JP6778113B2 - 生体成分用保存剤及び生体成分の回収方法 - Google Patents
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Description
修飾ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸由来の多糖類高分子鎖(以下、場合によりヒアルロン酸糖鎖という。)を有し、水酸基と反応して架橋構造を形成する置換基を有する。
−CH2CH2−(CH2)m−(OCH2CH2)n−(CH2)m−NH−CO− (2)
なお、式(2)における左端には、ヒアルロン酸糖鎖中の窒素原子が結合し、右端にはベンゼン環の炭素原子が結合する。
修飾率(%)=修飾ヒアルロン酸中の上記置換基の量(モル)/(修飾ヒアルロン酸中の上記置換基の量(モル)+修飾ヒアルロン酸中のヒアルロン酸由来のカルボキシル基の量(モル))
乾燥した修飾ヒアルロン酸粉末を、濃度0.03〜0.1%(w/v)となるように蒸留水で完全に溶解する。溶解した修飾ヒアルロン酸溶液をマイクロチューブに40μL入れ、ここにホウ酸硫酸試薬(四ホウ酸ナトリウム十水和物0.95gをはかりとり、硫酸100mLに加え4時間以上スターラー装置で攪拌し溶解)を200μL入れ、ボルテックスで攪拌した後、約100℃のヒートブロックで加熱する。30分後、直ちに取出し氷水中で冷却し、室温に戻す。カルバゾール試薬(1.25g/Lのカルバゾール濃度を有する95%エタノール溶液)を10μL添加し、ボルテックスで攪拌した後、約100℃のヒートブロックで加熱する。15分後、直ちに取出し氷水中で冷却し、室温に戻す。得られた試料を96ウェルプレートに100μLずつ入れ、マイクロプレートリーダー(VERSAmax、モレキュラーデバイスジャパン株式会社)を用いて、波長530nmの吸光度を測定する。
このとき、D−グルクロノラクトン水溶液を標準溶液とする。D−グルクロノラクトン0.500gを100mLメスフラスコに精密にはかりとり、水で溶解後メスアップし、標準原液を作製する。標準原液を蒸留水で希釈し、2.5μg/mL、10μg/mL、40μg/mLの溶液をそれぞれ調製する。これらを用いて吸光度の検量線データを取得し、未修飾部分のヒアルロン酸量(濃度)を算出する。なお、D−グルクロノラクトン量(濃度)をヒアルロン酸量(濃度)へ変換するための係数は2.279とした。ここで測定された未修飾部分のヒアルロン酸量から、下記式によって修飾ヒアルロン酸のヒアルロン酸由来のカルボキシル基の量(mol)を算出する。
修飾ヒアルロン酸のヒアルロン酸由来のカルボキシル基の量(mol)=測定された未修飾部分のヒアルロン酸量(g)/398(ヒアルロン酸の二糖単位の分子量)
乾燥した修飾ヒアルロン酸粉末を、蒸留水で溶解する。この修飾ヒアルロン酸溶液0.3mLと0.2N水酸化ナトリウム溶液0.3mLとを混合した溶液を測定試料とする。原子吸光測定装置(A−6800、島津製作所製)にパイロ化チューブを設置し、以下の表1に示すプログラムを設定する。測定試料を20μL、測定位置に入れ測定を行う。プログラムのRAMPは、目的温度まで設定時間をかけて、一定勾配で上昇することを意味し、STEPは直ちに目的温度まで上昇することを意味する。
この測定では、ホウ素標準液(1000ppm、和光純薬)を用いて、蒸留水で希釈し、濃度0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.6μg/mL、2.0μg/L、2.5μg/mLに調整した溶液を標準液とする。濃度0μg/mLには蒸留水を用いる。これらの溶液も修飾ヒアルロン酸溶液と同様、等量の0.2N水酸化ナトリウム溶液と混合し、ホウ素量を原子吸光測定装置で測定する。測定結果から検量データを取得し、ホウ素原子量(すなわち、ジヒドロボリル基の量)(モル)を算出した。
複数の水酸基を有する化合物としては、修飾ヒアルロン酸と架橋構造を形成してハイドロゲルを形成し得る化合物であれば、特に制限なく使用することができる。例えば、上記化合物の分子量、けん化度等は特に制限されない。
本実施形態に係る保存剤は、上記ハイドロゲル以外の成分を含んでいてもよく、上記ハイドロゲルが上記架橋体以外の成分を含んでいてもよい。
(実施例1)
分子量5万のヒアルロン酸1.0gをフラスコに入れ、150mLの蒸留水を加え、完全に溶解した。75mLの1,4−ジオキサンを加えた後、0.54gのm−アミノフェニルボロン酸(和光純薬社製)を添加した。室温で2時間撹拌した後、1.2gの1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(ナカライテスク社製)と、0.7gのN−ヒドロキシコハク酸イミド(ナカライテスク社製)を添加した後、室温で12時間撹拌した。反応液のpHが8.5以上となるように、5M炭酸水素ナトリウム溶液を滴下し、一昼夜撹拌した。反応液に塩化ナトリウムを4.5g加え、溶解後にアセトン225mLを徐々に入れ、修飾ヒアルロン酸を析出した。デカンテーションで上清を除去し、蒸留水で希釈した80%アセトンを100mL入れ、1時間撹拌する操作を3回行った。続いて、アセトン100mLを加え、1時間撹拌する操作を3回行った。析出物を回収し、減圧条件下で風乾した。修飾ヒアルロン酸を蒸留水で溶解し、修飾率を測定したところ、修飾率11.4mol%であった。
(実施例2)
細胞は、マウスES細胞(EB5)を用いた。ポリビニルアルコール(JF−17、日本酢ビ・ポバール株式会社製)と分子量5万の未修飾ヒアルロン酸を終濃度1.0%となるように、リン酸カリウム緩衝液(pH6.8)に溶解した(溶液A)。培養用48ウェルプレートの各ウェルに溶液Aを0.2mL入れ、ウェル底面に液を均一にしておいた。培養2日目の細胞をトリプシンで処理することで、培養皿から細胞を回収し、導入率11.4mol%の実施例1で作製した修飾ヒアルロン酸をリン酸カリウム緩衝液(pH6.8)で溶解し、終濃度1.0%溶液(溶液B)とし、0.2mLずつ、上記ウェル内に入れて撹拌し、ハイドロゲルを形成させた。ハイドロゲル形成後、冷蔵(約4℃)で5日間保存した。
細胞の生存率(−)=(計測した全細胞中の生細胞数)/(計測した全細胞数)
溶液Aから、未修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例2と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。
溶液Bから、修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例2と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。
溶液Aから、ポリビニルアルコールを除いた以外は、実施例2と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。
溶液Aから、未修飾ヒアルロン酸を除き、溶液Bから修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例2と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。
溶液Aから、ポリビニルアルコールを除き、溶液Bから修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例2と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。
溶液Aからポリビニルアルコール及び未修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例2と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。
溶液Aからポリビニルアルコール及び未修飾ヒアルロン酸を除き、溶液Bから修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例2と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。
10mgのチオール修飾ヒアルロン酸(HyStem;Glycosan BioSystems)を、1.0mLのリン酸緩衝生理食塩水に溶解した。2.5mgの架橋開始剤(Extralink;Glycosan Biosystems)を、0.25mLの蒸留水で溶解した。培養2日目のマウスES細胞(EB5)を終濃度が1.0×106cells/mLとなるように、1.0mLのチオール修飾ヒアルロン酸溶液に懸濁した後、0.25mLの架橋開始剤溶液を混合し、すぐに48ウェルプレートに0.4mLずつ小分けし、室温で30分間静置することでゲルを得た。このゲルを冷蔵(約4℃)で5日間保存した。
(実施例4)
修飾率11mol%、分子量約200万のアミノフェニルボロン酸修飾ヒアルロン酸を、生理的リン酸緩衝液に溶解し、0.5、1.0、2.0%(w/v)となるよう濃度を調整した。各濃度の修飾ヒアルロン酸溶液0.2mLと、ポリビニルアルコール0.2mLとを混合し、ハイドロゲルを作製した。このハイドロゲルを、生理食塩水、又は10mg/mLソルビトール含有生理食塩水9.6mLに入れ、室温でスターラー攪拌しながら溶解した。経時的に数回、上清を0.2mLずつ回収した。回収液中のヒアルロン酸量を上述したカルバゾール硫酸法で測定し、上清中のヒアルロン酸濃度を算出した。ゲルの溶解度を以下の式で算出した。
ゲルの溶解度=上清中のヒアルロン酸濃度(%)/完全溶解後のヒアルロン酸濃度(%)
ソルビトール含有生理食塩水の代わりに、ソルビトールを含まない生理食塩水を用いた以外は、実施例4と同様の方法によって、HL50を求めた。ハイドロゲル内の修飾ヒアルロン酸の濃度とHL50との関係は、図2に示すとおりとなった。
(実施例5)
修飾率が11mol%のアミノフェニルボロン酸修飾ヒアルロン酸を作製し、濃度が1%(w/v)となるようにリン酸緩衝生理食塩水に溶解して、測定サンプルとした。また、ポリビニルアルコールを濃度1%(w/v)となるようにリン酸緩衝生理食塩水で調製し、測定サンプルとした。また、1%(w/v)修飾ヒアルロン酸溶液と、1%(w/v)ポリビニルアルコール溶液とを等量混合し、ハイドロゲルの濃度1%(w/v)の測定サンプルを作製した。
(実施例6)
細胞は、ヒトiPS細胞(253G1)を用いた。ポリビニルアルコール(JF−17、日本酢ビ・ポバール株式会社製)を終濃度1.0%、分子量5万の未修飾ヒアルロン酸を終濃度3.0%となるように、リン酸カリウム緩衝液(pH6.8)に溶解した(溶液A)。修飾率11.4mol%の実施例1で作製した修飾ヒアルロン酸をリン酸カリウム緩衝液(pH6.8)で溶解し、終濃度3.0%溶液(溶液B)とした。培養用6ウェルプレートにMEF細胞を播種し、一晩培養後、ヒトiPS細胞を播種した。そのまま3日間培養し、溶液Bを1.0mLずつ入れてなじませた。ついで溶液Aを1.0mLずつ入れ、揺することで撹拌し、ハイドロゲルを形成させ、包埋した。ハイドロゲル形成後、冷蔵(約4℃)で5日間保存した。
細胞群の残存率(−)=(保存5日目の細胞群数)/(保存前の細胞群数)
溶液Aからポリビニルアルコール及び未修飾ヒアルロン酸を除き、溶液Bから修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例6と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。
溶液AとBの代わりに、セリオキープ(バイオベルデ)を2.0mL添加した以外は、実施例6と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。
(実施例7)
細胞は、マウスES細胞(EB5)を用いた。ポリビニルアルコール(JF−17、日本酢ビ・ポバール株式会社製)を終濃度1.0%、分子量5万の未修飾ヒアルロン酸を終濃度3.0%となるように、リン酸カリウム緩衝液(pH6.8)に溶解した(溶液A)。修飾率11.4mol%の実施例1で作製した修飾ヒアルロン酸をリン酸カリウム緩衝液(pH6.8)で溶解し、終濃度3.0%溶液(溶液B)とした。培養2日目の細胞をトリプシンで処理し、培養皿から細胞を15mLのコニカルチューブに回収した。遠心後に上清を除去し、細胞濃度が1×106/mLとなるように溶液Bを添加して懸濁した。この懸濁液0.5mLを15mLコニカルチューブに入れ、溶液Aを0.5mL添加して上下に反転撹拌し、ハイドロゲルを形成させた。ハイドロゲル形成後、冷蔵庫内(約4℃)で回転培養装置にセットした。この時、回転培養装置の回転軸方向は水平に、チューブの芯軸方向を回転軸方向に対して垂直となるようにし、30rpmで回転させながら5日間保存した。
溶液Aからポリビニルアルコール及び未修飾ヒアルロン酸を除き、溶液Bから修飾ヒアルロン酸を除いた以外は、実施例7と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。
溶液AとBの代わりに、セリオキープ(バイオベルデ)を1.0mL添加した以外は、実施例7と同様の方法で細胞の包埋、保存及び回収を行った。
Claims (8)
- 前記ハイドロゲルが、細胞用培地及び生理緩衝液から選ばれる少なくとも1種を更に含む、請求項1に記載の保存剤。
- 前記生体成分が、細胞、細胞から構築された2次元又は3次元細胞凝集体、及び生体由来の組織又は臓器から選ばれる少なくとも1種を含む、請求項1又は2に記載の保存剤。
- 請求項5に記載の混合物を製造する方法であって、
前記化合物、前記修飾ヒアルロン酸及び前記生体成分を混合して、前記ハイドロゲルを形成しつつ前記生体成分を前記ハイドロゲルに包埋させる工程を含む、製造方法。 - 請求項5に記載の混合物から、生体成分を回収する方法であって、
前記架橋体の架橋構造の少なくとも一部を解離して、前記ハイドロゲルを水可溶化させる工程を含む、回収方法。
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