PT2704741T - Método para o manuseamento de medicamentos biológicos contendo células vivas - Google Patents

Método para o manuseamento de medicamentos biológicos contendo células vivas Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
MÉTODO PARA O MANUSEAMENTO DE MEDICAMENTOS BIOLÓGICOS
CONTENDO CÉLULAS VIVAS
CAMPO
Esta invenção refere-se a métodos para manusear fármacos biológicos contendo suspensões de células vivas formuladas em tampão não nutritivo. Mais especificamente, a presente invenção refere-se à embalagem, transporte e distribuição de suspensões de células imunes vivas em meios não nutritivos, pelo que as células mantêm suas propriedades únicas de identidade, função e viabilidade. antecedentes A terapia celular é uma terapia potencialmente curativa contra tumores, virus e patógenos bacterianos. A terapia celular também pode ser usada para tratar doenças autoimunes (por exemplo, artrite reumatoide, esclerose múltipla e diabetes tipo I) , distúrbios neurológicos (como Alzheimer, ALS e doença de Parkinson), bem como tratamento anti-envelhecimento, cicatrização de feridas e tratamento de doenças cardiovasculares distúrbios. Aproveitar o poder do sistema imunológico para tratar ou prevenir doenças é um dos principais objetivos da imunoterapia. Uma variedade de métodos de imunoterapia e composições foram desenvolvidas para aumentar ou reprimir a resposta imune em pacientes. Os métodos de terapia celular geralmente envolvem anipulaçõesex vivo como proliferação, diferenciação e/ou ativação de células. As células que são mais do que minimamente manipuladas são consideradas drogas biológicas pela United States Food and Drug Administration (USFDA) , bem como agências reguladoras em outras jurisdições. Antes de tais medicamentos biológicos poderem ser comercializados para tratamento ou prevenção de qualquer doença, esses produtos devem primeiro ser investigados em ensaios clínicos em humanos de acordo com uma Solicitação de Medicamento Novo (IND) ou equivalente.
Para uso comercial, os processos utilizados para a fabricação de fármacos biológicas contendo células vivas devem ser padronizados para que as células resultantes tenham critérios pré-determinados de identidade, funcional e de viabilidade. Os processos para causar a proliferação, diferenciação e/ou ativação de células destinadas a serem utilizadas como um medicamento biológico geralmente ocorrem ex vivo onde as células são mantidas em meios de cultura ricos em nutrientes. No entanto, antes de administrar as células aos seres humanos, as células devem ser transferidas para um tampão de infusão não nutriente. Como essas soluções tampão não contêm nutrientes, as células permanecem viáveis apenas por curtos períodos de tempo. Além disso, mesmo que as células permaneçam viáveis depois de serem colocadas em tampão de infusão sem nutrientes, perdem rapidamente a sua identidade e caracteristicas funcionais únicas. Perder a sua identidade e caracteristicas funcionais únicas desqualifica as células para serem usadas como uma droga biológica. Esta limitação exige que as células destinadas ao uso de drogas biológicas devem ser formuladas em ou perto do ponto de atendimento.
As células vivas são relativamente estáveis em meios de cultura ricos em nutrientes. Exemplos de meios de cultura ricos em nutrientes incluem, por exemplo, X-Vivol 5 (BioWhittaker, Walkersville, MD), RPMI 1640, DMEM, Ham F12, McCoys 7A e Médium 199. O meio pode ser suplementado com ingredientes adicionais, incluindo soro, proteínas séricas, supressão de crescimento e substâncias promotoras do crescimento, tais como anticorpos monoclonais mitogénicos e agentes seletivos para selecionar células geneticamente modificadas ou modificadas. No entanto, a transferência das células para tampão não nutritivo, tal como é requerido para administração a um paciente, pode levar a uma rápida degradação da identidade celular, viabilidade celular e caracteristicas funcionais das células. Exemplos de tampões não nutrientes incluem, por exemplo, soluções isotónicas tais como solução salina normal, solução salina tamponada com fosfato, 5% de dextrose, Plasma-Lyte (Baxter Scientific, Deerfield, IL) e Normasol (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) . Além disso, quando as células são transferidas para tampão não nutritivo, geralmente se acredita que os reagentes que fornecem sinais de ativação e/ou diferenciação, bem como outros componentes, tais como moléculas estimulantes ou citoquinas, devem ser removidos antes da transferência para tampão não nutritivo. (Ver, a Patente US 6867041 de Berenson et al.). Portanto, as células em tampão não nutritivo geralmente têm uma vida útil limitada e podem, por exemplo, começar a perder suas propriedades e atividades de identificação em poucos minutos e raramente mantêm suas caracteristicas funcionais e de identidade por mais de algumas horas.
Atualmente, as composições imunoterapêuticas que incluem células vivas geralmente são produzidas em uma instalação cGMP perto do ponto de atendimento do paciente (ver, a Publicação de Patente US 2003/0175242 de Gruenberg). A formulação de fármacos biológicos com células vivas deve ser realizada em condições altamente controladas e estéreis em instalações de cGMP. As células vivas são manipuladas na instalação cGMP e formuladas para infusão num paciente. Uma vez que as células são preparadas para infusão, as células são rapidamente transferidas para o ponto do local de cuidados e administradas ao paciente. A principal desvantagem deste processo é que as instalações do cGMP precisam estar presentes perto de cada sítio do ponto de atendimento. As instalações do cGMP requerem um capital monetário considerável para o pessoal e executado de acordo com as regras e regulamentos necessários. A necessidade de estabelecer uma multiplicidade desses centros em ou perto de cada ponto de atendimento é custo proibitivo e uma limitação severa para o potencial comercial desta classe de droga. Isso leva a uma escolha difícil de incorrer em grandes despesas através da construção de um grande número de instalações cGMP, a fim de aumentar a acessibilidade para os pacientes ou para fornecer acessibilidade limitada para os pacientes, construindo apenas um número limitado de instalações cGMP para minimizar os gastos de capital. Assim, existe uma necessidade no campo da terapêutica com células vivas para métodos que permitem que células em tampão não nutritivo tenham uma vida útil mais prolongada. Além disso, é necessário um método que permita a embalagem, transporte e distribuição em massa de produtos de células formuladas em suspensão em tampão de infusão contendo não nutrientes.
Os problemas com a manutenção da identidade e função das células utilizadas na imunoterapia adotiva após a formulação são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente US 2003/0175272 de Gruenberg. Esta publicação ensina que as células T devem ser reativadas antes da administração do paciente (não mais de 4 horas antes da infusão) para manter as características funcionais da produção de citoquinas. A função das células pode ser mantida até 48 horas somente se a formulação incluir plasma autólogo. No entanto, a recolha de plasma de cada paciente pretendido não é propícia à distribuição e comercialização em massa.
RESUMO
Num primeiro aspeto, esta invenção inclui um método in vitro de manipulação de uma composição de fármaco biológico com células vivas para utilização na imunoterapia, em que as células vivas são células T ativadas que foram ativadas por porções de superfície celular de ligação cruzada por anticorpos monoclonais ou outra ligação agentes, compreendendo o método: - reativar as células vivas; - formulação das células vivas num tampão não nutritivo; - manter as células vivas no tampão não nutritivo a uma temperatura de armazenamento abaixo de cerca de 20°C durante mais de cerca de 6 horas, - em que as células vivas mantêm a sua identidade e, pelo menos, uma característica funcional que definiu as células vivas antes da formulação no tampão não nutritivo, sendo as células vivas úteis para a imunoterapia depois de serem armazenadas durante mais de cerca de 6 horas no tampão não nutritivo.
As células vivas são úteis para imunoterapia após serem armazenadas durante mais de cerca de 72 horas no tampão não nutritivo. De preferência, a temperatura de armazenamento está numa gama entre cerca de 4°C e cerca de 8°C e a concentração das células no tampão não nutritivo é de cerca de 107 células/ml ou superior. Para ativar as células T, é preferível usar anticorpos monoclonais imobilizados reativos às moléculas de superfície celular. De preferência, as moléculas de superfície celular são uma combinação de uma das seguintes substâncias: CD3, MHCI, MHCII, CD2 e segunda uma molécula co estimuladora. De preferência, a molécula co estimuladora é CD28. As células vivas são colocadas num recipiente ou seringa flexível, em que o recipiente ou seringa flexível é embalado num dispositivo com temperatura controlada que mantém as células vivas à temperatura de armazenamento. O método também inclui o transporte e a distribuição da embalagem no dispositivo com temperatura controlada até o ponto de atendimento.
Noutro aspeto, esta invenção inclui um método in vitro de proporcionar uma composição de células vivas para utilização na imunoterapia para um ponto de cuidados, em que as células vivas são células T ativadas que foram ativadas por meio de reticulação de porções de superfície celular por anticorpos monoclonais ou outros agentes de ligação, compreendendo o método: - reativar as células vivas; - formulação das células vivas em um tampão não nutritivo em uma instalação de processamento; e - transportando as células para um ponto de cuidados em uma embalagem equipada para manter uma temperatura de armazenamento abaixo de cerca de 20°C, em que as células vivas estão na temperatura de armazenamento durante mais de cerca de 6 horas enquanto mantêm sua identidade e, pelo menos, uma característica funcional que definiu as células vivas antes da formulação no tampão não nutritivo.
As células vivas estão na temperatura de armazenamento até cerca de 72 horas, mantendo a sua identidade e, pelo menos, uma das caracteristicas funcionais das células vivas úteis na imunoterapia.
Um método de administração de imunoterapia a um paciente está aqui descrito. O método compreende administrar uma composição que inclui células vivas formuladas em tampão não nutritivo, em que a composição foi armazenada até cerca de 72 horas no tampão não nutritivo, em que as células vivas mantêm a sua identidade e, pelo menos, uma das funções funcionais caracteristicas das células que definiram as células vivas antes da formulação no tampão não nutritivo, as células vivas úteis na imunoterapia.
Outro método de administração de imunoterapia a uma patente é aqui descrito. 0 método compreende a administração de uma composição que inclui células vivas formuladas em tampão não nutritivo, em que a composição foi previamente armazenada num estado congelado, por exemplo em azoto liquido, durante até 2 anos ou mais e foi descongelada e formulada e depois armazenada por até cerca de 72 horas no tampão não nutritivo, em que as células vivas mantêm a sua identidade e pelo menos uma das caracteristicas funcionais das células que definiram as células vivas antes da formulação no tampão não nutritivo, as células vivas são úteis em imunoterapia.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. IA é um gráfico da mudança de temperatura no recipiente durante o transporte onde o recipiente não estava precondicionado. A Fig. 1B é um gráfico da temperatura registrada dentro da caixa isolada de aeroginal precondicionada. A Fig. 1C é uma parcela da temperatura do ar durante o transporte.
As Figs. 2A-2C mostram a expressão do CD40L para HTC273, HTC245 e HTC264, respetivamente, células antes e depois da embalagem e do envio.
As Figs. 3A-3C mostra a viabilidade celular de HTC273, HTC245 e HTC264, respetivamente, células antes e depois da embalagem e do transporte.
As Figs. 4A-4C mostram a secreção de IFN-γ de HTC273, HTC245 e HTC264, respetivamente, células antes e depois da embalagem e do transporte.
As Figs. 5A-5C mostram a secreção de IFN-γ de HTC273, HTC245 e HTC264, respetivamente, células antes e depois da embalagem e do transporte seguido de incubação a 37°C durante 6 horas.
As Figs 6A-6C mostram a expressão de células CD40L de HTC273, HTC264 e HTC245, respetivamente, e são formuladas para administração ID, IT e IV.
As Figs. 7A-7C mostram a viabilidade celular para HTC273, HTC264 e HTC245, respetivamente, células formuladas para administração de ID, TI e IV.
As Figs. 8A-8C mostram a secreção de IFN-γ de HTC273, HTC264 e HTC245, respetivamente, células formuladas para administração de ID, TI e IV.
As Figs. 9A-9C mostram a expressão de CD40L de HTC273, HTC264 e HTC245, respetivamente, células formuladas para administração ID, IT e IV e armazenadas durante 24 e 48 horas.
As Figs. 10A-10C mostram a secreção de IFN-γ de HTC273, HTC264 e HTC245, respetivamente, células formuladas para administração ID, IT e IV e armazenadas durante 24 e 48 horas.
As Figs. 11A-11C mostram a viabilidade de HTC273, HTC264 e HTC245, respetivamente, células formuladas para administração de ID, TI e IV e armazenadas por 24 e 48 horas.
As Figs. 12A-12C mostram a expressão de CD40L, viabilidade de células, IFN-γ pelas células HTC264 após 24, 48 e 72 horas de armazenamento. A Fig. 12D mostra a secreção de IFN-γ pelas células HTC264 após 72 horas de armazenamento e incubação a 37°C durante 24 horas.
As Figs. 13A-13C mostram a expressão de CD40L, viabilidade de células, IFN-γ pelas células HTC245 após 24, 48 e 72 horas de armazenamento. A Fig. 13D mostra a secreção de IFN-γ pelas células HTC245 após 72 horas de armazenamento e incubação a 37°C durante 24 horas.
As Figs. 14A-14C mostram a expressão de CD40L, viabilidade de células, IFN-γ pelas células HTC273 após 24, 48 e 72 horas de armazenamento. A Fig. 14D mostra a secreção de IFN-γ pelas células HTC273 após 72 horas de armazenamento e incubação a 37°C durante 24 horas para 3 diferentes lotes de células.
As Figs. 15A-15C mostra a expressão CD40L para CAC e CFB após 48 horas para HTC245, HTC264 e HTC273, respetivamente.
As Figs. 16A-16C mostra a viabilidade celular para CAC e CFB após 48 horas para HTC245, HTC264 e HTC273, respetivamente.
As Figs. 17A-17C mostra a secreção de IFN-γ para CAC e CFB após 48 horas HTC245, HTC273 e HTC264, respetivamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA DE FORMAS DE REALIZAÇÃO ILUSTRATIVAS
Esta invenção refere-se à embalagem, armazenamento e distribuição de produtos de medicamentos biológicos de células vivas formulados em tampão não nutritivo que podem exibir caracteristicas celulares úteis para imunoterapia mesmo após longos períodos de tempo. Estes fármacos biológicos de células vivas podem manter a viabilidade, bem como a identidade pré-determinada e caracteristicas funcionais, mesmo após cerca de 72 horas no tampão não nutritivo.
Em algumas formas de realização exemplares, as células de memória imune Thl usadas como produto biológico podem manter a viabilidade, reter a identidade pré-determinada (CD4+, CD45RO+, CD40Lhi, CD62L10) e recuperar critérios funcionais, como a secreção de IFN-gama> 1000pg/106 células/4h. Essas células de memória Thl imunes podem exibir essas características celulares até, pelo menos, cerca de 72 horas quando formuladas em um tampão não nutritivo com microesferas revestidas com CD3/C28 e mantidas num estado refrigerado.
Os produtos biológicos que incluem as células vivas podem ser embalados em condições ambientalmente controladas para manter as condições de armazenamento desejadas e enviadas em qualquer lugar do mundo para pontos de atendimento por um serviço de correio expresso (por exemplo, Federal Express, United Parcel Service (UPS) e mensageiros internacionais similares). De preferência, a embalagem com as células vivas é armazenada e transportada sob temperaturas de refrigeração. No ponto de cuidado, as células formuladas podem ser removidas da embalagem e administradas a um paciente. As células formuladas permanecem estáveis após a remoção da embalagem refrigerada por até cerca de 6 horas. De preferência, as células são primeiro removidas da embalagem refrigerada no ponto de cuidado e deixadas equilibrar a temperatura ambiente de 1-2 horas antes da administração do paciente. As células transportadas são surpreendentemente estáveis e podem ser usadas para métodos semelhantes como células que não foram armazenadas por longos períodos de tempo. Em alternativa, as células são armazenadas e transportadas em estado congelado até um ponto de atendimento. As células podem ser armazenadas em um estado congelado em um ponto de atendimento e ser formuladas em um sistema estéril fechado automatizado ou semi-automatizado e depois armazenadas no local em um estado refrigerado por até aproximadamente 72 horas antes da administração ao paciente.
As células vivas podem ser qualquer célula que seja mais do que minimamente manipulada, pois esse termo é usado pelo FDA para determinar que o produto celular é uma droga biológica que exige avaliação em seres humanos somente sob uma Aplicação de Medicamentos novos (IND) ou equivalente e fabricada sob Boas Práticas de fabricação (GMP) de acordo com 21 CFR partes 211, 606 e 820, conforme aplicável.
As células vivas podem ser de um único tipo ou uma mistura, desde que tenham definido critérios identitários e funcionais. As células podem ser naturais ou projetadas, derivadas de dadores autólogos, alogénicos e/ou xenogénicos. Enquanto as células vivas são o ingrediente ativo do fármaco biológico, outras substâncias podem ser adicionadas às células, tais como proteínas biologicamente ativas, péptidos, produtos químicos, nucleotídeos (ARN, ADN) e/ou dispositivos. As células podem ser suspensas livremente na formulação ou ligadas a uma superfície ou dispositivo ou encapsuladas em um dispositivo ou material. As células devem ser destinadas a tratar ou prevenir a ocorrência de uma doença ou condição. As células podem ser infundidas, injetadas ou implantadas em qualquer local do corpo.
Por características funcionais, pretende-se incluir uma variedade de funções, particularmente funções imunológicas e funções de diferenciação realizadas pelas células e úteis na imunoterapia e na terapia com células estaminais. Essas funções imunológicas podem incluir, por exemplo, a secreção de moléculas, a expressão de porções de superfície celular, o reconhecimento de moléculas, a capacidade de responder a moléculas e crescer e/ou se transformar em um tipo de célula particular ou fazer com que outras células do corpo cresçam, mudem, morram ou de certa forma alterem a função normal ou doença, bem como outras funções de diferenciação imunológica e celular conhecidas na técnica. As funções imunológicas podem ser processos ou cascatas de processos ou produção de moléculas envolvidas na resposta inata e/ou adaptativa do sistema imune ou modulação da resposta imune adaptativa ou inata. As funções podem estar relacionadas às funções imunológicas mediadas por células e/ou ao sistema humoral, tanto imunoestimuladoras como imunossupressoras. As características funcionais podem estar relacionadas à memória imunológica ou relacionadas à distinção entre auto-antígenos e não-auto, ou reconhecimento de agentes patogénicos, como bactérias, virus ou fungos, bem como tumores ou outras células ou tecidos anormais ou indesejáveis. Outras funções podem estar relacionadas a moléculas de superfície que medeiam funções como o tráfico para um órgão ou tecido ou local particular, moléculas de superfície que bloqueiam, promovem ou modulam as respostas imunes ou permitem a diferenciação para um tipo de célula particular.
Esta divulgação descreve produtos farmacológicos biológicos que incluem células vivas formuladas em tampão não nutritivo como ingrediente ativo. Em algumas formas de realização, as células são células imunes vivas que podem ser usadas para imunoterapia ou terapia com células estaminais. As composições são estáveis em tampão não nutritivo durante, pelo menos, cerca de 6 horas à temperatura ambiente e durante, pelo menos, cerca de 24, de preferência, pelo menos, cerca de 48, e mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 72 horas a temperaturas de refrigeração. Surpreendentemente, as células vivas nas composições podem manter sua identidade, viabilidade e características funcionais que exibiram em meio contendo nutrientes mesmo após a formulação em tampão não nutritivo. As composições aqui descritas podem ser embaladas e, vantajosamente, ser enviadas e distribuídas usando mensageiros comerciais em recipientes que mantêm as condições de armazenamento apropriadas de uma instalação de processamento para um ponto de atendimento. Tais capacidades podem resultar em economias substanciais de mão-de-obra, tempo e dinheiro na produção e administração de composições terapêuticas contendo células vivas. Além disso, a acessibilidade das composições terapêuticas de células vivas para pacientes é grandemente aprimorada, uma vez que uma instalação de processamento pode produzir, distribuir e distribuir as células para qualquer ponto do local de atendimento no mundo.
Esta descrição também descreve métodos de manutenção de suspensões de células vivas por longos períodos de tempo em tampão não nutritivo. Os métodos incluem transferir as células vivas para tampão não nutritivo e armazená-las a uma temperatura de armazenamento mais fria. Em algumas formas de realização, as composições de células vivas são armazenadas em condições de refrigeração. Quando desejado, as composições são removidas do armazenamento e colocadas à temperatura ambiente por um período de tempo. Em algumas formas de realização, as características funcionais das células vivas são substancialmente recuperadas após as suspensões de células vivas serem colocadas aproximadamente a temperatura ambiente por um período de tempo. Em outras formas de realização, as características funcionais das células vivas são substancialmente recuperadas após as suspensões de células vivas terem sido colocadas em condições fisiológicas durante um período de tempo.
As composições terapêuticas aqui descritas incluem células vivas. Por células vivas, entende-se que> 70% das células são viáveis, tal como determinado por técnicas de ensaio apropriadas tais como a extrusão de azul de tripano, MTT ou deteção bioluminescente dos níveis de ATP de tal modo que as células são capazes de manipulações ex vivo tais como expansão, diferenciação e/ou ativação em condições apropriadas. As composições, no entanto, podem incluir algumas células inativadas, células irradiadas e/ou células não viáveis. As células vivas podem ser derivadas de várias fontes incluindo, por exemplo, linhas celulares imortalizadas, culturas de células primárias, fluidos biológicos, tecidos, sangue do cordão umbilical, sangue periférico, medula óssea, aliquotas congeladas de células e semelhantes. Células vivas derivadas de outras fontes que são capazes de manipulações ex-vivo como descrito acima também estão dentro do escopo da invenção.
As células na composição terapêutica podem ser células alogénicas. As células derivadas, por exemplo, de sangue ou medula de dadores alogénicos podem ser processadas da maneira desejada e depois formuladas para infusão em um paciente. A formulação de infusão colocada em uma seringa ou pacote de transferência ou outro dispositivo adequado para a manutenção de produtos de uso humano pode ser embalada e enviada para o local do ponto de atendimento para administração do paciente. Em alternativa, as células na composição terapêutica podem ser células autólogas que foram manipuladas, formuladas, embaladas e enviadas e devem ser reinfundidas no mesmo paciente. As células vivas também podem ser derivadas de uma fonte não humana e foram manipuladas, formuladas, embaladas e enviadas para administração humana (xenogénica).
Numa forma de realização em que as células vivas nas composições são células imunitárias, estas células imunes podem incluir células derivadas de medula óssea ou sangue do cordão umbilical, granulócitos, tais como neutrófilos, basófilos e eosinófilos. As células imunes também podem ser monócitos, macrófagos, células dendriticas, células assassinas naturais, linfócitos incluindo células B, células T e células NKT. As células T podem ser, por exemplo, células CD4+ (incluindo células ThQ, Thl, Th2, Thl7 e Treg) e/ou células CD8 + (Tcl e Tc2).
Um método de imunoterapia para aumentar a resposta imune celular em indivíduos é um tipo de terapia celular chamada imunoterapia adotiva. Uma terapia celular é uma droga cujo ingrediente ativo é total ou parcialmente uma célula viva. A imunoterapia adotiva é uma terapia celular que envolve a remoção de células imunes de um sujeito, o processamento ex vivo (isto é, ativação, purificação e/ou expansão das células) e a posterior infusão das células resultantes voltadas para o mesmo sujeito (terapia autóloga) ou em um sujeito diferente (terapia alogénica). 0 produto de fármaco biológico pode incluir células vivas que foram manipuladas usando uma variedade de manipulações ex vivo para imunoterapia adotiva. As células vivas que foram manipuladas ex vivo podem incluir, por exemplo, células LAK (Rosenberg Patente US 4690915), Células TIL (Rosenberg Patente US 5126132), células T citotóxicas (Cai, et al. Patente US 6255073; Celis, et al. Patente US 5846827), células de nódulos linfáticos de drenagem de células expandidas (Terman Patente US 6251385), várias preparações de linfócitos (Bell, et al. Patente US 6194207; Ochoa, et al. Patente US 5443983; Riddell, et al. Patente US 6040180; Babbitt, et al. Patente US 5766920; Bolton Patente US 6204058), células CD8+ TIL (Figlin et al. (1997) Journal of Urology 158: 740), células T CD4+ ativadas com anticorpo monoclonal anti-CD3 na presença de IL-2 (Nishimura (1992) J. Immunol. 148: 285), células T co-activadas com anti-CD3 e anti-CD28 na presença de IL-2 (Garlie et al. (1999) Journal of Immunotherapy 22: 336) células T CTL CD8+ específicas de antigénio produzidas ex vivo e expandidas com anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 (mAb) na presença de IL-2 (Oelke et al. (2000) Clinicai Câncer Research 6: 1997) e a injeção de células tumorais autólogas irradiadas misturadas com Bacille Calmette-Guerin (BCG) para vacinar os indivíduos seguidos sete dias depois por recuperação de células T de linfonodos drenantes que são ativadas com mAb anti-CD3 seguido de expansão em IL-2 (Chang et al. (1997) Journal of Clinicai Oncology 15:796).
Numa forma de realização exemplar, a composição terapêutica desta descrição inclui pelo menos algumas células T, de preferência células T alogénicas. Estas células T também são preferencialmente ativadas através da ativação da superfície celular para formar células de memória Thl ativadas. As células T podem ser ativadas de várias maneiras, incluindo a utilização de anticorpos monoclonais imobilizados específicos para moléculas de superfície de células T. As células T ativadas adequadas são, por exemplo, descritas na Patente US 7435592.
As células preferencialmente têm porções de superfície celular que são reticuladas por anticorpos monoclonais ou outros agentes de ligação. Estes anticorpos monoclonais e/ ou agentes de ligação são de preferência reticulados por, por exemplo, imobilização numa superfície sólida para ativar as células T. Estas são referidas aqui como células ativadas em cultura (CAC) . Estes CAC preparados ex vivo podem ser congelados para uso futuro ou formulados para perfusão.
Em formas de realização preferidas, o CAC preparado ex vivo é armazenado congelado até ser necessário para a administração do doente. Antes da administração ao doente, o CAC é descongelado, lavado e reativado em meio nutriente por ligação cruzada das porções de ligação à superfície celular tais como CD3 e CD28 como descrito, por exemplo, na Patente US 7402431. O CAC, juntamente com o agente de reticulação, pode então ser lavado e transferido para um tampão não nutritivo, tal como um tampão de formulação. As células reativadas no tampão de formulação são aqui referidas como células no tampão de formulação (CFB) . 0 CFB pode ser administrado ao paciente para fins terapêuticos. Geralmente, essas células reativadas, uma vez transferidas para tampão não nutritivo, têm uma vida útil limitada. As células vivas podem ser formuladas com uma densidade de, pelo menos, cerca de IO6 células por ml, de preferência a cerca de 107 células por ml ou superior. Em algumas formas de realização, as células vivas podem ser formuladas a uma densidade de cerca de 108 células por ml ou superior. A concentração especifica das células pode ser determinada pelo uso especifico das células e pelo protocolo terapêutico. A composição terapêutica pode também incluir uma série de outros componentes. Esses componentes podem incluir, por exemplo, agentes que mantêm as células vivas no estado de ativação desejado. Numa forma de realização exemplar, a composição terapêutica pode incluir agentes que mantêm as células T num estado ativado tal como Dynabeads ClinExVivo™ descrito abaixo nos Exemplos. A presente invenção inclui métodos para armazenar e manipular as composições de células vivas para aumentar a vida útil. A vida de prateleira, tal como aqui utilizado, é definida como a quantidade de tempo após a formulação que o CFB mantém viabilidade, identidade pré-definida e caracteristicas funcionais. Geralmente, as células são transferidas para tampão não nutritivo apropriado para infusão em um paciente. As células podem estar em uma variedade de tampões não nutritivos. 0 tampão não nutritivo, como referido aqui, é qualquer tipo de meio, tampão ou outro liquido que não possui os componentes apropriados para suportar proliferação e/ou expansão celular. Os tampões não nutritivos geralmente são isotónicos, USP estéril, sem pirogénio e contêm os componentes apropriados e/ou sistema de tampão para manter as células vivas intactas e são licenciadas para uso parenteral humano. Numa forma de realização exemplar, o tampão não nutritivo é um tampão de formulação que é Plasmalyte A (Baxter Scientific, Deerfield, IL) com 1% de albumina de soro humano. (McKesson, São Francisco, Califórnia)
Em formas de realização com células ativadas, particularmente células Thl ativadas, os sinais de ativação para as células são mantidos mesmo quando as células são transferidas para o tampão não nutritivo. Por exemplo, em formas de realização em que as células são ativadas por ligação cruzada das porções de ligação à superfície celular, a reticulação é de preferência mantida no tampão não nutritivo. A manutenção da reticulação durante o armazenamento pode ser fundamental para restaurar as caracteristicas funcionais da composição após a remoção do armazenamento. As composições de células em que os componentes de ativação são removidos em tampão não nutritivo não se recuperam do mesmo modo que as células que mantiveram o estado ativado.
Os métodos aqui descritos também incluem o tratamento das células vivas após as células serem transferidas para um tampão não nutritivo. A composição das células vivas pode ser transferida para um ambiente com uma temperatura mais fria para armazenamento, a fim de aumentar a vida útil das composições. A temperatura mais fria a que as células em tampão não nutritivo são transferidas é aqui referida como a temperatura de armazenamento. As células são geralmente transferidas para a temperatura de armazenamento o mais rápido possível depois de serem colocadas no tampão não nutritivo. As células são preferencialmente transferidas para a temperatura de armazenamento em menos de cerca de seis horas após serem colocadas em tampão não nutritivo, mais preferencialmente em menos de cerca de quatro horas após serem colocados em tampão não nutritivo. Em formas de realização ainda mais preferidas, A temperatura de armazenamento em que as composições podem ser mantidas varia, mas geralmente é inferior a cerca de 20"C. De preferência, as células são armazenadas a temperaturas de refrigeração. As temperaturas de refrigeração podem estar entre a faixa de cerca de -2°c e cerca de 12°C. Mais preferencialmente, as células são armazenadas a uma temperatura entre acima de 0°C e cerca de 10°C. Mais preferencialmente, as células são armazenadas entre cerca de 4°C e cerca de 8°C.
As composições aqui descritas também podem ser embaladas, enviadas e distribuídas a partir de uma instalação de fabricação ou processamento para um local de atendimento. Uma instalação de fabricação ou processamento pode ser uma instalação, como um hospital, clínica ou qualquer instalação de produção capaz de lidar com células vivas para medicamentos biológicos de acordo com as diretrizes estabelecidas. Um ponto de atendimento pode ser um hospital, clínica ou qualquer outro local em que um paciente geralmente seja administrado com cuidado. As composições são geralmente embaladas para envio de uma maneira que mantém as composições dentro da faixa de temperatura de armazenamento indicada acima. As células podem ser armazenadas e enviadas em uma variedade de recipientes. As células podem ser armazenadas e enviadas, por exemplo, para um recipiente flexível, seringa e similares. Ao enviar, o recipiente, tal como uma seringa, pode ser colocado numa embalagem tal como uma caixa isolada. A embalagem ou caixa é, de preferência, precondicionada à temperatura de armazenamento desejada antes do recipiente com as células vivas colocadas na embalagem. As composições, por exemplo, podem ser embaladas em caixas embaladas de gelo ou aerogel. Os pacotes são, de preferência, caixas isoladas que são capazes de manter as temperaturas de armazenamento desejadas, independentemente da temperatura externa. As caixas também são preferencialmente precondicionadas, o que significa que elas foram armazenadas ou ajustadas à temperatura desejada antes do recipiente com as células vivas colocadas no interior. Em formas de realização preferidas, as embalagens são precondicionadas antes da colocação do produto biológico e os pacotes são transportados sob condições de refrigeração ou congelamento até o ponto de cuidado. Qualquer tipo de método de transporte pode ser usado, mas em formas de realização exemplares, o transporte é feito por mensageiros comerciais. A vida útil das composições aqui descritas pode ser surpreendentemente estendida quando as composições são armazenadas dentro da faixa de temperatura de armazenamento. A vida útil das composições de células vivas pode ser prolongada por mais de cerca de 6 horas. De preferência, a vida útil das composições de células vivas pode ser prolongada por mais de cerca de 24 horas, e mais preferencialmente durante mais de cerca de 48 horas. Em formas de realização ainda mais preferidas, a vida útil das composições pode ser prolongada até cerca de 72 horas. Na forma de realização mais preferida, a vida útil pode ser prolongada até cerca de 120 horas. A superfície da prateleira de mais de cerca de 120 horas também está dentro do âmbito desta invenção.
As composições celulares em tampão não nutritivo armazenado de acordo com os métodos aqui descritos podem manter sua viabilidade, identidade e função durante o período de armazenamento e após a remoção do armazenamento. A viabilidade das células pode ser determinada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluem técnicas de ensaio tais como extrusão de azul de tripano, MTT, 7-Amino-Actinomicina D ou deteção bioluminescente dos niveis de ATP. A identidade das células pode ser confirmada por uma variedade de métodos. As células podem ser testadas para uma variedade de marcadores celulares externos e internos que são indicativos do tipo de célula particular na composição. Marcadores externos são categorizados pela designação de Cluster de anticorpos monoclonais (cluster de diferenciação (CD) designadas de 1 a 8 workshops sobre antígenos internacionais de diferenciação de leucócitos humanos com número total de (247) CDs. Os leucócitos expressam distintos sortidos de moléculas nas suas superfícies celulares, muitas das quais refletem diferentes estágios de sua diferenciação especifica de linhagem ou diferentes estados de ativação ou inativação. As moléculas de superfície de células leucocitárias são rotineiramente detetadas com anticorpos monoclonais anti-leucócitos (mAbs). Usando uma combinação diferente de mAbs, é possível traçar os imunofenotipos da superfície celular de diferentes subpopulações de leucócitos, incluindo as subpopulações de linfócitos maduras funcionalmente distintas de células B, células T auxiliares (Th), células T citotóxicas (Tc) e células Natural Killer (NK).
Mesmo após o armazenamento em meios não nutritivos, as células vivas na composição exibem as características funcionais que estavam presentes antes da formulação no meio não nutritivo. As características funcionais podem incluir uma variedade de atividades, incluindo, por exemplo, a expressão de moléculas funcionais como CD40L, FasL, perforina e granzymeB, moléculas coestimuladoras 4-lBBL, CD28, CTLA4 e citoquinas induzidas por ativação relacionadas ao TNF (TRANCE) Família TWEAK, PD-1, B7, moléculas de adesão, como integrinas, caderinas e selectinas e secreção de uma variedade de citoquinas e quimiocinas e expressão de recetores para essas citoquinas e quimiocinas. Citoquinas e quimiocinas são proteínas segregadas redundantes com crescimento, diferenciação, e funções de ativação que regulam e determinam a natureza das respostas imunes e controlam o tráfico de células imunes e a disposição celular dos órgãos imunológicos. As citoquinas podem incluir, por exemplo, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, GMCSF, IFN-gama e semelhantes.
Em algumas formas de realização, as características funcionais são mantidas após a formulação e ao longo do armazenamento e os níveis das enzimas ou dos marcadores podem ser ensaiados logo após a remoção do armazenamento e do transporte. Por exemplo, a expressão CD40L pode ser ensaiada depois que as composições são removidas do armazenamento e deixadas a incubar à TA durante cerca de 2 horas. A expressão CD40L pode ser semelhante aos níveis de expressão CD40L no momento da formulação e armazenamento. Veja, por exemplo, Figs. 2A-2C. De modo semelhante, o número de células viáveis nas composições pode ser determinado após a remoção do armazenamento e incubação à TA durante cerca de 2 horas. 0 número de células viáveis pode ser semelhante aos níveis de viabilidade celular no momento da formulação e armazenamento. Veja, por exemplo, Figs. 3A-3C.
Em outras formas de realização, as características funcionais podem ser recuperadas após as células serem expostas a condições fisiológicas. Isso pode indicar que as composições celulares, após a infusão em um paciente, podem funcionar como pretendido e segregar ou expressar componentes característicos das células no momento da formulação. A secreção de IFN-γ, por exemplo, pode ser deprimida quando as células são formuladas e colocadas em armazenamento. IFN-gama pode ser aqui referida como IFN-γ ou IFN-g. 0 retorno das células à temperatura ambiente não restaura a secreção de IFN-g, mas a incubação das células a 37°C durante 24 horas aumenta a secreção do IFN-γ em níveis semelhantes aos níveis no momento da formulação. Veja, por exemplo, Figs. 12D, 13D e 14D. Vantajosamente, a diminuição dos níveis de IFN-y durante o armazenamento pode evitar o esgotamento dos recursos celulares. Se os recursos celulares para secreção forem suficientemente preservados durante o armazenamento, então as células geralmente podem reiniciar a secreção do IFN-γ em condições fisiológicas apropriadas. Assim, a administração da composição a um paciente pode ainda proporcionar ao paciente o IFN-γ e outras citocinas inflamatórias derivadas como resultado da administração da composição terapêutica, mesmo que a composição tenha sido armazenada durante um período prolongado de tempo anterior para a administração. A extensão da vida útil das composições pode ser demonstrada de várias maneiras. Tal como aqui utilizado, a extensão da vida útil pode referir-se às células vivas nas composições mantendo a sua viabilidade, identidade e as suas características funcionais mesmo após os tempos de armazenamento prolongados descritos acima. Geralmente, após armazenamento durante pelo menos 24 horas, as composições mantêm, pelo menos, cerca de 50 por cento da atividade de uma característica definidora em tampão não nutritivo em relação à atividade no momento da formulação. De preferência, pelo menos, cerca de 75 por cento e mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 85 por cento e ainda mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 90 por cento da atividade é mantida após o armazenamento em relação à atividade no momento da formulação.
Em formas de realização preferidas, após armazenamento durante, pelo menos, 48 horas, as composições mantêm, pelo menos, cerca de 50 por cento da atividade de uma caracteristica definidora em tampão não nutritivo em relação à atividade no momento da formulação. De preferência, pelo menos, cerca de 75 por cento e mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 85 por cento e ainda mais preferencialmente, pelo menos, cerca de 90 por cento da atividade é mantida após o armazenamento em relação à atividade no momento da formulação.
As composições celulares podem ser administradas a um paciente usando uma variedade de métodos. As composições podem ser administradas por via intradérmica, intravenosa, intratecal, intratumoral e semelhantes.
EXEMPLOS
Materiais: CD40L conjugado com PE foi adquirido de Beckman Coulter, Brea, CA. 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) (lOOOx) foi adquirido da Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI. PlasmaLyte A foi adquirido da Baxter Scientific, Deerfield, IL. A albumina de soro humano (HSA) foi adquirida da McKesson, San Francisco, Califórnia. FcR Binding Inhibitor foi adquirido da eBioscience, San Diego, CA. Dynabeads ClinExVivo ™ foi adquirido da Invitrogen, Carlsbad, CA.
Preparação de células no taspâo de formulação (CFB) - As células ativadas em meio de cultura (CAC) foram colocadas em meio de cRPMI para lavagem. O tempo foi registado para indicar o inicio do protocolo de formulação. As células em meio de cRPMI foram centrifugadas, o sobrenadante foi removido e as células foram ressuspensas em tampão de cRPMI. A viabilidade celular foi determinada usando ensaios de Trypan Blue. 0 número total de células e a concentração de células vivas foram utilizadas para determinar a percentagem de células viáveis. Se a amostra tivesse mais de 80 por cento de viabilidade celular, então o procedimento foi continuado para reativação e formulação de células.
As células CAC foram ressuspensas a uma concentração de 1 x 107 células/ml. A reativação foi feita numa concentração de células vivas de 1 x 107 células/ml. A reativação foi feita em uma placa de 24 poços, uma placa de 6 poços ou um frasco de 75 cm3 dependendo do volume. Foram adicionados Dynabeads ClinExVivo™ CD3/CD28 para reativar as células e incubadas a 36-38eC e 5% de CO2 durante 4 horas. Após a incubação durante cerca de 4 horas, as células foram removidas e transferidas para 50 ml. tubo com tampão de formulação final (FFB) . FFB é PlasmaLyte A com 1% de HSA. As células reativadas foram centrifugadas, o sobrenadante foi removido e ressuspenso em FFB. Estas são referidas como células no tampão de formulação (CFB). O CFB foi ressuspenso em FFB a uma concentração de 107 células por ml. O CFB foi ressuspenso para administração de ID, IT ou IV. Adicionou-se 1 ml da suspensão celular a uma seringa de 3 ml como uma formulação ID. A formulação de TI e IV foi de 3 ml e 5 ml, respetivamente. As seringas com as formulações apropriadas foram armazenadas em refrigeração com uma temperatura média de cerca de 4°C.
Colheita de amostras após o armazenamento - As células e o sobrenadante foram coletados em diferentes pontos de tempo. Os pontos de tempo foram os seguintes: 0 (inicial); 2 horas à temperatura ambiente (RT) ; 48 horas a 4eC; e 48 horas a 4°C seguido de 2 horas de RT.
Em cada ponto do tempo, as suspensões de células de 100 pl foram recolhidas e as células foram centrifugadas a 400 g durante 5 min a 4°C. O sobrenadante foi então transferido para outro tubo para a deteção de IFN-γ mais tarde utilizando ELISA. As células foram ressuspensas em tampão de coloração 150ul para cirtometria de fluxo. Em algumas experiências, as células foram ressuspensas em meio cRPMI de 100 μΐ e cultivadas na incubadora a 37°C durante 24 h com 5% de CO2. O sobrenadante foi tomado após 24 h de incubação e o IFN-γ foi detetado por ELISA.
Cirtometria de fluxo (CD40L e 7-AAD) - A suspensão de células 50ul foi transferida de acima (150 μΐ) em 3 tubos eppendorf, rotulados como não corados, CD40L e 7-AAD, respetivamente. O tubo não manchado foi incubado em gelo durante 20 min. Para 0 tubo CD40L, as células foram pré-incubadas com inibidor de ligação FcR de acordo com as instruções do fabricante durante 20 minutos em gelo. Em seguida, adicionou-se tampão de coloração com 40 μΐ (PBS + FBS a 1%) e anticorpo 10-jun PE-CD40L na suspensão celular e incubou-se durante 20 minutos adicionais em gelo no escuro. A viabilidade celular foi testada por cirtometria de fluxo de 7-AAD. 7-AAD intercala em DNA de células mortas ou danificadas, portanto, a determinação de células positivas de 7-AAD é um indicador da viabilidade celular. Para tubos de 7-AAD, os tubos foram centrifugados a 400 g durante 5 min a 6°C. Após a remoção do sobrenadante, as pastilhas celulares foram ressuspensas em solução de 100 μΐ lx 7-AAD. O tubo foi incubado em gelo durante 15 minutos no escuro. Adicionou-se 1 ml de tampão de coloração ao tubo CD40L e depois os 3 tubos foram centrifugados em conjunto. Após o descarte do sobrenadante, os grânulos de células foram ressuspensos em 0,4 ml de tampão de coloração e FACS foi executado. ELISA IFN-γ - O IFN-γ segregado no sobrenadante foi determinado pelo kit ELISA em sanduíche IFN-γ (R & D Systems, Mpls MN) de acordo com as instruções do fabricante.
Exemplo 1- Esta experiência foi feito para determinar se as células no tampão de formulação (CFB) são estáveis a baixas temperaturas após o transporte. Os lotes de suspensões celulares foram formulados em FFB e transportados através de um serviço de correspondência {Federal Express) . A temperatura foi monitorizada por um registador de dados. A mudança de temperatura dentro de uma caixa que não foi precondicionada e uma caixa isolada de Airgel precondicionada foi monitorizada. A temperatura externa também foi monitorizada. Três lotes diferentes foram formulados e transportados. Foram retiradas amostras de sobrenadantes de células ativadas em meio de cultura (CAC), CFB logo após a formulação, CFB após 2 horas à temperatura ambiente (RT) , CFB após 48 horas a 4°C e CFB após 48 horas a 4°C e 2 horas a RT. 0 CAC foi testado quanto à expressão de CD40L e as células restantes foram testadas quanto à expressão de CD40L e a viabilidade das células. A Fig. IA e a Fig. 1B mostram a temperatura à qual as células foram submetidas durante o transporte. A Fig. IA mostra que a temperatura variou de cerca de 5°C a cerca de 13,7°C dentro de cerca de 48 horas quando as amostras não foram embaladas numa caixa precondicionada. As amostras foram estáveis, indicando que uma flutuação de temperatura mais ampla é aceitável. A Fig. 1B mostra que a temperatura dentro da caixa precondicionada e isolada permanece bastante estável. Variou de 0,2°C a 2,2°C. A Fig. 1C mostra a variação da temperatura externa durante o período de envio. A Fig. 2A-2C mostra que a expressão de CD40L não mudou muito. A Fig. 3A-3C mostra a viabilidade celular após o processo de envio ser semelhante à viabilidade celular antes do envio. Estes resultados indicam que manter as composições terapêuticas dentro de uma gama ampla como cerca de 2°C a cerca de 13°C dentro da embalagem não era prejudicial.
Exemplo 2 - Este estudo foi realizado para determinar se a baixa temperatura pode prolongar a expiração do CFB. A estabilidade das diferentes formulações de CFB na RT foi realizada. 0 CFB foi formulado para administração intradérmica (ID), intratumoral (TI) ou intravenosa (IV) como descrito acima. A estabilidade destas formulações foi testada para ver se a estabilidade a baixa temperatura pode ser estendida.
Os lotes HTC264, HTC245 e HTC273 foram formulados para identificação, TI e IV e testados quanto â expressão de CD40L, viabilidade celular e secreção de IFN-γ durante 6 horas à RT após a formulação. A Fig. 6A-6C, Fig. 7A-7C e Fig. 8A-8C mostram os resultados destes testes. Todos os três desses parâmetros são estáveis após 6 horas na RT. A Fig. 9A-9C mostra que a expressão de CD40L é estável após armazenamento durante 48 h a 4eC. A Fig. 11A-11C indica que a viabilidade celular é estável após armazenamento durante 48h a 4°C. A Fig. ΙΟΑ-Fig. 10C indica que a secreção de IFN-γ não se recupera também após 48 horas a 4°C. No entanto, como mostrado abaixo, isso pode ser recuperado transferindo de volta para RPMI e incubando a 37°C durante 24 horas.
Três lotes (HTC264, HTC245 e HTC273) foram formulados como formulações ID, IV ou IT. Foram feitas 4 seringas totais de cada formulação (1 para RT, 1 para 24h 4°C, 1 para 48h 4°C, 1 para 72h 4°C) e incubadas a 4°C por diferentes períodos de tempo. As amostras foram recolhidas após incubação de volta à RT por 2 horas. A Tabela 1 abaixo mostra os pontos de tempo, amostras e testes que foram realizados para cada lote de células. Os níveis de IFN-γ também foram determinados quando as células foram incubadas a 37°C durante 24 horas. TABELA 1
A Fig. 12A-12D, Fig. 13A-13D e Fig. 16A-14D mostra os resultados para os lotes HTC264, HTC245 e HTC273, respetivamente. As formulações intradérmicas desses lotes foram testadas conforme indicado. Os resultados mostraram que manter o CFB a 4°C pode manter a expressão de CD40L na superfície celular mesmo após 72h (Fig. 12A, Fig. 13A e Fig. 16A) . A viabilidade celular não foi muito afetada pelo armazenamento de baixa temperatura (Fig. 12B, Fig. 13B e Fig. 16B) . Os níveis de secreção de IFN-γ (Fig. 12C, Fig. 13C e Fig. 16C) são deprimidos quando as células são devolvidas à RT por apenas 2 horas. No entanto, os níveis de IFN-γ recuperam (Fig. 12D, Fig. 13D e Fig. 14D) quando as células são transferidas de volta para meio RPMI e incubadas a temperatura fisiológica (37°C) durante 24 horas. Isso indica que as células ainda são capazes de segregar IFN-γ após manter a baixa temperatura por 72 horas.
Exemplo 3 - Este experimento foi feito para comparar a estabilidade das células CAC e das células CFB. Três diferentes lotes de células foram formulados como seringas ID. Uma seringa para CAC e uma seringa para CFB para cada lote. 0 CAC foi descongelado e lavado com cRPMI. Após a contagem de células, o sedimento celular foi ressuspenso em 109 células/ml com FFB e 1 ml de suspensão celular foi transferido para uma seringa de 3 ml. Para CFB, o sedimento celular foi ressuspenso em 109 células/ml com cRPMI e misturado com as pérolas anti-CD3/anti-CD28. A mistura de células e grânulos foi incubada durante 4 horas a 37°C com 5% de CO2. As células foram lavadas com FFB e ressuspensas em 107 células/ml com FFB. A suspensão celular foi transferida para uma seringa de 3 ml. Em cada ponto do tempo, foram obtidas amostras de 100 μΐ da seringa para CD40L, IFN-γ, testes de viabilidade. Após a incubação a 4°C durante 48 horas, algumas amostras foram centrifugadas a 400 g durante 5 min. para remover o FFB. Após o descarte do sobrenadante, o sedimento celular foi ressuspenso em 100 μΐ de cRPMI e incubado a 37°C com 5% de CO2 durante 2 horas. O sobrenadante foi coletado para deteção de IFN-γ. A Tabela 2 abaixo lista as amostras que foram recolhidas e os testes que foram realizados. TABELA 2
Os resultados indicaram que a incubação de CAC durante 4 horas durante 48 horas diminuiu significativamente a expressão de CD40L na superfície celular. Veja a Fig. 15A-15C. No entanto, a incubação de CFB a 4°C durante 48 horas poderia manter a expressão de CD40L sugerindo que a reticulação de CD3 e CD28 são essenciais para a estabilidade das células. 0 CFB é capaz de manter a viabilidade e segregar grandes quantidades de IFN-γ, mesmo após 48 horas de incubação a 4°C. Veja as Figs. 16A-C e Figs. 17A-C.
Exemplo 4 - Este estudo foi realizado para determinar a estabilidade do CFB formulado após a embalagem e o embarque de uma instalação de produção em Jerusalém, Israel para um ponto de atendimento. Foi crucial confirmar que o produto CFB continua a atender a identidade pré-estabelecida e caracteristicas funcionais após 72 horas em trânsito, uma vez que no final do processo de formulação, as células são transferidas para um buffer de infusão não nutritivo, no qual as células podem perder suas viabilidade e identidade única e caracteristicas funcionais. Sabe-se que as baixas temperaturas podem retardar a expressão e a atividade dos genes das células e que essa expressão génica pode ser restaurada retornando as células de volta à temperatura fisiológica. Por este motivo, o transporte é feito usando recipientes pré-validados, refrigerados e com temperatura controlada.
As células CFB foram testadas para verificar se suas caracteristicas pré-definidas de identidade e funcional são mantidas após 72 horas de trânsito, comparando as caracteristicas das células de trânsito prévio (em seringas formuladas por linha de base após 4 h de ativação = FF) para aquelas obtidas após o envio para NY e de volta, no minimo 72 horas após a conclusão do FF.
Os parâmetros do ponto final pré-definidos foram: 1. Teste de viabilidade: a viabilidade do CFB deve ser> 70% de células vivas em todos os pontos de tempo testados. 2. Teste de Endotoxina Rápida: os níveis de endotoxina da amostra coletada na linha de base e após 72h a 4°C devem ser <0,5Eu/ml. 3. Mancha de Gram: nenhuma bactéria deve ser observada no slide de amostras recolhidas em todos os pontos de tempo testados. 4. Coloração da superfície - CD40L AM (CFB-CAC) ^30: 5. USP Esterilidade: sem crescimento da amostra formulada em todos os meios testados. 6. A secreção de IFNy testada por ELISA: 6.1 IFNy acumulado durante 4 horas de ativação> lOOOpg IFNy por 1 x 106 6.2 IFNy acumulado durante 24h após Linha de base> 6,000pg por 1 x 106 células 6.3 IFNy acumulado durante 24h após 72h a 2°C-8°C> 6000pg por 1 x 106 células
Resultados: 3 processos de formulação final separados foram realizados em doses do lote HTC300. O produto formulado, embalado em seringas, foi enviado com Flying Cargo (FC) para NY, e de volta a Jerusalém, Israel.
As seringas em trânsito foram mantidas a 2-8°C, desde o tempo de término da formulação até 72 horas, conforme demonstrado pelo registrador de temperatura dentro da embalagem de envio. Todos os resultados estão resumidos na Tabela 3. TABELA 3
Como pode ser visto na Tabela 3, os três lotes formulados passaram todos os critérios de aceitação pré-definidos, demonstrando assim a estabilidade do CFB em condições de distribuição sugeridas.
Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a formas de realização preferidas, os trabalhadores experientes na técnica reconhecerão que as mudanças podem ser feitas na forma e no detalhe sem se afastar do escopo da invenção como definido nas reivindicações anexas.

Claims (16)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de manipulação in vitro de uma composição de fármaco biológico com células vivas para utilização na imunoterapia, em que as células vivas são células T ativadas que foram ativadas por porções superficiais celulares de ligação cruzada por anticorpos monoclonais ou outros agentes ligantes, compreendendo o método: reativar as células vivas; formulação das células vivas em um tampão não nutritivo; manter as células vivas no tampão não nutritivo a uma temperatura de armazenamento abaixo de cerca de 20 °C durante mais de cerca de 6 horas, em que as células vivas mantêm a sua identidade e, pelo menos, uma característica funcional que definiu as células vivas antes da formulação no tampão não nutritivo, sendo as células vivas úteis para a imunoterapia após serem armazenadas durante mais de cerca de 6 horas no tampão não nutritivo.
  2. 2. Método da reivindicação 1, em que a temperatura de armazenamento está numa gama entre cerca de 0°C e cerca de 10°C.
  3. 3. Método da reivindicação 1, em que a concentração das células no tampão não nutritivo é de cerca de 106 células/ ml ou superior e/ou as células vivas são colocadas num recipiente ou seringa flexível, em que o recipiente ou seringa flexível é embalados em um dispositivo com temperatura controlada que mantém as células vivas à temperatura de armazenamento.
  4. 4. Método da reivindicação 1 em que as células vivas são células Thl ativadas por anticorpos monoclonais imobilizados que são reticulados ou as células Thl são ativadas por anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 imobilizados.
  5. 5. Método da reivindicação 1, em que as células vivas expressam CD40L, FasL, perforina e granzima B, expressam moléculas co estimuladoras, expressam moléculas de adesão, segregam citoquinas, quimiocinas ou suas combinações.
  6. 6. Método da reivindicação 1, em que as células vivas na composição expressam CD40L após armazenamento numa quantidade de, pelo menos, cerca de 80% em relação à expressão de CD40L no momento da formulação.
  7. 7. Método da reivindicação 5, em que a citoquina inflamatória segregada é IFN-γ e o nivel de secreção está numa quantidade de, pelo menos, cerca de 80% em comparação com os niveis no momento da formulação.
  8. 8. Método da reivindicação 7 em que a secreção de IFN-y após o armazenamento é recuperada após incubação a 37°C durante, pelo menos, 24 horas.
  9. 9. Método da reivindicação 1, em que as células vivas no tampão não nutritivo são estáveis durante, pelo menos, cerca de 72 horas.
  10. 10. Método in vitro de proporcionar uma composição de células vivas para utilização em imunoterapia para um centro de cuidados clínicos, em que as células vivas são células T ativadas que foram ativadas por porções de superfície celular de ligação cruzada por anticorpos monoclonais ou outros agentes ligantes, método que compreende: reativar as células vivas; formulação das células vivas em um tampão não nutritivo em uma instalação de processamento; e transportar as células para um local de cuidados em uma embalagem equipada para manter uma temperatura de armazenamento abaixo de cerca de 20°C, em que as células vivas estão à temperatura de armazenamento durante mais de cerca de 6 horas, mantendo sua identidade e, pelo menos, uma característica funcional que definiu as células vivas antes da formulação no tampão não nutritivo.
  11. 11. Método da reivindicação 10 compreendendo ainda a colocação das células formuladas num recipiente ou seringa flexível antes do transporte.
  12. 12. Método da reivindicação 10 em que as células vivas são células Thl ativadas por anticorpos monoclonais imobilizados, em que os anticorpos monoclonais são reticulados.
  13. 13. Método da reivindicação 10 em que as células vivas na composição expressam CD40L após o transporte e a remoção da temperatura de armazenamento numa quantidade de pelo menos cerca de 80% em relação à expressão de CD40L no momento da formulação.
  14. 14. Método da reivindicação 10 em que as células na composição segregam IFN-y após o transporte e a remoção da temperatura de armazenamento numa quantidade, de pelo menos, cerca de 80% em comparação com os níveis no momento da formulação.
  15. 15. Método da reivindicação 14 em que a secreção de IFN-γ após transporte e armazenamento é recuperada após incubação a 37°C durante, pelo menos, 24 horas.
  16. 16. Método da reivindicação 10 em que as células vivas no tampão não nutritivo estão à temperatura de armazenamento durante, pelo menos, cerca de 72 horas.
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