 미국특허 제 6,040,180; Babbit 등 미국특허 제 5,766,920; Bolton 미국특허 제 6,204,058), CD8+ 종양 침윤 림프구 세포들(Figlin 등(1997) Journal of Urology 158:740), IL-2의 존재 하에서 항-CD3+ 단일클론 항체로 활성화된 CD4+ T 세포들(Nishimura (1992) J. Immunol. 148:285), IL-2의 존재 하에서 항-CD3와 항-CD28로 공동 활성화된 T-세포들(Garlie 등 (1999) Journal of Immunotherapy 22:336), 생체외에서 생산되고 IL-2의 존재 하에서 항-CD3과 항-CD28 단일클론 항체들(mAB)로 증식된 항원 특이 CD8+ CTL T-세포들(Oelke 등 (2000) Clinical Cancer Research 6:1997), 및 항-CD3 단일클론 항체로 활성화되고 그 뒤에 IL-2 내에 증식되는 배출 림프절 T-세포들의 회복 후 7일 후에 대상들에 백신접종하기 위하여 결핵예방백신(BCG)과 혼합된 조사된(irradiated) 자가 종양 세포들의 주입(Chang 등 (1997) Journal of Clinical Oncology 15:796)을 포함할 수 있다.
바람직한 일 실시 예에서, 본 발명의 치료 조성물은 적어도 일부 T-세포들, 바람직하게는 동종의 T-세포들을 포함한다. 이러한 T-세포들은 또한 바람직하게는 활성화된 Th1 기억 세포들을 형성하도록 세포 표면 활성을 통하여 활성화된다. T-세포들은 T-세포 표면 분자들에 특이적인 고정화 단일클론 항체들의 사용을 포함하는 다양한 방법들로 활성화된다. 적절하게 활성화된 T-세포들은 예를 들면, 미국특허 제 7,435,592에서 설명되며 이는 여기에 참조로써 통합된다. 세포들은 바람직하게는 단일클론 항체 또는 다른 결합제들에 의해 교차 결합되는 세포 표면 모이어티들을 갖는다. 이러한 단일클론 항체들 및/또는 결합제들은 바람직하게는 예를 들면, T-세포들을 활성화하기 위하여 고형 표면 상의 고정화에 의해 교차 결합된다. 이것들은 여기서 배양 내에서 활성화된 세포들(cells activated in culture, CAC, 이하 CAC로 표기)로서 언급된다.이러한 생체외 제조된 CAC는 미래의 사용을 위하여 동결되거나 또는 주입을 위하여 제형화될 수 있다.
바람직한 실시 예들에서, 생체외 제조된 CAC는 환자 투여를 위하여 필요할 때까지 동결 저장된다. 환자로의 투여 이전에 CAC는 융해되고, 세척되며 예를 들면, 미국특허 제 7,402,431에서 설명된 것과 같이 CD3와 CD28과 같은 세포 표면 결합 모이어티들의 교차 결합에 의해 영양 배지 내에서 활성화되는데, 이는 여기에 참조로써 통합된다. 그리고 나서 교차 결합제와 함께 CAC는 세척되고 제형 버퍼와 같은 비-영양 버퍼 내로 이동된다. 제형 버퍼 내의 재활성화된 세포들은 여기서 제형 버퍼 내의 세포들(cells in formulation buffer, CFB, 이하 CFB로 표기)로서 언급된다. CFB는 치료 목적을 위하여 환자에 투여될 수 있다. 일반적으로, 이러한 활성화된 세포들은 일단 비-영양 버퍼로 이동되면, 한정된 유통 기한을 갖는다. 생세포들은 ㎖당 적어도 약 106 세포의 농도로 , 바람직하게는 ㎖당 적어도 약 107 세포 또는 그 이상의 농도로 제형화될 수 있다. 세포들의 특정 농도는 세포들의 특정 사용 및 치료 프로토콜에 의해 결정될 수 있다.
치료 조성물은 또한 다수의 다른 성분을 포함할 수 있다. 이러한 성분들은 DP를 들면, 원하는 활성 상태로 생세포들을 유지하는 제제를 포함할 수 있다. 바람직한 일 실시 예에서, 치료 조성물은 아래의 실시 예들에서 설명되는 Dynabeads ClinExVivoTm과 같은 활성화 상태에서 T-세포들을 유지하는 제제들을 포함할 수 있다.
본 발명은 유통 기한을 증가시키기 위하여 생세포 조성물들을 저장하고 처리하는 방법을 포함한다. 여기서 사용되는 유통 기한은 CFB가 생존율, 미리 정의된 본질 및 기능 특성들을 유지하는 제형 후의 시간이 양으로서 정의된다. 일반적으로, 세포들은 환자 내로의 주입에 적합한 비-영양 버퍼로 이동된다. 세포들은 다양한 비-영양 버퍼일 수 있다. 여기서 언급되는 것과 같은, 비-영양 버퍼는 세포 증식 및/또는 확장을 제공하는데 적절한 성분들이 없는 어떠한 종류의 배지, 버퍼 또는 다른 액체일 수 있다. 비-영양 버퍼들은 일반적으로 등장성(isotonic)이고, 미국약전 상의 멸균이고, 발열인자(pyrogen)가 없으며 생세포들을 온전하게 유지하기 위한 적절한 성분들 및/또는 버퍼링 시스템을 포함하며 인간 비경구(parenteral) 사용이 허가된다. 바람직한 일 실시 예에서, 비-영양 버퍼는 1% 인간 혈청 알부민(McKesson사, 캘리포니아주 샌프란시스코)을 갖는 Plasmalyte(플라스마라이트) A (Baxter Scientific사. 일리노이주 디어필드)인 제형 버퍼이다.
활성화된 세포들, 특히 활성화된 Th12 세포들을 갖는 실시 예들에서, 세포들이 비-영양 버퍼 내로 이동될 때에도 세포들을 위한 활성 신호들은 유지된다. 예를 들면, 세포들이 세포 표면 결합 모이어티들의 교차 결합에 의해 활성화되는 실시 예들에서, 교차 결합은 바람직하게는 비-영양 버퍼 내에서 유지한다. 저장 동안에 교차 결합의 유지는 저장으로부터의 제거 후에 조성물의 기능 특성들을 회복하는데 중요할 수 있다. 활성 조성물이 비-영양 버퍼 내에서 제거되는 세포 조성물은 활성 상태에서 유지된 세포들과 동일한 방법으로 회복되지 않는다.
여기에 설명되는 방법들은 또한 세포들이 비-영양 버퍼 내로 이동된 후에 생세포들의 처리를 포함한다. 생세포 조성물은 조성물의 유통 기한을 증가시키기 위하여 저장을 위한 서늘한 온도를 갖는 환경으로 이동될 수 있다. 비-영양 버퍼 내의 세포들이 이동되는 서늘한 온도는 여기서는 저장 온도로서 언급된다. 세포들은 일반적으로 비-영양 버퍼 내에 위치된 후에 가능한 한 신속하게 저장 온도로 이동된다. 세포들은 바람직하게는 비-영양 버퍼 내에 위치된 후에 약 6시간 이하로, 더 바람직하게는 비-영양 버퍼 내에 위치된 후에 약 4시간 이하로 저장 온도로 이동된다. 훨씬 더 바람직한 실시 예들에서, 세포들은 비-영양 버퍼 내에 위치된 후에 약 1시간 이하로 저장 온도로 이동된다.
조성물들이 유지되는 저장 온도는 다양할 수 있으나 일반적으로 생리학적 온도 이하, 즉, 약 37℃ 이하이다. 바람직하게는, 세포들은 냉장 온도에서 저장된다. 냉장 온도는 약 -2℃ 및 약 12℃ 사이의 범위일 수 있다. 더 바람직하게는 세포들은 약 0℃ 및 약 10℃ 사이의 온도에서 저장된다. 더 바람직하게는 세포들은 약 4℃ 및 약 8℃ 사이의 온도에서 저장된다.
여기에 설명되는 조성물들은 또한 제조 또는 처리 시설로부터 치료 시설로 패키징되고, 운송되며, 분배될 수 있다. 제조 또는 처리 시설은 설립된 가이드라인을 준수하여 생물학적 약물들을 위한 생세포들을 처리할 수 있는 병원, 클리닉 또는 다른 생산 시설일 수 있다. 치료 시설은 환자가 일반적으로 치료 투여되는 병원, 클리닉 또는 다른 현장일 수 있다. 조성물들은 일반적으로 위에서 설명된 저장 온도 범위 내에서 조성물들을 유지하는 방식으로 운송을 위하여 패키징된다. 세포들은 예를 들면, 유연성 컨테이너, 주사기 등 내에 저장되고 운송될 수 있다. 패키지 또는 박스는 바람직하게는, 생세포들을 갖는 컨테이너가 패키지 내에 위치되기 전에 원하는 저장 온도로 전처리된다. 조성물들은 예를 들면, 얼음 또는 에어로젤이 패킹된 박스들 내에 패키징될 수 있다. 패키지들은 바람직하게는 외부 온도와 상관없이 원하는 저장 온도를 유지할 수 있는 절연 박스들이다. 박스들은 또한 바람직하게는 전처리되는데, 이는 그것들이 생세포들을 갖는 컨테이너가 내부로 위치되기 전에 원하는 온도로 저장되었거나 설정되었다는 것을 의미한다. 바람직한 실시 예들에서, 패키지들은 생물학적 제품의 위치 이전에 전처리되고 패키지들은 냉장 또는 동결 조건 하에서 치료 시설로 운송된다. 모든 형태의 운송 방법이 사용될 수 있으나 바람직한 운송 방법은 상업적 택배에 의한 것이다.
여기에 설명되는 조성물들의 유통 기한은 놀랍게도 조성물들이 저장 온도 범위 내에서 저장될 때 연장된다. 생세포 조성물들의 유통 기한은 약 6시간 이상 동안 연장될 수 있다. 바람직하게는, 생세포 조성물들의 유통 기한은 약 24시간 이상 동안, 더 바람직하게는 약 48시간 이상 동안 연장될 수 있다. 훨씬 더 바람직한 실시 예들에서, 생세포 조성물들의 유통 기한은 약 72시간 이상 동안 연장될 수 있다. 가장 바람직한 실시 예에서, 생세포 조성물들의 유통 기한은 약 120시간 이상 동안 연장될 수 있다. 약 120시간 이상의 유통 기한이 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
여기에 설명된 방법들에 따라 저장된 비-영양 버퍼 내의 세포 조성물들은 저장 기간 동안에 그리고 저장으로부터의 제거 후에 그것들이 생존, 본질 및 기능을 유지할 수 있다. 세포들의 생존은 트리판 블루 배체 분석법, MTT, 7-아미노-악티노마이신 D(7-amino-actinomycin D, 7-AAD) 또는 ATP 레벨의 생물발광 검출과 같은 분석 기술들을 포함하는 종래에 알려진 다양한 방법들에 의해 결정될 수 있다.
세포들의 본질은 다양한 방법들에 의해 확인될 수 있다. 세포들은 조성물 내의 특정 세포형을 나타내는 다양한 내부 및 외부 세포 마커(marker)들에 의해 분석될 수 있다. 외부 마커들은 총 (247)가지 CD를 갖는 국제 인간 림프구 분화 항원들 상의 1차부터지 8차 워크숍까지 지정된 단일클론 항체들의 클러스터 지정(분화 집단, CD)에 의해 분류된다. 백혈구들은 그것들의 표면 상에 독특한 분자 조합들을 발현하는데, 상당수는 그것들의 계통 특이 변화의 서로 다른 상태 또는 활성화 혹은 불활성화의 서로 다른 상태를 반영한다. 백혈구 세포 표면 분자들은 일반적으로 항-백혈구 단일클론 항체들(mAbs)로 검출된다. 항-백혈구 단일클론 항체들의 서로 다른 조합을 사용하여, B-세포들, 헬퍼 T-세포들(Th), 세포독성 T-세포들(Tc), 및 자연 살해 세포들의 기능적으로 독특한 성숙 림프구 서브개체군을 포함하는, 서로 다른 백혈구 서브개체군의 세포 표면 면역표현형을 기록하는 것이 가능하다.
비-영양 배지 내의 저장 후에도, 조성물 내의 생세포들은 비-영양 배지 내의 제형화 이전에 존재한 기능 특성들을 나타낸다. 기능 특성들은 예를 들면, CD40L, FasL, 퍼포린(perforin)과 그랜자임(Granzyme) B와 같은 기능 분자들, 공동 자극 분자들 4-IBBL, CD28, CTLA4, 및 종양 괴사 인자(TNF) 관련 활성 유도 사이토카인(TRANCE), TWEAK, PD-1, B7 패밀리의 발현, 인테그린(integrin), 카데린(cadherin)과 셀렉틴(selectin)과 같은 접합 분자들의 발현, 다양한 사이토카인들과 케모카인들의 분비 및 이러한 사이토카인들과 케모카인들을 위한 수용체들의 발현을 포함하는, 다양한 활성들을 포함할 수 있다. 사이토카인들과 케모카인들은 성장, 분화, 및 면역 반응들의 본질을 조절하고 결정하며 면역 세포 트래피킹과 면역 조직들의 세포 배치를 제어하는 활성 기능들을 갖는 중복 분비되는 단백질들이다. 사이토카인들은 예를 들면, Il2, IL3, IL4, IL5, IL6, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GMCSF), 인터페론-감마 등을 포함할 수 있다.
일부 실시 예들에서, 기능 특성들은 제형화 후에 그리고 저장을 통하여 유지되고 효소들 또는 마커(marker)들의 레벨들은 저장과 운송으로부터의 제거 후에 곧 측정될 수 있다. 예를 들면, 조성물들이 저장으로부터 제거되고 약 2시간 동안 실온에서 배양하도록 허용한 후에 CD40L 발현이 측정될 수 있다. CD40L 발현은 제형화와 저장 시간에서의 CD40L 발현의 레벨들과 유사하다. 예를 들면, 도 2a-2c가 참조된다. 유사하게, 조성물들 내의 생존 세포들의 수는 약 2시간 동안 실온에서의 저장과 배양으로부터 제거 후에 결정될 수 있다. 생존 세포들의 수는 제형화와 저장의 시간에서의 세포 생존 레벨들과 유사하다. 예를 들면, 도 3a-3c가 참조된다.
다른 실시 예들에서, 기능 특성들은 세포들이 생리학적 조건들에 노출된 후에 회복될 수 있다. 이는 환자 내로의 주입 상에서, 세포 조성물들이 의도된 대로 기능을 할 수 있고 제형화 시간에서의 세포들의 성분 특성들을 분비하고 발현할 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 인터페론-감마의 분비는 세포들이 저장 내에서 제형화되고 위치될 때 감소될 수 있다. 인터페론 감마는 여기서는 IFN-γ 또는 IFN-g로서 언급될 수 있다. 실온으로의 복귀는 인터페론-감마의 분비를 회복시키지 않으나 24시간 동안 37℃에서의 배양은 제형화 시간에서의 레벨과 유사한 레벨로 인터페론-감마의 분비를 증가시킨다. 예를 들면, 도 12d, 13d 및 14d가 참조된다. 바람직하게는, 저장 동안의 인터페론-감마 레벨들의 감소는 세포 자원의 고갈을 예방할 수 있다. 만일 저장 동안에 분비를 위한 세포 자원이 충분히 보존되지 않으면, 세포들은 일반적으로 적절한 생리학적 조건들 하에서 인터페론-감마의 분비를 다시 시작할 수 있다. 따라서, 조성물이 투여 이전에 장시간 동안 저장되었다 하더라도, 환자로의 조성물의 투여는 여전히 환자에 치료 조성물의 투여의 결과로 유래하는 인터페론-감마 및 다른 염증성 사이토카인들을 제공할 수 있다.
조성물들의 유통 기한의 연장은 다양한 방법들로 설명될 수 있다. 여기서 사용되는 것과 같이, 유통 기한의 연장은 위에서 설명된 연장된 저장 시간 후에서도 그것들이 생존, 본질 및 그것들의 기능 특성들을 유지하는 조성물들 내의 생세포들을 언급할 수 있다. 일반적으로, 적어도 24시간의 저장 후에, 조성물들은 제형화 시간에서의 활성에 대하여 비-영양 버퍼 내의 정의한 특성의 활성의 적어도 약 50%를 유지한다. 바람직하게는, 활성의 적어도 약 75% 및 더 바람직하게는 약 85% 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 90%의 활성이 제형화 시간에서의 활성에 대하여 저장 후에 유지된다.
바람직한 실시 예들에서, 적어도 48시간의 저장 후에, 조성물들은 제형화 시간에서의 활성에 대하여 비-영양 버퍼 내의 정의한 특성의 활성의 적어도 약 50%를 유지한다. 바람직하게는, 활성의 적어도 약 75% 및 더 바람직하게는 약 85% 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 90%의 활성이 제형화 시간에서의 활성에 대하여 저장 후에 유지된다.
더 바람직한 실시 예들에서, 적어도 72시간의 저장 후에, 조성물들은 제형화 시간에서의 활성에 대하여 비-영양 버퍼 내의 정의한 특성의 활성의 적어도 약 80%를 유지한다. 바람직하게는, 활성의 적어도 약 75% 및 더 바람직하게는 약 85% 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 90%의 활성이 제형화 시간에서의 활성에 대하여 저장 후에 유지된다.
세포 조성물들은 다양한 방법을 사용하여 환자에 투여될 수 있다. 조성물들은 피내로(interadermally ID), 정맥내로(IV), 척추강내로(intrathecally), 종양내로(IT) 그리고 기타 유사한 종류로 투여될 수 있다.
실시 예들
재료: 캘리포니아주 브레아(Brea)시 소재의 Beckman Coulter사로부터 피코에리트린(PE)-결합 CD40L을 구매하였다. 7-아미노-악티노마이신 D (1000x)는 미시간주 앤 아버(Ann Arber)시 소재의 Cayman Chemical Co.사로부터 구매하였다. PlamaLyte A는 일리노이주 디어필드(Deerfield)시 소재의 Baxter Scientific사로부터 구매하였다. 인간 혈청 알부민(HSA)은 캘리포니아주 샌프란시스코시 소재의 McKesson사로부터 구매하였다. FcR 결합 억제제는 캘리포니아주 샌디에이고시 소재의 eBioscience사로부터 구매하였다. Dynabead ClinExVivoTM은 캘리포니아주 칼즈배드(Carlsbad)시 소재의 Invitrogen사로부터 구매하였다.
제형 버퍼 내의 세포들( CFB )의 제조 - 배양 배지 내에 활성화된 세포들(CAC)은 세척을 위하여 cRPMI 배지 내로 위치되었다. 제형화 프로토콜의 시작을 표시하기 위하여 시간이 기록되었다. cRPMI 배지 내의 세포들은 원심분리되었고, 상청액이 제거되었으며 세포들은 CRPMI 버퍼 내에 재현탁되었다. 트리판 블루 분석법을 사용하여 세포 생존율이 결정되었다. 생존 세포들의 백분율을 결정하기 위하여 총 세포 수 및 생세포들의 농도가 사용되었다. 만일 샘플이 80% 이상의 생존율을 가졌으면, 세포들의 재활성과 제형화를 위하여 과정이 계속되었다.
CAC 세포들은 1×107 cells/㎖의 농도로 재현탁되었다. 1×107 cells/㎖의 생세포 농도에서 재활성이 수행되었다. 재활성은 24 웰 플레이트(well plate), 6 웰 플레이트 또는 용량에 따라 75 ㎝3 플라스크 내에서 수행되었다. 세포들을 재활성화하기 위하여 Dynabeads ClinExVivoTM CD3/CD28이 첨가되었고 36-38℃ 및 5% 이산화탄소에서 4시간 동안 배양되었다. 4시간 동안의 배양 후에, 세포들은 제거되었고 최종 제형 버퍼(FFB)를 갖는 50 ㎖ 튜브로 이동되었다. 최종 제형 버퍼는 1% 인간 혈청 알부민을 갖는 PlasmaLyte A이다. 재활성화된 세포들은 원심분리되었고, 상청액이 제거되었으며 최종 제형 버퍼 내에 재현탁되었다. 이들은 제형 버퍼 내의 세포들(CFB)로서 언급된다.
CFB는 ㎖당 107 세포의 농도로 최종 제형 버퍼 내에 재현탁되었다. CFB는 ㅍ피내, 종양내 또는 정맥내 투여를 위하여 재현탁되었다. 피내 제형으로서 1 ㎖의 세포 현탁액이 3 ㎖ 주사기에 첨가되었다. 종양내 그리고 정맥내 제형은 각각 3 ㎖ 및 5 ㎖이었다. 적절한 제형들을 갖는 주사기들은 약 4℃의 평균 온도를 갖는 냉장에서 저장되었다.
저장 후의 샘플들의 수확 - 세포들 및 상청액이 서로 다른 시점들에서 수집되었다. 시점들은 다음과 같다: 0(초기); 실온에서 2시간; 4℃에서 48시간; 및 4℃에서 48시간 뒤에 실온에서 2시간.
각각의 시점에서, 100 ㎕ 세포 현탁액이 수집되었고 세포들은 4℃에서 5분 동안 400g로 회전되었다. 상청액은 그리고 나서 나중에 효소면역분석법(ELISA)을 사용하는 인터페론-감마 검출을 위한 또 다른 튜브로 이동되었다. 세포들은 유동세포 분석법(flow cytometry)을 위하여 150 ㎕ 염색 버퍼 내로 재현탁되었다. 일부 실시 예들에서, 세포들은 100 ㎕ cRPMI 배지 내에 재현탁되었고 5% 이산화탄소와 함께 24시간 동안 37℃의 배양기에서 배양되었다. 24시간 배양 후에 상청액을 취하였고 효소면역분석법에 의해 인터페론-감마가 검출되었다.
유동세포 분석법( CD40L 및 7-아미노- 악티노마이신 D) - 50 ㎕ 세포 현탁액이 위(150 ㎕)로부터 각각 미염색, CD40L 및 7-아미노-악티노마이신 D로 라벨링된, 3개의 에펜도르프 튜브 내로 이동되었다. 미염색 튜브는 20분 동안 얼음 상에서 배양되었다. CD40L 튜브를 위하여, 세포들은 얼음 상에 20분 동안 제조사의 지시에 따라 FcR 결합 저해제와 함께 미리 배양되었다. 그리고 나서 40 ㎕ 염색 버퍼(PBS+1%FBS) 및 10 ㎕ 피코에리트린-CD40L 항체가 세포 현탁액 내에 첨가되었고 암실 얼음 상에서 20분 동안 추가로 배양되었다.
7-아미노-악티노마이신 D의 유동세포 분석에 의해 세포 생존율이 조사되었다. 7-아미노-악티노마이신 D는 죽거나 손상된 세포들의 DNA를 삽입하며, 따라서 7-아미노-악티노마이신 D 양성 세포들의 결정이 세포 생존이 표시자이다. 7-아미노-악티노마이신 D 튜브들을 위하여, 튜브들은 6℃에서 5분 동안 400g로 원심분리되었다. 상청액의 제거 후에, 세포 펠릿(cell pellet)들은 100 ㎕ 1x 7-아미노-악티노마이신 D 용액 내에 재현탁되었다. 튜브는 암실에서 15분 동안 얼음 상에 배양되었다. 1 ㎖의 염색 버퍼가 CD40L 튜브에 첨가되었고 그리고 나서 3개의 튜브는 함께 원심분리되었다. 상청액을 제거한 후에, 세포 펠릿들은 0.4 ㎖ 염색 버퍼 내에 재현탁되었고 형광 활성화 세포 분류기(FACS)가 가동되었다.
인터페론-감마 효소면역 분석법( CD40L 및 7-아미노- 악티노마이신 D) - 상청액 내에 분비된 인터페론-감마는 제조사의 지시에 따라 인터페론-감마 샌드위치 효소면역측정 키트(R&D Systems사, 미네소타주 미니애폴리스)에 의해 결정되었다.
실시 예 1 - 본 실험은 제형 버퍼 내의 세포들(CFB)이 운송 후에 저온들에서 안정적인지를 결정하기 위하여 실행되었다. 세포 현탁액의 배치들은 최종 제형 버퍼 내에 제형화되었으며 우편 서비스(페더럴 익스프레스)를 통하여 운송되었다. 데이터 기록장치(data logger)에 의해 온도가 모니터되었다. 사전 처리되지 않은 박스 및 전처리된 에어로젤 절연 박스 내부의 온도 변화가 모니터되었다. 외부 온도가 또한 모니터되었다. 3가지 서로 다른 배치들이 제형화되고 운송되었다. 배양 배지(CAC), 제형화 바로 후의 CFB, 실온에서 2시간 후의 CFB, 4℃에서 48시간 후의 CFB, 및 4℃에서 48시간 후와 실온에서 2시간 후의 CFB 내에 활성화된 세포들로부터 상청액 샘플들을 취하였다. CD40L의 발현을 위하여 CAC가 조사되었으며 나머지 세포들은 CD40L의 발현 및 세포들의 생존율을 위하여 조사되었다.
도 1a 및 1b는 운송 동안에 대상이 되는 세포들의 온도를 도시한다. 도 1a는 샘플들이 미리 처리된 박스 내에 패키징되지 않았을 때 온도가 약 46시간 내에서 약 5℃ 부터 약 13.7℃까지 다양했다는 것을 나타낸다. 샘플들은 안정적이었으며 이는 광범위한 변동이 수용가능하다는 것을 나타낸다. 도 1b는 전처리된 내부 온도 및 절연 박스가 상당히 안정적으로 유지되는 것을 나타낸다. 이는 0.2℃부터 2.2℃까지 다양하였다. 도 1c는 운송 기간 동안에 외부 온도의 변화를 나타낸다.
도 2a-2c는 CD40L의 발현이 상당히 변화되지 않았다는 것을 나타낸다. 도 3a-3c는 운송 과정 후의 세포 생존율이 운송 이전의 세포 생존율과 유사한 것을 나타낸다. 이러한 결과들은 패키지 내에서 약 2℃ 내지 약 13℃ 같은 광범위한 범위 내에서의 치료 조성물의 유지가 유해하지 않았다는 것을 나타낸다.
실시 예 2 - 본 연구는 저온이 CFB의 발현을 연장할 수 있는지를 결정하기 위하여 실행되었다. 실온에서 CFB의 서로 다른 제형들의 안정성이 실행되었다. CFB는 위에 설명된 것과 같이 피내, 종양내 또는 정맥내 주입을 위하여 제형화되었다. 저온 안정성이 연장될 수 있는지를 확인하기 위하여 이러한 제형들의 안정성이 조사되었다.
배치들 HTC264, HTC245 및 HTC273은 피내, 종양내 및 정맥내 투여를 위하여 제형화되었으며 제형화 후에 실온에서 6시간 동안 CD40L의 발현, 세포 생존율 및 인터페론-감마의 분비를 위하여 조사되었다. 도 6a-6c, 도 7a-7c 및 도 8a-8c는 이러한 조사들이 결과를 나타낸다. 이러한 세 가지 모든 파라미터는 실온에서 6시간 후에 안정적이었다. 도 9a-9c는 4℃에서 48시간 동안의 저장 후에 CD40L의 발현이 안정적이라는 것을 나타낸다. 도 11a-11c는 4℃에서 48시간 동안의 저장 후에 세포 생존율이 안정적이라는 것을 나타낸다. 도 10a-10c는 또한 4℃에서 48시간 후에 인터페론-감마 분비가 회복되지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나, 아래에서 나타낸 것과 같이, 이는 다시 RPMI로 이동시키고 24시간 동안 37℃에서 배양함으로써, 회복될 수 있다.
3가지 배치들(HTC264, HTC245 및 HTC273)은 피내, 정맥내 또는 종양내 제형들로서 제형화되었다. 각각의 제형의 총 4개의 주사기가 만들어졌고(실온을 위한 하나, 24시간 4℃를 위한 하나, 48시간 4℃를 위한 하나, 72시간 4℃를 위한 하나) 서로 다른 시간 간격 동안 4℃에서 배양되었다. 배양 후에 샘플들이 수집되었으며 다시 2시간 동안 실온에서 배양되었다. 아래의 테이블 1은 각각의 세포들이 배치를 위하여 실행된 시점(time point), 샘플들 및 테스트들을 나타낸다. 세포들이 24시간 동안 37℃에서 배양되었을 때 인터페론-감마 레벨들이 또한 결정되었다.
테이블 1
도 12a-12d, 도 13a-13d 및 도 16a-16d는 각각 배치들 HTC264, HTC245 및 HTC273의 결과를 나타낸다. 이러한 배치들의 피내 제형들이 표시된 것과 같이 조사되었다. 결과들은 4℃에서 CFB의 유지가 72시간 후에도 세포 표면들 상의 CD40L의 발현을 유지할 수 있다는 것을 나타내었다(도 12a, 도 13a 및 도 16a). 세포 생존율은 저온 저장에 의해 크게 영향을 받지 않았다(도 12b, 도 13b 및 도 16b). 인터페론-감마 분비 레벨들(도 12c, 도 13c 및 도 16c)은 세포들이 단지 2시간 동안 실온으로 돌아왔을 대 저하되었다. 그러나, 인터페론-감마 레벨들은 RPMI 배지로 다시 이동되고 24시간 동안 생리학적 온도(37℃)에서 배양되었을 때 회복하였다. 이는 72시간 동안 저온이 유지 후에도 세포들이 여전히 인터페론-감마를 분비할 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 만일 이러한 세포들이 치료상으로 투여되면, 오랜 저장의 대상이 되지 않았던 세포들에 대한 유사한 레벨들로 인터페론-감마가 환자 내에 생산될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시 예 3 - 본 실험은 CAC 세포들과 CFB 세포들의 안정성을 비교하기 위하여 수행되었다. 3가지 서로 다른 세포들의 배치가 ID 주사기로서 제형화되었다. 이러한 서로 다른 세포들이 배치들은 ID 주사기로서 제형화되었다. 하나의 주사기는 CAC를 위한 것이며 다른 하나의 주사기는 각각의 배치를 위한 CFB를 위한 것이다. CAC는 해동되고 cRPMI로 세척되었다. 세포 계수 후에, 세포 펠릿은 최종 제형 버퍼와 함께 109 cells/㎖ 내에 재현탁되었으며 1 ㎖의 세포 현탁액이 3 ㎖ 주사기 내로 이동되었다. CFB를 위하여, 세포 펠릿은 CRPMI와 함께 109 cells/㎖ 내에 재현탁되었으며 항-CD3/항-CD28 비드들과 함께 혼합되었다. 세포와 비드 혼합물은 5% 이산화탄소와 함께 37℃에서 4시간 동안 배양되었다. 세포들은 최종 제형 버퍼로 세척되었고 최종 제형 버퍼와 함께 107 cells/㎖ 내에 재현탁되었다. 각각의 시점에서, CD40L, 인터페논-감마, 생존율 테스트를 위한 주사기로부터 100 ㎕ 샘플들이 획득되었다. 48시간 동안 4℃에서의 배양 후에, 일부 샘플은 최종 제형 버퍼를 제거하기 위하여 5분 동안 400g로 원심분리되었다. 상청액을 제거한 후에, 세포 펠릿은 100 ㎕ cRPMI 내에 재현탁되었으며 2시간 동안 5% 이산화탄소와 함께 37℃에서 배양되었다. 인터페론-감마 검출을 위하여 상청액이 수집되었다. 아래의 테이블 2는 수집된 샘플들 및 실행된 테스트들을 나타낸다.
테이블 2
결과들은 48시간 동안 4℃에서 CAC의 배양은 세포 표면 상의 CD40L 발현을 상당히 감소시켰다는 것을 나타낸다. 도 15a-15c가 참조된다. 그러나, 48시간 동안 4℃에서 CFC의 배양은 CD40L 발현을 유지할 수 있었는데 이는 CD3와 CD28의 교차 결합이 세포들의 안정성에 필수적이라는 것을 시사한다. 4℃에서 48시간의 배양 후에도, CFB는 생존을 유지할 수 있으며 많은 양의 인터페론-감마를 분비할 수 있다. 도 16a-c 및 17a-c가 참조된다.
실시 예 4 - 본 연구는 이스라엘의 예루살렘 내의 생산시설로부터 치료 시설로의 패키징 및 운송 후에 제형화된 CFB의 생존율을 결정하기 위하여 실행되었다. CFB 제품이 운송 중의 72시간 후에 미리 설립된 본질과 기능 특성을 계속 충족시키는 것을 확인하는 것이 중요한데, 그 이유는 제형화 과정의 끝에서, 세포들은 세포들이 그것들의 생존 및 독특한 본질과 기능 특성을 상실할 수 있는 비-영양 주입 버퍼 내로 이동되기 대문이다. 낮은 온도들이 세포들의 유전자 발현과 활성을 늦출 수 있으며 이러한 유전자 발현은 세포들을 다시 생리학적 온도로 되돌림으로써 회복될 수 있다는 것이 알려졌다. 이러한 이유 때문에, 미리 인증된, 냉장의 온도 제어 컨테이너들을 사용하여 운송이 수행된다.
운송 이전(베이스라인에서- 4시간 활성 후에 제형화된 주사기들 = 이하 FF로 표기)의 세포들 특성을 FF가 완료된 후 최소 72시간에서, 뉴욕으로 운송되고 다시 돌아온 후에 획득된 세포들 특성과 비교함으로써, 운송의 72시간 후에 그것들의 미리 정의된 본질과 기능 특성들이 유지되는지를 검사하기 위하여 CFB 세포들이 조사되었다.
미리 정의된 종말점(end point) 파라미터들은 다음과 같다:
1. 생존율 테스트: CFB 생존율은 모든 테스트 시점((time point)에서 ＞70% 생세포이어야만 한다.
2. 급속 내독소 테스트: 4℃에서 베이스라인(baseline)에서 그리고 72시간 후에 수집된 샘플의 내독소 레벨들은 반드시 ＜0.5 Eu/㎖이어야 한다.
3. 그람 염색 - 모든 테스트 시점에서 수집된 샘플들의 슬라이드 상에 어떠한 박테리아도 관찰되어서는 안 된다.
4. 표면 염색 - CD40L AM (CFB-CAC)≥30:
*5. 미국약전 멸균율: 모든 테스트 배지 내에 제형화된 샘플의 성장이 없음.
6. 효소면역분석법에 의해 검사되는 인터페론-감마 분비
6.1
4시간 활성 동안에 축적된 인터페론-감마 ＞ 1×106 세포당 1,000 pg
6.2
베이스라인 이후 24시간 동안에 축적된 인터페론-감마 ＞ 1×106 세포당 6,000 pg
6.3
2℃∼8℃에서 72시간 후 24시간 동안에 축적된 인터페론-감마 ＞ 1×106 세포당 6,000 pg
결과:
배치 HTC300으로부터 투여 상에서 3가지 개별적인 최종 제형 과정이 실행되었다. 주사기들 내에 패키징된 제형화 제품은 뉴욕까지 항공 화물로 운송되었고, 다시 이스라엘이 예루살렘으로 운송되었다. 수송 중의 주사기들은 운송 패키지 내부의 온도 기록장치에 의해 나타낸 것과 같이 제형화 종료 시간부터 72시간 동안까지 2-8℃로 유지되었다. 모든 결과가 테이블 3에 요약되었다.
테이블 3
테이블 3에서 알 수 있는 것과 같이, 3가지 모든 제형화된 배치들은 미리 정의된 모든 수용 기준을 통과하였으며, 따라서 이는 제안된 분배 조건 내에서 CFB의 안정성을 나타낸다.
비록 바람직한 실시 예들을 참조하여 본 발명이 설명되었으나, 통상의 지식을 가진 자들은 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고 형태와 세부사항에서 변경이 만들어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
Claims (6)
- 냉동보관, 해동 및 재활성화되고, 비-영양 버퍼 내에서 제형화된 생세포들을 포함하는 생물학적 약물 조성물에 있어서, 상기 생세포들은 CD4+ 세포들이며, 상기 비-영양 버퍼 내에서 24시간 이상 저장된 후에도, 상기 비-영양 버퍼 내에서의 제형화 이전에 상기 생세포들에 정의된 그것들의 본질 및 CD40L, FasL, 퍼포린과 그랜자임 B의 발현, 공동자극 분자들의 발현, 접합 분자들의 발현, 및 사이토카인, 케모카인 및 이들의 조합의 분비에서 선택된 적어도 하나의 기능 특성을 유지하며, 상기 생세포들은 상기 비-영양 버퍼 내에서의 저장 후에도 면역치료에 유용하며, 분비되는 상기 사이토카인은 인터페론-감마이며 저장 후의 상기 인터페론-감마의 분비의 레벨은 제형화 시간에서의 레벨과 비교하여 적어도 80%까지 회복되는 것을 특징으로 하는 생물학적 약물 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 생세포들은 유연성 컨테이너 또는 주사기 내에 위치되며, 상기 유연성 컨테이너 또는 주사기는 냉장 온도 범위인, 0℃ 내지 10℃ 사이의 온도 범위 내에서 상기 생세포들을 유지하는 온도 제어 장치 내에 패키징되는 것을 특징으로 하는 생물학적 약물 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 생세포들은 CD4+ 세포들이며 활성화될 때 Th1 세포들인 것을 특징으로 하는 생물학적 약물 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 Th1 세포들은 T-세포 표면 분자들에 특이적인 고정화 단일클론 항체들에 의해 활성화되거나 또는 고정화 항-CD3 및 항-CD28 단일클론 항체들에 의해 활성화되는 것을 특징으로 하는 생물학적 약물 조성물.
- 제 4항에 있어서, 상기 단일클론 항체들은 교차 결합되는 것을 특징으로 하는 생물학적 약물 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 비-영양 버퍼 내의 상기 생세포들은 적어도 72시간 동안 안정적인 것을 특징으로 하는 생물학적 약물 조성물.
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