KR20170005450A

KR20170005450A - 바로 프린트할 수 있는 세포 및 통합 장치

Info

Publication number: KR20170005450A
Application number: KR1020167034122A
Authority: KR
Inventors: 조나단 알렌 롤리; 라이 텡 록
Original assignee: 루스터바이오, 인크.
Priority date: 2014-05-12
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2017-01-13
Also published as: EP3142485B1; JP6817194B2; CA2948820A1; EP3142485A1; EP3142485A4; AU2015259373B2; CN106659148A; US11058106B2; JP2017515510A; AU2015259373A1; US20170079262A1; WO2015175457A1; CA2948820C; IL248911A0; KR102311902B1; ES2880948T3

Abstract

본원에는 실험적, 치료적 및 조직 공학 프로토콜을 위한 바로 사용할 수 있는 포맷으로 세포 물질을 제공하는 조성물, 장치 및 방법이 개시되어 있다. 예를 들면, 응집물로서 존재하는 동결되거나 동결되지 않은 세포를 함유하는 조성물이 개시되어 있다. 또한, 저장 후, 예를 들면, 3D 프린팅에 의한 분산에 적합한 세포 물질을 함유하는 조성물이 개시되어 있다. 또한, 바이오잉크 조성물을 제조하기 위한 키트가 개시되어 있다. 또한, 본원에 기재된 세포 물질 조성물을 포함하는 폐쇄계 장치가 개시되어 있다.

Description

바로 프린트할 수 있는 세포 및 통합 장치 {READY-TO-PRINT CELLS AND INTEGRATED DEVICES}

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 2014년 5월 12일자로 출원된 미국 가특허원 제61/992,184호의 이익을 청구하며, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함되어 있다.

재생 의학이 진료소에서 대단한 장래성을 보이고 있지만, 연구원들이 실험 및 임상 시험을 수행할 수 있는 세포 물질의 비용 및 이용가능성이 이 분야를 저해하고 있다. 고품질 및 저비용으로 제조되고 제품 개발과 제조 노력을 가속화시키는 품질과 포맷으로 번역 연구원 및 장치 제조업자에게 전달되는 표준화된 일차 세포가 강력하게 요구되고 있다. 또한, 바이오프린팅과 같은 조직 공학 분야를 위한 충분한 저장 수명을 갖는 세포 포맷이 요구된다. 특히, 바로 사용할 수 있고 안정한 포맷의 중간엽 줄기 세포(MSC)가 조직 공학 및 세포 요법 분야를 위해 요구된다.

본원에는 실험적, 치료적 및 조직 공학 프로토콜을 위한 "바로 사용할 수 있는" 포맷으로 세포 물질을 제공하는 조성물, 장치 및 방법이 개시되어 있다. 예를 들면, 중간엽 줄기 세포를 포함하는 응집물을 포함한, 응집물로서 존재하는 동결되거나 동결되지 않은 세포를 함유하는 조성물이 개시되어 있다. 응집물은 응집물 당 약 1,000 내지 약 100,000개 세포를 포함하여, 응집물 당 평균 약 100 내지 200,000개 세포를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 응집물은 응집물 당 평균 약 1,000, 5,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 110,000, 120,000, 130,000, 140,000, 150,000, 160,000, 170,000, 180,000, 190,000, 또는 200,000개 세포를 함유한다. 예로서, 세포 응집물은, 예를 들면, 3D 프린팅에 의한 조직 공학을 위한, 및 세포 요법 분야에 대한 기능성 이식 가능한 대상을 위한 구성 블럭으로서 사용될 수 있다. 따라서, 세포 응집물의 특징은 응집물 내의 개별 세포들이 이들의 생존능과 기능을 유지하고, 응집되는 경우 배양액 중에서 서로 융합하여 기능적 조직을 형성할 수 있는 능력이다. 따라서, 응집물이 융합하는 능력은 우수한 세포 생존률 및 기능을 입증할 수 있다. 응집물은 또한 바람직하게는 유사한 크기와 체적의 것이다. 예를 들면, 몇몇 실시형태에서, 조성물 내의 각각의 세포 응집물은 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 미만의 평균 직경 분산을 갖는다.

개시된 조성물은 적어도 70%의 세포 생존률을 유지하기에 충분한 양으로 냉동보존제 및/또는 생물보존제(biopreservative agent)를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 세포는 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60개월 동안 -10 내지 -80℃, 예를 들면, -20℃에서 저장한 후 세포 응집물이 융합하는 능력을 보유하기에 충분한 양의 디메틸 설폭사이드 (DMSO)와 같은 냉동보존제를 갖는 동결된 세포일 수 있다. 또 다른 예로서, 세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30일 동안 0 내지 25℃, 예를 들면, 4℃에서 저장한 후 세포 응집물이 융합하는 능력을 보유하기에 충분한 양의 생물보존제, 예를 들면, 하이포써모솔(HypoThermosol)®을 갖는 동결되지 않은 세포일 수 있다.

개시된 조성물의 세포는 세포 응집물을 형성하고 함께 배양되는 경우 융합할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 일부 경우에, 세포는 조작되는 목적하는 조직에 상응하는 세포 계보 포텐셜을 갖는 미분화 줄기 세포 또는 전구 세포(progenitor cell)이다. 세포는 단분화능, 소분화능(oligopotent), 다분화능, 또는 전분화능(pluripotent)일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 성체 줄기 세포이다. 세포는 바람직하게는 동종이계이거나 자가조직이다. 특정 실시형태에서, 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 포함한다. 조성물은 단일 세포 유형, 예를 들면, MSC를 함유할 수 있다. 그러나, 몇몇 실시형태에서, 조성물은 둘 이상의 상이한 유형의 세포, 즉, 둘 이상의 상이한 계보의 세포를 함유한다. 세포는 동물 세포, 예를 들면, 인간 세포일 수 있다.

또한, 저장 후, 예를 들면, 3D 프린팅에 의한 분산에 적합한 세포 물질을 함유하는 조성물이 개시된다. 개시된 조성물은, 세포가 밀리리터 당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 백만개 세포를 포함하여 밀리리터 당 1 내지 100 백만개 세포의 평균 세포 밀도가 되도록 점성 기질(viscous matrix)에 현탁된 세포를 함유한다. 또한, 점성 기질은 조성물에서 세포 밀도 분산을 적어도 24, 36, 48, 72, 또는 120시간 동안 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 미만으로 유지하는데 효과적인 점도를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물 중의 세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30일 동안 0 내지 25℃, 예를 들면, 4℃에서 저장된 후 적어도 70%의 세포 생존률을 갖는다. "생존성"이란 세포가 살아있고 기능적임을 의미한다. 세포의 기능은 세포의 유형에 따라 변할 수 있지만, 복제하거나, 사이토킨을 분비하거나, 성장 인자를 분비하거나, 조직 배양 플라스틱에 부착하거나, 다른 세포에 부착하거나, 이동할 수 있는 능력 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 생존률을 결정하는 것은 세포에 의해 생산된 하나 이상의 효소의 존재 및/또는 활성을 검출함을 포함한다. 위와 같이, 세포는 응집물로서 존재할 수 있다. 응집물에서 세포의 생존률을 평가하는 중요한 한 가지 방식은 응집물이 융합하는 능력을 시험하는 것이다. 따라서, 조성물은 생물보존제, 냉동보존제, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.

세포를 현탁시키는데 사용되는 점성 기질은 3D 프린팅 및/또는 조직 공학에 적합한 임의의 생체적합성 중합체일 수 있다. 일부 경우에, 중합체는 바이오중합체이다. 예를 들면, 적합한 바이오중합체는 다당류, 폴리펩타이드, 및 당단백질을 포함한다. 이것은 천연 또는 합성-유도된 세포외 기질(ECM) 분자를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 생체적합성 중합체는 알기네이트를 포함한다. 생체적합성 중합체의 점도는 세포의 현탁을 유지하면서도 바람직하게는, 예를 들면, 니들 또는 노즐을 통한 주사에 의한 분산을 위해 충분한 유체이도록 조절될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포는 조성물에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30일 동안 5%, 10%, 15%, 또는 20% 미만의 밀도 분산을 유지한다.

또한, 바이오잉크 조성물을 제조하기 위한 키트가 개시된다. 일부 경우에, 키트는 응집물 당 평균 약 1,000 내지 약 100,000개 세포를 함유하는 세포 응집물을 포함하는 조성물을 함유한다. 키트는 또한 생체적합성 중합체를 함유할 수 있다. 생체적합성 중합체는 세포 응집물과 동일하거나 상이한 용기에 존재할 수 있다. 키트는 또한 가교결합제를 함유할 수 있다. 이러한 제제도, 생체적합성 중합체와 가교결합제가 상이한 용기에 존재하는 한, 세포 응집물과 동일하거나 상이한 용기에 존재할 수 있다.

또한, 본원에 기재된 세포 물질 조성물을 포함하는 폐쇄계 장치가 개시된다. 폐쇄계 장치는 이산 단위(discrete unit)로서 표면에 조성물을 분배하도록 구성될 수 있다. 예를 들면, 각각의 이산 단위는 몇몇 실시형태에서 조절량의 세포를 함유할 수 있다. 폐쇄계 장치의 예는 삼차원 (3D) 프린터 장치에서 사용하기 위한 카트리지와 같은 카트리지이다.

본 발명의 하나 이상의 실시형태의 상세한 설명이 아래 첨부된 도면 및 설명부에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 특징들, 목적들 및 이점들은 상세한 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구항으로부터 자명해질 것이다.

도 1a는 플레이팅한지 2hr 후 부착된 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 이미지를 보여준다. 도 1b는 플레이팅하여 2번 계대배양 동안 확대시킨 후의 MSC의 두 개의 로트에 대한 성장 곡선이다.
도 2는 냉동보존된 MSC를 해동 및 확대시킨 후 MSC의 세 개의 로트가 CD73, CD90, CD105 및 CD166을 발현하며, CD45, CD34, 및 CD14에 대해서는 음성임을 보여주는 막내 그래프이다.
도 3은 냉동보존된 MSC를 해동 및 확대시킨 후 MSC의 세 개의 로트에서의 혈관형성 사이토킨의 분비 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 4는 냉동보존된 MSC를 해동 및 확대시킨 후 MSC는 지방세포형성(adipogenic)(A) 및 골형성(osteogenic)(B) 계통으로 분화함을 보여준다.
도 5는 냉동보존된 MSC를 해동 및 확대시킨 후 MSC가 이들의 면역조절 기능을 유지함을 보여주는 막대 그래프이다.
도 6a 및 6b는 hMSC 응집물 형성을 보여주는 이미지이다.
도 7a는 대사적으로 활성인 살아있는 세포를 나타내는 MSC 응집물 자연 융합(spontaneous fusion)을 보여주는 이미지이다. 도 7b는 대사적으로 활성인 살아있는 세포를 나타내는 MSC 응집물 부착을 보여준다.
도 8은 플레이팅되어 37℃ 배양에서 항온처리되는 경우 MSC 응집물이 혈관형성 사이토킨을 계속해서 분비함을 보여주는 막대 그래프이다.
도 9는 MSC 응집물의 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나제(IDO) 활성을 보여주는 막대 그래프이다.
도 10a는 알기네이트 중에서 캡슐화되어 CaCl2로 압출된 단일 세포 및 응집물 MSC를 보여주는 이미지이다. 도 10b는 캡슐화 후 칼세인-AM으로 염색된 매우 생존성인 MSC 응집물을 보여주는 이미지이다(녹색. 도 10c는 압출된 알기네이트 중의 MSC 응집물의 융합을 보여주는 이미지이다).
도 11은 TC 플레이트에서 배양한지 1일 후, 하이포써모솔, 배지, 또는 4% HSA를 갖는 염수 중에서 4℃에서 3일 및 7일 동안 저장된 hMSC 응집물을 보여주는 일련의 이미지이다.
도 12는 TC 플레이트에서 배양한지 6일 후, 하이포써모솔, 배지, 또는 4% HSA를 갖는 염수 중에서 4℃에서 3일 및 7일 동안 저장된 hMSC 응집물을 보여주는 일련의 이미지이다.
도 13은 비-부착 플레이트에서 배양한지 1일 후, 하이포써모솔, 배지, 또는 4% HSA를 갖는 염수 중에서 4℃에서 3일 및 7일 동안 저장된 hMSC 응집물을 보여주는 일련의 이미지이다.
도 14는 HTS, 염수, 배지 중에서 4℃에서 3일 및 7일 동안 저장 후 MSC 응집물에 의한 IDO 활성을 보여주는 막대 그래프이다.
도 15는 HTS, 염수, 배지 중에서 4℃에서 3일 또는 7일 동안 저장 후 MSC 응집물에 의한 Ang-2, FGF, HGF, IL-8, TIMP-1, TIMP-2, 및 VEGF 분비를 보여주는 막대 그래프이다.
도 16은 냉동보존된 hMSC 응집물이 융합하는 능력, 및 개별 세포들이 조직 배양(TC) 플라스틱에 부착하여 응집물로부터 성장하는 능력을 유지함을 보여주는 일련의 이미지이다.
도 17은 냉동보존된 응집물이 유도성 면역조절 표현형을 유지함을 보여주는 막대 그래프이다.
도 18은 냉동보존된 및 동결되지 않은 MSC 응집물의 Ang-2, FGF, HGF, IL-8, TIMP-1, TIMP-2, 및 VEGF 분비를 보여주는 막대 그래프이다.
도 19a 내지 19c는 냉동보존된 MSC 응집물이 고리 형상으로 제조될 수 있음을 보여주는 이미지이고(도 19a-19b), H&E 염색은 고리 구조 전반에 걸친 응집물의 일관된 건강한 융합을 입증한다(도 19c).
도 20a는 응집물 당 1000개 세포로 만들어진 100,000개의 응집물의 생성을 예시하는 공정 흐름도이다. 도 20b는 세포 확대에 대한 시간 절약(일수)을 보여주는 막대 그래프이다.
도 21a는 상이한 알기네이트 제형의 인쇄적성 시험을 보여주는 이미지이다. 도 21b는 상이한 알기네이트 제형의 조도 및 점착성을 보여주는 차트이다.
도 22는 상이한 알기네이트 제형의 침강(settling) 및 군집(clumping)을 보여주는 차트이다.
도 23은 4℃에서 7일간 저장 및 TC 플레이트에 접종시 응집물로부터의 팽창 후 하이드로겔에서의 MSC 응집물 생존을 보여주는 일련의 이미지이다.
도 24a & 24b는 MSC 응집물 제품 사양을 위한 바이오잉크 키트를 보여주는 이미지이다.
도 25는 제품 운송 및 4℃에서의 저장에 적합한, 최종 MSC 응집물 바이오잉크 제품 사양의 이미지이다.

개시된 조성물, 장치, 및 방법은 재생 의학, 줄기-세포-기반 기술 및 의료 장치, 조직 공학, 생물의학 연구 및 개발, 세포 원료 및 살아있는 세포 유래의 기능성 물질의 분야에 관한 것이다. 특히, 이러한 세포 또는 세포 유래 물질을 생물학적 및 생물의학적 제품에 삽입할 수 있도록 하는 포맷으로 전달되는 살아있는 기능성 세포의 안정한 조성물 및 제형이 개시된다.

본원에는 세포를 조작된 조직, 의료 장치, 또는 살아있는 기능성 세포를 필요로 하는 기타의 제품에 삽입할 수 있도록 하는 매우 기능적인 살아있는 세포의 안정한 제형이 제공된다. 예를 들면, 재생 의학, 조직 공학, 및 바이오프린팅 분야에서 사용하기 위한 세포 조성물이 개시된다. 본원에 제공된 안정한 제형은 세포 또는 세포성 응집물을 높은 생존성 및 기능성 상태로 현탁액 중에 유지한다.

조성물은 세포의 제형을 수 일, 주, 또는 개월의 저장 후 바로 사용할 수 있는 균질 또는 이질 세포 응집된 세포로서 또는 단일 세포 현탁액으로서 함유할 수 있다. 세포 제형은 세포 생존능 및 기능성을 유지시킬 수 있다. 세포는 몇몇 제형에서 바람직하게는 저장 동안 침강 없이 현탁액 중에 남아 있으며, 생존능 및 기능을 유지하면서 특정 위치로 전달될 수 있는 능력을 갖는다. 안정한 제형은 동결된(즉, 냉동보존된) 또는 동결되지 않은(생물보존된) 상태로 수 주 내지 수 개월 또는 수 년 동안 안정할 수 있다. 동결된 상태란, 안정한 제형이 동결 온도(예를 들면, 섭씨 0도 또는 그 미만, 및 전형적으로 적어도 섭씨 -20도) 이하에 있음을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 동결된 상태로 저장된 제형은 냉동보존제를 추가로 포함한다. 동결되지 않은 상태란, 안정한 제형이 동결 온도 초과(예를 들면, 섭씨 0도 또는 그 초과), 전형적으로 적어도 섭씨 2도에 있음을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 동결되지 않은 상태는 섭씨 0 내지 37도, 예를 들면, 섭씨 4 내지 24도를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "세포"는 또한 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 개발 세포, 세포주, 일차 배양물, 또는 이러한 세포로부터 유도된 배양물을 말한다. "배양물"은 동일하거나 상이한 유형의 단리된 세포를 포함하는 조성물을 말한다.

몇몇 실시형태에서, 개시된 조성물은 줄기 세포 또는 전구 세포를 함유한다. 전분화능 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 배반포-유래 줄기 세포, 생식선 능선-유래 줄기 세포, 테라토마-유래 줄기 세포, 전능성 줄기 세포, 다분화능 줄기 세포, 온코스타틴-비의존성 줄기 세포(OISC), 배아 줄기 세포(ES), 배아 생식 세포(EG), 및 배아 암종 세포(EC)가 줄기 세포의 모든 예이다. 줄기 세포는 각종 상이한 특징들과 이러한 특징들의 카테고리를 가질 수 있다. 예를 들면 몇몇 형태에서 줄기 세포는 미분화된 상태에서 적어도 10, 15, 20, 30, 또는 그 이상의 계대배양을 위해 증식할 수 있다. 몇몇 형태에서 줄기 세포는 분화 없이 1년 이상 동안 증식할 수 있다. 줄기 세포는 또한 증식 및/또는 분화하면서 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 줄기 세포는 또한 생식 세포, 난 및 정자를 포함한 중배엽, 내배엽, 및 외배엽 조직으로 분화하는 능력을 보유할 수 있다. 몇몇 줄기 세포는 또한 미분화된 상태에서 시험관내 무한 증식할 수 있는 세포일 수 있다. 몇몇 줄기 세포는 또한 연장된 배양을 거쳐 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 몇몇 줄기 세포는 연장된 배양 후에도 세 가지 모든 배아 생식 층(내배엽, 중배엽, 및 외배엽)의 유도물로 분화될 가능성을 유지할 수 있다. 몇몇 줄기 세포는 유기체에서 어떠한 세포 유형도 형성할 수 있다. 몇몇 줄기 세포는 미분화된 성장을 유지하지 않는 배지에서의 성장과 같은 특정 조건하에서 배양체(embryoid body)를 형성할 수 있다. 몇몇 줄기 세포는, 예를 들면, 배반포와 융합을 통해 키메라를 형성할 수 있다.

일부 줄기 세포는 각종 마커에 의해 정의될 수 있다. 예를 들면, 일부 줄기 세포는 알칼리성 포스파타제를 발현한다. 일부 줄기 세포는 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및/또는 TRA-1-81을 발현한다. 일부 줄기 세포는 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, 및/또는 TRA-1-81을 발현하지 않는다. 일부 줄기 세포는 Oct 4, Sox2, 및 Nanog을 발현한다. 일부 줄기 세포는 이들을 mRNA 수준에서 발현할 것이며, 여전히 다른 줄기 세포들은 또한 이들을 단백질 수준에서, 예를 들면, 세포 표면 상에서 또는 세포 내에서 발현할 것으로 이해된다.

몇몇 실시형태에서, 개시된 조성물은 줄기 세포 이외의 세포를 포함한다. 성인 사람 신체는 다수의 상이한 세포 유형을 생산한다. 이러한 상이한 세포 유형은 각질화 상피 세포, 습윤 층화 장벽 상피 세포, 외분비 상피 세포, 호르몬 분비 세포, 상피 흡수 세포(내장, 외분비선 및 비뇨생식로), 대사 및 저장 세포, 장벽 기능 세포(폐, 내장, 외분비선 및 비뇨생식로), 상피 세포 내벽 폐쇄 내부 체강, 추진 기능을 갖는 섬모 세포, 세포외 기질 분비 세포, 수축성 세포, 혈액 및 면역계 세포, 감각 변환기 세포, 자율 신경 세포, 감각 기관 및 말초 신경 세포 지지 세포, 중추 신경계 신경 세포 및 아교 세포, 수정체 세포, 색소 세포, 생식 세포, 및 영양 세포를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.

사람 신체의 세포는 각질화 상피 세포, 표피 각질세포 (분화성 표피 세포), 표피 기저 세포 (줄기 세포), 손톱 및 발톱의 각질세포, 손톱밑바닥 기저 세포 (줄기 세포), 수질 모간 세포, 피질 모간 세포, 각피 모간 세포, 각피 모근초 세포, 헉슬리 층의 모근초 세포, 헨레 층의 모근초 세포, 외부 모근초 세포, 모 기질 세포 (줄기 세포), 습윤 층화 장벽 상피 세포, 각막, 혀, 구강, 식도, 항문관, 말초 요도 및 질의 층화 편평 상피의 표면 상피 세포, 각막, 혀, 구강, 식도, 항문관, 말초 요도 및 질의 상피의 기저 세포 (줄기 세포), 비뇨기 상피 세포 (내벽 방광 및 비뇨기 관), 외분비 상피 세포, 타액선 점액 세포 (다당류-풍부 분비), 타액선 장액 세포 (당단백질 효소-풍부 분비), 혀의 폰 에브너선 세포 (미뢰를 씻어냄), 유선 세포 (젖 분비), 누선 세포 (눈물 분비), 귀의 이도선 세포 (귀지 분비), 소한선 암 세포(Eccrine sweat gland dark cell)(당단백질 분비), 소한선 명 세포 (소 분자 분비), 대한선 세포 (냄새 분비, 성-호르몬 민감성), 눈꺼풀의 몰 세포 선(Gland of Moll cell)(특수한 한선), 피지선 세포 (지질-풍부 피지 분비), 코의 보만선 세포(후상피를 씻어냄), 십이지장의 브루너선 세포 (효소 및 알칼리성 점액), 정낭 세포 (정자가 수영하기 위한 프럭토스를 포함한, 정액 성분을 분비함), 전립선 세포 (정액 성분을 분비함), 요도구선 세포 (점액 분비), 바르톨린선 세포 (질 윤활제 분비), 리트레선(Gland of Littre) 세포 (점액 분비), 자궁 내막 세포 (탄수화물 분비), 호흡기 및 소화기의 단리된 배상 세포 (점액 분비), 위 내벽 점액 세포 (점액 분비), 위선 효소분비 세포 (펩시노겐 분비), 위선 산분비 세포 (HCl 분비), 췌장 포상 세포 (중탄산염 및 소화 효소 분비), 소장의 파네트 세포 (라이소자임 분비), 폐의 II형 폐포세포 (표면활성제 분비), 폐의 클라라 세포, 호르몬 분비 세포, 뇌하수체 전엽 세포 분비 성장 호르몬, 뇌하수체 전엽 세포 분비 여포-자극 호르몬, 뇌하수체 전엽 세포 분비 황체형성 호르몬, 뇌하수체 전엽 세포 분비 프로락틴, 뇌하수체 전엽 세포 분비 부신피질자극 호르몬, 뇌하수체 전엽 세포 분비 갑상선-자극 호르몬, 뇌하수체 중엽 세포 분비 멜라닌세포-자극 호르몬, 뇌하수체 후엽 세포 분비 옥시토신, 뇌하수체 후엽 세포 분비 바소프레신, 내장 및 호흡기 세포 분비 세로토닌, 내장 및 호흡기 세포 분비 엔돌핀, 내장 및 호흡기 세포 분비 소마토스타틴, 내장 및 호흡기 세포 분비 가스트린, 내장 및 호흡기 세포 분비 세크레틴, 내장 및 호흡기 세포 분비 콜레시스토키닌, 내장 및 호흡기 세포 분비 인슐린, 내장 및 호흡기 세포 분비 글루카곤, 내장 및 호흡기 세포 분비 봄베신, 갑상선 세포 분비 갑상선 호르몬, 갑상선 세포 분비 칼시토닌, 부갑상선 세포 분비 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호산성 세포, 부신 세포 자극 에피네프린, 부신 세포 자극 노르에피네프린, 부신 세포 자극 스테로이드 호르몬 (미네랄코르티코이드 및 글루코코르티코이드), 고환의 레디히 세포 분비 테스토스테론, 난소 여포의 내난포막 세포 분비 에스트로겐, 파열된 난소 여포의 항체 세포 분비 프로게스테론, 신장 방사구체 장치 세포 (레닌 분비), 신장의 치밀반 세포, 신장의 혈관극주위 세포, 신장의 혈관간막 세포, 상피 흡수 세포 (내장, 외분비선 및 비뇨생식로), 장내 브러시 보더 세포 (미세융모를 가짐), 외분비선 줄무늬관 세포, 쓸개 상피 세포, 신장 근위세뇨관 브러시 보더 세포, 신장 원위세뇨관 세포, 세관 원심성 비섬모 세포, 정소상체 주 세포, 정소상체 기저 세포, 대사 및 저장 세포, 간세포 (간 세포), 백색 지방 세포, 갈색 지방 세포, 간 지방세포, 장벽 기능 세포 (폐, 내장, 외분비선 및 비뇨생식로), I형 폐포세포 (폐의 내벽 공기 공간), 췌관 세포 (샘꽈리중심 세포), (한선, 타액선, 유선 등의) 비줄무늬관 세포, 신장 사구체 벽 세포, 신장 사구체 족세포, 헨레 고리 얇은 분절 세포 (신장에서), 신장 집합관 세포, (정낭, 전립선 등의) 관 세포, 상피 세포 내벽 폐쇄 내부 체강, 혈관 및 림프성 혈관 내피 유창 세포, 혈관 및 림프성 혈관 내피 연속 세포, 혈관 및 림프성 혈관 내피 비장 세포, 활막 세포 (내벽 관절 강, 히알루론산 분비), 장막 세포 (내벽 복막강, 흉막강, 및 위심강), 편평 세포 (귀의 내벽 외림프 공간), 편평 세포 (귀의 내벽 내림프 공간), 미세융모를 갖는 내림프강의 원주 세포 (귀의 내벽 내림프 공간), 미세융모가 없는 내림프강의 원주 세포 (귀의 내벽 내림프 공간), 암 세포 (귀의 내벽 내림프 공간), 전정 막 세포 (귀의 내벽 내림프 공간), 혈관줄무늬 기저 세포 (귀의 내벽 내림프 공간), 혈관줄무늬 변연 세포 (귀의 내벽 내림프 공간), 클라우디우스의 세포 (귀의 내벽 내림프 공간), 뵈트허의 세포 (귀의 내벽 내림프 공간), 맥락총 세포 (뇌척수액 분비), 피아-거미막 편평 세포, 눈의 색소화 섬모 상피 세포, 눈의 비색소화 섬모 상피 세포, 각막 내피 세포, 추진 기능을 갖는 섬모 세포, 호흡기 섬모 세포, 수란관 섬모 세포 (여성에서), 자궁 내막 섬모 세포 (여성에서), 정소망 섬모 세포 (남성에소), 세관 원심성 섬모 세포 (남성에서), 중추 신경계의 섬모 뇌실막 세포 (내벽 뇌강), 세포외 기질 분비 세포, 에나멜아세포 상피 세포 (치아 에나멜 분비), 귀의 전정 장치의 플래넘 세미루나툼(Planum semilunatum) 상피 세포 (프로테오글리칸 분비), 코르티 기관의 치간 상피 세포 (모 세포를 덮는 덮개막을 분비함), 소성 결합 조직 섬유아세포, 각막 섬유아세포, 힘줄 섬유아세포, 골수 세망 조직 섬유아세포, 기타의 (비상피) 섬유아세포, 모세혈관 주피세포, 추간판의 수핵 세포, 시멘트아세포/시멘트질세포 (치근 골유사 시멘트질 분비), 상아질모세포(Odontoblast)/치아모세포(odontocyte) (치아 덴틴 분비), 유리질 연골 연골세포, 섬유연골 연골세포, 탄성 연골 연골세포, 조골세포(Osteoblast)/골세포(osteocyte), 골전구 세포 (조골 세포의 줄기 세포), 눈의 유리체의 유리체세포, 귀의 외림프 공간의 성상 세포, 수축성 세포, 적색 골격근 세포 (느림), 백색 골격근 세포 (빠름), 중간 골격근 세포, 근방추 -- 핵낭 세포, 근방추 -- 핵쇄 세포, 위성 세포 (줄기 세포), 고유 심근 세포, 결절 심근 세포, 푸르키녜 섬유 세포, 평활근 세포 (각종 유형), 홍채의 근상피 세포, 외분비선의 근상피 세포, 혈관 및 면역계 세포, 적혈구 (적혈 세포), 거핵구, 단핵구, 결합 조직 대식세포 (각종 유형), 상피 랑게르한스 세포, 파골세포 (뼈에서), 수지상 세포 (림프 조직에서), 미세교 세포 (중추 신경계에서), 호중구, 호산구, 호염구, 비만 세포, 헬퍼 T 림프구 세포, 억제유전자 T 림프구 세포, 살생 T 림프구 세포, IgM B 림프구 세포, IgG B 림프구 세포, IgA B 림프구 세포, IgE B 림프구 세포, 살생 세포, 혈액 및 면역계에 대한 줄기 세포 및 수임된 전구세포 (각종 유형), 감각 변환기 세포, 눈의 광수용기 간상 세포, 눈의 광수용기 청색-민감성 원추 세포, 눈의 광수용기 녹색-민감성 원추 세포, 눈의 광수용기 적색-민감성 원추 세포, 코르티 기관의 청각 내 모 세포, 코르티 기관의 청각 외 모 세포, 귀의 전정 장치의 I형 모 세포 (가속 및 중력), 귀의 전정 장치의 II형 모 세포 (가속 및 중력), I형 미뢰 세포, 후각 신경세포, 후각 상피의 기저 세포 (후각 신경세포에 대한 줄기 세포), I형 경동맥체 세포 (혈액 pH 센서), II형 경동맥체 세포 (혈액 pH 센서), 표피의 메르켈 세포 (터치 센서), 접촉-민감성 일차 감각 신경세포 (각종 유형), 저온-민감성 일차 감각 신경세포, 열-민감성 일차 감각 신경세포, 통증-민감성 일차 감각 신경세포 (각종 유형), 자기수용 일차 감각 신경세포 (각종 유형), 자율 신경 세포, 콜린성 신경 세포 (각종 유형), 아드레날린성 신경 세포 (각종 유형), 펩티드성 신경 세포 (각종 유형), 감각 기관 및 말초 신경세포 지지 세포, 코르티 기관의 내 기둥 세포, 코르티 기관의 외 기둥 세포, 코르티 기관의 내 지골 세포, 코르티 기관의 외 지골 세포, 코르티 기관의 변연 세포, 코르티 기관의 헨센 세포, 전정 장치 지지 세포, I형 미뢰 지지 세포, 후각 상피 지지 세포, 슈반 세포, 위성 세포 (포낭성 말초 신경 세포체), 장 신경교세포, 중추 신경계 신경세포 및 신경교세포, 뉴런 세포(매우 다양한 유형, 여전히 불량하게 분류됨), 성상교세포 신경교세포 (각종 유형), 희돌기교세포 신경교세포, 수정체 세포, 전방 수정체 상피 세포, 크리스탈린-함유 수정체 섬유 세포, 색소 세포, 멜라닌세포, 망막 색소화 상피 세포, 생식 세포, 난원세포/난모세포, 정모세포, 정원 세포 (정모세포에 대한 줄기 세포), 영양 세포, 난소 여포 세포, 세르톨리 세포 (고환에서), 및 흉선 상피 세포를 포함한다.

일부 경우에, 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 골수 간질 세포 (BMSC)이다. 이러한 용어들은 본원 전반에 걸쳐 동의어로 사용된다. MSC가 관심의 대상이 되는데, 그 이유는 이들이 골수의 작은 흡인물, 또는 기타의 중간엽 줄기 세포 공급원으로부터 쉽게 단리되고, 단-세포 유래 콜로니를 쉽게 생성하기 때문이다. 골수 세포는 장골능, 대퇴부, 경골, 척추, 늑골, 무릎 또는 기타의 간엽성 조직으로부터 수득될 수 있다. MSC의 기타의 공급원은 배아 난황낭, 태반, 탯줄, 피부, 지방, 관절로부터의 활액 조직, 및 혈액을 포함한다. 배양 콜로니 중의 MSC의 존재는 단클론성 항체로 동정된 특이 세포 표면 마커에 의해 검증될 수 있다. 미국 특허 제5,486,359호 및 제7,153,500호 참조. 단세포 유래 콜로니는 약 10주 내에 50개 집단 배가(population doubling) 만큼 많이 확장될 수 있으며, 조골세포, 지방세포, 연골세포(문헌 참조; Friedenstein et al., 1970 Cell Tissue Kinet. 3:393-403; Castro-Malaspina, et al., 1980 Blood 56:289-301; Beresford et al., 1992 J. Cell Sci. 102:341-351; Prockop, 1997 Science 276:71-74), 근세포(문헌 참조; Wakitani et al, 1995 Muscle Nerve 18:1417-1426), 성상세포, 희돌기교세포, 및 신경세포(문헌 참조; Azizi et al., 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3908-3913); Kopen et al 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10711-10716; Chopp et al., 2000 Neuroreport II 300 1-3005; Woodbury et al., 2000 Neuroscience Res. 61:364-370)로 분화할 수 있다. 희귀한 경우에, 세포는 세 가지 모든 생식계열의 세포로 분화할 수 있다. 따라서, MSC는 뼈, 연골, 인대, 힘줄, 지방질, 근육, 심장 조직, 기질, 피부, 및 기타의 결합 조직을 포함한 다중 간엽성 세포 계보에 대한 전구세포로서 작용한다. 미국 특허 제6,387,369호 및 제7,101,704호 참조. 이러한 이유로, MSC는 최근에 다수의 사람 질환의 세포 및 유전자 요법에서 이들의 잠재적인 사용을 위해 시험되고 있다(문헌 참조; Horwitz et al., 1999 Nat. Med. 5:309-313; Caplan, et al. 2000 Clin. Orthoped. 379:567-570).

MSC 응집물을 생성하기 위한 방법은 문헌[참조; Prockop et al, and Bartosh, et al. PNAS 2010 107(31):13724-13729]에 의해 제US 2012/0219572호에 기재되어 있으며, 이것은 이러한 교시에 대해 전문이 참고로 포함된다. 예를 들면, MSC는 타원체(spheroid)의 응집 및 형성을 촉진시키는 방식으로 배양될 수 있다. 예를 들면, MSC는 사람 골수로부터 단리되고 현적 또는 비-부착 디쉬에서 완전 배지(4mM L-글루타민, 10% PBS, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 저 글루코스 DMEM) 중에서 배양될 수 있다. 시험관내에서 MSC를 지탱할 수 있는 임의의 배지가 MSC를 배양하는데 사용될 수 있다. MSC의 성장을 지탱할 수 있는 배지 제형은 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 알파 변형 미네랄 필수 배지 (αMEM), 및 Roswell Park Memorial Institute 배지 1640 (RPMI Media 1640) 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 전형적으로, MSC의 성장을 지탱하기 위해 20% 이하의 태아 소 혈청 (FBS) 또는 1-20% 말 혈청이 상기 배지에 첨가된다. 그러나, MSC를 배양하는데 필요한 성장 인자, 사이토킨, 및 호르몬이 배지에서 적당한 농도로 제공된다면 한정된 배지가 또한 사용될 수 있다. 개시된 방법에서 유용한 배지는 MSC의 배양에 유용한 항생제, 분열촉진 또는 분화 화합물을 포함하지만 이에 한정되는 않는 하나 이상의 관심의 대상인 화합물을 함유할 수 있다. 세포는, 예를 들면, 31℃ 내지 37℃를 포함한, 27℃ 내지 40℃의 온도에서 성장할 수 있다. 이산화탄소 함량은 2% 내지 10%로 유지될 수 있고 산소 함량은 1% 내지 22%로 유지될 수 있다.

몇몇 실시형태에서, MSC는 추가의 배양을 위한 충분한 수의 세포를 제공하기에 충분한 시간 및 조건하에서 배양된다. 그후, 세포는 세포의 타원체형 응집물의 형성을 촉진시키는 조건하에서 배양된다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 Aggrewell 플레이트에서 배양된다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 현적(hanging drop)으로서 배양된다. 몇몇 실시형태에서, 배양되는 MSC의 각각의 현적은 약 1,000 내지 약 500,000개 세포/현적을 함유한다. 그후, MSC의 현적은 중간엽 줄기 세포의 타원체형 응집물을 형성하기에 충분한 기간 동안 배양될 수 있다. 일반적으로, 세포의 점적은 4일 이하의 기간 동안 배양된다.

세포는 사람 또는 다른 동물로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 세포는 마우스, 기니 피그, 랫트, 소, 말, 돼지, 양, 또는 염소로부터 기원할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 비사람 영장류로부터 기원한다. 일부 경우에, 세포는 자가조직이거나 동종이계이다.

일부 경우에, 세포는 집단 배가(세포 계대배양)를 포함한, 세포 배양물로부터 수득된다. 이러한 경우에, 세포는 바람직하게는 4 내지 50, 10 내지 30의 집단 배가를 포함한, 50개 이하의 집단 배가로부터 수득된다. 따라서, 세포는 계대배양 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50로부터의 것일 수 있다.

조직 공학 및 세포 전달에서 사용될 수 있는 몇 가지 생체재료(biomaterial)가 있으며, 이러한 재료의 대부분은 "하이드로겔" 또는 수-함유 겔로 간주된다. 이러한 재료의 요건은 다음과 같다: 1) 생체적합성: 세포는 재료와, 종종 재료 전반에 걸쳐, 조합될 수 있어야 하며, 생존 가능하고 기능적이어야 하며, 2) 대부분의 경우에 하이드로겔은 또한 포매된 내생 세포의 이동, 증식 및 분화를 촉진시킨다. 생체적합성 및 이동/기능의 초기 요건을 여전히 가지면서 하이드로겔의 "인쇄적성"을 유지하기 위한 추가의 제약이 있다. 이들은 문헌[참조; Malda, J, et al, Adv. Mater. 2013, 25, 5011-5028]의 비평 부분에 요약되어 있다. 또한, I형 콜라겐, 콜라겐/피브린, 피브린, Extracel™ 하이드로겔, Extracel™ UV, 티라민 치환된 히알루론산 (TS-NaHy), Corgel™ 메틸셀룰로스-히알루로난 (MC-HA), 키토산, 키토산/콜라겐, 알기네이트, 알기네이트/젤라틴, 및 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 (PEGDA)를 포함한, 바이오-프린팅을 위해 사용될 수 있는 하이드로겔의 다수의 상업적 공급원이 문헌[참조; Murphy SV, Skardal A, Atala A. 2013. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. J Biomed Mater Res Part A 2013:101A:272-284]에 의해 기재된다.

조직 공학 및 바이오프린팅에서 사용되는 통상의 재료는 알기네이트, 콜라겐, 피브린, 피브리노겐, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 한천, 아가로스, 키토산, 히알루로난, 메타크릴아미드, 젤라틴, 플루오닉스, 마트리겔, 메틸셀룰로스, 및 PEG-DA (디아크릴레이트)이다. 이들 재료는 종종 단지 단독으로 사용되는 것이 아니라, 종종 함께 혼합되어 특성들(예를 들면, 알기네이트 또는 PEG-DA의 겔화 특성과 콜라겐/피브린의 세포 부착 능력)을 겸비하여 새로운 조성물을 만들어낸다. 게다가, 새로운 하이드로겔은 이러한 특성들을 설명하기 위해 근본적으로 철저히 설계될 수 있다(문헌 참조; Guvendiren and Burdick, Current Opinion in Biotechnology 2013, 24:841-846).

개시된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 하이드로겔은 세포가 생물보존 공정 동안 수 일/주/개월 간 생존 가능하고 기능적이도록 하는 능력을 또한 가지면서 세포의 분산/인쇄와 상용성이다.

본원에 제공된 조성물은 연장된 저장 후 높은 생존능과 기능성을 유지하는 세포를 포함한다. 생존능이란 보존 또는 저장 후, 세포가 살아있고 저장 전 존재할 때와 동일한 세포 기능을 가질 수 있음을 의미한다. 일부 경우에, 높은 생존능은 보존 또는 저장 후 초기 세포 집단의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%가 생존, 성장 및 기능할 수 있음을 의미한다.

세포 생존능은 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 결정될 수 있다. 생존능 검정은 기관, 세포 또는 조직이 생존능을 유지 또는 회복할 수 있는 능력을 결정하기 위한 검정이다. 생존능은 0 내지 1 (또는 0 내지 100%)의 정량 가능한 지수의 사용에 의해 생과 사의 양단간 상태와는 구분될 수 있다(문헌 참조; Pegg DE (1989). "Viability assays for preserved cells, tissues, and organs". Cryobiology 26(3): 212-231). 예를 들면, 세포에서 칼륨 대 나트륨의 비를 실험하는 것이 생존능의 지표로서 작용할 수 있다. 세포가 높은 세포내 칼륨 및 낮은 세포내 나트륨을 갖지 못한다면, 세포 막이 온전하지 않을 수 있고/있거나, (2) 나트륨-칼륨 펌프가 잘 작동하지 않을 수 있다. 따라서, 세포 막 완전성을 측정하는 다수의 검정들이 생존능의 정량 가능한 척도로서 사용된다. 이것은 트리판 블루, 프로피듐 요오드화물(PI)일 수 있으며, 이들은 새는 세포 막을 관통할 수 있는 염료이고 상업적으로 이용 가능한 세포 계수기에서 자동화된다. 총 ATP 측정, 포르마잔-기반 검정(MTT/XTT) 및 알로마 블루(Alomar blue)-기반 또는 레자주린(Resazurin)-기판 검정과 같은 다른 유형의 검정들은 세포 집단의 전반적인 대사율을 측정한다. 그러나, 생리학적 기능의 정량적 척도가 손상 복구 및 회복이 가능한지를 나타내지는 않는다. 세포가 표면에 부착하고, 확산되고 마침내 이동하고 분할하는 능력의 검정이 살아있는 세포를 더 잘 나타낼 수 있지만, 상당히 더 많은 시간이 들 수 있으며 덜 정량적일 수 있다. 말이 나온 김에, 이러한 시험 모두는 냉동보존 기술의 성공, 물질의 독성, 또는 독성 물질의 효과를 경감시키는데 있어서의 물질의 효능을 평가하기 위한 생존능 검정으로서 사용될 수 있다.

개시된 연구에서, 자동화 PI 막 완전성 검정(NucleoCounter NC100, 제조원; Chemometech Inc)이 형광 생/사 검정(fluorescent Live/Dead assay)으로서 사용되었고, 알로마 블루가 응집물의 세포 대사를 측정하는데 사용되었다. 응집물 내의 세포가 여전히 세포 배양 플라스틱에 부착하여 응집물로부터 성장할 수 있음을 보여주는 기능 시험들이 또한 사용되었으며, 응집물이 비부착성 표면 상에 유지되는 경우, 응집물 가장자리의 세포가 다른 응집물과 합쳐져서 단일의 보다 큰 구조로의 응지물의 융합을 만들어낼 것이다. 세포가 여전히 배양 플레이트 상에 부착되어 확산될 수 있다면, 또는 세포성 응집물이 융합된다면(이것은 부착 및 확산의 3D 등가이다) hMSC의 사이토킨 분비, 분화, 및 면역조절 기능과 같은 다수의 세포 기능들이 유지된다는 것은 일반적인 추정이다.

조성물에서 세포(예를 들면, MSC)의 높은 생존능은 세포가 저장되는 수용액의 결과로서 유지될 수 있다. 수용액은, 예를 들면, 세포 아폽토시스 및 세포사를 감소시키는 화학물질 및 영양소를 포함할 수 있다.

따라서, 몇몇 실시형태에서, 조성물은 냉동보존제를 함유한다. 냉동보존제의 비제한적인 예는 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, i-에리트리톨, D-리비톨, D-만니톨, D-소르비톨, i-이노시톨, D-락토스, 콜린 클로라이드, 아미노산, 메탄올, 아세트아미드, 글리세롤 모노아세테이트, 무기 염, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 냉동보존제는 CryoStor® CS2, CS5, 또는 CS10 동결 배지 (BioLife Solutions, Inc) 및 5% DMSO를 함유한다. 일부 경우에, 냉동보존제는 1% 내지 15% DMSO, 예를 들면, 5% DMSO를 포함하여 2% 내지 7.5% DMSO를 함유한다.

몇몇 실시형태에서, 개시된 세포 조성물은 자유 라디칼을 제거하거나, pH 완충을 제공하거나, 종창/삼투 지지체를 제공하거나, 에너지 기질을 함유하거나, 저온에서 세포내 상태를 균형잡는 이온 농도를 갖거나, 이들의 임의의 조합을 갖는 생물보존제를 포함한다. 예를 들면, 몇몇 실시형태에서, 생물보존 제형은 하이포써모솔(HypoThermosol)®(BioLife Solutions, Inc.), 예를 들면, 하이포써모솔(HypoThermosol)®FRS를 포함한다. 하이포써모솔(HypoThermosol)®FRS의 성분은 트롤록스(Trolox)(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산), Na⁺, K⁺, Ca² ⁺, Mg² ⁺, Cl^-, H₂PO₄ ^-, HCO₃ ^-, HEPES, 락토비오네이트, 수크로스, 만니톨, 글루코스, 덱스트란-40, 아데노신, 및 글루타티온을 포함하며, pH 7.6 및 약 360의 삼투질 농도를 갖는다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 개시된 세포 조성물은 2-10% DMSO 및 하이포써모솔(HypoThermosol)® 또는 하이포써모솔(HypoThermosol)®FRS를 포함한다.

본원에 제공된 조성물은 세포를 높은 체적 및 높은 세포 농도로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 개시된 세포 조성물은 적어도 1백만개 세포/mL의 농도로 적어도 10 백만개의 세포를 함유한다. 예를 들면, 몇몇 실시형태에서, 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, , 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 백만개 세포/mL의 농도로 적어도 10 백만, 100 백만, 1 십억, 10 십억, 또는 50 십억개 세포를 포함한다.

몇몇 실시형태에서, 개시된 세포는 "미세-조직"으로서 작용하는 다세포 응집물로서 존재하며, 프린팅되는 경우 고차 3D 조직을 위한 구성 블럭에, 또는 세포 요법 분야에서 이식된 세포를 위한 안정한 포맷에 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 응집물은 바람직하게는 균일한 크기와 형상을 갖지만, 불균일한 크기와 형상의 다세포 응집물이 다수의 분야에서 충분할 수 있다. 응집물은 또한 바람직하게는 분산되거나, 압출되거나, 인쇄되는 경우 일관된 세포 수를 제공하도록 세포 조성물 내에 균일하게 분산된다.

응집물의 크기와 밀도는 의도된 용도에 기반하여 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 응집물 당 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000,100,000, 150,000, 또는 200,000개 세포를 함유하는 응집물로 존재한다. 응집물은 바람직하게는 각각의 조성물 내에 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% , 15%, 또는 20% 미만의 직경 분산을 갖는다.

몇몇 실시형태에서, 개시된 세포는, 예를 들면, 바이오프린팅을 위한 압출에 대한 조성물의 적합성을 유지하면서 조성물 내의 균일한 분포를 증진시키도록 세포를 현탁액에 유지시키는 점성 용액(즉, 압출 물질)에 현탁된다. "균일한 분포"란 세포가 각 조성물 내에서 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15% 또는 20% 미만의 밀도 분산을 가짐을 의미한다. 예를 들면, 점성 용액은 상기한 것과 같은 하이드로겔일 수 있다. 따라서, 점도는 바람직하게는 균일한 분포를 유지하기에 충분히 높으면서 바이오프린터에 의한 압출에 적합하도록 충분히 낮다.

몇몇 실시형태에서, 개시된 조성물(바이오-잉크)은 약 500 내지 1,000,000 센티포이즈, 약 750 내지 1,000,000 센티포이즈; 약 1000 내지 1,000,000 센티포이즈; 약 1000 내지 400,000 센티포이즈; 약 2000 내지 100,000 센티포이즈; 약 3000 내지 50,000 센티포이즈; 약 4000 내지 25,000 센티포이즈; 약 5000 내지 20,000 센티포이즈; 또는 약 6000 내지 15,000 센티포이즈의 점도를 가짐을 특징으로 한다. 점도는 점도계로 일상적인 방법에 의해 측정할 수 있다.

일부 경우에, 압출 재료가 또한 조직 공학에 적합한 생체재료, 예를 들면, 콜라겐, 히알루로네이트, 피브린, 알기네이트, 아가로스, 키토산, 및 이들의 조합이다. 또 다른 실시형태에서, 적합하 하이드로겔은 합성 중합체이다. 추가의 실시형태에서, 적합한 하이드로겔은 폴리(아크릴산) 및 이의 유도체, 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 글리콜), 및 이의 공중합체, 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 및 이들의 조합으로부터 유도된 것들을 포함한다.

몇몇 실시형태에서, 압출 화합물은 광개시제를 포함하며, 이것은 특정 파장의 빛의 흡수시 중합 또는 중축합 반응을 촉매할 수 있는 반응성 화학종을 생산하는 분자이다. 이러한 반응 부위는 광중합 또는 방사선 경화라고도 불린다. 광개시제는 전형적으로 방향족 및 카보닐 그룹 둘 다를 함유하는 케톤이다.

몇몇 실시형태에서, 하이드로겔-기반 압출 화합물은 열가역적 겔(열-반응성 겔 또는 서모겔로도 공지됨)이다. 몇몇 실시형태에서, 적합한 열가역성 하이드로겔은 실온에서 액체가 아니다. 폴리옥시프로필렌 및 폴리옥시에틸렌으로 이루어진 중합체는, 수용액으로 혼입될 경우, 열가역성 겔을 형성한다. 이러한 중합체는 바이오프린터 장치에서 유지될 수 있는 온도에서 액체 상태에서 겔 상태로 변하는 능력을 갖는다. 액체 상태-대-겔 상태 상 전이는 중합체 농도 및 용액 중의 성분에 따라 좌우된다.

안정한 세포 제형은, 예를 들면, 종래의 스크류 또는 격막 뚜껑 병에, 또는 동결- 또는 비동결-저장으로부터 제거되고 분배 장치와 통합될 수 있는 멸균 폐쇄계 장치 내에 저장될 수 있다. 분배 장치는, 예를 들면, 바이오프린터 또는 자동화 또는 자동 또는 수동 주입 장치일 수 있다. 임의로, 바이오프린터는 삼차원 (3D) 바이오프린터일 수 있다. 분배 장치는 세포의 살균성 및 품질을 유지하면서 살아있는 세포를 특정 위치로 전달할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 개시된 세포 조성물은 멸균 또는 무균 바이오잉크 카트리지 또는 생물의학 시린지 내에 함유된다.

몇몇 실시형태에서, 개시된 균질 세포 집단 및 점성 용액은 바이오프린팅에서 사용하기 위한 바이오-잉크를 포함한다. 본원에서 사용되는 "바이오-잉크"는 다수의 세포를 포함하는 액체, 반-고체, 또는 고체 조성물을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 바이오-잉크는 세포 현탁액, 세포 응집물, 세포-포함 겔, 다세포체, 또는 조직을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 바이오-잉크는 지지 물질을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 바이오-잉크는 바이오프린팅을 가능케 하는 특정 생체역학 특성을 제공하는 비-세포 물질을 추가로 포함한다.

본원에 사용되는 "바이오프린팅"은 자동화된 컴퓨터-보조 삼차원 프로토타이핑 장치(예를 들면, 바이오프린터)와 호환성인 방법을 통해 세포(예를 들면, 세포 용액, 세포-함유 겔, 세포 현탁액, 세포 농축액 다세포 응집물, 다세포체 등)의 삼차원적인 정확한 용착을 사용함을 의미한다.

본원에서 사용되는 "카트리지"는 바이오-잉크 또는 지지 물질을 수용(및 보유)할 수 있는 임의의 물체를 의미한다.

몇몇 실시형태에서, 용기 또는 카트리지는 필요에 따라 무균 조건을 유지하면서 세포 및 생체재료가 용기 또는 카트리지로부터 배출될 수 있도록 하는 멸균 포트 또는 배관을 갖는다.

몇몇 실시형태에서, 바이오프린터는 특정한 세포 작제물, 조직, 또는 기관을 형성하기 위해 컴퓨터 보조 설계 소프트웨어에 의해 지시된 바와 같은 특정 패턴 및 특정 위치에서 카트리지로부터 바이오-잉크를 분배한다. 복합 조직 작제물을 제조하기 위해, 바이오프린터는 바이오-잉크를 정확한 속도로 균일한 양을 용착시킨다. 몇몇 실시형태에서, 카트리지는 분배 오리피스를 포함한다. 각종 다른 실시형태에서, 카트리지는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 그 이상의 분배 오리피스를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 분배 오리피스의 가장자리는 매끄럽거나 실질적으로 매끄럽다.

여러 유형의 카트리지가 바이오프린터에 사용하기에 적합하다. 몇몇 실시형태에서, 카트리지는 하나 이상의 분배 오리피스를 통해 반-고체 또는 고체 바이오-잉크 또는 지지 물질을 압출시킴을 포함하는 바이오프린팅과 호환된다. 몇몇 실시형태에서, 카트리지는 하나 이상의 분배 오리피스를 통해 액체 또는 반-고체 세포 용액, 세포 현탁액, 또는 세포 농축액을 분배함을 포함하는 바이오프린팅과 호환된다. 몇몇 실시형태에서, 카트리지는 비연속 바이오프린팅과 호환된다. 몇몇 실시형태에서, 카트리지는 연속 및/또는 실질적으로 연속 바이오프린팅과 호환된다.

몇몇 실시형태에서, 카트리지는 모세관 또는 마이크로피펫이다. 몇몇 실시형태에서, 카트리지는 시린지 또는 니들이다. 여러 내부 직경이 실질적으로 원형이거나 원통형인 카트리지에 적합하다. 다양한 실시형태에서, 적합한 내부 직경은, 비제한적인 예를 들자면, 1, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 또는 그 이상의 μ를 그 안의 증분(increment)을 포함하여 포함한다. 또 다른 다양한 실시형태에서, 적합한 내부 직경은, 비제한적인 예를 들자면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상의 mm를 그 안의 증분을 포함하여 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 카트리지는 약 1㎛ 내지 약 1000㎛의 내부 직경을 갖는다. 특정 실시형태에서, 카트리지는 약 500㎛의 내부 직경을 갖는다. 또 다른 특정 실시형태에서, 카트리지는 약 250㎛의 내부 직경을 갖는다. 여러 내부 체적이 본원에 개시된 카트리지에 적합하다. 다양한 실시형태에서, 적합한 내부 체적은, 비제한적인 예를 들자면, 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 또는 그 이상의 ml를 그 안의 증분을 포함하여 포함한다. 또 다른 다양한 실시형태에서, 적합한 내부 체적은, 비제한적인 예를 들자면, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 199, 300, 400, 500 또는 그 이상의 ml를 그 안의 증분을 포함하여 포함한다.

몇몇 실시형태에서, 카트리지는 미국 특허 제7,051,654호에 기재된 것과 같이 수신 2D 또는 3D 표면으로의 바이오-잉크 및/또는 지지 물질의 잉크젯 프린팅과 호환된다. 추가의 실시형태에서, 카트리지는 본원에 기재된 컴퓨터 코드의 제어하에서 전압-개폐 노즐 또는 니들의 형태로 분배 오리피스를 포함한다.

몇몇 실시형태에서, 카트리지는 이의 내용물의 조성을 나타내도록 표시된다. 추가의 실시형태에서, 카트리지는 그 안에 함유된 바이오-잉크의 조성을 나타내도록 표시된다. 몇몇 실시형태에서, 카트리지의 표면은 유색이다. 몇몇 실시형태에서, 카트리지의 외면은 염색되거나, 색칠되거나, 펜으로 표시되거나, 스티커로 표시되거나, 이들의 조합으로 된다.

일부 경우에, 카트리지는 1회용 매니폴드 유닛의 교시를 위해 본원에 개시된 미국 특허 제6,712,963호에 기재된 것과 같은 1회용 매니폴드 시스템이다. 간략하게, 일회용 배관 및 가요성-벽 용기는 무균 커넥터를 통해 조립될 수 있다. 이러한 매니폴드는 매니폴드 배관의 외부면과만 맞물려 있는 적어도 하나의 원격 조종되는 핀치 밸브와 상호작용할 수 있다. 이러한 매니폴드 및 핀치 밸브 시스템은, 원격 조종되는 핀치 밸브와 함께, 클리닝 및 품질 보증 절차를 피하거나 줄이면서 무균 환경에서 생명공학 유체의 자동화된 정확한 전달을 제공하는 제어기에 의해 작동될 수 있는 연동 타입의 펌프와 함께 사용될 수 있다.

개시된 카트리지는 바람직하게는 바이오잉크로 무균적으로 충전되어 바이오잉크를 환경에 노출되는 것으로부터 보호하여 오염을 방지하도록 구성된다. 따라서, 카트리지는 바람직하게는 충전된 후 폐쇄계를 유지하는 씰(seal)을 갖는다. 카트리지는 또한 바람직하게는 세포를 특정 온도에서 바이오잉크에 유지시킬 수 있어야 한다. 예를 들면, 카트리지는 절연될 수 있다.

개시된 카트리지는 또한 바람직하게는 내부에 바이오잉크를 사출하도록 구성된다. 예를 들면, 바이오잉크는 공기압, 수압, 스크류 구동된 피스톤 등에 의해 사출될 수 있다. 사출은 상당한 압력을 생성할 수 있기 때문에, 카트리지는 바람직하게는 강성 물질로부터 형성된다.

카트리지는 바이오잉크의 사출/분산을 위한 적어도 하나의 오리피스를 갖는다. 그러나, 다중 오리피스가 프린팅을 가속시킬 수 있다. 일부 경우에, 3D 프린터는 둘 이상의 카트리지가 둘 이상의 유형의 세포를 분배하도록 구성된다. 그러나, 일부 경우에, 단일 카트리지는 두 가지 유형의 세포를 동시에 분배하도록 둘 이상의 구획과 둘 이상의 오리피스를 함유한다. 대안적으로, 2 이상의 세포 유형을 바이오중합체에 현탁되어 있는 세포 응집물에서 조합할 수 있거나, 2개의 세포 유형을 동일한 하이드로겔 기질 내에 최적화된 비율로 함께 혼합하여 동시에 압출시킬 수 있다.

몇몇 실시형태에서, 카트리지는 일단 저장(예를 들면, 동결된 또는 비동결된)으로부터 제거되면 세포가 생존 가능하고 바로 프린팅할 수 있도록 점성 기질에 현탁된 세포를 함유하는 본원에 개시된 조성물을 함유한다. 일부 경우에, 이는 점성 기질이 세포가 조성물 중에 균일하게 분산되도록, 즉, 카트리지의 바닥에 침강되지 않도록 충분히 점성임을 의미한다.

또한, 바이오잉크 조성물을 제조하기 위한 키트가 개시된다. 일부 경우에, 키트는 응집물 당 평균 적어도 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 또는 300개 내지 200,000개 이하의 세포를 함유하는 세포 응집물을 포함하는 조성물을 함유한다. 키트는 또한 비가교결합된 생체적합성 중합체, 예를 들면, 알기네이트를 함유할 수 있다. 생체적합성 중합체는 세포 응집물과 동일하거나 상이한 용기에 있을 수 있다. 키트는 또한 가교결합제, 예를 들면, 황산칼륨을 함유할 수 있다. 생체적합성 중합체와 가교결합제가 상이한 용기에 있는 한, 이 제제 또한 세포 응집물과 동일하거나 상이한 용기에 있을 수 있다. 키트는 키트의 구성분들을 혼합하기 위한 수단, 예를 들면, 시린지를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 다수의 실시형태들이 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 개질이 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 기타의 실시형태들도 하기 청구의 범위내에 있다.

실시예

실시예 1: MSC 특성화

hMSC를 배양, 확장 및 냉동보존할 수 있다. 세포가 해동되는 경우, 이들이 플라스틱에 부착되고 분할되어 수를 증가시킬 수 있으며, 혈관형성 사이토킨 분비, 인터페론 감마와 같은 염증성 분자로 자극되는 경우 면역조절 효소 상향조절 및 다분화능 삼계통(trilineage) 분화를 포함하는 요법에 관련된 생물학적 기능을 갖는다.

hBM-MSC는 몇 가지 공급원으로부터 냉동보존된 포맷으로 상업적으로 이용가능하다. 이 실험에서, 10 백만개 hBM-MSC (vendor, RoosterBio, Frederick, MD, part # MSC001)의 바이알을 해동시키고 확장 배지 (RoosterBio, part # KT-001)에서 T225 플라스크 (Corning)에 플레이팅한다. hMSC를 3,000개 세포/cm²로 접종하고 37℃ 가습 CO₂ 항온처리기에서 항온처리하였다. 2시간 내에 다수의 세포가 배양 접시에 부착되었으며(도 1), 이것은 배양 동안의 세포 확대를 위한 전제조건이다. MSC는 수확 전 4-5일 동안 확장된 배양물이었다. 일단 세포가 80-90% 시각 세포 합류도를 달성하면, 이들을 TrypLE 수확 시약 (Thermo Fisher)으로 수확하고 세포 계수 및 생존능을 Nucleocounter NC100 (Chemometec)이라고 불리는 자동화 시스템으로 정량하였다. 세포를 또한 기능에 대해 검정하였다. hMSC를 다수회 연속 계대배양할 수 있으며, 이때 각 계대배양은 사용되는 배지에 따라 2 내지 5 집단 배가를 생산한다. 최종 목표는, 수천 또는 수만의 생성물이 단일 공여체로부터 생산될 수 있고, 세포의 생물학적 기능이 유지되도록 충분히 높은 집단 배가 수준으로 세포를 달성하는 것이다.

MSC를 표준 유동 세포분석 마커에 대해 특성화하였다(도 2). MSC를 DMEM + 10% 혈청 중에서 7-10일 동안 배양하고 세포 유동분석법으로 검정하였다. 세포는 CD73, CD90, CD105 및 CD166에 대해 양성이고, CD14, CD34, 및 CD45에 대해 음성이었다.

생물학적 기능: hMSC가 배양 배지로 분비하는 생물학적 인자의 패널에 대해 검정하기 위해, hMSC를 배양물로부터 수확하고 기본 배지 (RoosterBio) + 2% 소 혈청 (Atlas Biologics) 중에서 40,000개 세포/cm²로 24 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 24시간 +/- 1시간 동안 항온처리하였으며, 이때 세포 배양 배지가 -20℃에서 동결된 채로 수집되었다. 그후, 수집된 배지를 아홉개의 혈관형성 바이오마커 ANG-2, FGF 베이직, HGF, IL-8, TIMP-1, TIMP-2, TNFα, VEGF의 동시 측정을 가능케 하는 Q-Plex™ 인간 혈관형성 (9-plex, Quansys Biosystmes) 완전 정량 ELISA-기반 화학발광 검정을 사용하여 검정하였다. 다중화 ELISA는 배양 상청액 중의 분석물을 pg/mL로 제공하였으며, 그후 이것을 웰에 접종된 세포의 수 및 배양시 시간으로 정규화하여 특정 사이토킨 분비 계량치를 pg/세포/일로 수득하였다(도 3).

확장된 hMSC를 벌크 배양물 중에서 지방생성(지방) 및 골형성(뼈) 쪽으로 분화하였다(도 4). 상업적으로 이용가능한 키트를 사용하여 MSC를 제공된 프로토콜을 이용하여 지방세포 및 조골세포 (StemPro 지방생성 및 골형성 분화 키트, 제조원; Life Technologies)로 분화하였다. 분화는 지방생성에 대해서는 지질 소포의 오일 레드 O 염색(도 4a) 및 골형성에 대해서는 칼슘의 알리자린 레드 염색(도 4b)에 의해 검출하였다.

IFN-γ로의 MSC의 노출에 의한 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO) 발현 및 활성의 유도가 사람 MSC의 면역 억제제 기능(T-세포 억제)에 중심이 된다(도 5). 간략하게, MSC를 IFN-γ의 존재 또는 부재하에 40,000개 세포/cm²로 배지에 플레이팅하였다. 24hr의 항온처리 후, 배지 상청액을 수집하여 동결시켰다. IDO 활성은 표준 비색 검정법을 사용하여, IDO 효소 활성의 산물인 키누레닌을 정량함으로써 측정하였다.

MSC는 다수의 판매처로부터 상업적으로 이용가능하며 생물보존된 포맷(전형적으로 동결보존된)으로 분포될 수 있다. 생물보존 후의 세포를 배양물에 평편배양할 수 있으며, 여기서, 이들은 먼저 부착되고 그후 성장한다. 이러한 세포는 다중계통 분화, 생체-기능성 사이토킨 및 인자들이 분비와 같은 각종 치료학적으로 관련된 기능을 발현할 수 있으며, 면역계를 조절하도록 유도될 수 있다.

실시예 2: MSC 응집물 형성 & 특성화

hBM-MSC(RoosterBio, Frederick, MD, part # MSC001)를 해동시키고 RoosterBio 성장 배지 중에서 T225 플라스크에 편팡배양하여 80-90% 합류도로 될 때까지 4-5일 동안 배양하거나, 해동 직후 성장 배지 (RoosterBio) 중에서 Aggrewell 400Ex 플레이트(Stem Cell Technologies)에 접종하였다. 응집물 형성 전 세포 확대를 위해, 세포를 3000개 세포/cm2로 접종하고, 수확할 준비가 될 때까지 37℃ 항온처리기에서 항온처리하였다. 세포를 TrypLE (Thermo Fisher)로 수확하고 RoosterBio 성장 배지 중에서 응집물 당 1000개 세포의 밀도로 Aggrewell 400Ex에 플레이팅하였다. Aggrewell을 제조자의 지침에 따라 사용 전에 세정 용액으로 한번 세정하였다. 세정 용액을 흡인시키고 단세포를 각 마이크로웰에 한 방울씩 접종하여 균일한 세포 분포를 보장하였다. 밤새, hMSC는 37℃ 항온처리시 각 마이크로웰에서 융합하여 다세포 응집물(aggs)(도 6a)을 형성하였다. 응집물을 성장 배지로 세정함으로써 웰로부터 수집하고 50ml 원뿔형 관으로 옮겼다. 응집물이 중력에 의해 관의 바닥에 침강되도록 한 후 관에서 성장 배지를 흡인시킴으로써 농축된 응축물(도 6b)을 수득하였다. 실험을 수행하거나 임상적 크기의 조직편을 생성하기 위해서는 응집물 당 1000 - 100,000개 세포의 100,000 내지 1,000,000개 응집물이 필요한 것이 일반적이다.

새로 수집된 hMSC 응집물을 비부착성 페트리 디쉬 또는 플레이트에 플레이팅하여 다세포 응집물을 배양하였다. 응집물은 비부착성 배양 플레이트에서 접종된다면(도 7a) 함께 신속하게 융합할 것이며, 조직 배양 (TC) 플라스틱에 접종된다면 aggs는 플레이트에 부착될 것이고 개별 세포들은 디쉬로 성장해 나갈 것이다(도 7b). 이미지를 촬영하기 전에 배양물을 37℃ 항온처리기에서 밤새 항온처리하였다.

MSC 응집물을 사이토킨 분석을 위해 플레이트에 접종하고 37℃에서 24시간 +/- 1시간 동안 항온처리하였으며, 이때 세포 배양 배지가 -20℃에서 동결된 채로 수집되었다. 그후, 수집된 배지를 아홉개의 혈관형성 바이오마커 ANG-2, FGF 베이직, HGF, IL-8, TIMP-1, TIMP-2, TNFα, VEGF의 동시 측정을 가능케 하는 Q-Plex™ 인간 혈관형성 (9-plex, Quansys Biosystmes) 완전 정량 ELISA-기반 화학발광 검정을 사용하여 검정하였다. 다중화 ELISA는 배양 상청액 중의 분석물을 pg/mL로 제공하며, 그후 이것을 웰에 접종된 세포의 수 및 배양시 시간으로 정규화하여 특정 사이토킨 분비 계량치를 pg/세포/일로 수득하였다(도 8). MSC 응집물은 또한 인터페론 감마의 존재하에서 IDO 활성을 상향조절하는 능력을 유지할 수 있었다.

당해 실시예는 hMSC가 세포 확대 후 또는 동결 직후 응집물로 형성될 수 있음을 입증한다. 세포는 배양 플라스틱에 부착하여 융합하는 이들의 능력을 유지하며, 이것이 MSC 응집물의 주요 속성이다. 응집물 내의 세포 또한 다중계통 분화, 사이토킨 분비, 및 면역조절과 같은 기능을 유지한다.

실시예 3: 하이드로겔에서의 응집물 캡슐화 및 맞춤 작제물의 압출

세포 캡슐화를 위해, 단세포 hMSC 또는 새로 수집된 hMSC 응집물을 Ca² ⁺ 또는 Mg² ⁺없는 DPBS에 용해시킨 2% 알기네이트 (FMC BioPolymer)에 현탁시켰다. 세포를 CalCl₂ 용액 6.6mg/ml에 니들로 한 방울씩 압출시켜 구체 비드를 형성하거나, CaCl₂ 용액에 침지시키기 전에 페트리 디쉬 상에 맞춤 형상으로 압출시켜 작제물의 가교결합을 가능케 하였다. CaCl₂ 용액을 흡인시키고, 세포가 성숙되도록 37℃ 항온처리기에서 작제물을 항온처리하기 전에 성장 배지로 대체하였다. 캡슐화된 MSC를 2μM 칼세인-AM/DPBS로 염색하고, 알기네이트 겔 내의 매우 생존 가능한 응집물을 보여주는 형광 현미경으로 이미지화하였다(도 10b). 이러한 응집물은 또한 배양물 중에서 5일 뒤 겔에서 융합하는 능력을 유지하였다(도 10c).

결과 및 논의:

MSC 응집물은 응집되는 경우 보다 높은 세포 생존 기회 및 인쇄 용이성으로 인해 바이오프린팅을 위한 매력적인 구성이다. 매우 생존 가능한 hMSC 응집물은 Aggrewell™ 플레이트를 사용하여 지속적으로 생성될 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 응집물은 함께 융합하고 표면에 부착하여 증식하는 능력을 가지며, 이들 둘 다가 대사 활성 세포의 주요 기능적 파라미터이다. 응집물 융합은 새로 수집된 응집물에 대해 37℃에서 배지 중에서 항온처리한지 몇 시간 후에 일찍이 관찰되었다.

바이오프린팅 분야에서는 세포가 세포 적격 생체재료에 포매되는 것을 필요로 하기 때문에, 본 출원인은 2% 알기네이트에서 캡슐화되고 맞춤 형상으로 압출된 단세포 및 응집물 MSC가 매우 생존 가능하며(도 10b), 이들이 배양물 중에서 융합하는 능력을 유지하여(도 10c), 바이오가공 및 바이오프린팅 분야에 사용되도록 하는 응집물 세포의 실행가능성을 확인시켜줌을 입증하였다.

이러한 신규한 제품 포맷이 연구에 사용되었지만, 응집된 포맷으로 이러한 세포를 전달하는 실제 양상 중 다수는 산출되지 않았다. 당업계에서 대개는 세포가 수확되고, 응집물로 만들어진 다음 즉시 사용될 것으로 추정한다. 그러나, 광범위한 채택을 위해, MSC 응집물이 즉시 사용을 위해 이용가능하도록 하는 기술이 개발되어야 한다. 본질적으로, 생물보존 기술이 MSC 응집물에 채택되어야 하며 이들의 주요 기능은 유지되어야 한다.

본원에는 hMSC 응집물의 생물보존, "바로 사용할 수 있는" 제형을 갖는 경제적이면서도 실제적인 이익의 윤곽, 및 이의 유용성의 입증을 위한 최적의 공정이 개시된다. MSC 및 응집된 포맷으로 사용되는 기타의 세포들은 수억 내지 수 십억개의 세포를 필요로 하기 때문에, 표준 기술은 널리 퍼져있지 않은 세포 확대 기술을 사용하여 세포를 생산하는데 단지 몇 주를 필요로 할 것이다. 응집물로서 전달된, 높은 세포 수의 제형이 상당한 타임프레임(수 주 내지 수 개월)을 즉시 사용으로 감소시키는 방법으로서 개시된다. 이러한 "바로 사용할 수 있는" 제형은 연구를 수행하는 랩에 상당한 경제적 효과를 가질 수 있으며, 보다 빠른 발견과 제품 개발 노력을 야기할 수 있다.

실시예 4: 생물보존된 MSC 응집물

당해 실시예의 목표는 응집물이 생물보존될 수 있고 여전히 주요 기능을 보유함을 입증하는 것이다. 여기서는, 응집물을 세포 배양 배지 (RoosterBio part # KT-001), 세포 요법을 위한 임상 금 표준 저장 용액, 생리 식염수 + 4% HSA (BioMed Supply), 및 하이포써모솔 (Biolife Solutions) 중에서 동결되지 않은 포맷으로 저장한 후 시험하였다. 비동결 저장에서 수 일에 걸쳐, 또는 동결보존된 포맷으로 수 주 내지 수 년에 걸쳐 MSC 응집물 기능을 보존할 수 있는 능력이 장래에 이 기술의 상업화 및 사용 편의성에 중심이 될 것이며, MSC 응집물을 바로 사용할 수 있는 포맷으로 구입할 수 있다면 연구자 및 제품 개발자로 하여금 수 주의 시간을 절감할 것이다.

재료 & 방법

hBM-MSC (RoosterBio, Frederick, MD, part # MSC001)를 해동시키고 RoosterBio™ 성장 배지 (RoosterBio Inc.)에서 T225 플라스크에 플레이팅하고 80-90% 합류도로 될 때까지 4-5일 동안 배양하거나, RoosterBio™ 성장 배지 (RoosterBio Inc.)에서 Aggrewell™ 400Ex 플레이트 (Stem Cell Technologies)로 해동시킨 직후 접종하였다. 응집물 형성 전에 세포 확대를 위해, 세포를 3,000개 세포/cm²로 접종하고, 바로 수확할 수 있을 때까지 37℃ 항온처리기에서 항온처리하였다. 세포를 TrypLE로 수확하고, RoosterBio™ 성장 배지에서 응집물 당 1,000개 세포의 밀도로 Aggrewell™ 400Ex에 플레이팅하였다. Aggrewell™을 제조자의 지침에 따라 사용 전에 세정 용액으로 한번 세정하였다. 세정 용액을 흡인시키고, 단세포를 각각의 마이크로웰에 한 방울씩 접종하여 균일한 세포 분포를 보장하였다. 밤새, 37℃ 항온처리에서 각각의 마이크로웰에서 hMSC가 융합하여 다세포 응집물을 형성하였다(도 6a). 성장 배지로 세정함으로써 응집물을 세포로부터 수집하여 50 ml 원뿔형 관으로 옮겼다. 응집물을 중력에 의해 관 바닥에 침강되도록 한 후 관에서 성장 배지를 흡인시킴으로써 농축된 응집물 (도 6b)을 수득하였다.

새로 수집된 응집물을 1500 aggs/ml의 저장 용액 (즉, 하이포써모솔, 10% FBS/DMEM 또는 4% HSA/염수)에서 재현탁시켰다. 각 용액 중의 응집물을 2ml 저온바이알에 분취하여 4℃ 냉장고에서 암흑 속에 저장하였다.

응집물 기능성 (융합, 세포가 디쉬에 부착함, IDO 및 사이토킨 분비)

연구 3일 또는 7일째에, 상이한 조건으로부터의 응집물을 수집하고 PBS로 한번 세정하고, 250개 응집물(또는 250,000개 세포)을 재현탁시키고, 10ng/ml IFN-γ의 존재 또는 부재하에 2% FBS/기본 배지 중에서 12-웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 추가의 응집물을 수집하고 비부착 48-웰 플레이트에 플레이팅하여 자연 융합을 가능케 하였다. 항온처리의 24시간 후 (도 11) 및 6일 후 (도 12), 둘 다 조직 배양 플레이트 상에 부착되거나 비부착 표면에 떠있으면서 융합한 세포에 대해 이미지를 촬영하였다. 부착성 배양물의 배지를 IDO 및 사이토킨 분비 검정을 위해 15ml 원심분리 관에 수집하였다. 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅한 응집물을 250㎕의 트립신/EDTA로 처리하고 45min 동안 10-15min 마다 피펫팅에 의해 혼합하여 응집물로부터 세포를 방출시켰다. 분리된 세포를 생존 가능한 총 세포 수에 대해 NucleoCounter®로 계수하였다.

사이토킨 분비의 측정을 위해, 수집된 상청액을 아홉개의 혈관형성 바이오마커 ANG-2, FGF 베이직, HGF, IL-8, TIMP-1, TIMP-2, TNFα, VEGF의 동시 측정을 가능케 하는 Q-Plex™ 인간 혈관형성 (9-plex, Quansys Biosystmes) 완전 정량 ELISA-기반 화학발광 검정을 사용하여 검정하였다. 다중화 ELISA는 배양 상청액 중의 분석물을 pg/mL로 제공하며, 그후 이것을 웰에 접종된 세포의 수 및 배양시 시간으로 정규화하여 특정 사이토킨 분비 계량치를 pg/세포/일로 수득하였다.

IDO 활성의 측정을 위해, 키누레인의 양을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같은 표준 비색 검정을 사용하여 측정하였다.

결과 & 논의 :

바이오프린팅 분야에서는 세포가 인쇄 전에 매우 생존 가능한 채로 있는 것을 필요로 하기 때문에, 응집물을 세포의 생존능 또는 기능성에 영향을 미치지 않으면서 일정 기간(1-7일) 동안 저체온 조건에서 저장할 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 도 11-13은 하이포써모솔 용액, 성장 배지, 또는 4% HSA를 갖는 염수 중에서 3일 또는 7일 저장 후 (A) 융합하거나 (B) 부착되는 응집물의 능력을 보여준다. 하이포써모솔 및 성장 배지 둘 다에서 저장된 응집물에서는 유사한 융합 및 접착도가 관찰되었지만, 4% HSA/염수 중에서 제형화된 응집물은 부유한 성긴 응집물 구조에 의해 나타내어지는 바와 같이 생존하지 못했다. 배양물 중에서 6일 후(도 12), TC 플레이트 상에 부착된 응집물은 플레이트에서 합류되도록 계속해서 증식하여, 세포가 대사적으로 활성인 채로 있음을 입증하였다.

다양한 제형 및 저장 지속시간에서의 생물보존된 응집물의 IDO 활성 (도 14) 및 사이토킨 분비 (도 15)는 이들이 이들의 기능성을 유지하였음을 보여주지만, 이 연구는 하이포써모솔 용액 중에서 생물보존된 응집물이 성장 배지 및 4% HSA/염수 저장 용액을 능가하였다는 것을 시사한다.

실시예 5: MSC 응집물 동결보존 및 해동후 기능

hMSC 응집물 (1000개 세포/agg)은 상기한 바와 같이 Aggrewell™ 400EX로 제조하였다. 새로 수집된 응집물을 CryoStor®5 (Biolife Solutions) 중에서 1-5M 세포/ml로 재구성하였다. 응집물을 CoolCell® 속도 조절 동결 장치(Biocision)에서 밤새 동결시키고, 저장을 위해 증기상 액체 질소로 옮겼다. 적어도 7일간의 동결보존 후, MSC aggs의 2개 바이알을 2% FBS/기본 배지에 해동시키고, 응집물 융합, 세포 부착, 및 IDO 및 사이토킨 기능 검정에 대한 시험을 위해 조직 배양 플레이트 또는 비부착 플레이트에 접종하였다(상기한 바와 같음).

응집물 생존능을 입증하기 위해, 대략 250,000개 응집물을 사용하여, 20㎕ 피펫 팁 주위에 응집물을 접종함으로써 15ml 관 속에 "고리" 형상을 제조하였다. 융합된 MSC 응집물을 1-4일 후 수집하고 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 다음 샘플을 탈수시키고 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) (Alizee Pathology)에 대해 염색하여 응집물 융합의 조밀도를 가시화시켰다.

결과

해동시, hMSC 응집물은 함께 융합하는 능력을 유지할 수 있었으며(도 16a), 개별 세포들은 조직 배양 플라스틱에 부착하여 응집물로부터 성장할 수 있었다(도 16b 및 16c). 게다가, hMSC 응집물은 유도성 IDO 발현을 갖고(도 17) 혈관형성 사이토킨을 분비하는(도 18) 능력을 유지하였다. 동결된 응집물을 제조하여 고리와 같은 거시적 형상을 형성할 수 있으며(도 19a 및 19b), H&E 염색(도 19c)은 동결보존된 융합된 응집물로부터 형성된 건강한 거시적 조직을 입증한다.

논의 :

이것은 hMSC 응집물은 동결보존될 수 있음을 입증하는 첫번째 실시예이다. 게다가, 개별 세포들이 응집물로부터 TC 플라스틱에 성장하는 능력, 응집물이 보다 큰 거시적 조직으로 융합하는 능력, 사이토킨을 분비하고 이들의 유도성 IDO 활성을 유지하는 세포 능력을 포함한 hMSC 응집물의 주요 기능은 동결보존 후 유지된다. 이러한 신규한 동결보존된 조성물의 이점은 동결보존된 제품 포맷이 선반에서 해내는 실현 가능성, 신선한 응집물을 제조하는데 필요한 복잡하고 장황한 제조 단계들과 비요하여 응집물 세포의 온-디멘드 공급(on-demand supply)이다. 필요에 따라 응집물을 해동시켜 사용하는 융통성은 도 20a의 공정 흐름도에 나타낸 바와 같이 연구원 또는 임상의로 하여금 세포 배양 시간을 수 주 내지 수 개월 절감시킨다. cGMP 생산 시설로 옮겨지는 경우 - 시간 절감량은 수 만 달러로 번역된다(도 20b).

실시예 6: 알기네이트 바이오잉크 개발

바이오잉크는 저장 동안 균질 현탁액에 단세포 또는 응집물을 현탁시켜 세포 군집을 방지하고 세포 농도 균일성을 유지하기 위해 생체적합성 하이드로겔 기질을 갖는 세포로 이루어질 필요가 있다. 저 점도 알기네이트를 포함한, 고 점도 고 M 및 고 G 알기네이트를 2가지 상이한 칼슘 공급원(CaCl₂ 및 CaSO₄)에 대해 시험하였다. 하이드로겔 기질 중의 칼슘의 양은 하이드로겔의 가교결합도, 이에 따라 인쇄된 작제물의 구조 및 강도를 지시할 수 있다. 이 연구에서, 세포를 제형화하기에 충분한 겔화를 가능케 하는 CaSO₄의 양을 이의 서방출 작용으로 인해 최적의 인쇄적성에 대해 적정하여, 사용자가 겔화 전에 용액을 조작하고 혼합하기 위한 타당한 "시간 창"을 하용하였다. 여기서, 본 출원인은 중간 내지 고 점도의 고 G 알기네이트가 우수한 "인쇄적성", 즉 "반고체" 구조(노즐로부터의 압출 용이성, 형상을 제자리에 보유시키기에 충분한 겔의 두께를 특징으로 하지만, 부스러질 정도로 너무 단단하지는 않음)를 유지할 수 있는 능력을 갖고 겔이 다층 형상을 만들기 위해 자체에 달라붙어 통합되는 능력인 점착성을 갖는 바이오잉크를 제조하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 올바른 제형은 또한 응집물을 저장 동안 균질 용액으로 잔류하게, 프린트 헤드를 막히게 할 수 있는 침강 및 군집을 피할 수 있게 한다(도 22). 마지막으로, 프린팅 후 CaCl₂ 세척 처리는 형상을 강화시키고 세포가 성숙하면서 구조의 보존을 가능하게 한다.

방법 :

고 G (프로타날) 또는 고 M (manugel & 나트륨 알기네이트, 제조원; Sigma)을 갖는 2-8% 중간 점도(Sigma Aldrich) 또는 고점도 (FMC 바이오중합체) 알기네이트를 Ca2+ 또는 Mg2+ 없이 DPBS 중에서 제조하였다. 25mg/ml CaSO₄를 DPBS 중에서 제조하여 알기네이트를 올바른 조도로 겔화시키는데 사용하였다. 상이한 용적의 알기네이트를 사용하였으며, 즉, 10% v/v/, 5% v/v, 또는 2.5% v/v를 상이한 알기네이트 유형으로 시험하였으며, 겔을 밤새 항온처리하여 "겔화" 및 "인쇄적성"의 정도를 결정하였다.

결과 :

저점도 알기네이트는 8% 이하의 알기네이트 농도에서도 구조를 부분적으로 겔화시킬 정도로 잘 가교결합하지 않았다. 중간/고 점도 알기네이트 (Manugel 고 M 알기네이트 및 프로타날 고 G 알기네이트가 여기서 사용됨)가 더 적합하였으며, 우수한 인쇄가능 제형을 만드는 것으로 나타났다. 염화칼슘이 2가 양이온 공급원으로서 최적이지 않아서, 황산칼슘이 칼슘을 혼합물로 더 서서히 방출하는데 사용되었으며 - 보다 균질한 하이드로겔을 생성하였다. 고 G 알기네이트 중의 보다 높은 수준의 황산칼슘은, 시린지 니들 조립체로부터 압출시 부스러질 정도로 너무 강성인 겔을 야기하였다. 중간 수준의 황산칼슘(2% 프로타날 중에 혼합된 1.25 mg/mL)이 이상적이었으며, 이것은 평활한 배출 조도, 다중 층을 형성하는 능력을 알기네이트에 제공하며, 여기서 새로 배출된 알기네이트는 이전에 압출된 물질에 부착되어(점착성) 3D 구조를 형성한다. 낮은 수준의 황산칼슘은 알기네이트를 겔화시키는데 충분하지 못하였으며 이것은 여전히 유체이므로 - 인쇄에 이상적이지 않았다(도 21).

3D 구조를 인쇄한 후, 인쇄된 구조가 즉시 기계적으로 안정하지는 않았다. 인쇄된 구조를 작은 용적의 용해된 염화칼슘으로 "경화"시키면 기계적으로 안정한 구조가 생성되었다. 바이오잉크를 위해 다음의 공정 및 제형이 확인되었다: 세포 또는 세포 응집물을 2% 고 G, 중간 내지 고 점도 알기네이트에 시린지 혼합(2개의 시린지를 커넥터와 연결시키고 2-10회 혼합함)을 통해 혼합하고; 모든 용액을 하나의 시린지로 옮기고, 황산칼슘을 1.25 mg/mL의 최종 농도로 가하고, 시린지 혼합을 통해 혼합하고; 알기네이트 겔을 5분 동안, 또는 수 주 정도로 길게 정치시키고; 시린지, 또는 다른 카트리지 시스템을 3D 프린터에 배치하고 3D 조직을 인쇄하고; 인쇄된 조직을 용도에 따라 배양물 또는 생물반응기에 배치한다.

따라서, 알기네이트와 같은 비겔화된 하이드로겔 중합체의 시린지, 또는 기타의 용기; 2개의 시린지가 멸균적으로 연결되도록 하는 멸균 연결 장치; 가교결합제(예를 들면, 황산칼슘)을 함유하는 또 다른 시린지, 및 세포 또는 세포 응집물을 함유하는 제3 시린지를 함유하는 바이오잉크 키트가 고려된다(도 24a &　24b).

이러한 키트를 사용하면, 최종 사용자가 다양한 용도를 위한 세포 함유 바이오잉크를 신속하고 용이하고 재현성있게 생산할 수 있다.

일부 경우에, 소비자가 상기 공정들을 전적으로 생략하고 바이오잉크 함유 카트리지를 3D 프린터에 삽입하여 즉시 인쇄할 수 있도록(바로 사용가능함) - 상당한 시간을 절감함 - 바이오잉크를 운송 전에 세포로 겔화시킨다(도 25).

실시예 7: 알기네이트 바이오잉크 생물보존

재료 & 방법

바이오잉크 A 제조

0.4g 프로타날 (고 G 알기네이트)을 20 ml 하이포써모솔에서 일정 교반하에 희석시킴으로써 하이포써모솔 (BioLife Solutions) 중의 2% 알기네이트를 제조하였다. MSC 응집물을 2 ml 알기네이트 용액에 혼합하고 10%의 25 mg/ml CaSO₄를 가하고 시린지를 사용하여 혼합하여 부분적으로 겔화되도록 하였다. 시린지를 파라필름으로 밀봉하고 시험 준비가 될 때까지 암흑에서 4℃에서 저장하였다.

바이오잉크 B 제조

하이포써모솔 & 콜라겐을 갖는 알기네이트 바이오잉크를 위해, 3 mg/ml 콜라겐(Collagen Solutions Inc.)을 제조자의 지침에 따라 제조하였으며, 여기서는 1부의 완충 용액을 빙상에서 9부의 콜라겐 용액에 가하여 잘 혼합하였다. 콜라겐 및 알기네이트를 갖는 응집물의 혼입을 위해, MSC 응집물을 동일 용적의 2% 알기네이트와 혼합하기 전에 3 mg/ml의 콜라겐 용액 1　ml에 가하였다. 일단 용액이 잘 혼합되면, 10% v/v의 25 mg/ml CaSO₄를 시린지로 가하고 잘 혼합하여 바이오잉크 용액을 부분적으로 겔화시켰다. 유사하게, 시린지를 파라필름으로 밀봉하고 시험 준비가 될 때까지 암흑에서 4℃에서 저장하였다.

저장한지 2주 후, 50-100㎕의 바이오잉크 A 및 B 둘 다를 15ml 원심분리관으로 압출시켰다. 4ml의 50mM 나트륨 시트레이트를 겔에 가하고 37℃에서 항온처리하여 겔을 용해시켰다. 겔이 용해될 때까지 관을 30분 동안 10분 마다 뒤집었다. 세포를 200 x g에서 5분 동안 원심분리함으로써 수집하였다. 상청액을 흡인시키고, 세포를 2% FBS/기본 배지에 재현탁시키고 TC 플레이트에 플레이팅하여 부착되도록 하였다.

대조군 세포의 제조를 위해, 원심분리하고 TC 플레이트에 플레이팅하기 전에 알기네이트로부터 MSC를 방출하기 위한 공정과 유사하게 새로 해동한 MSC를 50　mM 나트륨 시트레이트와 함께 30분 동안 항온처리하였다.

TC 배양 플레이트 상의 MSC 부착을 모니터링하고 접종한지 1일 및 6일째에 이미지를 촬영하였으며(도 23), 여기서 바이오잉크 B 중의 MSC 응집물은 TC 플레이트에 부착되어 증식하는 것으로 관찰되었으며, 이는 MSC 응집물의 보존을 위한 매우 실현 가능한 바이오잉크 제형을 입증하였다. 바이오잉크 A 및 B의 인쇄적성은 둘 다 점착성이고 강하며, 3D 구조는 부분적으로 고체인 겔로 형상화될 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 개시된 발명이 속하는 기술분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 인용된 간행물 및 이들이 언급된 자료들이 참고로 구체적으로 포함된다.

당업계의 숙련가들은 본원에 기재된 발명의 구체적인 실시형태에 대한 다수의 등가물을 단지 일상적인 실험을 사용하여 인지하거나, 알아낼 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims

냉동보존제 중에 동결된 세포를 포함하는 조성물로서,
상기 세포가 응집물 당 평균 적어도 1,000개의 세포를 함유하는 응집물로 형성되고, 상기 세포 응집물이 -60℃에서 적어도 6개월 동안 저장된 후 적어도 70%의 세포 생존률을 갖는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 응집물의 적어도 70%가 -60℃에서 적어도 6개월 동안 저장된 후 융합하는 능력을 보유하는, 조성물.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 응집물이 상기 조성물 내에 20% 미만의 평균 직경 분산을 갖는 조성물.
청구항 1 내지 3 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 냉동보존제가 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함하는 조성물.
청구항 1 내지 4 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 중간엽 줄기 세포를 포함하는 조성물.
생물보존제 중에 세포를 포함하는 조성물로서,
상기 세포가 응집물 당 평균 적어도 1,000개의 세포를 함유하는 응집물로 형성되고, 상기 세포 응집물이 4℃에서 적어도 7일 동안 저장된 후 적어도 70%의 세포 생존률을 갖고 융합하는 능력을 보유하는, 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 응집물의 적어도 70%가 4℃에서 적어도 7일 동안 저장된 후 융합하는 능력을 보유하는, 조성물.
청구항 6 또는 7에 있어서, 상기 응집물이 상기 조성물 내에 20% 미만의 평균 직경 분산을 갖는, 조성물.
청구항 6 내지 8 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 생물보존제가 하이포써모솔(HypoThermosol)®을 포함하는, 조성물.
청구항 6 내지 9 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 중간엽 줄기 세포를 포함하는, 조성물.
점성 기질에 현탁된 세포를 포함하는 조성물로서
상기 세포가 밀리리터 당 적어도 백만개 세포의 평균 세포 밀도로 존재하고, 상기 점성 기질이 적어도 48시간 동안 10% 미만의 세포 밀도 분산을 유지하기에 효과적인 점도를 가지며, 상기 세포가 4℃에서 적어도 7일 동안 저장된 후 적어도 70%의 세포 생존률을 갖는, 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 세포가 응집물 당 평균 적어도 1,000개의 세포를 함유하는 응집물로 형성되고, 상기 응집물이 4℃에서 적어도 7일 동안 저장된 후 융합하는 능력을 보유하는, 조성물.
청구항 12에 있어서, 상기 응집물이 상기 조성물 내에 10% 미만의 평균 직경 분산을 갖는, 조성물.
청구항 11 내지 13 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 생물보존제, 냉동보존제, 또는 이들의 배합물을 포함하는, 조성물.
청구항 14에 있어서, 상기 생물보존제가 하이포써모솔(HypoThermosol)®을 포함하는, 조성물.
청구항 14 또는 15에 있어서, 상기 냉동보존제가 디메틸 설폭사이드 (DMSO)를 포함하는, 조성물.
청구항 11 내지 16 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 점성 기질이 생체적합성 중합체를 포함하는, 조성물.
청구항 17에 있어서, 상기 생체적합성 중합체가 바이오중합체를 포함하는, 조성물.
청구항 18에 있어서, 상기 생체적합성 중합체가 다당류를 포함하는, 조성물.
청구항 19에 있어서, 상기 생체적합성 중합체가 알기네이트를 포함하는 조성물.
청구항 11 내지 20 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 조성물 중에서 10% 미만의 밀도 분산을 갖는, 조성물.
청구항 11 내지 21 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 중간엽 줄기 세포를 포함하는, 조성물.
청구항 11 내지 22 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 내피 세포를 추가로 포함하는, 조성물.
a) 응집물 당 평균 적어도 300개 세포를 함유하는 세포 응집물을 포함하는 조성물;
b) 생체적합성 중합체; 및
c) 가교결합제를 포함하는, 키트.
청구항 24에 있어서, 상기 조성물이 청구항 1 내지 15 중의 어느 한 항의 조성물인, 키트.
청구항 24 또는 25에 있어서, 상기 생체적합성 중합체가 바이오중합체를 포함하는, 키트.
청구항 26에 있어서, 상기 생체적합성 중합체가 다당류를 포함하는, 키트.
청구항 27에 있어서, 상기 생체적합성 중합체가 알기네이트를 포함하는, 키트.
청구항 1 내지 21 중의 어느 한 항의 조성물을 포함하는 폐쇄계 장치로서,
상기 폐쇄계 장치는 상기 조성물을 이산 단위(discrete unit)로서 분배하도록 구성되고, 각각의 이산 단위가 상기 세포의 조절된 양을 포함하는, 폐쇄계 장치.
청구항 29에 있어서, 상기 폐쇄계 장치는 카트리지인, 폐쇄계 장치.
청구항 29 또는 30에 있어서, 상기 폐쇄계 장치는 삼차원 (3D) 프린터 장치에서 사용하기 위해 구성된, 폐쇄계 장치.