JP6435267B2 - 再生細胞の培養、保存、及び投与のための培地 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１１月８日出願された米国仮特許出願第６１／７２４，２８５号に基づく優先権を主張し、該仮特許出願の内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は概して、修復性幹細胞を含む細胞の保存、懸濁、凍結保存、又は培養のための、並びに動物及びヒトの関節、皮下組織、又は器官等における弱まった又は損傷した組織を修復又は増強するための投与を目的とした使用のための、組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、再生細胞を保存、懸濁、凍結保存、又は培養し、培地中の再生細胞成長を増強し、多系列分化能を維持するための、グリコサミノグリカンの組成物を含む、培地、培地添加物、又は可溶性マトリックス、及びその使用法を提供する。本発明はまた、概して、培地から単離された又はそれと共に同時投与される、そのような細胞の治療的投与にも関する。

グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、細胞外マトリックスの重要な成分であり、細胞及び組織の生理及び病態生理において重要な調節的役割を担う。ＧＡＧは、反復する二糖単位から成る長鎖の分岐していない多糖類である。反復単位は、ヘキソサミン（窒素含有六炭糖）に連結された、ヘキソース（六炭糖）又はヘキスロン酸から成る。ＧＡＧは結合組織の重要な成分を形成する。ＧＡＧ鎖は、タンパク質と共有結合的に連結してプロテオグリカンを形成している場合がある。プロテオグリカン及びコラーゲンは、全ての結合組織の主要な構造要素である。それらの合成は、結合組織の適切な維持及び修復にとって不可欠である。インビトロにおいて、ＧＡＧの重要な前駆体であるグルコサミンの導入は、線維芽細胞におけるコラーゲン及びＧＡＧの合成を増加させることが示されている。インビボにおいて、グルコサミンの局所投与は創傷治癒を増強させた。グルコサミンはまた、変形性関節症を患うヒトにおいて、症状における再現性のある改善及び軟骨完全性（cartilage integrity）を示した（L. Bucci, Nutritional Supplement Advisor, July 1992）。

軟骨等の結合組織に存在する主なプロテオグリカンは、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及びヒアルロン酸（ヒアルロナン又はＨＡとしても知られている）である。関節軟骨の成分ではないが、ヘパリン硫酸もプロテオグリカンである。プロテオグリカンの新規の名称は、コンドロイチン硫酸及びケラチン硫酸内に存在する分子内コアタンパク質の機能を参照するか（例えば、ヒアルロニン（hyaluronin）と凝集する大型プロテオグリカンであるアグレガン（aggregan））、又は部位を参照するか（例えば、Ｉ型コラーゲン原線維を装飾するデコリン（デルマタン硫酸））、又は一次構造を参照（２つのグリコサミノグリカン（glysoaminoglycan）鎖を有するバイグリカン）している場合がある。軟骨細胞は軟骨基質内の活性細胞であり、新規のコラーゲン及びプロテオグリカン分子を生産する一方、損傷した軟骨及びプロテオグリカンの除去を補助する酵素を排出する。高含量の細胞外マトリックスを有する腱、靱帯、皮下結合組織又は骨等の他の組織において、組織特異的な細胞は、細胞外マトリックスの適切な組成を合成するそれぞれの機能を与える。

ヒアルロナンは、例示的な組織としての滑液及び関節軟骨の両方の不可欠な部分である。関節軟骨内において、ヒアルロナンは、対向する表面間での運動の容易さを可能にし、耐圧縮性を増加させる、粘弾性を与える。滑膜内において、ヒアルロナンは、滑液の成分として、血漿成分の導入を制御する有効な障壁を与える。正常状態下で、身体は、健常な関節軟骨を維持及び成長させるのに充分な量の基本成分を合成し、一方で、破壊的プロテアーゼ、炎症性メディエーター及び分解酵素の産生及び放出を制限している。

ヒアルロナン又はヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸（D-glucuronic）及び２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコースの交互単位から成る、天然高電荷ポリアニオン系分子である。これらの分岐していないコイル状の長い多糖鎖は、水分子を誘引する大きな負の帯電を維持しており、凍結及び解凍中に氷の結晶化が起こる際の分子コイルの変形を可能にする。ヒアルロン酸は細胞上のＣＤ４４受容体部位に結合することで細胞及び組織を被覆及び保護していると考えられている。ヒアルロン酸及び他の複合ＧＡＧ製剤は、しばしば変形性関節症を含む関節疾患の治療のために関節内注射で投与され、臨床症状を改善し、疾患増悪を遅延させる。別の例は、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸及び他の複合ＧＡＧ製剤の注射による皮下構造の再構築である。

コンドロイチン硫酸は硫酸二糖類及びＮ−アセチルガラクトサミンに分解される。身体内のＣＳ４及びＣＳ６硫酸化形態としてのコンドロイチン硫酸は、水を関節軟骨マトリックスに結び付ける不可欠なグリコサミノグリカンであると考えられており、プロテオグリカンの形成に必要である。具体的には、コンドロイチン硫酸は反復する糖類から成る長い親水性鎖である。このグリコサミノグリカンはプロテオグリカン分子に結合し、関節軟骨内の水及び栄養分の輸送を補助する。硫酸塩形態のコンドロイチンは、ヒアルロナンの一次基質であるガラクトサミン、及びグリコサミノグリカン産生に利用されるヘキソサミン経路に続発するプロテオグリカン合成のための二糖経路を含む。コンドロイチン硫酸鎖により、軟骨基質及びプロテオグリカン分子の不可欠な部分の空間形成が構成される。コンドロイチンは、健常な軟骨の構成要素であるプロテオグリカン、グリコサミノグリカン、及びコラーゲンの産生を刺激する。コンドロイチン硫酸はまた、関節軟骨内の軟骨細胞による変性酵素の分泌を阻害する。コンドロイチン硫酸は無毒であり、グルコサミンと相乗的に作用して、関節軟骨に対し水分補給及び修復を行う。

グルコサミンはアミノ糖であり、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の前駆物質である。グルコサミンは、グルコサミン５−リン酸塩として、身体内で自然発生し、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、ヒアルロナン、及びコラーゲンの生合成における成分となる。グルコサミンは、グルコサミン硫酸塩ナトリウム、グルコサミン塩酸塩及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの外因性型で利用可能である。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、キチンの化学的加水分解によって得られるグルコースの誘導体である。この多糖類は、水に易溶性であり、生物学的利用能が非常に高い。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンはグルクロン酸及びガラクトースに結合し、それをヒアルロン酸、ケラタン硫酸及びコンドロイチン硫酸の前駆物質にする。この独特な誘導体は、プロテオグリカン、コラーゲン及びグリコサミノグリカンの産生に役立つ。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンはまた、軟部組織傷害の治癒に役立つことが示されている。Ｄ−グルクロン酸は、ヒアルロナン分子の半分を構成する重要な基質であり、もう一方はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンである。

補充グルコサミンは、軟骨等の結合組織に影響を与え得るため、関節炎を含む種々の機能障害の軽減に適用され得る。関節において、例えば、コンドロイチン硫酸は、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、及びコラーゲンの産生を刺激し、軟骨細胞及び滑膜細胞によって排出された変性酵素を阻害し、滑液内の栄養分輸送を補助する働きをする。グルコサミン、具体的にはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、その主な基質であるガラクトサミン（コンドロイチン硫酸同化作用を介して）及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの直接的なインサイツ包含により、滑膜細胞及び軟骨細胞の産生並びにその後の内因性ヒアルロン酸の利用能を増加させる。外因性ヒアルロナンは、修復過程中、劣化した内因性ヒアルロン酸と置き換わり、健常関節組織及び傷害性関節組織を潤滑及び被覆する働きをする。

ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ（アルスロダイナミック・テクノロジーズ社（ArthroDynamic Technologies））という商品名で獣医学医療デバイスとして販売されているＧＡＧ組成物は、コンドロイチン硫酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、及びヒアルロン酸を含む。そのようなプロテオグリカン組成物は、米国特許第６，９７９，６７９号及び同第７，４８５，６２９号（これらの全体は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。

多細胞生物に存在する再生細胞は、組織修復及び再生を促進し炎症を低減することができる細胞である。幹細胞は、様々な特殊化した細胞型に分化することができる再生細胞である。２つの広範な哺乳類幹細胞の種類として、胚盤胞に存在する胚性幹細胞、及び成体組織に存在する成体幹細胞がある。幹細胞の２つの典型的な特性は、自己複製能及び分化能力（potency）である。自己複製能とは、未分化状態を維持しながら多数回の細胞分裂周期を経る能力を指し、分化能力とは、特殊化した細胞型に分化する能力を指す。分化能力は、様々な細胞型へ分化するよう幹細胞の分化能を特定化する。例えば、全能性幹細胞は、卵細胞及び精子細胞の融合及び受精卵の最初の数回の分裂から生じる細胞であり、胚細胞型及び胚外細胞型に分化することができる。多能性幹細胞は、全能性細胞の子孫であり、三胚葉のいずれかに由来する細胞に分化することができる。多能性幹細胞は、近縁関係にある細胞ファミリーの細胞のみを生み出すことができる（例えば、造血幹細胞は赤血球、白血球、血小板等に分化する）。単能性細胞は、１つの細胞型しか生み出すことができないが、自身を非幹細胞（例えば、筋幹細胞）と区別する自己複製の特性を有する。さらに、再生細胞集団はしばしば、細胞だけではなく、身体内の免疫調節等の機能において重要な、再生細胞によって放出されるミクロソームも含む。

前駆細胞とは、典型的には出生後動物に存在する未成熟な、又は部分的に未分化な再生細胞を指す。幹細胞と同様、前駆細胞は自己複製能及び分化能を有するが、これらの特性はより制限されている場合がある。胚性幹細胞は多能性であり、無制限の自己複製能を示す。故に、胚性幹細胞は真性（true）幹細胞と称される場合がある。対照的に、成体幹細胞と呼ばれる多くの細胞は、それらの無制限の自己複製及び可塑性の能力が完全には示されていないため、前駆細胞と定義された方が良いだろう。前駆細胞の大部分は、それらが属する組織において、休止中であるか又はわずかな活性を示すのみである。それらは緩徐な増殖を示し、それらの主な役割は通常の摩耗によって失われた細胞の置換である。しかし、組織の損傷又は傷害時には、前駆細胞は、増殖因子又はサイトカインによって活性化され、それにより、修復過程において重要な細胞分裂の増加を引き起こし得る。前駆細胞の例としては、筋肉に存在する衛生細胞及び吻側移動経路の一過性増殖（transit-amplifying）神経前駆細胞が挙げられる。

間葉系幹細胞（「ＭＳＣ」）（すなわち、間質細胞）は、種々の細胞型に分化できる多能性再生細胞である。ＭＳＣは、骨髄、脂肪、臍帯、及び歯髄を含む多くの組織に由来し得る。ＭＳＣは、プラスチックの組織培養に接着し、通常、このプラスチック接着特性に基づいてより多様な再生細胞集団から選別される。例えば、骨髄ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）は、プラスチック組織培養表面に接着する細胞を培養することにより骨髄穿刺液中に存在する細胞集団から選別することができ、脂肪ＭＳＣ（Ａｄ−ＭＳＣ）は、脂肪の間質血管分画（stromal vascular fraction：ＳＶＦ）細胞群から同様に選別することができる。脂肪ＳＶＦは、脂肪組織由来の非脂質充填細胞集団であり、高い割合で再生細胞を含有している。インビトロ又はインビボにおいてＭＳＣが分化することが示されている細胞型としては、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、神経細胞、及びβ膵島細胞が挙げられる。ＭＳＣは、組織の機能細胞が居住する支持構造を与える。さらに、ＭＳＣは、組織の治癒及び修復に関与する。

成体生物において、ＭＳＣは、特殊化した細胞を補充しそれに加えて組織恒常性を維持する身体の修復機構として働き、様々な種類の組織に分化することが可能であるため、例えば、骨格組織障害及び結合組織障害の治療に利用されている。

他の組織に由来する再生細胞（例えば、脂肪由来再生細胞）が、結合組織機能障害の修復又は軽減において、骨髄由来再生細胞と同等、さらにはそれよりも有能であるという証拠が増えつつある（Toghraie et al., “Treatment of Osteoarthritis with Infra-Patellar Fat Pad Derived Mesenchymal Stem Cells in Rabbit,” Knee, 2011, 18(2):71-75;及びFrisbie et al., “Evaluation of Adipose Derived Stromal Vascular Fraction or Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells for Treatment of Osteoarthritis,” J. Orthop. Res., 2009, 27(12):1675-1680を参照）。

幹細胞及び再生細胞、特に脂肪組織及び骨髄に由来するＭＳＣの関節内投与は、診療において利用が増えつつある。現在の慣例は、食塩水又は多血小板血漿等の不活性担体中に懸濁した細胞、又は単一成分としてヒアルロナン等の非硫酸化ＧＡＧを投与することである。現在までに、ＧＡＧの幹細胞及び再生細胞に対する影響に関して、並びにインビトロ及びインビボ適用のための幹細胞及び再生細胞と組み合わせるためのＧＡＧ製剤の最適組成に関して、極少ないデータしか報告されていない。

許容できる混合物としての、又は同時もしくは連続投与における、少なくとも１つの硫酸化ＧＡＧと共にヒアルロン酸を含むＧＡＧ組成物中に懸濁した細胞の使用が、本発明の一態様である。そのようなＧＡＧ製剤中の細胞の投与は、関節内注射に対してだけでなく、真皮下、皮下、局所的、筋肉内、静脈内、海綿体等の毛細血管内、動脈内、くも膜下腔内、器官内へ直接、膀胱内、腱及び腱周膜内、骨膜内、並びに骨嚢胞等の空洞内等の他の投与様式にも、利益をもたらす。

さらに、そのようなＧＡＧ組成物中の細胞の培養、保存、又は凍結保存は、細胞の増殖、生存率、及び再生能に利益をもたらす。本発明は、動物又はヒトに由来する細胞の培養、懸濁、保存、凍結保存、もしくは投与又はそのあらゆる組み合わせのために、少なくとも１つの硫酸化ＧＡＧと共にヒアルロン酸を含むＧＡＧ製剤を使用するための、組成物及び方法を提供する。

一つの態様では、本発明は、インビトロ及びインビボにおいて分化能を維持しながら、脂肪由来再生細胞（adipose-derived regenerative cell：ＡＤＲＣ）等の細胞の保存、懸濁、貯蔵、凍結保存、培養、成長、及び増殖における有効性を増強するための、培地添加物を提供する。ある実施形態では、本発明の培地又は培地添加物は、既定濃度の一つ又は複数のＧＡＧを含むグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）製剤を含む。特に、多能性を維持しながら、細胞を培養、成長、及び増殖させるのに適したある実施形態では、特定のＧＡＧ組成物は、培地の最終体積に応じて、１〜１０％（ｖ／ｖ）、２．５〜７．５％（ｖ／ｖ）、３〜７％（ｖ／ｖ）、又は５％（ｖ／ｖ）の濃度に希釈される。特に、保存、懸濁、貯蔵及び凍結保存に適した他の実施形態では、特定のＧＡＧ製剤は、培地の最終体積に応じて、５％（ｖ／ｖ）、１０％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）、３０％（ｖ／ｖ）、４０％（ｖ／ｖ）、５０％（ｖ／ｖ）、６０％（ｖ／ｖ）、もしくは７０％（ｖ／ｖ）、又はそれ以上の濃度に希釈される。

本発明の一実施形態では、ＧＡＧ組成物を含む培地又は培地添加物は、約１：２０：２０（ｍｇ／ｍｌ）の比率のヒアルロン酸（ＨＡ）：コンドロイチン硫酸（ＣＳ）：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＮａＤｇ）を含む。そのような組成物は、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム塩（５ｍｇ／ｍｌ）、コンドロイチン硫酸ナトリウム（１００ｍｇ／ｍｌ）（ＣＳ４型及びＣＳ６型の一方又は両方）、及び市販のＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物等のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含み得る。本発明のＧＡＧ組成物の比率は、０．１〜１０ＨＡ：２〜２００ＣＳ：２〜２００ＮａＤｇ（ｍｇ／ｍｌ）で変動してもよい。

ある実施形態では、本発明は、細胞培地中１％〜１０％（ｖ／ｖ）又は約５％（ｖ／ｖ）濃度のヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＧＡＧ配合物の存在下で、脂肪由来再生細胞（ＡＤＲＣ）がより多くの接着細胞を増殖させ、軟骨分化及び骨分化が阻止されることを報告する。他の実施形態では、本発明は、ヒアルロン酸（ＨＡ）のみを含有する製剤が、より低度にではあるが、有糸分裂誘導性であることを報告する。

本発明の一態様は、分化能を維持しながら細胞のインビトロ増殖速度を増強する方法を提供する。本態様において、本発明の方法は、本発明の培地中で細胞を培養すること、又は本発明の培地添加物で細胞を処理すること、又は細胞が増殖している表面を本発明の可溶性マトリックスで被覆することを含み、ここで本発明の培地、培地添加物、凍結保存剤（cryopreservant）、又は可溶性マトリックスは、一つ又は複数のＧＡＧを既定の濃度で含む特定のＧＡＧ組成物を含む。ある実施形態では、特定のＧＡＧ製剤は、最大５０％（ｖ／ｖ）、１〜１０％（ｖ／ｖ）、３〜７％（ｖ／ｖ）、又は約５％（ｖ／ｖ）の濃度の、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから成るＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物を含む。他の実施形態では、特定のＧＡＧ製剤は、最大５０％（ｖ／ｖ）、１〜１０％（ｖ／ｖ）、２．５〜７．５％（ｖ／ｖ）又は５％（ｖ／ｖ）の濃度の、ヒアルロン酸（ＨＡ）、及び所望により硫酸化コンドロイチンを含む。ある実施形態では、細胞は、さらなる使用のために回収するのに先立ち、係る本発明の培地中で数時間及び数日、場合によっては１２〜２０時間培養される。他の実施形態では、培養細胞は、さらなる使用に先立ち、培地中に残されるか、又は補充培地（supplemental media）に暴露される。

本発明の一態様はさらに、関節又は他の結合組織の傷害等の疾患の治療のための細胞を投与するための、特定のＧＡＧ製剤を含む可溶性マトリックスを提供する。ある実施形態では、可溶性マトリックス中の特定のＧＡＧ製剤は、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物を１〜２０％（ｖ／ｖ）の濃度で含む。他の実施形態では、可溶性マトリックス中の特定のＧＡＧ製剤は、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物における比と同じ比で、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、又は他のＧＡＧを含む。また、本発明の一態様の可溶性マトリックス及び細胞投与用デバイスを含む細胞投与パッケージも提供される。

本発明の一態様はさらに、動物もしくはヒトの患部における、関節疾患もしくは他の組織傷害を予防及び治療するための、又は、特に軟骨組織及び結合組織の修復における、前記培地中で培養及び増殖された細胞、又は前記培地中でもしくは本発明の培地添加物を用いて処理、貯蔵もしくは凍結保存された細胞を投与することによる、方法、及びその構成（composition）を提供する。ある実施形態では、前記細胞は、細胞投与のために、特定のＧＡＧ製剤（例えば、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物）を含む本発明の一態様の可溶性マトリックスと混合される。本明細書に記載の医薬製剤は、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ及び他のプロテオグリカン又はＧＡＧ組成物を細胞と共に含む。薬剤的に許容できる混合物として、又は同時投与もしくは連続投与において、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物及び他のプロテオグリカン又はＧＡＧ組成物を再生細胞と共に用いる、治療法が本明細書に提供される。また、特定のＧＡＧ製剤を含む可溶性マトリックス、及び細胞投与用デバイスを含む細胞投与パッケージ又はキットも提供される。

図１Ａ及び図１Ｂは、Ａｄ−ＭＳＣの増殖に対するＧＡＧ濃度の影響を示すものである。新鮮なイヌ脂肪ＳＶＦ細胞を同じ有核細胞密度で播種し、完全増殖培地（２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ）及び各濃度（ｖ／ｖ）のＧＡＧ製剤の存在下、プラスチック組織培養表面上の培地中で７日間増殖させた（図１Ａ）。Ｓｙｔｏ１３染色及びその後の蛍光顕微鏡下の血球計計数によって、有核細胞の計数を行った（図１Ｂ）。 図２は、Ａｄ−ＭＳＣが５％濃度（ｖ／ｖ）のＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ製剤中でより速く増殖することを示すものである。新鮮なイヌ脂肪由来間質細胞を同じ有核細胞密度で播種し、完全増殖培地及び各濃度（ｖ／ｖ）のＧＡＧ製剤の存在下、プラスチック組織培養表面上の培地中で７日間増殖させた。Ｓｙｔｏ１３染色及びその後の蛍光顕微鏡下の血球計計数によって、有核細胞の計数を行った。^＊Ｐ＜０．０５。 図３Ａ及び図３Ｂは、ＧＡＧ製剤中で培養された場合に、Ａｄ−ＭＳＣがより速く増殖しより高いレベルのＳｏｘ２を発現することを示すものである。イヌＡｄ−ＭＳＣを、完全増殖培地及び各５％（ｖ／ｖ）のＧＡＧ製剤の存在下で、培地中で６日間増殖させた。拡大率は１００倍である。幹細胞増殖のマーカーであるＳｏｘ２レベルを全ＲＮＡ試料において測定し、βアクチンに対して正規化した。 図４Ａ及び図４Ｂは、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮによってコロニー形成が増強されることを示すものである。合計０．２５×１０^６個の有核イヌ脂肪ＳＶＦ細胞を播種し、組織培養プラスチック表面上の培地中で１４日間増殖させた。示された結果は、５％（ｖ／ｖ）ＧＡＧ製剤を含有する増殖培地中のコロニー形成を示している。^＊Ｐ＜０．０５。 図５は、６日間のインビトロでのＨＡ製剤への暴露後のＡｄ−ＭＳＣ細胞表面マーカーの発現を示すものである。ＧＡＧ製剤中での６日間培養後の、ヒトＡｄ−ＭＳＣのＣＤマーカープロファイリング。ＧＡＬＬＩＯＳ（商標）フローサイトメーターを用いてＦＡＣＳ解析を行った。 図６は、インビトロにおいて、硫酸化ＧＡＧを含有するＧＡＧ製剤によって、骨分化が阻害される一方で、Ａｄ−ＭＳＣ増殖が維持されることを示すものである。培養物を、５％（ｖ／ｖ）製剤中、骨分化誘導培地中で１４日間維持した。培養物を４％ホルマリン固定し、カルシウムを染色するアザリンレッドで染色した。 図７は、インビトロにおいて、硫酸化ＧＡＧを含有するＧＡＧ製剤によって、軟骨分化が阻害される一方で、Ａｄ−ＭＳＣ増殖が維持されることを示すものである。培養物を、５％（ｖ／ｖ）製剤中、軟骨分化誘導培地中で１４日間維持した。培養物を４％ホルマリン固定し、軟骨細胞を含有（contain）するアルシアンブルーで染色した。 図８は、インビトロ暴露及びその後のＧＡＧ含有製剤の除去後に、Ａｄ−ＭＳＣにおいて、骨分化が高度に効率的であることを示すものである。培養物を、ＧＡＧ製剤中で６日間培養した後、骨分化培地中で１４日間維持した。培養物を４％ホルマリン固定し、カルシウムを染色するアザリンレッドで染色した。 図９は、インビトロ暴露及びその後のＨＡ含有製剤の除去後に、Ａｄ−ＭＳＣにおいて、軟骨分化が高度に効率的であることを示すものである。培養物を、ＧＡＧ製剤中で６日間培養した後、軟骨分化誘導培地中で１４日間維持した。培養物を４％ホルマリン固定し、アルシアンブルーで染色した。 図１０は、５％ＤＭＳＯ及び８５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で凍結保存された細胞と比較した場合の、ＧＡＧ含有製剤の存在下での凍結保存後の有核生存イヌ間質血管細胞の細胞計数を示すものである。 図１１は、５％ＤＭＳＯ及び８５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で凍結保存された細胞と比較した場合の、ＧＡＧ含有製剤の存在下での凍結保存後のイヌ間質血管細胞の細胞表面マーカー発現のフロー活性化細胞選別（flow activated cell sorting：ＦＡＣＳ）解析を示すものである。 図１２は、ＧＡＧ製剤中で増殖中のイヌＡｄ−ＭＳＣにおける幹細胞マーカーの発現を示すものである。 図１３は、６日間培養後のｈＡＤＳＣの遺伝子発現における、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮにより誘導される変化を示すものである。 図１４は、−８０℃中で１ヵ月後の凍結保存回復を示すものである。 図１５は、運送後の培養ｈＡＤＳＣの安定性解析を示すものである。 図１６は、運送後の新鮮なｈＡＤＳＣの安定性解析を示すものである。

本発明のさらなる目的、利点及び他の新規の特徴は、以下の発明を実施するための形態に部分的に記載され、部分的に上記の説明に基づいて当業者に明らかになるか、又は本発明の実施により習得され得る。さらに、本文書の全体を通じて、種々の刊行物及び特許が引用されているが、それらの内容はそれらの全体において参照によって本明細書に組み込まれる。

一つの態様では、本発明は、細胞成長の増強及び分化能の維持のための培地又は培地添加物を提供する。一実施形態では、本発明の培地又は培地添加物は特定のプロテオグリカン又はＧＡＧ製剤を含み、ある実施形態では、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物、又はヒアルロン酸（ＨＡ）及び他のＧＡＧを既定濃度で含む。ある実施形態では、本発明の培地又は培地添加物は、ヒアルロン酸ナトリウム塩（５ｍｇ／ｍｌ）、コンドロイチン硫酸ナトリウム（１００ｍｇ／ｍｌ）、及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（１００ｍｇ／ｍｌ）から成るＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物を含む。ある実施形態では、培地又は培地添加物は、ｍｇ／ｍｌ比率で約１：２０：２０のヒアルロン酸：コンドロイチン硫酸：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから成る組成物を含む。添加物組成物は、ヒアルロン酸ナトリウム及び他の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含み得る。本発明の別の実施形態では、ｍｇ／ｍｌ比率で約１：１０：１０のヒアルロン酸：コンドロイチン硫酸：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから成る組成物を含む培地又は培地添加物が適用され得る。理解されることではあるが、前記組成物の最終希釈は用途に応じて調節することができる。

本明細書で使用される場合、本明細書に記載の用語「プロテオグリカン組成物」又は「ＧＡＧ製剤」又は「ＧＡＧ組成物」は、同義的に用いられ、一つ又は複数のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、例えば、限定はされないが、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む組成物又は製剤を指し、貯蔵、凍結保存、培地、培地添加物、もしくはマトリックスに適した、又は治療的投与に適したいかなる許容できる製剤にも製剤化される。本発明のＧＡＧ組成物としては、限定はされないが、再生細胞の培養、投与、懸濁、もしくは凍結保存における当該技術分野において公知のもしくは近年開発された、細胞もしくはあらゆる細胞培養、凍結保存、もしくは懸濁培地もしくは培地添加物と混合することができる、又は、再生細胞が当該技術分野において公知のもしくは近年開発されたあらゆる適切な培地中で増殖される表面を被覆するために用いらることができる、無菌液もしくは懸濁液、又はマトリックスもしくはゲルが挙げられる。許容できる混合物として又は同時投与もしくは連続投与において、再生細胞と共にＧＡＧ組成物を用いる治療法が本明細書において提供される。本発明のＧＡＧ組成物は、再生細胞と併せて、関節又は他の結合組織の傷害又は脱力感の治療を必要とする対象に対する、直接適用又は関節内、筋肉内、静脈内、皮下、もしくは他の非経口もしくは全身投与用に製剤化することもできる。

実施形態に応じて、種々のＧＡＧは、本明細書に記載の特定のＧＡＧ組成物中に含まれ得る。ある実施形態では、ＧＡＧ組成物は、コンドロイチン硫酸、グルコサミン、及びヒアルロナンを含むか、又はそれらから本質的に成る。ある実施形態では、ＧＡＧ組成物は、グルコサミン及びヒアルロナンを含むか、又はそれらから本質的に成る。ある実施形態では、ＧＡＧ組成物は、コンドロイチン硫酸、ポリ−硫酸化ＧＡＧ、グルコサミン及びヒアルロナンの混合物を含み、冷蔵庫又はフリーザー内に、室温の単一容器内に貯蔵することができる。他の実施形態では、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等のグルコサミンは、冷蔵庫又はフリーザー内に、室温の別々の容器内に貯蔵され、投与前にコンドロイチン硫酸及びヒアルロナン混合物と混合することができる。さらに他の実施形態では、ＧＡＧ組成物は、コンドロイチン硫酸、（ＣＳ４型及びＣＳ６型の両方の）ヒアルロナン、及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン等のグルコサミンを含み、これらは全て混合され、培地との混合、又は細胞を増殖させるための表面の被覆、又は治療を必要とする対象に対する細胞と一緒の直接的な同時投与に即応可能な単一容器内に貯蔵されている。

ある実施形態では、ＧＡＧ組成物は、有効量のコンドロイチン硫酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、及びヒアルロナン（ヒアルロン酸）から本質的に成るＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物（アルスロダイナミック・テクノロジーズ社、ケンタッキー州レキシントン）である。ある実施形態では、プロテオグリカン組成物中のコンドロイチン硫酸は、コンドロイチン４−硫酸塩（ＣＳ４）、コンドロイチン６−硫酸塩（ＣＳ６）、又はＣＳ４及びＣＳ６両方の混合物であることが好ましい。有効量のコンドロイチン硫酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、それぞれ単位用量当たり約０．５グラム〜約１．５グラムであることが好ましく、有効量のヒアルロナンは、単位用量当たり約１０ｍｇ〜約５０ｍｇであることが好ましい。ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物、又はその等価物、並びにそのような組成物の調製法及び使用法の詳細な説明は、米国特許第６，９７９，６７９号及び同第７，４８５，６２９号に記載されており、これら特許の全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」又は「再生細胞」は、同義的に用いられ、有糸細胞分裂を通じて自身を再活性化する能力を保持することが可能な、且つ、２種以上の特殊化した細胞型に分化可能な細胞である。一実施形態では、本明細書に記載の再生細胞は、間葉及び／又は間質細胞であり、例えば、限定はされないが、骨芽細胞、軟骨細胞、軟骨前駆細胞（例えば、間葉系幹細胞又はＭＳＣ）、線維芽細胞、線維芽細胞様細胞、及びＳＶＦ細胞、又は軟骨組織内で典型的に産生されるコラーゲン型及びプロテオグリカンを産生可能な他の間質細胞が挙げられる。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の再生細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨芽細胞を産生可能な間質細胞である。さらに別の実施形態では、記載される再生細胞は、中胚葉、内胚葉、又は外胚葉系譜に分化可能である。

さらに別の実施形態では、再生細胞は、軟骨形成性幹細胞及び／又は前駆細胞であり、例えば、間葉系幹細胞又はＭＣＳが挙げられる。さらなる実施形態では、間葉系幹細胞又はＭＣＳは、動物組織標本から単離された動物の間葉系幹細胞である。さらに他の実施形態では、前駆細胞は、自己又は同種から、患者から得られ得る。前駆細胞、線維芽細胞様細胞並びに間質を含む他の細胞及び／又は成分は、胎児由来又は成体由来であり得、脂肪、軟骨、骨、皮膚、靱帯、腱、筋肉、胎盤、臍帯等の好都合な供給源に由来し得る。例えば、軟骨細胞等の間質細胞は、生検（適切な場合）又は剖検によって得ることができるあらゆる種類の軟骨、例えば、限定はされないが、硝子軟骨、肋軟骨、繊維軟骨等に由来し得る。

再生細胞は、濃縮された数で、又は天然では一緒に存在するその他の成分のうちの少なくともいくつかを含有しない細胞培養物で提供されるため、典型的には単離された状態で本発明に用いられる。再生細胞は、脂肪組織、骨髄、臍帯、胎盤、歯髄、腱、筋肉、又は皮膚を含む種々の供給源に由来し得る。種々の供給源に由来する再生細胞は本発明で用いられ得る。

本発明で用いられる再生細胞は、適切な組織を脱凝集することにより容易に単離され得る。さらに、細胞を単離した後、本発明に開示される組成物中でグリコサミノグリカンと組み合わせるための細胞調製物を得るために、それらの集団を、有糸分裂的に増殖させ、好ましい場合は、ある特定の細胞型に富化することができる。

ある実施形態では、本発明は、分化能を維持しながら、コロニー形成細胞の再生細胞生存率及び増殖が増強されることを報告する。ある実施形態では、本発明は、間質細胞のプラスチック接着を促進し、アノイキス誘導性アポトーシスを低減する。

ある実施形態では、再生細胞は、一つ又は複数の適切な周知の追加の凍結保護物質と共に、本明細書に記載の組成物中で保存される。一実施形態では、培養されていないもしくは培養された、又は一つもしくは複数の適切な凍結保護物質の存在下で予め保存された、本明細書において提供される再生細胞は、本明細書に記載の組成物と組み合わせることができる。さらに、再生細胞は、本明細書に記載の組成物と組み合わされた場合、凍結保存過程の間適切に保護され、生存率の向上がもたらされ得る。

ある実施形態では、本発明の有効性は、様々なＧＡＧを様々な濃度で含有する種々の製剤中で凍結保存されたイヌ及びヒト脂肪ＳＶＦ細胞の生細胞計数及びフローサイトメトリー解析によって示される。

本発明はさらに、ヒト又は動物の身体に、本培地中で培養及び増殖せられた、又は本培地添加物で処理された、又は本発明の培地添加物もしくはマトリックスで被覆された表面上で成長せられた再生細胞を投与するための、方法、及びその構成を提供する。ある実施形態では、再生細胞は、本発明の培地又は培地添加物中で培養、保存、又は凍結保存され、その後、再生細胞の投与のために、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物等の特定のＧＡＧ製剤、又はあらゆる他の適切なＧＡＧ製剤を含む本発明のマトリックスと混合される。本明細書に記載の調製物は、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ又はあらゆる他のＧＡＧ製剤を再生細胞と共に含む。許容できる混合物として又は同時投与もしくは連続投与において、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ又はあらゆる他のＧＡＧ製剤を再生細胞と組み合わせて用いる治療法が本明細書において提供される。しかし、培養、保存、及び凍結保存で用いられるＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ又はあらゆる他のＧＡＧ製剤の希釈は、再生細胞の投与のために用いられる希釈とは異なり得る。再生細胞の投与のために用いられるＧＡＧ製剤の希釈は、具体的な患者の状態及び投与の解剖学的部位に応じて異なり得る。

本明細書で使用される場合、本発明の調製物は、適切な形態、例えば、限定はされないが、無菌液、懸濁液、ステント、スポンジ、縫合糸、もしくはマトリックス等の足場、又はゲル状もしくは糊状製剤の形態に製剤化される。ＧＡＧ製剤中のＧＡＧの分子量は、適切な形態の物理的性質を決定するように選択することができる。そのようなＧＡＧ製剤中の再生細胞の投与は、関節内注射に対してだけでなく、真皮下、皮下、局所的、筋肉内、静脈内、海綿体等の毛細血管内、動脈内、くも膜下腔内、器官内への直接、膀胱内、腱及び腱周膜内、骨膜内、並びに骨嚢胞等の空洞内等の他の投与様式に対しても、利益を与える。全身投与としては、限定はされないが、筋肉内注射、静脈内注射もしくは皮下注射、又は非経胃腸粘膜（例えば、舌下）投与を介した血流中への直接的な吸着（adsorption）が挙げられ得る。

経粘膜（trasnsmucosal）送達が、血流中への直接的な吸着のための粘膜表面積を与え、本発明の組成物を消化及び／又は胃もしくは腸内酵素を介した他の変質に暴露しないいかなる粘膜組織をも含み得ることは、本発明の特定の実施形態に基づいて企図されている。本組成物は、所望の粘膜組織への直接適用のために液体又は半固体として提供され得る。本組成物は、所望の粘膜組織との接触を増強及び／又は延長し、血流中への吸着を促進するように設計された種々の提示物（presentation）のいずれかに製剤化することができる。例えば、本組成物は、溶解性又は生分解性の設置用フィルム（例えば、舌下の）に、又は経口もしくは経鼻噴霧剤、もしくは中咽頭（oropharnyx）もしくは他の標的組織の粘膜との接触を増強及び／もしくは延長するように設計された他の提示物として、組み込むことができる。

さらに別の好ましい実施形態では、本明細書において提供される本組成物は、ヒト又は動物の身体組織の表面又は間への埋め込みに適した材料から成るシートに付着される。本組成物は、重合体ガーゼ様物質に浸透しているか、又はガーゼ様物質上に被覆されている、又は接着及び／もしくは毛管作用によって該物質に結合していることが好ましい。本組成物が付着する物質は、永久埋め込み材であってもよいし、あるいは生分解性であってもよい。さらに別の好ましい実施形態では、本明細書において提供される本組成物は、包帯又は他の外科用材料、例えば、限定はされないが、外科用縫合材料、外科用ステープル、又はバックル等のデバイスに付着されている。

本明細書に記載の医薬製剤はさらに、一つ又は複数の他の治療薬、例えば、限定はされないが、合成及び非合成副腎皮質ステロイド剤、非ステロイド系抗炎症剤、鎮痛剤、抗リウマチ剤、免疫調節剤、免疫抑制剤、関節機能増強剤、インターロイキン産生阻害剤、又は増殖因子を所望により含んでいてもよく、これらは全て治療効果を有している。いかなる所望の治療効果をも示す、公知の及び／又は開発予定である、いかなる薬剤、作用剤、化合物も、本発明の範囲内である。他の実施形態では、本発明は、上記治療薬のうちの一つ又は複数を明確に除外し得る。さらに別の実施形態では、幹細胞、又は再生細胞を含む薬剤的に許容できる製剤はさらに、例えば、筋組織、心組織、神経組織、及び結合組織を含む一つ又は複数の組織の産生を補助する他の細胞も含み得る。

本発明の組成物は、ヒト又は動物におけるいかなる原疾患もしくは続発疾患又は結合組織傷害をも含む、結合組織損傷の予防又は治療に用いることができる。そのような疾患又は傷害としては、限定はされないが、関節炎疾患、変形性関節症（ＯＡ）、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、離断性骨軟骨症（osteochondrosis dessicans）（ＯＣＤ）、軟骨損傷、関節損傷、関節炎、関節滑膜炎、変性関節疾患（ＤＪＤ）、手術後ＤＪＤ、外傷性障害、骨折、腱損傷、靱帯損傷、骨格損傷、筋骨格損傷、骨損傷、線維損傷、脂肪組織損傷、血液細胞損傷、及び血漿損傷が挙げられる。

分化能を維持しながら、再生細胞の培養、成長、保存、凍結保存、投与、及び増殖の有効性の増強をもたらす、動物及びヒトの治療のための、特定のＧＡＧ製剤を含む培地又は培地添加物、及びその使用法が議論された。ある特定の好ましい実施形態の例を提供することを意図しており、本発明の範囲を限定することは意図していない、以下の具体例から、より明瞭な認知及びより深い理解が得られるだろう。

材料
ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮは、関節の恒常環境の維持において中心的な役割を果たす滑液の自然発生的な成分を含有していることから、滑膜区画の術後洗浄に用いられる、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから成る市販の特許製剤である。また、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮは、外科手術中に失われた滑液の代わりとなるように設計されている。市販のＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ（アルスロダイナミック・テクノロジーズ社）は、１０％Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン溶液中の既定の割合の精製されたヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ｃ４＆Ｃ６から成る高粘稠性の水溶液である。それぞれの１０ｍＬバイアルは、５０．０ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム塩、１０００ｍｇのコンドロイチン硫酸ナトリウム、及び１０００ｍｇのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含有する。

ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸（D-glucuronic）及び２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコースの交互単位から成る、天然高電荷ポリアニオン系分子である。これらの分岐していないコイル状の長い多糖鎖は、水分子を誘引する大きな負の帯電を維持しており、凍結及び解凍中に氷の結晶化が起こる際の分子コイルの変形を可能にする。ヒアルロン酸の１つの市販供給源は、ＭＡＰ５（バイオニッシェ社（Bioniche））である。ＡＤＥＱＵＡＮ Ｃａｎｉｎｅ（ツイトポルド・アニマル・ヘルス社（Luitpold Animal Health））は、処方の、水性の、筋肉内の、多硫酸化グリコサミノグリカン（ＰＳＧＡＧ）である。

方法
卵巣摘出処置で採取されたイヌ脂肪組織から、及びＩＲＢプロトコルに基づき、随意の脂肪吸引術を受けている患者からインフォームドコンセントを受けて獲得されたヒト吸引脂肪組織試料から、脂肪ＳＶＦ細胞を得た。ポイントオブケア組織処理システム並びに付属の使い捨ての器具及び試薬（ＡＲＣ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ及びＭＡＴＲＡＳＥ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ、インジェネロン社（InGeneron, Inc.）、テキサス州ヒューストン）を用いて、初代細胞調製物を得た。αＤＭＥＭ（２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）含有）中の初代細胞の培養により、Ａｄ−ＭＳＣを得た。多硫酸化グリコサミノグリカンの市販製剤（ＡＤＥＱＵＡＮ、ツイトポルド・アニマル・ヘルス社、ニューヨーク州シャーリー）、ヒアルロン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、及びコンドロイチン硫酸から成る製剤（ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ、アルスロダイナミック・テクノロジーズ社、ケンタッキー州レキシントン）、及びヒアルロン酸（ＨＡ）から成る製剤（ＭＡＰ−５、バイオニッシェ社、ジョージア州アセンズ）、並びに個々のＧＡＧを、最大５０％（ｖ／ｖ）の濃度で試験した。

細胞増殖、コロニー形成単位（ＣＦＵ）、遺伝子発現解析、細胞表面マーカー、並びに軟骨分化及び骨分化に対するアッセイを行った。細胞成長及びコロニー形成単位（ＣＦＵ）は、αＭＥＭ（２０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）、ペニシリン／ストレプトマイシン）中、組織培養グレードプラスチック上で単層で成長させた。有核細胞の計数は、Ｓｙｔｏ１３（インビトロジェン社）で染色した後の、蛍光顕微鏡下での血球計計数により行った。遺伝子発現解析は、定量的ＲＴ−ＰＣＲプロファイリング、ＢｉｏＲａｄ ｉＱにより行った。フロー活性化細胞貯蔵（Flow Activated Cell Storing:FACS）解析は、Ｍ．Ｄ．アンダーソンがんセンターＦＡＣＳコア施設（M.D. Anderson Cancer Center FACS Core Facilities）（テキサス州ヒューストン）で、ＧＡＬＬＩＯＳ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ベックマン・コールター社）により、行った。骨分化及び軟骨分化用に、細胞を、ＳＴＥＭＰＲＯ誘導培地（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）中で１４日間培養し、４％ホルマリンで固定し、それぞれアザリンレッド及びアルシアンブルーで染色した。ＡＮＯＶＡにより統計解析を行った。

ＳＶＦ細胞は、既知の方法により、好ましくはＭＡＴＲＡＳＥ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ製剤中のコラゲナーゼ１、コラゲナーゼ２、及び中性プロテアーゼを用いて処理することにより、皮下脂肪組織から得た。得ることができる典型的な細胞数は、６００，０００〜１，０００，０００個／ヒト皮下脂肪組織１グラムの有核細胞、１，０００，０００〜１，５００，０００個／１グラム、及び１，２００，０００〜３，０００，０００個／ウマ脂肪組織１グラムである。より多くの細胞数は、より低い肥満度指数を有するそれらにおいて得ることができる。このことは、間質血管細胞群と比較した場合の脂肪細胞の相対的割合がより小さいことを示している。また、１グラムの組織が脂肪細胞と比較して比較的より多くの間質血管（interstitial stromal vascular）成分を含有することを意味し、一方、肥満個体においては、脂肪細胞の相対的割合がより高いために、１グラムの組織当たりで得られる細胞数はより少ない。

細胞を回収した後、細胞を、血清（好ましくは自己の）を用いる５０％ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ希釈にかけ、細胞破裂を阻止するために、微細な変化による温度勾配を調節する既知の方法により凍結した。５０％ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ希釈は、その組成及び物理的性質により、細胞死を阻止した。−１８摂氏温度〜−２０摂氏温度に保存した後、凍結時のアポトーシス比と比較した場合の、解凍後のアポトーシス比は、無視できるものであった。数か月及び数年等の長期間の保存において、−７０摂氏温度又はさらにより低い摂氏温度での貯蔵は、細胞死を阻止する。

解凍後、細胞は注射に用いることができる。しかし、細胞が関節等の明確な区画に注射される場合、最終部位における希釈度は最大５パーセント含量のＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮであることが有益であり得る。そのような希釈度は、再生細胞を含有する初期溶液を５０％から例えば１０％まで希釈することにより得ることができる。一例として、細胞が１．８ｍｌのガラス製バイアル内の５０％ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ中で凍結された場合、９ｍｌへのさらなる希釈は、再生細胞が分散した１０％ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ含量をもたらすだろう。例えば、約１８ｍｌの滑液を典型的に有する膝に注射される際、この滑液の９ｍｌが穿刺により除去され、９ｍｌの再生細胞溶液が注射されて、これにより、膝関節内の最終ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ溶液が、細胞成長に対し有益な作用を示した５％溶液にされる。

再生細胞の運送は、典型的に、細胞が最適レベルに調整された温度、培地、及びＣＯ_２を備えた最適培養条件に保たれたとしても、アポトーシス率の増加をもたらす。これは、細胞外マトリックスへの接着の欠如からもたらされるアノイキスが原因である。本発明のＧＡＧ製剤は、ＣＤ４４受容体等のある特定の細胞表面受容体に結合し、アノイキスを妨げるための天然マトリックスを与えるため、製剤（例えば本発明の製剤）において、好ましい運送用培地となる。

結果
図１Ａ及び図１Ｂは、Ａｄ−ＭＳＣの増殖に対するＧＡＧ濃度の影響が図１Ａ〜図１Ｂに示されたことを示している。新鮮なイヌ脂肪ＳＶＦ細胞を同じ有核細胞密度で播種し、完全増殖培地（２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ）及び各濃度（ｖ／ｖ）のＧＡＧ製剤の存在下、組織培養プラスチック上の培地中で７日間増殖させた（図１Ａ）。３日目及び６日目に培地を交換した。Ｓｙｔｏ１３染色及びその後の蛍光顕微鏡下の血球計計数によって、有核細胞の計数を行った（図１Ｂ）。

本発明は、Ａｄ−ＭＳＣが５％濃度（ｖ／ｖ）のＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ製剤中でより速く増殖することを示している（図２参照）。新鮮なイヌ脂肪ＳＶＦ細胞を同じ有核細胞密度で播種し、完全増殖培地及び各濃度（ｖ／ｖ）のＧＡＧ製剤の存在下、組織培養プラスチック上の培地中で７日間増殖させた。Ｓｙｔｏ１３染色及びその後の蛍光顕微鏡下の血球計計数によって、有核細胞の計数を行った。データは、７日目の細胞数の３連測定値の平均値＋／−ＳＤを示している。^＊Ｐ＜０．０５。

本発明はさらに、ＧＡＧ製剤中で培養された場合に、Ａｄ−ＭＳＣがより速く増殖しより高いレベルのＳｏｘ２を発現することを示している（図３Ａ及び図３Ｂ参照）。イヌＡｄ−ＭＳＣを、完全増殖培地及び各５％（ｖ／ｖ）のＧＡＧ製剤の存在下で、培地中で６日間増殖させた。拡大率は１００倍である。幹細胞増殖のマーカーであるＳｏｘ２レベルを全ＲＮＡ試料において測定し、βアクチンｍＲＮＡに対して正規化した。ここで「ＧＡＧ」とは、多硫酸化グリコサミノグリカン（ＡＤＥＱＵＡＮ）を表す。図３Ｂは、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ中のＨＡ、ＣＳ及びＮａＤｇの組み合わせがＳｏｘ２レベルの実質的により大きな増加をもたらしたことを明確に示している。

コロニー形成も、多硫酸化ＧＡＧ（ＡＤＥＱＵＡＮ）又はヒアルロナン（ＭＡＰ５）単独と比較した場合に、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮのＧＡＧ組成物により有意に増強される（図４Ａ、図４Ｂ）。合計０．２５×１０^６個の有核イヌ脂肪ＳＶＦ細胞を、組織培養プラスチック上の培地中で１４日間増殖させた。示された結果は、５％（ｖ／ｖ）ＧＡＧ製剤を含有する増殖培地中のコロニー形成を示している。^＊Ｐ＜０．０５。

図５は、６日間のインビトロでのＧＡＧ製剤への暴露後のＡｄ−ＭＳＣ細胞表面マーカーの発現を示している。ＧＡＧ製剤中での６日間培養後の、ヒトＡｄ−ＭＳＣのＣＤマーカープロファイリング。ＧＡＬＬＩＯＳ（商標）Ｆｌｏｗ ＣｙｔｏｍｅｔｅｒにおいてＦＡＣＳ解析を行った。

図６は、インビトロにおいて、硫酸化ＧＡＧを含有するＧＡＧ製剤（ＡＤＥＱＵＡＮ及びＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ）によって、骨分化が阻害される一方で、Ａｄ−ＭＳＣ増殖が維持されることを示している。培養物を、５％（ｖ／ｖ）製剤中、骨分化誘導培地中で１４日間維持した。培養物を４％ホルマリン固定し、カルシウムを染色するアザリンレッドで染色した。

図７は、インビトロにおいて、硫酸化ＧＡＧを含有するＧＡＧ製剤（ＡＤＥＱＵＡＮ及びＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ）によって、軟骨分化が阻害される一方で、Ａｄ−ＭＳＣ増殖が維持されることを示している。培養物を、５％（ｖ／ｖ）製剤中、軟骨分化誘導培地中で１４日間維持した。培養物を４％ホルマリン固定し、軟骨細胞を含有（contain）するアルシアンブルーで染色した。

図８は、インビトロ暴露及びその後のＧＡＧ含有製剤の除去後に、Ａｄ−ＭＳＣにおいて、骨分化が高度に効率的であることを示している。培養物を、ＧＡＧ製剤中で６日間培養した後、骨分化培地中で１４日間維持した。培養物を４％ホルマリン固定し、カルシウムを染色するアザリンレッドで染色した。

図９は、インビトロ暴露及びその後のＨＡ含有製剤の除去後に、Ａｄ−ＭＳＣにおいて、軟骨分化が高度に効率的であることを示している。培養物を、ＧＡＧ製剤中で６日間培養した後、軟骨分化誘導培地中で１４日間維持した。培養物を４％ホルマリン固定し、アルシアンブルーで染色した。

図１０は、対照培地（５％ＤＭＳＯ、１０％α−ＭＥＭ、８５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））中で凍結保存された細胞と比較した場合の、ＧＡＧ含有製剤の存在下での凍結保存後の有核生存イヌＳＶＦの回復を示している。５０％ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ中の凍結保存は、いかなる他のＧＡＧ配合物よりも有意により高いＡＤＳＣ回復をもたらした。５．５×１０^６個の新鮮イヌ間質血管細胞を、各条件用に１５ｍｌ無菌コニカルチューブに２連で分注し、６００×ｇ、１０分間の遠心分離でペレットに濃縮させた。上清を吸引除去し、ペレットを１．５の対照又は試験凍結保存培地中に懸濁し、個々の２．０ｍｌ無菌クライオバイアルに移した。次に、クライオバイアルを、Ｍｒ． Ｆｒｏｓｔｙ冷凍コンテナ（ナルゲン社（Nalgene）、ニューヨーク州ロチェスター）内で−８０Ｃに冷却した。凍結後、クライオバイアルを−８０Ｃに２０日間維持した。凍結保存された細胞を３７Ｃ水浴中で急速に解凍した。全細胞数をＳｙｔｏ１３核染色を用いて決定し、非生細胞計数をトリパンブルー色素を用いて決定した。（（全細胞−非生細胞／全細胞）×１００）として、生存率を直ちに決定した。

図１１は、対照培地（５％ＤＭＳＯ、１０％α−ＭＥＭ、８５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））中で凍結保存された細胞と比較した場合の、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ（ＰＯ）ＧＡＧ含有製剤（５〜５０％（ｖ／ｖ））の存在下での凍結保存後のヒト脂肪ＳＶＦ細胞による細胞表面マーカー発現のフローサイトメトリー解析を示している。図１０に示された通りに凍結保存を行った。−８０Ｃで１４日間保管した後、細胞を解凍し、培地（２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ）を含む７５ｃｍ^２プラスチック製組織培養皿内で２４時間培養した。プラスチック接着細胞上のＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、及びＣＤ１１７の表面マーカー発現を、ＧＡＬＬＩＯＳ（商標）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ベックマン・コールター社、カリフォルニア州ブレア）を用いるＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｙによって評価し、凍結保存しなかったこと以外は同一の条件下で２４時間培養した同一試料から得られた細胞と比較した。

図１２は、ＧＡＧ製剤含有培地中で６日間培養した後のイヌＡｄ−ＭＳＣにおける遺伝子発現の変化を示している。新鮮イヌ脂肪ＳＶＦ細胞を、６ウェルプレート内に５×１０^５細胞／ウェルの密度で播種し、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び２．５〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲のＧＡＧ製剤を含有するα−ＭＥＭ中、組織培養プラスチック上で６日間培養した。培地は３日目に交換した。６日目に全ＲＮＡを調製し、選択された遺伝子の遺伝子発現を定量的ｒｔ−ＰＣＲで決定した。

図１３は、ＧＡＧ製剤含有培地中で６日間培養した後のヒトＡｄ−ＭＳＣにおける遺伝子発現の変化を示している。新鮮ヒト脂肪ＳＶＦ細胞を、６ウェルプレート内に７.５×１０^５細胞／ウェルの密度で播種し、対照培地（２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ）又は５％（ｖ／ｖ）ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ又はＭＡＰ５を添加した対照培地中、組織培養プラスチック上で６日間培養し、３日目に培地を交換した。６日目に全ＲＮＡを調製し、選択された遺伝子の遺伝子発現を定量的ｒｔ−ＰＣＲで決定した。バーは、対照培地中で培養された細胞に対する、ＧＡＧ製剤含有培地中で培養された細胞の遺伝子発現における相対変化を示している。

図１４は、対照培地（５％ＤＭＳＯ、１０％α−ＭＥＭ、８５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））又は市販の凍結保存培地（ＣＲＹＯＳＴＯＲ、バイオライフ・ソリューションズ社（BioLife Solutions, Inc.）、ワシントン州ボセル）中で凍結保存された細胞と比較した場合の、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ ＧＡＧ含有製剤の存在下での凍結保存後の有核生存イヌ間質血管細胞の回復を示している。５．５×１０^６個の新鮮イヌ脂肪SVF細胞を、各条件用に１５ｍｌ無菌コニカルチューブに２連で分注し、６００×ｇ、１０分間の遠心分離でペレットに濃縮させた。上清を吸引除去し、ペレットを１．５の対照又は試験凍結保存培地中に懸濁し、個々の２．０ｍｌ無菌クライオバイアルに移した。次に、クライオバイアルを、Ｍｒ． Ｆｒｏｓｔｙ冷凍コンテナ（ナルゲン社（Nalgene）、ニューヨーク州ロチェスター）内で−８０Ｃに冷却した。凍結後、クライオバイアルを−８０Ｃに２０日間維持した。凍結保存された細胞を３７Ｃ水浴中で急速に解凍した。全細胞数をＳｙｔｏ１３核染色を用いて決定し、非生細胞計数をトリパンブルー色素を用いて決定した。（（全細胞−非生細胞／全細胞）×１００）として、生存率を直ちに決定した。

図１５は、一晩の運送に曝された、培養ｈＡｄ−ＭＳＣの生存率に対する保存溶液組成の影響を示している。１．５×１０^６個の生存ヒトＡｄ−ＭＳＣを、１．０ｍｌ試験溶液中で懸濁し、無菌クライオバイアルに移した。クライオバイアルを、温度を２〜８Ｃに維持するための冷パックを含む発泡スチロール運送容器中に配置した。運送容器を密封し、地元の発送センターに輸送し、翌日配達便で研究室の場所に運送した。前記容器内にクライオバイアルを配置してから２４時間後、容器を開け、クライオバイアルから細胞を回収し、図１０に示される通りに細胞生存率を評価した。バーは、各試験溶液についての３連測定値の平均値を示している。

図１６は、一晩の運送に曝された、新鮮脂肪ＳＶＦ細胞の生存率に対する保存溶液組成の影響を示している。ヒト吸引脂肪組織から単離した直後、１．５×１０^６個の生存ヒト間質血管細胞を、１．０ｍｌ試験溶液中で懸濁し、無菌クライオバイアルに移した。クライオバイアルを、温度を２〜８Ｃに維持するための冷パックを含む発泡スチロール運送容器中に配置した。運送容器を密封し、地元の発送センターに輸送し、翌日配達便で研究室の場所に運送した。前記容器内にクライオバイアルを配置してから２４時間後、容器を開け、クライオバイアルから細胞を回収し、図１０に示される通りに細胞生存率を評価した。バーは、各試験溶液についての３連測定値の平均値を示している。

上記に記載された研究及び結果を見ると、低濃度の本発明のＧＡＧ製剤（例えば、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物）に暴露した再生細胞は、細胞増殖及びコロニー形成能を増加させ（Ｐ＜０．０５）、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１４６、ＣＤ１１７、ＣＤ７３、及びＣＤ１０５等の重要な再生細胞マーカーを発現する培養細胞の割合を富化させる。さらに、これらの製剤は、Ｓｏｘ２レベル（細胞の幹細胞性又は分化能のマーカー）を有意に増加させ（Ｐ＜０．０５）、再生細胞増殖の制御において重要であることが知られているＷｎｔ経路等の細胞経路に影響を与える。影響は顕著に用量依存的であったことに注目されたい。インビトロでのこれらのＧＡＧの存在は、培地中の分化合図（differentiation cue）の存在下であってさえ、増殖及び自己複製を促進した。ＧＡＧ製剤の非存在下においては効率的な分化が観察されたため、これらの影響は可逆的であった。

培養イヌＡｄ−ＭＳＣにおける遺伝子発現に対するＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮの影響を見ると、データは、ＣＤ４４レベル（ヒアルロン酸（ＨＡ）の受容体）の有意な増加、分化マーカーのレベルの減少、アポトーシス関連遺伝子のレベルの有意な減少、ＩＬ１ｂ及びＩＬ６等の炎症性サイトカインの発現の有意な減少、Ｃｏｌ．１Ａのレベルの増加、及び（ＦＧＦ）増殖因子のレベルの増加を示している。

これらのことから、上記実施例は、ＧＡＧ製剤の影響が強く用量依存的であったこと、及び非常に大きな差異がＧＡＧ製剤間で観察されたことを示している。増殖培地中１〜１０％（ｖ／ｖ）の希釈度のＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物中のヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、及びグルコサミンの組み合わせは、増殖及び自己複製を促進するのに最適であることが分かった。培地へのＨＡ単独の添加は、細胞増殖に対する影響と相関している、幹細胞性のマーカーであるＳｏｘ２に対して、より小さい程度ではあるが質的に同様の影響を誘発した。ＨＡ含有製剤の除去は、適切な培地における系譜特異的分化を可能にさせた。対照的に、市販のＧＡＧ製剤ＡＤＥＱＵＡＮ（多硫酸化ＧＡＧのみ）の添加は、増殖を阻害し、再生細胞の軟骨形成能を劇的に低減させた。これらの結果は、幹細胞及び再生細胞の培養及び投与に最適なＧＡＧ製剤が、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ組成物中のＧＡＧの割合に基づいていることを示している。
保存、運送、凍結保存、又は懸濁へのＧＡＧ製剤の効用は、本明細書に記載のＧＡＧ希釈においても証明される。本発明は、ＭＳＣが５％（ｖ／ｖ）のＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮを含有する製剤を添加した培地中でより急速に増殖すること、及びＧＡＧ製剤が除去された後にＭＳＣがインビトロでの効率的な分化を行うことが可能であることを報告している。培地中の低濃度（例えば、５％）のＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮは、ＭＳＣのマーカーの発現を誘導する。ＨＡのみを含有する市販ＧＡＧ製剤ＭＡＰ５は、有糸分裂誘導性であるが、ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮよりも作用が弱いと思われる。さらに、１０％ＰＯＬＹＧＬＹＣＡＮ、５％ＤＭＳＯ、８５％リンゲル液を含有する凍結保存培地は、ＦＢＳ及びＤＭＳＯを含有する標準対照培地と少なくとも同程度の性能をもたらす。

Claims (21)

1. 多系列分化能を有する細胞を培養する方法であって、
   細胞を、少なくとも２４時間、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）組成物を含む細胞培地中で培養することを含み、
   前記ＧＡＧ組成物が、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを、１：２０：２０の相対的な質量比で含み、
   前記ＧＡＧ組成物が５〜１０％（ｖ／ｖ）の濃度であり、
   前記培養細胞は、前記培地で培養されていない多系列分化能を有する細胞と比較して、増強されたインビトロ増殖速度を有し、多系列分化能を維持する、
   方法。
2. 前記ＧＡＧ組成物がヒアルロン酸、ＣＳ４及びＣＳ６コンドロイチン硫酸並びにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを５〜１０％（ｖ／ｖ）の濃度で含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記組成物が５〜７％（ｖ／ｖ）の濃度である、請求項２に記載の方法。
4. 前記組成物が５％（ｖ／ｖ）の濃度である、請求項３に記載の方法。
5. 前記細胞を前記ＧＡＧ組成物を含む培地添加物で処理した後に前記細胞を培養する、請求項１に記載の方法。
6. 前記ＧＡＧ組成物を含む可溶性マトリックスで被覆した表面上で前記細胞を増殖させる、請求項１に記載の方法。
7. 前記細胞が脂肪由来間葉系幹細胞（Ａｄ−ＭＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
8. 細胞の凍結保存及び多系列分化能の維持のための凍結保存培地であって、
   グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）組成物を含み、
   前記ＧＡＧ組成物が、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを、１：２０：２０の相対的な質量比で含む、
   凍結保存培地。
9. 前記ＧＡＧ組成物がヒアルロン酸、ＣＳ４及びＣＳ６コンドロイチン硫酸並びにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを５〜５０％（ｖ／ｖ）の濃度で含む、請求項８に記載の凍結保存培地。
10. 前記培地が細胞投与のための担体又は可溶性マトリックスをさらに含む、請求項８に記載の凍結保存培地。
11. 単離された再生細胞をさらに含む、請求項８に記載の凍結保存培地。
12. 前記細胞が脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）である、請求項１１に記載の凍結保存培地。
13. −８０℃に冷却される、請求項１１に記載の凍結保存培地。
14. 細胞が少なくとも３日間培養される、請求項１に記載の方法。
15. 細胞が少なくとも６日間培養される、請求項１に記載の方法。
16. 前記ＧＡＧ組成物が、約５ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸ナトリウム塩、約１００ｍｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸ナトリウム、及び約１００ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む、請求項１に記載の方法。
17. 再生細胞を０℃以上の温度でグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）組成物と組み合わせることを含む、再生細胞の凍結保存方法であって、
    前記ＧＡＧ組成物が、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを、１：２０：２０の相対的な質量比で含み、
    前記温度が−１８℃以下に下げられる、
    方法。
18. 前記ＧＡＧ組成物がヒアルロン酸、ＣＳ４及びＣＳ６コンドロイチン硫酸並びにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを５〜６０％（ｖ／ｖ）の濃度で含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記組成物が約５０％（ｖ／ｖ）の濃度である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記組成物が、少なくとも７日間、−１８℃以下の温度で維持される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記細胞が脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）である、請求項１７に記載の方法。

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