CN108379659A - 一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，该方法首先打印一层强度可控的水凝胶支架层，再将一层细胞根据天然软骨中细胞的分布特点精确打印到水凝胶支架上，如此往复，层层叠加，直至打印完成。该方法打印速度快、精度高，制备的生物支架机械性能好，支架内部细胞分布精确，生长周期可调，所制备的软骨支架具备多梯度细胞密度和力学强度，在结构和功能上较好的模拟了天然软骨，有较好的机械性能和生物性能。

Description

一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法
技术领域
本发明属于3D细胞打印技术领域，具体涉及一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法。
背景技术
关节软骨几乎没有自我修复的能力，软骨损伤往往是不可逆的，会引起骨性关节炎，甚至危及生命。严重的关节软骨损伤只能使用人工软骨置换病变软骨。传统的人工软骨置换是利用金属、高分子材料、陶瓷等制作假体，替代病损关节，组织结构精度不足，假体植入后不能消除关节疼痛，替代效果不甚理想。
组织结构是发挥组织生理功能的基础。关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质构成，没有血管、神经、淋巴，软骨细胞密度由内至外呈梯度分布；同时关节软骨轮廓复杂，不同的部位有不同的力学要求，难以采用传统方式加工。
3D打印技术能够复制软骨外形轮廓和内部组织结构，并且3D打印的人工软骨具有较好的生物活性，软骨细胞来源于自体，排异反应较小，是最有希望的软骨修复方式。水凝胶支架具有多孔的高分子网络体系，内部可以存储大量的营养物质和生长因子，水凝胶支架能够实现药物的缓释作用，可以在很长一段时间内调控支架内部的细胞的生长，是一种较为理想的3D打印生物支架材料。
目前有多种人工软骨支架3D打印方法：
一种方法是首先制备生物支架，然后将细胞打印到生物支架表面，最后培养“支架+细胞”复合体得到所需组织。公开号为CN105031733A的专利公开了一种组织制备方法，该方法使用细胞外基质构建出与损伤组织外形相同的支架，然后使用3D打印技术将细胞打印到该支架表面，形成“支架+细胞”复合体。使用这种方法简单快捷，细胞在支架表面能够得到充足的养分。但是这种方法不能实现细胞在组织内部定点分布，难以形成多功能组织，不适合大块人工软骨的制备。
另一种方法是打印细胞和支架混合物。公开号为CN103750918A的专利公开了一种基于温敏水凝胶的细胞喷射打印技术，该方法首先将细胞和温敏水凝胶混合，再通过空气动力辅助喷射技术挤压出细胞和水凝胶的混合物，最后降温使得温敏水凝胶固化，得到“支架+细胞”复合体。该方法可以使用高黏度生物支架基体材料，制备出有较高的机械性能的生物支架，但是细胞在挤压出来的混合物中不能实现精确的分布，挤压打印过程中的高压还会造成细胞的死亡。因此这种方法不能制备细胞密度多梯度分布的人工软骨。公开号为CN105861308A的专利公开了一种使用压电喷头打印细胞和生物支架基体材料混合物的方法，该方法通过控制压电喷头喷速及喷射液滴的大小，实现细胞的精准打印。这种方法打印速度快，打印精度高，具备单细胞打印的能力，能够实现细胞在支架内部的精确分布。但是压电喷头只能打印低黏度液体，因此制备的支架强度低，不能满足人工软骨的力学性能需求，不适合人工软骨的打印。
目前的人工软骨制备方法难以同时满足支架强度和细胞精准分布的要求，低强度的水凝胶不满足组织力学性能，高强度水凝胶内部孔隙率越低，不利于细胞生存，同时也难以实现内部细胞精准分布。制备的人工软骨不具备天然软骨的组织结构和力学性能，缺乏细胞生长定向调控的能力，定值后容易被血管入侵，造成软骨内骨化，不能发挥天然软骨的生理功能。
发明内容
为克服现有技术不能制备具有精准细胞梯度的人工软骨的缺陷，本发明提出了一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，既保证人工软骨的机械性能，又保证细胞在人工软骨中的精准分布，同时还提高软骨定值成功率。
该方法首先打印一层强度可控的水凝胶支架层，再将一层细胞根据天然软骨中细胞的分布特点精确打印到水凝胶支架上，如此往复，层层叠加，直至打印完成。该方法打印速度快、精度高，制备的生物支架机械性能好，支架内部细胞分布精确，生长周期可调，所制备的软骨支架具备多梯度细胞密度和力学强度，在结构和功能上较好的模拟了天然软骨，有较好的机械性能和生物性能。
本发明的技术方案为：
所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：获取待打印软骨组织的三维模型，并对软骨组织三维模型进行分层切片处理，获取分层截面数据。
步骤2：向步骤1中分层截面数据中导入软骨组织的细胞密度梯度数据。
步骤3：培养待打印的软骨细胞，得到5×106cells/ml～7×106cells/ml软骨细胞悬液。
这里控制悬液细胞密度为对应生物组织中细胞密度的110％-140％。申请人发现，如果简单的按照生物组织中细胞密度直接配置相应密度的细胞悬液，则会在打印过程中，因为需要打印大量的细胞悬浮液而增加打印时间，减小细胞存活率；所以需要在生物组织中细胞密度的基础上，提高一定密度来配置细胞悬液，但细胞密度又不能过高，实验发现，密度过高会增加细胞培养的难度，同时打印过程中造成一个液滴中含有多个细胞等问题，影响打印精度。
步骤4：制备黏度为1×103cps～1×106cps的水凝胶支架基体材料，基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶，其中海藻酸钠的质量分数为2％～5％，明胶的质量分数为0.8％～1.2％；将制备好的基体材料放入45℃恒温环境，再加入质量分数为2％-5％，直径20μm-70μm，长度不超过3mm的PLGA纳米纤维丝，以及包埋软骨调节素-I的纳米PLGA缓释微球；得到的每升水凝胶支架基体材料中软骨调节素-I的总量为5ng～50ng。
这里海藻酸钠以及明胶的质量分数限定较为重要，海藻酸钠质量分数低于设定范围会导致软骨支架固化后强度低、弹性差；浓度高于设定范围能够提升强度和弹性，但是会缩小微孔直径，不利于细胞生存。而明胶质量分数低于设定范围，难以促进软骨支架快速固化；明胶质量分数高于设定范围，也会缩小软骨支架微孔直径，不利于细胞生存。此外，明胶具有温敏性，高于40℃时候，整个溶液粘度较低，利于挤压打印，但温度过高会导致降温固化缓慢，降低打印速度，过高的水凝胶温度还会导致其周围的细胞损伤；低于40℃便形成粘度较大的胶体，水凝胶还未打印到位置便开始固化，导致层与层之间结合不紧密，降低机械强度，所以，选择恰当的保存温度，既可以提高固化后的强度，同时会加快固化速度。
步骤5：在步骤3中培养的软骨细胞悬液中加入质量分数0.15％～3％的壳聚糖，再加入1ng/mL～50ng/mL的BMP2，最后装入压电打印喷头储液腔；将步骤4得到的水凝胶支架基体材料装入挤压打印喷头的储液腔。
步骤6：按照步骤1得到的分层截面数据控制挤压打印喷头打印一层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的雾化氯化钙溶液对水凝胶支架进行固化。
步骤7：按照步骤2中得到的分层截面数据及细胞密度梯度数据控制压电打印喷头在固化后的水凝胶支架上打印一层软骨细胞，并通过压电打印喷头的打印频率，实现同一分层截面中不同区域软骨细胞密度分布。
步骤8：重复步骤6和步骤7，直至所有分层打印完毕。
步骤9：将打印完成的软骨组织放入9％～11％FBS高糖低钙培养基，移入36.8℃～37.5℃，4.5％～5.5％的CO2细胞培养箱中培养；其中高糖低钙培养基的钙离子浓度0.5～0.8mmol/L，培养的第一周细胞培养箱中氧气浓度为5％～7％，之后将氧气浓度为19％～22％。
进一步的优选方案，所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：步骤5中压电打印喷头储液腔温度为35±2℃，挤压打印喷头的储液腔温度为45±2℃。
进一步的优选方案，所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：步骤6中采用挤压打印喷头打印水凝胶支架前，先将挤压打印喷头喷嘴处的低温水凝胶排出后，再进行打印；步骤7中采用压电打印喷头打印细胞之前的空闲期间，保持细胞悬液低频振荡，且每隔30s～40s将压电打印喷头喷嘴处的细胞悬液排出至废液槽。
这里进行进一步限定的主要原因是，申请人在实际使用过程中发现，如果仅仅是简单的一层水凝胶一层细胞往复打印，由于挤压喷头和压电喷头处于交替工作状态，在挤压打印空闲期，喷嘴冷却导致喷嘴处水凝胶固化，再次打印时难以同之前打印的组织结合；在细胞打印空闲期：细胞悬液停止运动造成细胞沉降，不仅导致细胞悬液内细胞分布不均匀，还容易造成细胞堆积堵塞压电喷头；为解决上述问题，提出了上述限定特征。
进一步的优选方案，所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：步骤1中软骨组织三维模型分层切片的层间距为△h，△h等于挤压打印喷头的喷嘴直径。
进一步的优选方案，所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：步骤2中，对于每个分层截面，软骨组织浅层、中层、深层的面积各占截面面积的15％，15％，70％，软骨组织浅层、中层、深层的细胞密度比为3:2:1。
进一步的优选方案，所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：压电打印喷头的打印频率不超过3kHz。
这里对打印频率进行进一步限定的主要原因是，过高的打印频率会导致喷头堵塞。
进一步的优选方案，所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：对于每个分层截面，控制压电打印喷头分别以3kHz,2kHz,1kHz的频率打印软骨组织浅层、中层、深层截面，实现细胞密度的梯度变化。
进一步的优选方案，所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：采用质量分数3％～5％的氯化钙进行喷雾固化时，氯化钙溶液温度1℃～10℃。
进一步的优选方案，所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：对于每个分层截面，在进行氯化钙喷雾固化时，软骨组织浅层、中层、深层截面的的雾化量依次为200mL/h、250mL/h、300mL/h。
这里通过控制氯化钙雾化量，可以控制软骨支架的强度，实现软骨支架力学梯度分布。氯化钙使水凝胶发生交联反应，提高组织强度。而且喷洒氯化钙降温会加快水凝胶固化过程，将温度快速降低到适合细胞打印的范围。
进一步的优选方案，所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：步骤4中PLGA纳米纤维丝中PLA:PGA＝50:50。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有显著的优点：
(1)组织结构是发挥组织生理功能的基础，本发明制备出的多梯度人工软骨能够在外形轮廓和内部细胞分布上精确的模拟天然软骨，实现软骨细胞的梯度分布，具有较好的机械性能和生物性能。打印过程中采用了两种类型的打印喷头，使用挤压式喷头打印高黏度的水凝胶支架基体材料，从而使水凝胶支架获得较好的力学性能；同时使用压电喷头打印软骨细胞，实现细胞的高精度打印和精准分布。
(2)采用基于挤压和压电的打印方式，打印的人工软骨在一个设备中一次成型，既减少了制备过程中二次污染的概率，又缩短了打印时间，减少细胞死亡。整个打印过程细胞不会处于高温或者高压的环境，对细胞的伤害较小，可以保证较高的细胞存活率和细胞活性。
(3)PLGA(PLA:PGA＝50:50)纳米纤维丝降解快，在打印过程和组织培养前期可以迅速有效提升组织强度。待软骨组织发育稳定后PLGA降解，又可以留下纳米孔道，提高组织孔隙率，利于软骨细胞的生长发育。
(4)通过控制氯化钙的雾化量控制软骨支架不同位置的弹性和强度，满足人工软骨不同部位的力学强度需求。
(5)本发明制备的人工软骨生长周期可调。低钙环境保持软骨细胞在整个培养过程中的稳定，减少细胞肥大，BMP2减少在打印和培育过程中软骨细胞的凋亡。培养前期低氧环境可以促进软骨细胞迅速增殖，以提高细胞密度。在植入后，纳米PLGA缓释微球释放软骨调节素-I，阻止血管的入侵软骨组织，防止软骨内骨化。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：
本实施实例采用膝关节人工软骨的制备，来描述多喷头多梯度人工软骨的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1、使用CT扫描，经过计算机处理获取待打印膝关节软骨组织的三维模型，使用计算机对该软骨组织的三维模型进行分层切片处理：其中，总共分为厚度相同的N层，第i层的截面为Ai，层间距为△h，△h等于挤压喷头喷嘴直径，即△h＝0.35mm。
步骤2、使用计算机在步骤1中的切片中导入细胞密度数据：膝关节软骨浅层、中层、深层的面积由表及里各占截面Ai的15％，15％，70％，膝关节软骨浅层、中层、深层的细胞密度比为3:2:1。
步骤3、在高糖DMEM培养液中培养待打印的软骨细胞，制备出5×106cells/ml软骨细胞悬液。
步骤4、制备黏度为5×104cps的水凝胶支架基体材料，基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶，其中海藻酸钠的质量分数为3％，明胶的质量分数为1％。将制备好的基体材料放入45℃恒温环境，加入质量分数为3.5％，直径20μm-70μm，长度不超过3mm的PLGA(PLA:PGA＝50:50)纳米纤维丝，再加入包埋软骨调节素-I的纳米PLGA缓释微球，得到的每升水凝胶支架基体材料中软骨调节素-I的含量为25ng。
步骤5、在步骤3中培养的软骨细胞悬液中加入质量分数2％的壳聚糖，再加入5ng/mL的BMP2，之后将软骨细胞悬液装入压电打印喷头储液腔，将水凝胶基体材料装入挤压打印喷头的储液腔，其中细胞悬液储液腔温度为35℃，水凝胶基体材料储液腔温度为45℃。设置初始值i＝1，并启动打印设备。
步骤6、将第i层截面图形输入打印控制设备中，控制挤压喷头将喷嘴处的低温水凝胶排出，再打印第i层截面Ai，形成第i层水凝胶支架，其中挤压打印喷头喷嘴直径0.35mm，挤压速率为0.2mm/s，挤压喷头运动速度为6mm/s，打印温度45℃，喷嘴距离打印平台的高度为0.9mm。在打印的第i层水凝胶支架上喷撒质量分数为4％的雾化氯化钙溶液,其中氯化钙溶液温度2℃，软骨浅层、中层、深层的雾化量依次为200mL/h、250mL/h、300mL/h。
步骤7、将第i层截面数据和细胞密度梯度数据输入打印设备，控制压电喷头分别以3kHz,2kHz,1kHz的频率打印第i层软骨的浅层、中层、深层截面，实现人工软骨中浅层、中层、深层细胞密度比3:2:1的梯度分布。其中：压电喷头为赛尔xaar128，打印过程中压电打印喷头运动速度为1mm/s。
为了防止细胞沉降导致的溶液中细胞密度不均匀和喷头堵塞，在压电喷头空闲期间，应当保持细胞悬液低频振荡，并且每隔30s～40s就将压电喷头内的细胞悬液排出至废液槽。
步骤8、判断i：若i<N，则i＝i+1，重复步骤6-7；否则，执行步骤9。
步骤9、将打印完成的软骨组织放入10％FBS高糖低钙培养基，37℃，5％的CO2细胞培养箱中培养。其中高糖低钙培养基的钙离子浓度0.5～0.8mmol/L，培养的第一周细胞培养箱中氧气浓度为5％～7％，之后将氧气浓度为19％～22％。
为了说明海藻酸钠以及明胶的质量分数的重要性，下面给出两个实施反例：
反例1：
步骤1、使用CT扫描，经过计算机处理获取待打印膝关节软骨组织的三维模型，使用计算机对该软骨组织的三维模型进行分层切片处理：其中，总共分为厚度相同的N层，第i层的截面为Ai，层间距为△h，△h等于挤压喷头喷嘴直径，即△h＝0.35mm。
步骤2、使用计算机在步骤1中的切片中导入细胞密度数据：膝关节软骨浅层、中层、深层的面积由表及里各占截面Ai的15％，15％，70％，膝关节软骨浅层、中层、深层的细胞密度比为3:2:1。
步骤3、在高糖DMEM培养液中培养待打印的软骨细胞，制备出5×106cells/ml软骨细胞悬液。
步骤4、制备黏度为5×104cps的水凝胶支架基体材料，基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶，其中海藻酸钠的质量分数为1％，明胶的质量分数为0.5％。将制备好的基体材料放入45℃恒温环境，加入质量分数为2％，直径20μm-70μm，长度不超过3mm的PLGA(PLA:PGA＝50:50)纳米纤维丝，再加入包埋软骨调节素-I的纳米PLGA缓释微球，得到的每升水凝胶支架基体材料中软骨调节素-I的含量为25ng。
步骤5、在步骤3中培养的软骨细胞悬液中加入质量分数2％的壳聚糖，再加入5ng/mL的BMP2，之后将软骨细胞悬液装入压电打印喷头储液腔，将水凝胶基体材料装入挤压打印喷头的储液腔，其中细胞悬液储液腔温度为35℃，水凝胶基体材料储液腔温度为45℃。设置初始值i＝1，并启动打印设备。
步骤6、将第i层截面图形输入打印控制设备中，控制挤压喷头将喷嘴处的低温水凝胶排出，再打印第i层截面Ai，形成第i层水凝胶支架，其中挤压打印喷头喷嘴直径0.35mm，挤压速率为0.2mm/s，挤压喷头运动速度为6mm/s，打印温度45℃，喷嘴距离打印平台的高度为0.9mm。在打印的第i层水凝胶支架上喷撒质量分数为4％的雾化氯化钙溶液,其中氯化钙溶液温度2℃，软骨浅层、中层、深层的雾化量依次为200mL/h、250mL/h、300mL/h。
步骤7、将第i层截面数据和细胞密度梯度数据输入打印设备，控制压电喷头分别以3kHz,2kHz,1kHz的频率打印第i层软骨的浅层、中层、深层截面，实现人工软骨中浅层、中层、深层细胞密度比3:2:1的梯度分布。其中：压电喷头为赛尔xaar128，打印过程中压电打印喷头运动速度为1mm/s。
为了防止细胞沉降导致的溶液中细胞密度不均匀和喷头堵塞，在压电喷头空闲期间，应当保持细胞悬液低频振荡，并且每隔30s～40s就将压电喷头内的细胞悬液排出至废液槽。
步骤8、判断i：若i<N，则i＝i+1，重复步骤6-7；否则，执行步骤9。
步骤9、将打印完成的软骨组织放入10％FBS高糖低钙培养基，37℃，5％的CO2细胞培养箱中培养。其中高糖低钙培养基的钙离子浓度0.5～0.8mmol/L，培养的第一周细胞培养箱中氧气浓度为5％～7％，之后将氧气浓度为19％～22％。
该方法制备的人工软骨在打印过程中已经局部坍塌变形，不满足人工软骨的形态需求。
反例2：
步骤1、使用CT扫描，经过计算机处理获取待打印膝关节软骨组织的三维模型，使用计算机对该软骨组织的三维模型进行分层切片处理：其中，总共分为厚度相同的N层，第i层的截面为Ai，层间距为△h，△h等于挤压喷头喷嘴直径，即△h＝0.35mm。
步骤2、使用计算机在步骤1中的切片中导入细胞密度数据：膝关节软骨浅层、中层、深层的面积由表及里各占截面Ai的15％，15％，70％，膝关节软骨浅层、中层、深层的细胞密度比为3:2:1。
步骤3、在高糖DMEM培养液中培养待打印的软骨细胞，制备出5×106cells/ml软骨细胞悬液。
步骤4、制备黏度为5×104cps的水凝胶支架基体材料，基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶，其中海藻酸钠的质量分数为10％，明胶的质量分数为3％。将制备好的基体材料放入45℃恒温环境，加入质量分数为5％，直径20μm-70μm，长度不超过3mm的PLGA(PLA:PGA＝50:50)纳米纤维丝，再加入包埋软骨调节素-I的纳米PLGA缓释微球，得到的每升水凝胶支架基体材料中软骨调节素-I的含量为25ng。
步骤5、在步骤3中培养的软骨细胞悬液中加入质量分数2％的壳聚糖，再加入5ng/mL的BMP2，之后将软骨细胞悬液装入压电打印喷头储液腔，将水凝胶基体材料装入挤压打印喷头的储液腔，其中细胞悬液储液腔温度为35℃，水凝胶基体材料储液腔温度为45℃。设置初始值i＝1，并启动打印设备。
步骤6、将第i层截面图形输入打印控制设备中，控制挤压喷头将喷嘴处的低温水凝胶排出，再打印第i层截面Ai，形成第i层水凝胶支架，其中挤压打印喷头喷嘴直径0.35mm，挤压速率为0.2mm/s，挤压喷头运动速度为6mm/s，打印温度45℃，喷嘴距离打印平台的高度为0.9mm。在打印的第i层水凝胶支架上喷撒质量分数为4％的雾化氯化钙溶液,其中氯化钙溶液温度2℃，软骨浅层、中层、深层的雾化量依次为200mL/h、250mL/h、300mL/h。
步骤7、将第i层截面数据和细胞密度梯度数据输入打印设备，控制压电喷头分别以3kHz,2kHz,1kHz的频率打印第i层软骨的浅层、中层、深层截面，实现人工软骨中浅层、中层、深层细胞密度比3:2:1的梯度分布。其中：压电喷头为赛尔xaar128，打印过程中压电打印喷头运动速度为1mm/s。
为了防止细胞沉降导致的溶液中细胞密度不均匀和喷头堵塞，在压电喷头空闲期间，应当保持细胞悬液低频振荡，并且每隔30s～40s就将压电喷头内的细胞悬液排出至废液槽。
步骤8、判断i：若i<N，则i＝i+1，重复步骤6-7；否则，执行步骤9。
步骤9、将打印完成的软骨组织放入10％FBS高糖低钙培养基，37℃，5％的CO2细胞培养箱中培养。其中高糖低钙培养基的钙离子浓度0.5～0.8mmol/L，培养的第一周细胞培养箱中氧气浓度为5％～7％，之后将氧气浓度为19％～22％。
该方法制备的人工软骨结构致密，强度非常高，弹性很好，培育过程中，细胞增殖慢，死亡率高，不能满足植入要求。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：获取待打印软骨组织的三维模型，并对软骨组织三维模型进行分层切片处理，获取分层截面数据；
步骤2：向步骤1中分层截面数据中导入软骨组织的细胞密度梯度数据；
步骤3：培养待打印的软骨细胞，得到5×106cells/ml～7×106cells/ml软骨细胞悬液；
步骤4：制备黏度为1×103cps～1×106cps的水凝胶支架基体材料，基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶，其中海藻酸钠的质量分数为2％～5％，明胶的质量分数为0.8％～1.2％；将制备好的基体材料放入45℃恒温环境，再加入质量分数为2％-5％，直径20μm-70μm，长度不超过3mm的PLGA纳米纤维丝，以及包埋软骨调节素-I的纳米PLGA缓释微球；得到的每升水凝胶支架基体材料中软骨调节素-I的总量为5ng～50ng；
步骤5：在步骤3中培养的软骨细胞悬液中加入质量分数0.15％～3％的壳聚糖，再加入1ng/mL～50ng/mL的BMP2，最后装入压电打印喷头储液腔；将步骤4得到的水凝胶支架基体材料装入挤压打印喷头的储液腔；
步骤6：按照步骤1的分层截面数据控制挤压打印喷头打印一层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的雾化氯化钙溶液对水凝胶支架进行固化；
步骤7：按照步骤2中的分层截面数据及细胞密度梯度数据控制压电打印喷头在固化后的水凝胶支架上打印一层软骨细胞，并通过压电打印喷头的打印频率，实现同一分层截面中不同区域软骨细胞密度分布；
步骤8：重复步骤6和步骤7，直至所有分层打印完毕；
步骤9：将打印完成的软骨组织放入9％～11％FBS高糖低钙培养基，移入36.8℃～37.5℃，4.5％～5.5％的CO2细胞培养箱中培养；其中高糖低钙培养基的钙离子浓度0.5～0.8mmol/L，培养的第一周细胞培养箱中氧气浓度为5％～7％，之后将氧气浓度为19％～22％。
2.根据权利要求1所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：步骤5中压电打印喷头储液腔温度为35±2℃，挤压打印喷头的储液腔温度为45±2℃。
3.根据权利要求2所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：步骤6中采用挤压打印喷头打印水凝胶支架前，先将挤压打印喷头喷嘴处的低温水凝胶排出后，再进行打印；步骤7中采用压电打印喷头打印细胞之前的空闲期间，保持细胞悬液低频振荡，且每隔30s～40s将压电打印喷头喷嘴处的细胞悬液排出至废液槽。
4.根据权利要求1或3所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：步骤1中软骨组织三维模型分层切片的层间距为△h，△h等于挤压打印喷头的喷嘴直径。
5.根据权利要求4所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：步骤2中，对于每个分层截面，软骨组织浅层、中层、深层的面积各占截面面积的15％，15％，70％，软骨组织浅层、中层、深层的细胞密度比为3:2:1。
6.根据权利要求5所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：压电打印喷头的打印频率不超过3kHz。
7.根据权利要求6所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：对于每个分层截面，控制压电打印喷头分别以3kHz,2kHz,1kHz的频率打印软骨组织浅层、中层、深层截面。
8.根据权利要求7所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：采用质量分数3％～5％的氯化钙进行喷雾固化时，氯化钙溶液温度1℃～10℃。
9.根据权利要求8所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：对于每个分层截面，在进行氯化钙喷雾固化时，软骨组织浅层、中层、深层截面的的雾化量依次为200mL/h、250mL/h、300mL/h。
10.根据权利要求1所述一种细胞密度多梯度人工软骨制备方法，其特征在于：步骤4中PLGA纳米纤维丝中PLA:PGA＝50:50。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112378720A (zh) * 2020-11-13 2021-02-19 维捷(苏州)三维打印有限公司 一种多强度砂型打印方法
CN109568658B (zh) * 2018-12-19 2021-02-26 复旦大学附属中山医院 一种基于3d打印的细胞均一性分布的生物墨水及其装配方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103143062A (zh) * 2013-03-06 2013-06-12 上海大学 活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法与成形系统
CN105664248A (zh) * 2016-01-18 2016-06-15 西北工业大学 一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法
CN106222085A (zh) * 2016-07-28 2016-12-14 西安交通大学 一种高精度的生物复合3d打印装置及打印方法
CN106563162A (zh) * 2016-11-15 2017-04-19 深圳先进技术研究院 细胞‑生物材料复合支架及其制备方法和应用
CN106659148A (zh) * 2014-05-12 2017-05-10 鲁斯特生物股份有限公司 即用打印细胞和集成装置
US20170143831A1 (en) * 2015-11-24 2017-05-25 The Texas A&M University System In vivo live 3d printing of regenerative bone healing scaffolds for rapid fracture healing
CN106999635A (zh) * 2014-12-11 2017-08-01 苏黎世联邦理工学院 软骨修复用移植物支架及其制造方法
US20170218228A1 (en) * 2014-07-30 2017-08-03 Tufts University Three Dimensional Printing of Bio-Ink Compositions
CN107308502A (zh) * 2016-10-28 2017-11-03 深圳市第二人民医院 复合负载生长因子微球的3d打印支架及其制备方法
CN107320773A (zh) * 2017-06-09 2017-11-07 西安交通大学 一种人工肌肉支架模型以及其制备装置和方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103143062A (zh) * 2013-03-06 2013-06-12 上海大学 活性骨软骨一体化梯度支架三维可控的增量成形方法与成形系统
CN106659148A (zh) * 2014-05-12 2017-05-10 鲁斯特生物股份有限公司 即用打印细胞和集成装置
US20170218228A1 (en) * 2014-07-30 2017-08-03 Tufts University Three Dimensional Printing of Bio-Ink Compositions
CN106999635A (zh) * 2014-12-11 2017-08-01 苏黎世联邦理工学院 软骨修复用移植物支架及其制造方法
US20170143831A1 (en) * 2015-11-24 2017-05-25 The Texas A&M University System In vivo live 3d printing of regenerative bone healing scaffolds for rapid fracture healing
CN105664248A (zh) * 2016-01-18 2016-06-15 西北工业大学 一种基于压电喷印方式的蛋白质支架制备方法
CN106222085A (zh) * 2016-07-28 2016-12-14 西安交通大学 一种高精度的生物复合3d打印装置及打印方法
CN107308502A (zh) * 2016-10-28 2017-11-03 深圳市第二人民医院 复合负载生长因子微球的3d打印支架及其制备方法
CN106563162A (zh) * 2016-11-15 2017-04-19 深圳先进技术研究院 细胞‑生物材料复合支架及其制备方法和应用
CN107320773A (zh) * 2017-06-09 2017-11-07 西安交通大学 一种人工肌肉支架模型以及其制备装置和方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAHAR SULTAN ET AL: ""3D printed scaffolds with gradient porosity based on a cellulose nanocrystal hydrogel"", 《NANOSCALE》 *
任翔: ""挤压式生物3D打印机初建与仿生细胞分布组织工程软骨体外初步验证"", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
汪焰恩 等: ""个性化三维打印仿生骨骼术前诊断模型"", 《中国科学：信息科学》 *
郭雄: "《软骨分子生物学基础与临床应用》", 31 May 2012, 西安交通大学出版社 *
顾其胜: "《海藻酸与临床医学》", 31 May 2006 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109568658B (zh) * 2018-12-19 2021-02-26 复旦大学附属中山医院 一种基于3d打印的细胞均一性分布的生物墨水及其装配方法
CN112378720A (zh) * 2020-11-13 2021-02-19 维捷(苏州)三维打印有限公司 一种多强度砂型打印方法

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