KR20040016984A

KR20040016984A - 세포·조직 배양용 담체 및 배양방법

Info

Publication number: KR20040016984A
Application number: KR10-2004-7000487A
Authority: KR
Inventors: 요시오카히로시; 구보타스나오; 모리유이치
Original assignee: 메비올 가부시키가이샤
Priority date: 2001-07-13
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2004-02-25
Also published as: IL159794A0; US20040203148A1; EP1416044A4; CA2453539A1; WO2003006635A1; JPWO2003006635A1; US6897064B2; EP1416044A1

Abstract

본 발명은 섬유아세포의 과잉증식을 억제하면서, 목적으로 하는 조직이나 장기를 효과적으로 재생할 수 있는 세포·조직배양용 담체, 및 세포·조직배양 방법에 관한 것이다. 그 수용액이 저온에서 졸상태, 고온에서 겔상태가 되는 열가역적인 졸-겔 전이를 나타내는 하이드로겔 형성성 고분자를 사용하여, 상기 하이드로겔 형성성 고분자에 근거한 겔내에서 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않는 세포·조직배양용 담체를 구성한다.

Description

세포·조직 배양용 담체 및 배양방법{SUPPORT FOR CELL/TISSUE CULTURE AND CULTURE METHOD}

이식의료뿐만 아니라, 유전자 해석, 유용한 세포산 생물의 생산을 목적으로 한 생물반응기(bioreactor), 약제의 생물활성 평가 등을 비롯한 여러가지 연구·개발 분야에 있어서, 동물세포 내지 조직의 배양은 광범위하게 이용되고 있다.

예를 들어, 현재의 이식의료 현장에서는, 심각한 도너(donor)의 부족이 긴급한 문제이다. 사람 또는 동물 모두를 도너로 하더라도, 「생체 도너」의 확보는 이후에도 매우 어려운 문제이다.

한편, 이 도너 부족 문제를 해결하기 위한 매우 유력한 방법으로서, 이식용 장기나 조직, 기관을 생체 밖에서 작성하려는 인비트로 티슈·엔지니어링(생체외 조직 공학)이 각광을 받고 있다. 이 티슈·엔지니어링의 기본 전략은, 세포(예를 들어, 간세포(幹細胞, stem cell))를 필요에 따라 성장 인자 등의 생리활성 물질과 함께 인공적인 세포외 담체(티슈·엔지니어링에서는 「세포외 매트릭스」라고도 한다)에 조합하여, 특정 장기나 조직, 기관을 재생하는 것이다.

종래부터 세포·조직 배양에서의 담체의 역할은, 조직이나 장기의 뼈대를 구성하고, 조직·장기의 형태를 결정하며, 또한 조직·장기의 굳기, 강도, 유연성을 결정한다는, 단순히 물리적이고 구조적인 것으로 생각되어져 왔다. 하지만, 최근 발생 생물학, 세포 생물학의 진전에 따라, 세포외 담체는 세포의 분화·증식, 이동, 접착, 시그널 전달, 유전자 발현, 호르몬 작용, 이온채널 등 세포 활동에 대한 다양한 조절 작용을 담당하고 있는 것이 밝혀지고 있다.

이와 같은 상황하에서, 세포외 담체의 세포분화·증식기능을 기대하며, 천연 또는 합성의 여러가지 세포외 담체, 예를 들어, 소 추출 콜라겐 타입 I을 동결 건조한 콜라겐 스폰지, 폴리유산이나 폴리글리콜산 등의 생분해성 폴리머 등을 이용한 인비트로 티슈·엔지니어링이 활발하게 시도되고 있다(예를 들어, 우에다 미노루 편「티슈·엔지니어링」, 1999년, 나고야대학 출판회 참조).

하지만, 상술한 바와 같은 기존의 세포증식용 담체는 고체이기 때문에, 이 담체로의 세포나 조직의 파종 또는 혼화(混和)가 어렵거나, 세포의 증식성이나 분화가 불충분하다는 등의 문제가 있었다. 더욱이, 기존의 세포증식용 담체 안에서재생한 조직을 회수하기 위하여, 이 담체를 용해시키는 것이 어렵거나, 회수할 때 담체를 용해시키기 위하여 고온으로 하거나, 또는 산소 처리를 하기 때문에, 이 담체 안에서 재생한 조직이 손상을 받는다는 문제가 있었다.

더욱이, 종래 담체의 가장 중대한 문제는, 이 담체 안에서는 목적으로 하는 조직이나 장기의 재생에 필요한 세포의 증식·분화보다도, 섬유아세포(纖維芽細胞, fibroblast)의 증식이 활발하게 일어나기 때문에, 목적으로 하는 조직이나 장기의 재생이 어려워진다는 것이었다.

본 발명은 동물세포·조직의 배양에 적절하게 사용가능한 세포·조직배양용 담체(擔體) 및 이 담체를 사용하는 세포·조직의 배양방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생체밖에서의(in vitro) 삼차원 배양(예를 들어, 티슈·엔지니어링용 재료의 취득을 위하여)으로서 특히 바람직하게 사용할 수 있는 세포·조직배양용 담체 및 이 담체를 사용하는 세포·조직의 배양방법에 관한 것이다.

본 발명의 세포·조직배양용 담체를 사용함으로써, 예를 들어, 분화 가능한 세포 내지 이것을 포함하는 조직(장기 포함)을 적절한 상태에서 삼차원 배양하여, 이 세포 내지 조직을 분화시킬 수 있게 된다.

도 1은 실시예 1에서 췌장관 조직 바깥쪽에서부터, 세포가 분열, 증식한 집괴를 나타내는 현미경 사진이다(5일째, 배율×100).

도 2는 실시예 1에서 시간이 지남에 따라 크기를 증식한 세포덩이를 나타내는 현미경 사진이다(30일째, 배율×100).

본 발명의 목적은, 상술한 종래의 세포·조직배양용 담체의 결점을 해소한 인공담체 내지 세포외 매트릭스(Extra Cellular Matrix, ECM)로서 기능하는 세포·조직배양용 담체, 및 그것을 사용한 세포·조직배양 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 섬유아세포의 과잉증식을 억제하면서, 목적으로 하는 조직이나 장기를 효과적으로 재생할 수 있는 세포·조직배양용 담체, 및 세포·조직배양 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 여러가지 세포(간세포, 전구세포 등) 또는 이들 세포를 함유하는 생체조직 등을 쉽게 파종, 혼화할 수 있으며, 목적으로 하는 조직이나 장기를 재생하는 여러가지 세포의 접착·분화·형태 형성을 위한 ECM으로서 기능할 수 있는 세포·조직배양용 담체, 및 그것을 이용한 세포·조직배양 방법을 제공하는데 있다.

본 발명자가 세밀히 연구한 결과, 보다 저온에서 졸(sol) 상태, 보다 고온에서 겔(gel) 상태가 되는 졸-겔 전이온도를 가지며, 이 졸-겔 전이가 열가역적인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 형성성 고분자를 사용하여 세포·조직배양용 담체를 구성하는 것이, 이 고분자에 근거한 겔 안에서의 조직아세포의 증식을 실질적으로 억제할 수 있게 하여, 상기 목적의 달성을 위하여 매우 효과적이라는 것을 알아내었다.

본 발명의 세포·조직배양용 담체는 상기 식견에 근거한 것으로, 보다 구체적으로는, 그 수용액이 저온에서 졸 상태, 고온에서 겔 상태가 되는 열가역적인 졸-겔 전이를 나타내는 하이드로겔 형성성 고분자를 적어도 포함하는 세포·조직배양용 담체로서, 이 하이드로겔 형성성 고분자에 근거한 겔 안에서 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명에 따르면, 더욱이 그 수용액이 저온에서 졸 상태, 고온에서 겔 상태가 되는 열가역적인 졸-겔 전이를 나타내는 하이드로겔 형성성 고분자와, 물을 적어도 포함하는 담체로서, 이 겔 안에서 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않는 담체를 사용하여,

상기 졸-겔 전이 온도보다 저온의 졸 상태에서, 이 담체에 세포 또는 조직을 첨가하고,

이 졸-겔 전이 온도보다 고온의 겔 상태에서, 상기 담체를 사용하여 세포 또는 조직을 배양하며,

상기 담체를 다시 졸-겔 전이 온도보다 저온의 졸 상태로 하여, 배양 후의 세포 또는 조직을 회수하는 것을 특징으로 하는 세포·조직의 배양방법이 제공된다.

상기 구성을 가지는 세포·조직배양용 담체에서, 상기 고분자는 담점(曇点, cloud point)을 가지는 복수개의 블록과 친수성 블록이 결합한 고분자를 적어도 포함하는 것이 바람직하다.

상기 하이드로겔 형성성 고분자의 졸-겔 전이 온도는, 0℃보다 높고 42℃ 이하인 것이 바람직하다.

상기 세포·조직배양용 담체는, 더욱이 생체내 조직·장기의 재생을 촉진하는 화학 중개물질을 함유하는 것이 바람직하다.

상기 세포·조직배양용 담체는 또한 종래부터 세포외 담체로서 사용되어 왔던 콜라겐, 젤라틴 등을 함유할 수도 있다.

상기 하이드로겔 형성성 고분자 수용액은, 고온의 겔상태에서 실질적으로 수불용성을 나타내는 것이 바람직하다.

상기 세포·조직배양용 담체는, 상기 하이드로겔 형성성 고분자와 물을 적어도 포함하는 것이 바람직하다.

(조직·장기 재생의 추정 메카니즘)

생물의 몸은 통상 1개의 수정란으로부터 시작한다. 그 수정란은 세포분열을 반복하여, 외배엽, 중배엽, 내배엽의 세포로 분화한다. 각각의 배엽은 더욱이 세포분열이나 이동을 반복하여, 손이나 발, 여러가지 조직·장기가 된다.

넓은 의미에서의 간세포란, 발생과정에서의 형태 형성이나, 성체(成體)의 항상성·생식세포의 유지에 작용하는 일군의 세포이다. 배간 세포(胚幹, ES 세포)란,배반포(胚盤胞)의 내부세포 덩이에서 유래하며, 암화(癌化)하지 않고 생체 밖에서 안정하게 증식하는 세포이며, 이른바 세포로 분화할 수 있는 유일한 간세포라고 할 수 있다.

좁은 의미에서 사용되는 간세포란, 성체에서도 또한 조직이나 장기의 항상성 유지나 손상시의 재생에 작용하는 세포의 일군이라고 할 수 있다. 지금까지 조혈(造血)조직, 골격근, 신경, 유선, 표피, 장관, 정자 등에서 간세포의 존재가 확인되고 있다. 하지만, 이 간세포들이나 전구세포만으로는 생체내조직·장기의 재생이 일어날 수 없으며, 통상은 간세포나 전구세포의 접착·분화·형태형성을 위한 담체의 존재가 필요시되고 있다.

일반적으로 담체(내지 인공세포외 매트릭스)로서 널리 이용되고 있는 소 추출 콜라겐 타입 I을 동결건조한 콜라겐 스폰지 등의 안에서는 섬유아세포의 증식이 활발하게 일어나기 때문에, 이것을 세포·조직배양용 담체로 한 경우에는 (상기 섬유아세포의 증식에 의해) 목적으로 하는 세포의 증식·분화가 저해되고 만다.

이것에 대하여, 상술한 본 발명의 세포·조직배양용 담체는 섬유아세포의 과잉 증식을 억제하는 기능이 있기 때문에, 목적으로 하는 세포 등의 증식·분화의 발판으로서 효과적으로 기능한다. 즉, 본 발명의 세포·조직배양용 담체는 목적으로 하는 세포(예를 들어, 간세포, 전구세포)의 접착·분화·형태형성을 위한 담체(내지 인공세포외 매트릭스)로서의 역할을 효과적으로 수행하기 때문에, 양호한 생체조직·장기의 재생을 달성할 수 있다.

본 발명의 세포·조직배양용 담체를 수용액으로 한 경우, 이 용액은 졸-겔전이보다 저온에서는 유동성이 있는 졸 상태이기 때문에, 생체의 세포나 조직, 기관을 쉽게 파종, 혼화할 수 있다. 이와 같은 용액은 그대로 체온(37℃)에서 겔화하기 때문에, 본 발명의 세포·조직배양용 담체 안에서 목적으로 하는 세포(예를 들어, 간세포, 전구세포)를 생체내와 마찬가지로 삼차원적으로 배양할 수 있어, 양호한 생체내 조직·장기의 재생을 달성할 수 있다.

생체조직의 재생에는, 전구 세포 등의 세포뿐만 아니라, 그 분화나 증식을 촉진하는 세포성장 인자 등의 여러가지 화학 중개물질(chemical mediator)이 필요한 경우가 있다. 본 발명의 세포·조직 배양용 담체는 체온에서 겔화하여 삼차원적인 그물망 구조를 형성하며, 후술하는 바와 같이 이 담체를 구성하는 하이드로겔은 겔 안에 다수의 소수성(疏水性) 영역을 가지고 있어, 소수성이 강한 화학 중개물질을 소수 결합에 의해 이 세포·조직 배양용 담체 안에 장기간에 걸쳐 보유해 둘 수 있기 때문에, 양호한 생체내 조직·장기의 재생을 달성할 수 있다.

본 발명의 세포·조직배양용 담체 안에서 세포나 조직 등을 배양한 후, 다시 냉각함으로써 이 담체는 저온에서 유동성이 있는 졸 상태로 되돌아가기 때문에, 재생된 장기나 조직 등을 쉽게, 또한 재생된 장기나 조직 등에 실질적으로 상해를 주지 않으면서 회수할 수 있다.

이하, 필요에 따라 도면을 참조하면서 본 발명의 더욱 구체적으로 설명한다. 이하의 기재에서 양비(量比)를 나타내는 「부」 및 「%」는 특히 단정짓지 않는 한 질량기준으로 한다.

(세포·조직배양용 담체)

본 발명의 세포·조직배양용 담체는, 졸-겔 전이온도를 가지는 하이드로겔 형성성 고분자를 적어도 포함한다. 이 세포·조직배양용 담체는, 보다 낮은 온도에서 졸상태, 보다 높은 온도에서 겔상태가 되는 열가역적인 졸-겔 전이를 나타낸다.

본 발명의 세포·조직배양용 담체는, 세포 및/또는 조직의 재생뿐만 아니라 복원에도 이용할 수 있다.

(복원)

본 발명에서 「복원」(repair)이란, 어떠한 원인(외상이나 질병, 외과적 수술 등)에 의해 손상된 세포, 조직, 기관, 장기 등이 잔존하는 동일 세포나 조직의 증식에 의해, 그 연속성을 회복하는 것을 말한다.

(재생)

본 발명에서 「재생」(regeneration)이란, 어떠한 원인(외상이나 질병, 외과적 수술 등)에 의해 손상된 세포, 조직, 기관, 장기 등이 잔존하는 동일 세포나 조직의 증식에 의해, 원래의 모습으로 돌아가는 것을 말한다(「재생」은 통상 분화를 동반한다). 본 발명에서 「재생」은 잔존하는 동일 세포나 조직의 증식뿐만 아니라, 외부로부터 부여된 세포나 조직의 증식에 의해, 원래 조직의 연속성이나 기능을 회복하는 복원도 포함한다.

(하이드로겔 형성성 고분자)

본 발명의 하이드로겔을 구성하는 「하이드로겔 형성성 고분자」란, 가교(crosslinking) 구조 내지 그물망구조를 가지며, 이 구조에 따라, 그 내부에 물 등의 분산액체를 보유함으로써 하이드로겔을 형성할 수 있는 성질을 가지는 고분자를 말한다. 또한, 「하이드로겔」이란 고분자로 이루어지는 가교 내지 그물망구조와 이 구조 안에 지지 내지 보유된(분산액체인) 물을 적어도 포함하는 겔을 말한다.

가교 내지 그물망구조 안에 보유된 「분산액체」는 물을 주요 성분으로 하여 포함하는 액체라면, 특히 제한되지 않는다. 보다 구체적으로 말하면, 분산액체는 물 자체여도 좋고, 또한 수용액 및/또는 함수액체 중의 어느 하나여도 좋다. 이 함수액체는, 이 함수액체의 전체 100부에 대하여, 물을 80부 이상, 더욱 바람직하게는 90부 이상 포함하는 것이 좋다.

(졸-겔 전이온도)

본 발명에서 「졸 상태」, 「겔 상태」 및 「졸-겔 전이온도」는 아래와 같이 정의된다. 이 정의에 대해서는 문헌(Polymer Journal.18(5), 411~416(1986))을 참조할 수 있다.

보다 구체적으로는, 졸 형상의 하이드로겔 1mL를 내직경 1cm의 시험관에 넣고, 소정 온도(일정 온도)로 한 물욕조 안에서 12시간 유지한다. 그 후, 시험관의상하를 거꾸로 한 경우에, 용액/공기의 경계면(메니스커스;meniscus)이 용액의 자체의 무게로 인해 변형한 경우(용액이 유출한 경우를 포함)에는, 상기 소정 온도에서 하이드로겔은 「졸 상태」라고 정의한다. 한편, 시험관의 상하를 거꾸로 하여도, 상술한 용액/공기의 경계면(메니스커스)이 용액의 자체 무게로 인해 변형하지 않는 경우에는, 이 하이드로겔은 상기 소정 온도에서「겔 상태」라고 정의한다.

상기 측정에서, 농도가 예를 들어 약 8질량%인 졸 형상의 하이드로겔(용액)을 사용하여, 상술한 「소정온도」를 서서히(예를 들어, 1℃단위로) 상승시켜 「졸 상태」가 「겔 상태」로 전이하는 온도를 구한 경우, 이에 의해 구해진 전이온도를 「졸-겔 전이온도」라고 정의한다(이 때, 「소정온도」를 예를 들어 1℃단위로 하강시켜, 「겔 상태」가 「졸 상태」로 전이하는 온도를 구하여도 좋다).

(졸-겔 전이온도)

본 발명에서 「졸 상태」, 「겔 상태」 및 「졸-겔 전이온도」의 정의 및 측정은, 문헌(H.Yoshioka 외, Journal of Macromolecular Science, A31(1), 113(1994))에 기재된 정의 및 방법에 따라, 아래와 같이 구하여도 좋다.

즉, 관측주파수 1Hz에서의 시료의 동적 탄성율을 저온에서 고온으로 서서히 온도를 변화(1℃/1분)시켜 측정하고, 이 시료의 저장탄성율(G′, 탄성항)이 손실탄성율(G″,점성(粘性)항)을 상회하는 점의 온도를 졸-겔 전이온도라고 한다. 일반적으로, G″＞G′인 상태가 졸이며, G″＜G′인 상태가 겔이라고 정의된다. 이 졸-겔 전이온도를 측정할 때에는, 아래의 측정조건을 적절하게 사용할 수 있다.

<동적·손실탄성율의 측정조건>

측정기기(상품명): 스트레스 제어식 유량계(rheometer) CSL700, Carri-Med사 제품

시료용액(내지 분산액)의 농도(단, 「졸-겔 전이온도를 가지는 고분자 화합물」 의 농도로서) : 10(중량) %

시료용액의 양 : 약 0.8g

측정용 셀의 형상·칫수: 아크릴제 평행원반(직경 4.0cm), 갭 600㎛

측정주파수 : 1Hz

적용스트레스: 선형 영역 내

(적절한 졸-겔 전이온도)

본 발명에서는, 세포나 생체 조직의 열적 손상을 방지하는 점에서는, 상기 졸-겔 전이온도는 0℃보다 높고, 45℃이하인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0℃보다 높고 42℃이하(특히, 4℃이상 40℃이하인)인 것이 좋다.

이와 같은 적절한 졸-겔 전이온도를 가지는 하이드로겔은, 후술하는 바와 같은 구체적인 화합물 중에서, 상술한 스크리닝(screening) 방법(졸-겔 전이온도 측정법)에 따라 쉽게 선택할 수 있다. 본 발명의 담체를 사용하여 생물체 조직·장기를 재생시키는 일련의 조작에서는, 상술한 졸-겔 전이온도(a℃)를 세포·조직의 배양온도(b℃)와 세포·조직을 파종, 혼화 또는 회수하기 위한 냉각시의 온도(c℃) 사이에서 설정하는 것이 바람직하다. 즉, 상술한 3 종류의 온도 a℃, b℃ 및 c℃는 b＞a＞c의 관계에 있는 것이 바람직하다. 또한, (b-a)는 1~40℃, 더욱 바람직하게는 2~30℃인 것이 좋고, 또한 (a-c)는 1~40℃, 더욱 바람직하게는 2~30℃인 것이좋다.

(담체의 동작에 대한 추종성)

본 발명의 담체에 근거한 하이드로겔은, 그 생체조직의 재생에 따른 조직의 형태변화에 대한 추종성의 밸런스의 면에서, 보다 높은 주파수에 대해서는 고체적인 거동을 나타내고, 다른 한편, 보다 낮은 주파수에 대해서는 액체적인 거동을 나타내는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 이 하이드로겔의 동작에 대한 추종성은 아래의 방법으로 적절하게 측정할 수 있다.

(동작에 대한 추종성의 측정방법)

하이드로겔 형성성 고분자를 포함하는 본 발명의 담체(하이드로겔로서 1mL)를 졸 상태(졸-겔 전이온도보다 낮은 온도)에서 내직경 1cm의 시험관에 넣고, 이 담체의 졸-겔 전이온도보다도 충분히 높은 온도(예를 들어, 이 졸-겔 전이온도보다 약 10℃ 높은 온도)로 한 수욕조 안에서 상기 시험관을 12시간 유지하여, 이 하이드로겔을 겔화한다.

이어서, 이 시험관의 상하를 거꾸로 한 경우에 용액/공기의 경계면(메니스커스)이 용액의 자체 무게로 변형될 때까지의 시간(T)을 측정한다. 여기서 1/T(sec^-1)보다 낮은 주파수의 동작에 대하여 이 하이드로겔은 액체로서 움직이고, 1/T(sec^-1)보다 높은 주파수의 동작에 대하여 이 하이드로겔은 고체로서 움직이게 된다. 본 발명의 하이드로겔의 경우에는 T는 1분~24시간, 바람직하게는 5분~10시간이다.

(정상 유동 점도)

본 발명의 담체에 따른 하이드로겔의 겔적 성질은, 정상 유동 점도의 측정에 의해서도 적절하게 측정할 수 있다. 정상 유동 점도η(이타)는 예를 들어, 크리프 (creep) 실험에 의해 측정할 수 있다.

크리프 실험에서는 일정한 전단 응력을 시료에 가하여, 전단 변형의 시간 변화를 관측한다. 일반적으로 점탄성체의 크리프 거동에서는, 초기에 전단 속도가 시간과 함께 변화하지만, 그 후 전단 속도가 일정해진다. 이 때의 전단 응력과 전단 속도의 비를 정상 유동점도(η)라고 정의한다. 이 정상 유동 점도는 뉴튼 점도라고 부르는 경우도 있다. 단, 여기서 정상 유동 점도는 전단 응력에 거의 의존하지 않는 선형 영역안에서 결정한다.

구체적인 측정방법은, 측정장치로서 스트레스 제어식 점탄성 측정장치 CSL형 유량계(CSL500, 미국 Carri-Med사 제품)를, 측정 디바이스에 아크릴제 원반(직경 4cm)을 사용하여, 시료 두께 600㎛로 하여 적어도 5분 이상의 측정시간 동안 크리프 거동(지연곡선)을 관측한다. 샘플링 시간은 최초 100초 동안에는 1초에 한 번, 그 후에는 10초에 한번으로 한다.

적용하는 「전단 응력」(스트레스)의 결정에 있어서는, 10초간 전단응력을 부하하여 편이(偏移;굴곡) 각도가 2×10^-3rad 이상 검출되는 최저치로 설정한다. 해석에는 5분 이후의 적어도 20 이상의 측정치를 채용한다. 본 발명의 담체에 따른 하이드로겔은 그 졸-겔 전이온도보다 약 10℃ 높은 온도에서, η가 5×10³~5×10⁶Pa·sec인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 8×10³~2×10⁶Pa·sec, 특히 1×10⁴Pa·sec이상, 1×10⁶Pa·sec이하인 것이 바람직하다.

상기 η가 5×10³Pa·sec미만에서는 단시간의 관측으로도 유동성이 비교적 높아져, 겔에 의한 세포나 조직의 삼차원적인 유지가 불충분해지기 쉽고, 담체로서 기능하는 것이 어려워지는 경향이 있다. 다른 한편, η가 5×10⁶Pa·sec를 넘으면, 장시간의 관측으로도 겔이 유동성을 거의 나타내지 않게 되는 경향이 강하여, 생물체 조직의 재생에 따른 움직임에 추종하기가 더욱 어려워진다. 또한, η가 5×10⁶Pa ·sec를 넘으면 겔이 물러질 가능성이 높아져, 약간의 순탄성 변형 후, 일거에 무르게 파괴되는 취성 파괴가 일어나기 쉬운 경향이 강해진다.

(동적 탄성율)

본 발명의 담체에 따른 하이드로겔의 겔적 성질은, 동적 탄성율에 의해서도 적절하게 측정할 수 있다. 이 겔에 진폭 γ₀, 진동수를 ω/2π로 하는 변형 γ(t)=γ₀cosωt(t는 시간)을 주었을 때, 일정 응력을 σ₀, 위상차를 δ로 하는 σ(t)=σ₀cos(ωt+δ)가 얻어졌다고 한다. ｜G｜=σ₀/γ₀으로 하면, 동적탄성율 G′(ω)=｜G｜cosδ와, 손실탄성율 G″(ω)=｜G｜sinδ의 비(G″/G′)가 겔적 성질을 나타내는 지표가 된다.

본 발명의 담체에 따른 하이드로겔은, ω/2π=1Hz의 변형(빠른 동작에 대응한다)에 대해서는 고체로서 거동하며, ω/2π=10^-4Hz의 변형(느린 동작에 대응한다)에 대해서는 액체로서 거동한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 담체에 따른 하이드로겔은, 아래의 성질을 나타내는 것이 바람직하다(이와 같은 탄성율 측정에 대한 상세한 것은 예를 들어, 문헌 고다 요시히라 외 편집, 근대공업화학19, 359페이지, 아사쿠라서점, 1985를 참조할 수 있다).

ω/2π=1Hz(겔이 고체로서 거동하는 진동수)일 때, (G″/G′)_S=(tanδ)_S가 1 미만인 것이 바람직하다. 이 (G″/G′)_S=(tanδ)_S는 보다 바람직하게는 0.8이하, 특히 바람직하게는 0.5이하가 좋다.

ω/2π=10^-4Hz(겔이 액체로서 거동하는 진동수)일 때, (G″/G′)_L=(tanδ)_L가 1 이상인 것이 바람직하다. 이 (G″/G′)_L=(tanδ)_L는 보다 바람직하게는 1.5이상, 특히 바람직하게는 2이상이 좋다.

상기 (tanδ)_S와 (tanδ)_L의 비{(tanδ)_S/(tanδ)_L}이 1 미만인 것이 바람직하다. 이 비{(tanδ)_S/(tanδ)_L}은 보다 바람직하게는 0.8이하, 특히 바람직하게는 0.5이하가 좋다.

<측정조건>

하이드로겔 형성성 고분자의 농도: 약 8질량 %

온도: 담체의 졸-겔 전이온도보다 약 10℃ 높은 온도

측정기기: 스트레스 제어식 유량계(기기명: CSL 500, 미국 Carri-Med사 제품)

(생체내 잔존성의 제어)

본 발명의 하이드로겔은 필요에 따라, 생체 내(복강내, 피하 등)에서의 잔존성을 임의로 제어할 수 있다. 본 발명의 하이드로겔은 주로 생체 밖에서의 사용을 목적으로 하지만, 그 사용법(예를 들어, 본 발명의 하이드로겔을 사용하여 증식시킨 조직을, 생체내로 되돌리는 경우 등)에 따라서는, 이 하이드로겔의 생체내 잔존성의 제어가 바람직한 경우가 있기 때문이다.

본 발명의 하이드로겔의 졸-겔 전이온도를 저하시키면, 하이드로겔은 생체 내에서 장기간 잔존하게 되고, 졸-겔 전이온도를 상승시키면 생체 내에서 하이드로겔의 소실이 빨라진다. 또한, 하이드로겔 중의 하이드로겔 형성성 고분자의 농도를 높이면, 하이드로겔은 생체내에서 장기간 잔존하게 되며, 하이드로겔 중의 하이드로겔 형성성 고분자의 농도를 저하시키면, 생체내에서 하이드로겔의 소실이 빨라진다.

본 발명의 하이드로겔에서는 본 발명의 하이드로겔의 졸-겔 전이온도를 저하시키면, 생체온도(37℃)에서의 하이드로겔의 저장탄성율(G′)이 상승한다. 또한, 하이드로겔 중의 하이드로겔 형성성 고분자의 농도를 높이면, 생체온도(37℃)에서의 하이드로겔의 저장탄성율(G″)이 상승한다. 즉, 생체내에서의 잔존성을 제어하기 위해서는, 37℃에서의 G′를 제어하면 좋다.

이 G′의 측정시에는, 아래의 측정조건을 적절히 사용할 수 있다.

<동적·손실탄성율의 측정조건>

측정기기(상품명): 스트레스 제어식 유량계 CSL 500, Carri-Med사 제품

시료용액의 양 : 약 0.8g

측정주파수 : 1Hz

적용스트레스: 선형 영역 내

본 발명의 하이드로겔의 생체내에서의 잔존기간과 G′의 관계는 생체내의 부위에 따라서도 다르기 때문에 일률적으로 말할 수는 없지만, 예를 들어 복강내에서의 잔존기간과, 관측 주파수 1Hz에서의 G′의 관계는 본 발명자들이 아는 바에 따르면, 아래와 같다.

즉, 3일 이내에 소실시키기 위한 G′의 바람직한 범위는 10~500Pa, 3일 이상 잔존하고 14일 이내에 소실시키기 위한 G′의 바람직한 범위는 200~1500Pa, 14일 이상 잔존시키기 위한 G′의 바람직한 범위는 400~10000Pa이다.

(섬유아세포의 증식성)

본 발명에서, 담체를 구성하는 하이드로겔 형성성 고분자에 근거한 하이드로겔에서는, 이 겔 안에서 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않는다. 섬유아세포는 통상 세포배양 티슈(플레이트) 위의 단층 배양이나 콜라겐겔 내에서의 배양에서, 섬유아세포에 특징적인 나뭇가지 형상의 형태변화를 동반한 현저한 증식이 확인된다(예를 들어, 에노키나미 준페이 문헌 :배양세포를 사용하는 방법. 와타나베 메이지 편, 세포외 매트릭스, 메티칼 리뷰사, 도쿄, 1996, pp108-115를 참조). 이에 대하여, 본 발명의 하이드로겔 안에서는, 섬유아세포는 구(球)형상의 형태를 유지한 채 실질적으로 증식을 나타내지 않는다.

(섬유아세포 증식억제의 추정 메카니즘)

본 발명의 조직·장기재생용 재료에 있어서, 섬유아세포의 증식이 억제되는 메카니즘은 반드시 명확하지 않지만, 본 발명자가 아는 바에 따르면, 아래와 같이 추정할 수 있다.

즉, 섬유아세포는 단층배양, 즉 지지체 표면을 인식하여 접착함으로써 2차원적으로 활발하게 증식하는 성질을 가진다. 콜라겐겔의 구조는 길이 300nm, 직경 1.5nm의 콜라겐 분자(분자량 30만)가 다수 집합하여, 규칙적으로 배열되어 섬유 상태(collagen fibril)가 되어 수중에 그물망 구조를 만든 것이다. 이 그물망 구조는 가시광의 파장보다 큰 구조(400nm이상)이기 때문에, 콜라겐겔은 통상 뿌옇게 보인다. 콜라겐겔은 3차원 배양담체로서 이용되고 있지만, 섬유아세포는 이 두꺼운 콜라겐 섬유(collagen fibril)의 표면을 지지체로 인식하여 접착하기 때문에, 콜라겐겔 안에서 2차원적으로 현저하게 증식성을 나타낸다고 추정된다.

이에 대하여, 본 발명의 조직·장기 재생용 재료는 하이드로겔 형성성 고분자가 분자상태에서 3차원 그물망 구조를 형성한 하이드로겔이 되기 때문에, 그 구조의 불균질성은, 가시광의 파장보다 작고 비교적 투명성이 높다. 따라서, 본 발명의 재료중에서는 섬유아세포가 명확한 2차원적 지지체 표면을 인식하지 않고, 그 결과 본 발명의 재료중에는 섬유아세포가 과잉 증식하는 것이 억제된다고 추정된다.

(섬유아세포의 증식성 평가)

섬유아세포의 증식성은 아래의 방법에 따라 평가할 수 있다(이 방법에 대한상세한 내용은, 예를 들어 요시가와 다케시, 츠키가와 켄, 성마리안나 의과대학 잡지, 제28권, 제4호, 161-170(2000)을 참조할 수 있다).

본 발명의 세포·조직배양용 담체를 구성하는 하이드로겔 형성성 고분자를 배양액, 예를 들어 RPMI-1640(Life Technologies, N.Y., USA)에 저온(예를 들어, 4℃)하에서 교반용해하여, 정상인의 폐섬유아세포(Normal Human Lung Fibro blasts, NHLF, 다카라슈조(주) 제품)를 6×10⁴개/ml의 세포밀도가 되도록 분산시킨다. 이 NHLF 분산액 0.2mL를 24 웰-플레이트(재료: 플라스틱제, 웰 1개의 크기는 세로 15mm, 가로15mm, 깊이 20mm정도, 시판품으로는 예를 들어 Becton-Dickinson사 제품의 상품명: Multiwell)의 각 웰 안에 주입하여, 37℃에서 겔화시킨 후, 배양액 0.4mL를 첨가하여 37℃, 5% CO₂대기압하에서 배양한다. 섬유아세포의 증식 모습은 시간이 지남에 따라(예를 들어, 0, 1, 3, 7일) 위상차 현미경에 의한 관찰로 확인한다.

(섬유아세포의 증식율)

더욱이, 아래의 효소활성을 이용하는 방법에 의해, 배양기간 중의 섬유아세포의 증식율을 측정하는 것이 가능하다.

예를 들어, 상술한 바와 같이 24 웰-플레이트를 사용하여, 본 발명의 세포·조직배양용 담체 중에서 섬유아세포를 소정 기간 배양한 후, 이 담체를 그 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도(예를 들어, 졸-겔 전이온도보다 10℃낮은 온도)로 떨어뜨림으로써 이 담체를 용해하고, 이어서 각 웰 안에 호박산 탈수소효소 활성측정용시약인 WST-8 시약(도진 카가쿠 가부시키가이샤 제품) 50㎕를 첨가한다.

이 24 웰-플레이트를 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도(예를 들어, 졸-겔 전이온도보다 10℃낮은 온도, 예를 들어, 10℃)에서 10시간 반응시킨 후, 약 4℃로 1시간 유지하여 완전히 균일한 수용액 상태로 한다. 이 수용액을 96 웰-플레이트에 200㎕씩 나누어 주입하고, 마이크로플레이트용 비색계(比色計)를 사용하여 450nm(참조파장 620nm)에서 흡광도(OD(450))를 측정한다. 이 OD(450)와 살아 있는 세포수는 비례 관계에 있는 것이 확실시되고 있다(예를 들어, 문헌 Furukawa, T.외, "High in vitro-in vitro correlation of drug response using spongegel-supported three-dimensional histoculture and MTT end point", Int. J. Cancer 51:489, 1992을 참조). 즉, 섬유아세포의 증식율은 배양개시시의 흡광도 OD_f=(OD(450))와 배양후의 흡광도 OD_L=(OD(450))의 비 (OD_L/OD_f)에 의해 구할 수 있다.

본 발명에서 3일간 37℃에서 배양한 후의 섬유아세포의 증식율 P_F=(OD_L/OD_f)은 70%에서 200%의 범위인 것이 바람직하다. 이 증식율 (OD_L/OD_f)은 또한 80%에서 150%의 범위, 특히 90%에서 120%의 범위인 것이 바람직하다.

(섬유아세포의 상대적인 증식성)

본 발명에서, 하이드로겔 형성성 고분자에 기인하여 겔 안에서, 섬유아세포의 증식은 억제되는 한편, 목적으로 하는(섬유아세포 이외의) 세포의 증식은, 상대적으로 억제되지 않는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 목적으로 하는 세포의증식율(P_T)과, 상술한 섬유아세포의 증식율(P_F)의 비(P_T/P_F)는 1.1 이상인 것이 바람직하다. 더욱이, 이 비 (P_T/P_F)는 1.5 이상, 특히 2.0 이상인 것이 바람직하다. 이 목적으로 하는 세포의 증식율 P_T는 아래와 같이 하여 구할 수 있다.

상술한 섬유아세포의 증식율(P_F) 측정에서 정상인의 폐섬유아세포(NHLF) 대신에, 사람의 대장암 세포(SW-948, 상품명:대장선암세포주, 다이니혼세이야쿠 가부시키가이샤 제품)를 사용하는 것 이외에는, 상기 증식율(P_F) 측정과 마찬가지로 하여, 섬유아세포 이외의 세포의 증식율(P_F)을 구한다(이 증식율 P_T및 P_F측정은, 마찬가지 조건하에서 행한다).

상술한 바와 같이 측정한 증식율 P_T및 P_F값에 따라, 이들의 비(P_T/P_F)를 구한다.

(하이드로겔 형성성 고분자)

상술한 바와 같은 열가역적인 졸-겔 전이를 나타내는 한(즉, 졸-겔 전이온도를 가지는 한), 본 발명의 담체에 사용가능한 하이드로겔 형성성 고분자는 특히 제한되지 않는다. 생리적 온도(0~42℃)에서 적절한 졸-겔 변화를 나타내는 것이 쉽다는 점에서는, 예를 들어 상기 하이드로겔 형성성 고분자 안의 담점을 가지는 복수의 블록과 친수성 블록의 담점, 두 블록의 조성 및 두 블록의 소수성도, 친수성도 및/또는 분자량 등을 각각 조정함으로써, 적절한 졸-겔 전이온도를 달성할 수 있다.

이 수용액은 졸-겔 전이온도를 가지고, 이 전이온도보다 낮은 온도에서 가역적으로 졸상태를 나타내는 고분자의 구체예로서는, 예를 들어 폴리플로필렌옥사이드와 폴리에틸렌옥사이드의 블록 공중합체 등으로 대표되는 폴리알킬렌옥사이드 (polyalkyleneoxide) 블록 공중합체; 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 에테르(ether)화 셀루로오스; 키토산 유도체(K.R. Holme. et al. Macromolecules, 24, 3828(1991)) 등이 알려져 있다.

폴리알킬렌옥사이드 블록 공중합체로서, 폴리프로필렌옥사이드(polypro pyleneoxide)의 양단에 폴리에틸렌옥사이드가 결합된 플루로닉(Pluronic) F-127(상품명, BASF Wyandotte Chemicals Co. 제) 겔이 개발되고 있다. 이 플루로닉 F-127의 고농도 수용액은 약 20℃ 이상에서 하이드로겔이 되며, 이보다 낮은 온도에서 수용액이 되는 것으로 알려져 있다. 하지만, 이 재료의 경우에는 약 20질량 %이상의 고농도에서만 겔 상태로 되지는 않고, 또한 약 20질량% 이상의 고농도에서 겔화 온도보다 높은 온도로 유지하여도, 더욱이 물을 더하면 겔이 용해되어 버린다. 또한, 플루로닉 F-127은 분자량이 비교적 작고, 약 20질량 % 이상의 고도의 겔 상태에서 매우 높은 침투압을 나타낼 뿐만 아니라, 세포막을 쉽게 투과하기 때문에, 세포·조직에 악영향을 줄 가능성이 있다.

한편, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등으로 대표되는 에테르화 셀룰로오스의 경우에는, 통상은 졸-겔 전이온도가 높고 약 45℃이상이다(N. Sarkar, J.Appl. Polym. Science, 24, 1073, 1979). 이에 대하여 생체의 체온은 통상 37℃ 부근의 온도이기 때문에, 상기 에테르화 셀룰로오스는 졸상태이며, 이 에테르화 셀루로오스를 조직·장기의 담체로서 사용하는 것은 사실상 곤란하다.

상기와 같이, 그 수용액이 졸-겔 전이점을 가지며, 이 전이온도보다 낮은 온도에서 가역적으로 졸상태를 나타내는 종래 고분자의 문제점은 1) 졸-겔 전이온도보다 높은 온도에서 일단 겔화하여도, 더욱이 물을 첨가하면 겔이 용해해버리는 것, 2) 졸-겔 전이온도가 생체의 체온(37℃ 부근)보다도 높고, 체온에서는 졸 상태인 것, 3) 겔화시키기 위해서는, 수용액의 고분자 농도를 매우 높일 필요가 있는 것 등이다.

이에 대하여, 본 발명자들의 검토에 따르면, 바람직하게는 0℃보다 높고 42℃이하인 졸-겔 전이온도를 가지는 하이드로겔 형성성 고분자(예를 들어, 담점을 가지는 복수의 블록과 친수성 블록이 결합하여 이루어지고, 그 수용액이 졸-겔 전이온도를 가지며, 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도에서 가역적으로 졸 상태를 나타내는 고분자)를 사용하여 본 발명의 담체를 구성한 경우, 상기 문제는 해결되는 것이 판명되고 있다.

(적절한 하이드로겔 형성성 고분자)

본 발명의 담체로서 적절하게 사용할 수 있는 소수 결합을 이용한 하이드로겔 형성성 고분자는, 담점을 가지는 복수의 블록과 친수성 블록이 결합하여 이루어지는 것이 바람직하다. 이 친수성 블록은 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도에서 상기 하이드로겔이 수용성이 되기 위하여 존재하는 것이 바람직하고, 또한 담점을 가지는 복수의 블록은 하이드로겔이 졸-겔 전이온도보다 높은 온도에서 겔 상태로 변화하기 위하여 존재하는 것이 바람직하다. 바꿔말하면, 담점을 가지는 블록은 이 담점보다 낮은 온도에서는 물에 용해하고, 이 담점보다 높은 온도에서는 물에 불용성으로 변화하기 때문에, 담점보다 높은 온도에서, 상기 블록은 겔을 형성하기 위한 소수 결합으로 이루어지는 가교점으로서의 역할을 한다. 즉, 소수성 결합에 유래하는 담점이 상기 하이드로겔의 졸-겔 전이온도에 대응한다.

단, 이 담점과 졸-겔 전이온도는 반드시 일치하지 않아도 된다. 이것은 상술한 「담점을 가지는 블록」의 담점은 일반적으로 이 블록과 친수성 블록의 결합에 의해 영향을 받기 때문이다.

본 발명에 사용하는 하이드로겔은 소수성 결합이 온도의 상승과 함께 강해질 뿐만 아니라, 그 변화가 온도에 대하여 가역적이라는 성질을 이용한 것이다. 1 분자 안에 복수개의 가교점이 형성되어, 안정성이 뛰어난 겔이 형성되는 점에서는, 하이드로겔 형성성 고분자가 「담점을 가지는 블록」을 복수개 가지는 것이 바람직하다.

한편, 상술한 하이드로겔 형성성 고분자 안의 친수성 블록은, 상술한 바와 같이, 상기 하이드로겔 형성성 고분자를 졸-겔 전이온도보다도 낮은 온도에서 수용성으로 변화시키는 기능을 가지며, 상기 전이온도보다 높은 온도에서 소수성 결합력이 지나치게 증대되어 상기 하이드로겔이 응집 침전해버리는 것을 방지하면서, 함수(含水)겔의 상태를 형성시키는 기능을 가진다.

(담점을 가지는 복수의 블록)

담점을 가지는 블록으로는, 물에 대한 용해도-온도계수가 음을 나타내는 고분자 블록인 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는 폴리프로필렌옥사이드, 프로필렌옥사이드와 다른 알킬렌옥사이드와의 공중합체, 폴리 N-치환 아크릴아미드 유도체, 폴리 N-치환 메타아크릴아미드 유도체, N-치환 아크릴아미드 유도체와 N-치환 메타아크릴아미드 유도체와의 공중합체, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐알코올 부분 초화물로 이루어지는 군에서 선택되는 고분자가 바람직하게 사용가능하다. 상기 고분자(담점을 가지는 블록)의 담점이 4℃보다 높고 40℃이하인 것이, 본 발명에 사용하는 고분자(담점을 가지는 복수의 블록과 친수성 블록이 결합한 화합물)의 졸-겔 전이온도를 4℃보다 높고 40℃이하로 하는 점에서 바람직하다.

여기서 담점의 측정은 예를 들어, 상기 고분자(담점을 가지는 블록)의 약 1 질량%의 수용액을 냉각하여 투명한 균일 용액으로 한 후, 서서히 온도를 상승시켜(온도 상승 속도 1℃/min), 이 용액이 처음으로 뿌옇게 되는 점을 담점으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 폴리 N-치환 아크릴아미드 유도체, 폴리 N-치환 메타아크릴아미드 유도체의 구체적인 예를 아래에 열거한다.

폴리-N-아크로일피페리딘; 폴리-N-n-프로필메타아크릴아미드; 폴리-N-이소프로필아크릴아미드; 폴리-N,N-디에틸아크릴아미드; 폴리-N-이소프로필메타아크릴아미드; 폴리-N-시클로프로필아크릴아미드; 폴리-N-아크릴로일피롤리딘(acryloyl pyrrolidine); 폴리-N,N-에틸메틸아크릴아미드; 폴리-N-시클로프로필메타아크릴아미드; 폴리-N-에틸아크릴아미드.

상기 고분자는 단독중합체(호모폴리머)여도, 상기 중합체를 구성하는 단량체(單量體)와 다른 단량체의 공중합체여도 좋다. 이와 같은 공중합체를 구성하는 다른 단량체로서는, 친수성 단량체, 소수성 단량체 모두 사용할 수 있다. 일반적으로는, 친수성 단량체와 공중합하면 생성물의 담점은 상승하고, 소수성 단량체와 공중합하면 생성물의 담점은 하강한다. 따라서, 이 공중합해야 할 단량체를 선택함으로써, 원하는 담점(예를 들어, 4℃보다 높고 40℃이하인 담점)을 가지는 고분자를 얻을 수 있다.

(친수성 단량체)

상기 친수성 단량체로서는, N-비닐피롤리돈(vinylpyrrolidone), 비닐피리딘, 아크릴아미드, 메타아크릴아미드, N-메틸아크릴아미드, 히드록시에틸메타아크릴레이트, 히드록시에틸아크릴레이트, 히드록시메틸메타아크릴레이트, 히드록시메틸아크릴레이트, 산성기를 가지는 아크릴산, 메타아크릴산 및 이들의 염, 비닐술폰산, 스티렌술폰(styrene sulfone)산 등, 및 염기성기를 가지는 N,N-디메틸아미노에틸메타크릴레이트, N,N-디에틸아미노에틸메타크릴레이트, N,N-디메틸아미노프로필아크릴아미드 및 이들의 염 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.

(소수성 단량체)

한편, 상기 소수성 단량체로서는, 에틸아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트, 글리시딜메타크릴레이트 등의 아크릴레이트 유도체 및 메타크릴레이트 유도체, N-n-부틸메타아크릴아미드 등의 N-치환 알킬메타아크릴아미드 유도체, 염화비닐, 아크릴로니트릴(acrylonitrile), 스티렌(tyrene), 초산비닐 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.

(친수성 블록)

한편, 상술한 담점을 가지는 블록과 결합해야 할 친수성 블록으로서 구체적으로는, 메틸셀룰로오스, 덱스트란(dextran), 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알코올, 폴리N-비닐피롤리든, 폴리비닐피리딘, 폴리아크릴아미드, 폴리메타아크릴아미드, 폴리N-메틸아크릴아미드, 폴리히드록시메틸아크릴레이트, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리비닐술폰산, 폴리스티렌술폰산 및 이들의 염; 폴리N,N-디메틸아미노에틸메타크릴레이트, 폴리N,N-디에틸아미노에틸메타크릴레이트, 폴리N,N-디메틸아미노프로필아크릴아미드 및 이들의 염 등을 들 수 있다.

담점을 가지는 블록과 상기 친수성 블록을 결합하는 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 이 블록들을 가지는 블록 공중합체, 또는 그래프트(grafting) 공중합체 또는 덴드리머(dendrimers)형 공중합체로서 얻는 것이 바람직하다.

담점을 가지는 블록과 친수성 블록의 결합은, 상기 어느 한 블록 중에 중합성 관능기(예를 들어, 아크릴로일(acryloyl)기)를 도입하고, 다른 쪽 블록을 부여하는 단량체를, 이와 같이 중합성 관능기를 도입한 블록과 공중합시킴으로써 행할 수 있다. 또한, 담점을 가지는 블록과 상기 친수성 블록의 결합물은, 담점을 가지는 블록을 부여하는 단량체와, 친수성 블록을 부여하는 단량체의 블록 공중합에 의해 얻을 수도 있다. 또한, 담점을 가지는 블록과 친수성 블록의 결합은 미리 양자에 반응활성의 관능기(예를 들어, 수산기, 아미노기, 카르복실기, 이소시아네이트기 등)를 도입하고, 양자를 화학반응에 의해 결합시킴으로써 행할 수도 있다. 이 때, 친수성 블록 중에는 통상, 반응활성의 관능기를 복수개 도입한다.

또한, 담점을 가지는 폴리프로필렌옥사이드와 친수성 블록의 결합에 관해서는, 예를 들어, 아니온(anion) 중합 또는 카티온(cation) 중합으로, 프로필렌옥사이드와 「다른 친수성 블록」을 구성하는 모노머(예를 들어, 에틸렌옥사이드)를 반복 차례로 중합시킴으로써, 폴리프로필렌옥사이드와 「친수성 블록」(예를 들어, 폴리에틸렌옥사이드)이 결합한 블록 공중합체를 얻을 수 있다. 이와 같은 블록 공중합체는, 폴리프로필렌옥사이드의 말단에 중합성 기(예를 들어, 아크릴로일기)를 도입한 후, 친수성 블록을 구성하는 모노머를 공중합시킴으로써도 얻을 수 있다. 더욱이, 친수성 블록 안에, 폴리프로필렌옥사이드 말단의 관능기(예를 들어, 수산기)와 결합반응할 수 있는 관능기를 도입하여, 양자를 반응시킴으로써도, 본 발명에 사용하는 고분자를 얻을 수 있다. 또한, 폴리프로필렌글리콜의 양끝에 폴리에틸렌글리콜이 결합한, 플루로닉 F-127(상품명, 아사히덴카고교 가부시키가이샤 제품) 등의 재료를 연결시킴으로써도, 본 발명에서 사용하는 하이드로겔 형성성 고분자를 얻을 수 있다.

이 담점을 가지는 블록을 포함하는 태양에서의 본 발명의 고분자는, 담점보다 낮은 온도에서는, 분자 안에 존재하는 상기 「담점을 가지는 블록」이 친수성 블록과 함께 수용성이기 때문에, 완전히 물에 용해하여 졸 상태를 나타낸다. 하지만, 이 고분자 수용액의 온도를 상기 담점보다 높은 온도로 가열하면, 분자 안에 존재하는 「담점을 가지는 블록」이 소수성이 되어, 소수적 상호 작용에 의해, 별개의 분자 사이에서 회합한다.

한편, 친수성 블록은, 이 때(담점보다 높은 온도로 가열되었을 때)에도 수용성이기 때문에, 본 발명의 고분자는 수중에서, 담점을 가지는 블록간의 소수성 회합부를 가교점으로 한 3차원 그물망 구조를 가지는 하이드로겔을 생성한다. 이 하이드로겔의 온도를 다시, 분자 안에 존재하는 「담점을 가지는 블록」의 담점보다 낮은 온도로 냉각하면, 상기 담점을 가지는 블록이 수용성이 되고, 소수성 회합에 의한 가교점이 해방되어, 하이드로겔 구조가 소실되고, 본 발명의 고분자는 다시 완전한 수용액이 된다. 이와 같이, 바람직한 태양에서의 본 발명의 고분자의 졸-겔 전이는, 분자안에 존재하는 담점을 가지는 블록의 상기 담점에서의 가역적인 친수성, 소수성의 변화에 따른 것이기 때문에, 온도변화에 대응하여, 완전한 가역성을 가진다.

(겔의 용해성)

상술한 바와 같이 수용액 중에서 졸-겔 전이 온도를 가지는 고분자를 적어도 포함하는 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자는, 상기 졸-겔 전이온도보다 높은 온도(d℃)에서 실질적으로 수불용성을 나타내고, 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도(e℃)에서 가역적으로 수가용성을 나타낸다.

상술한 높은 온도(d℃)는 졸-겔 전이 온도보다 1℃이상 높은 온도인 것이 바람직하다. 2℃ 이상(특히 5℃이상) 높은 온도인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 「실질적으로 수불용성」이라는 것은, 상기 온도(d℃)에서 물 100mL에 용해하는 상기 고분자의 양이 5.0g 이하(더욱이 0.5g이하, 특히 0.1g이하)인 것이 바람직하다.

한편, 상술한 낮은 온도(e℃)는 졸-겔 전이 온도보다(절대치로) 1℃ 이상 낮은 온도인 것이 바람직하고, 2℃ 이상(특히, 5℃이상) 낮은 온도인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 「수가용성」이란, 상기 온도(e℃)에서, 물 100mL에 용해하는상기 고분자의 양이 0.5g 이상(더욱이 1.0g이상)인 것이 바람직하다. 또한, 「가역적으로 수가용성을 나타낸다」라는 것은, 상기 하이드로겔 형성성 고분자의 수용액이, 일단(졸-겔 전이온도보다 높은 온도에서) 겔화된 후에도, 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도에서는, 상술한 수가용성을 나타내는 것을 말한다.

상기 고분자는 그 10% 수용액이 5℃에서, 10~3,000mPa·s(10~3,000센티포이즈 (centipoise)), 더욱이 50~1,000mPa·s(50~1,000센티포이즈)의 점도를 나타내는 것이 바람직하다. 이와 같은 점도는, 예를 들어 아래와 같은 측정 조건에서 측정하는 것이 바람직하다.

점도계: 스트레스 제어식 유량계(기종명: CSL 500, 미국 Carri-Med사 제품)

로터 직경: 60mm

로터 형상: 평행 평판

측정주파수 : 1 Hz(헤르츠)

본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자의 수용액은, 상기 졸-겔 전이온도보다 높은 온도에서 겔화시킨 후, 다량의 물 속에 침지하여도, 상기 겔은 실질적으로 용해하지 않는다. 상기 담체의 상기 특성은, 예를 들어, 아래와 같이 하여 확인할 수 있다.

즉, 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자 0.15g을 상기 졸-겔 전이 온도보다 낮은 온도(예를 들어, 빙냉하)에서, 증류수 1.35g에 용해하여 10W%의 수용액을 제작하고, 이 수용액을 직경이 35mm인 플라스틱 샬레 안에 주입하여, 37℃로 가열함으로써, 두께 약 1.5mm의 겔을 상기 샬레 안에 형성시킨 후, 이 겔을 포함하는 샬레 전체의 질량(f 그램)을 측정한다. 이어서, 이 겔을 포함하는 샬레 전체를 250mL 의 수중에 37℃에서 10시간 정치한 후, 이 겔을 포함하는 샬레 전체의 질량(g 그램)을 측정하여, 겔 표면에서부터 상기 겔이 용해했는지 여부를 평가한다. 이 때, 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자에서는, 상기 겔의 질량감소율, 즉 (f-g)/f가 5.0% 이하인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1.0% 이하(특히, 0.1% 이하)인 것이 좋다.

본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자의 수용액은, 상기 졸-겔 전이 온도보다 높은 온도에서 겔화시킨 후, 다량(체적비로, 겔의 0.1~100배 정도)의 물 안에 침지하여도, 장기간에 걸쳐 상기 겔은 용해되지 않는다. 이와 같은 본 발명에서 사용하는 고분자의 성질은 예를 들어, 상기 고분자 안에 담점을 가지는 블록이 2개 이상(복수개) 존재함으로써 달성된다.

이에 대하여, 폴리프로필렌옥사이드의 양 끝에 폴리에틸렌옥사이드가 결합되어 이루어지는 상술한 플루로닉 F-127을 사용하여 마찬가지의 겔을 작성한 경우에는, 수시간의 정치로 상기 겔은 완전히 물에 용해하는 것을 본 발명자들은 발견하였다.

겔화되지 않았을 때의 세포독성을 가능한 한 낮은 레벨로 억제하는 점에서는, 물에 대한 농도, 즉 {(고분자)/(고분자+물)}×100(%)로, 20%이하(더욱이 15%이하, 특히 10%이하)의 농도에서 겔화가 가능한 하이드로겔 형성성 고분자를 사용하는 것이 바람직하다.

(다른 성분)

본 발명의 담체는, 상술한 졸-겔 전이온도를 가지는 고분자를 적어도 포함하는 것이지만, 필요에 따라 다른 성분을 포함하고 있어도 좋다. 이와 같은 태양에서의 「다른 성분」으로서는, 예를 들어 항생제, 항암제, 콜라겐, 젤라틴 등의 ECM, 후술하는 국소성 화학중개물질, 인슐린, 세포성장 인자 등의 호르몬류, 외래 유전자 등 혹은 이들의 화학중개물질이나 세포성장인자 등을 분비하는 그 밖의 세포나 조직 등을 들 수 있다.

이와 같은 「다른 성분」의 사용량은 소정의 효과를 나타내는 양이면서, 하이드로겔 형성성 고분자에 따른 겔 안에 소정 시간(예를 들어, 세포·조직의 배양에 필요한 시간) 보유 가능한 양이라면, 특히 제한되지 않는다. 통상은, 하이드로겔 형성성 고분자를 기준(10배)으로 하여, 2배 이하 정도, 더욱이는 1배 이하 정도인 것이 바람직하다.

(화학중개물질)

생체조직의 재생에는, 전구세포 등의 세포뿐만 아니라, 그 분화나 증식을 촉진하는 세포성장인자 등의 여러가지 화학중개물질(chemical mediator)이 필요한 경우가 있다. 이들의 화학중개물질은, 통상은 세포 자체에서 분비되지만, 재생을 효율적으로 진행하기 위하여 본 발명의 세포·조직배양용 담체에 미리 이들 화학중개물질을 함유시켜 외부로부터 보급하는 것이 효과적이다.

이 화학중개물질로서는, 1) 세포의 매우 근방에서밖에 작용하지 않는 국소성 화학중개물질(local chemical mediator), 2) 신경세포에서 분비되어 유효 작용거리가 매우 짧은 신경전달물질(neurotransmitter), 3) 내분비 세포에서 분비되어 혈류등을 통하여 전신의 표적세포에 작용하는 호르몬(hormone) 혹은 세포간 정보전달 물질인 세포증식인자 등을 들 수 있다.

상기 1)의 국소성 화학중개물질로서는, 신경세포 성장인자 등의 단백, 주화성(走化性) 인자 등의 펩티드, 히스타민 등의 아미노산 유도체, 프로스타글란딘 (prostaglandin) 등의 지방산 유도체 등을 들 수 있다.

상기 2)의 신경전달 물질로서는, 글리신(glycine) 등의 아미노산, 노르아드레날린, 아세틸콜린, 엔케팔린(Enkephalin)등의 저분자 펩티드 등의 저분자량 물질을 들 수 있다.

상기 3)의 세포증식 인자 혹은 호르몬으로는, 선유아세포 성장인자 (fibroblast growth factor, FGF), 상피세포 성장인자(epithelial growth factor, EGF), 혈관내피 세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 간세포 증식인자(hepatocyte growth factor, HGF) 등의 세포성장 인자, 인슐린, 소마토트로핀(somatotropin), 소마토메딘(somatomedin), 부신피질자극 호르몬(ACTH), 부갑상선 호르몬(PTH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 등의 단백, 또는 당단백, TSH 방출인자, 바소프레신(vasopressin), 소마토스타틴(somatostatin) 등의 아미노산 유도체, 코티솔(cortisol), 에스트라디올(estradiol), 테스토스테론 (testosterone) 등의 스테로이드 등을 들 수 있다.

(겔 안에서의 화학중개물질의 확산)

본 발명의 하이드로겔은, 하이드로겔 안의 화학중개물질의 확산 속도를 임의로 제어할 수 있다. 특히, 친수성 물질과 수소성 물질을 서로 다른 확산 속도로 확산시킬 수 있다. 수용성 친수성 물질의 확산은 하이드로겔 형성성 고분자의 3차원 그물망 구조에 의한 분자 선별 효과에 의해 제어된다. 따라서, 수용성 친수성 물질의 확산속도를 저하시키기 위해서는, 하이드로겔을 구성하는 하이드로겔 형성성 고분자의 농도를 높이면 좋다. 또한, 수용성 친수성 물질의 확산은 그 물질의 분자량에도 의존한다. 하이드로겔을 구성하는 하이드로겔 형성성 고분자의 농도가 일정하면 분자량이 큰 물질일수록 그 확산속도가 느려진다.

본 발명의 하이드로겔 안에서의 수용성 소수성 물질의 확산은, 하이드로겔 형성성 고분자의 3차원 그물망 구조에 의한 분자 선별 효과에 더하여, 하이드로겔 형성성 고분자의 소수성 부분으로의 분배에 의해서도 영향을 받으며, 하이드로겔 형성성 고분자 안의 소수성 부분의 비율에 의해서도 제어되기 때문에, 수용성 친수성 물질의 확산보다도 통상 늦어진다.

하이드로겔 안의 용질의 확산계수는 문헌(Eric K.L.Lee, et al, Journal of Membrane Science, 24, 125-143(1985))에 기재된 "early-time" 근사법에 의해 구할 수 있다. 이 방법에서는, 균일한 두께 L(cm)의 하이드로겔 평판 중에 균일하게 분산된 용질이 하이드로겔 평판의 양표면으로부터 용출하는 과정을 시간 경과에 따라 관측한다. 시간 t(sec)에서의 용질의 용출량을 M_t, 무한대 시간후의 용출량을 M_∞이라고 하면, M_t/M_∞＜0.6의 범위에서 용질의 하이드로겔 중의 확산계수 D(cm²/sec)에 대해서 아래의 식 1이 성립한다.

M_t/M_∞=(Dt/π)^1/2×4/L ………(1)

따라서, 경과시간(t)의 제곱근에 대해서, 시간 t까지의 용출율을 따라 그린 직선의 기울기로부터 확산계수(D)를 산출할 수 있다.

여러가지 물질의 보유/확산(내지 방출) 성능의 균형이라는 점에서는, 본 발명의 세포·조직 배양용 담체는, 페놀 레드(phenol red)(PR), 메틸블루(MB), 및 미오글로빈(myoglobin)(MG)의 확산계수의 비가 (D_PR/D_MB)≥2 및 (D_PR/D_MG)≥1.2인 것이 바람직하다. 이들 값의 보다 바람직한 범위는 아래와 같다.

(1) (D_PR/D_MB): 보다 바람직하게는 10이상, 더욱이 20이상, 특히 50이상

바람직하게는 1×10⁵이하, 보다 바람직하게는 1×10⁴이하, 더욱이 1×10³이하,

(2) (D_PR/D_MG): 보다 바람직하게는 1.5이상, 더욱이 3이상, 특히 5이상

바람직하게는 1×10⁴이하, 보다 바람직하게는 1×10³이하, 더욱이 1×10²이하

(콜라겐 등의 경우)

상술한 바와 같이, 종래의 세포증식용 「발판」(세포·조직배양 담체)인 콜라겐은 친수성 고분자이고, 본 발명의 하이드로겔에서와 같이, 그 친수성/소수성의 밸런스를 임의로 제어할 수 없으며, 따라서 콜라겐 안의 화학중개물질의 확산속도를 억제하는 것이 어려웠다.

또한, 폴리유산 또는 폴리글리콜산 등의 경우에는, 역으로 소수성이 강하고,이들 폴리머 안의 화학중개물질의 확산속도를 제어하는 것은 역시 어려웠다.

이에 대하여, 본 발명의 하이드로겔은, 상술한 바와 같이, 친수성/소수성의 밸런스를 실질적으로 임의로 제어할 수 있기 때문에, 본 발명의 겔 안의 화학중개물질의 확산속도도 실질적인 자유도로 제어할 수 있다.

본 발명의 겔을 콜라겐 등의 공지의 겔 형성성 고분자와 함께 사용했을 경우(즉, 겔 형성성 고분자로서, 본 발명에서 사용하는 고분자와 콜라겐 등의 공지의 겔 형성성 고분자가 공존하는 경우)에는, 콜라겐 등의 공지의 겔 형성성 고분자를 함유하는 겔 안에서도, 화학중개물질의 확산속도를 실질적인 자유도에서 제어할 수 있다.

(생체내 조직·장기)

본 발명에서 「생체조직·장기」란, 동물(특히, 사람)의 조직, 기관, 장기를 말한다. 본 발명의 배양용 담체에 의해 배양가능한 생체조직·장기는 특히 제한되지 않지만, 예를 들어, 식도, 위, 소장, 대장, 췌장, 간장, 심장, 혈관, 뼈, 연골, 신경, 각막, 진피 등을 예로 들 수 있다.

(세포·조직)

본 발명의 배양용 담체에 의해 배양가능한 세포·조직은 특히 제한되지 않는다.

본 발명의 배양용 담체는, 분화성 세포·조직에 대하여 특히 효과적으로 이용할 수 있다. 이와 같은 분화성 세포로서는, 예를 들어 간세포(stem cell) 및 전구세포를 들 수 있다. 분화성 세포는 분화 단능성(單能性), 분화 다능성(多能性)내지 분화 전능성(全能性)의 모든 세포를 포함한다.

(생체조직·장기의 복원·재생방법)

본 발명의 담체를 사용하여, 세포·조직을 복원·재생시키는 방법은 특히 제한되지 않지만, 상기 세포 등의 파종 및 회수를 용이하게 한다는 점에서는, 하이드로겔 형성성 고분자의 졸-겔 전이를 이용하는 것이 바람직하다.

(졸-겔 전이를 이용하는 태양)

이와 같은 졸-겔 전이를 이용하는 태양에서는, 먼저, 본 발명의 담체 안에 세포(예를 들어, 간세포나 전구세포) 또는 이들을 함유하는 조직 등을 파종, 혼화한다. 이와 같은, 파종, 혼화를 위해서는 예를 들어, 본 발명의 세포·조직 배양용 담체를 구성하는 하이드로겔 형성성 고분자를, 배양액, 예를 들어 RPMI-1640(Life Technologies, N.Y.,USA)에 저온(예를 들어, 4℃)하에서 교반용해하여, 본 발명의 담체를 그 졸-겔 전이온도 이하의 수용액(졸)의 상태로 하여 상기 세포나 조직을 첨가, 현탁시키면 좋다. 여기서 사용하는 배양액에는 특히 제한이 없고, 목적으로 하는 세포(간세포, 전구세포 등)가 증식·분화하기 쉬운 것을 적절히 선택하여 사용하면 좋다. 또한, 이 배양액에 목적으로 하는 간세포나 전구세포의 증식·분화를 촉진하는 상술한 화학중개물질을 필요에 따라 함유시켜도 좋다. 더욱이 콜라겐, 젤라틴 등의 ECM을 첨가하여도 좋다.

본 발명의 담체중에서 생체조직·장기를 재생시키는데는, 예를 들어 상기 현탁액을 본 발명의 담체의 졸-겔 전이온도보다 높은 온도(통상은 37℃)로 승온하여 겔화시킨 후, 상기 온도(통상 37℃)에서 목적으로 하는 세포 또는 그것을 함유하는조직 등을 배양하여도 좋다.

또한, 본 발명의 담체를 겔화시킬 때, 원하는 형상의 틀을 사용하여 원하는 형상을 부여하여 겔화시킬 수도 있다. 예를 들어, 연골 조직을 귀나 코의 재건에 사용하는 경우 등에, 본 발명의 담체를 코나 귀의 적용부위에 적합한 형상으로 하여 연골세포를 배양하고, 연골조직을 재생시키면, 쉽게 원하는 형상으로 성형하여 사용할 수 있다.

본 발명의 담체 중에서 목적으로 하는 조직·장기가 재생된 후에, 이들을 본 발명의 담체에서 회수하기 위해서는, 목적으로 하는 조직·장기를 포함하는 본 발명의 담체를 상기 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도(예를 들어 4℃)로 냉각하여 본 발명의 담체를 졸 상태로 되돌리고, 원심분리 등의 통상의 분리 방법으로 목적으로 하는 조직·장기와 본 발명의 담체를 분리하면 된다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 담체는 섬유아세포의 증식을 억제하는 한편, 목적으로 하는 세포(간세포, 전구세포 등)의 증식이나 분화를 실질적으로 저해하지 않는(내지는 촉진시키는) 것이 가능하기 때문에, 본 발명의 담체안에서 목적으로 하는 조직·장기를 효율적으로 재생시킬 수 있다.

(실시예)

아래에 실시예를 나타내어, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하겠지만, 본 발명의 범위는 특허청구의 범위에 의해 한정되는 것이며, 아래의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예 1

폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드 공중합체(프로필렌옥사이드/에틸렌옥사이드 평균 중합도 약 60/180, 아사히덴카고교 가부시키가이샤 제품: 플루로닉 F-127) 10g을 건조 클로로포름 30mL에 용해하고, 오산화인(1g) 공존하, 헥사메틸렌디이소시아네이트 0.13g을 더하여, 비점 환류(沸点還流)하에서 6시간 반응시켰다. 용매를 감압증류한 후, 나머지를 증류수에 용해하고, 분획분자량 3만의 한외 여과막(아미콘 PM-30)을 사용하여 한외여과(ultrafiltration)하고, 고분자량 중합체와 저분자량 중합체를 분획하였다. 얻어진 수용액을 동결하여, F-127 고중합체 및 F-127 저중합체를 얻었다.

상기에 의해 얻어진 F-127 고중합체(본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자, TGP-1)를 빙냉하, 8질량 %의 농도에서 증류수에 용해하였다. 이 수용액을 천천히 가열해가면, 21℃부터 서서히 점도가 상승하여, 약 27℃에서 고화(固化)하고, 하이드로겔이 되었다. 이 하이드로겔을 냉각하면, 21℃에서 수용액으로 돌아갔다. 이 변화는 가역적으로 반복 관측되었다.

한편, 상기 F-127 저중합체를 빙점하 8질량 %의 농도에서 증류수에 용해한 것은, 60℃이상으로 가열하여도 전혀 겔화하지 않았다.

제조예 2

트리메티롤프로판 1몰에 대하여, 에틸렌옥사이드 160몰을 카티온 중합에 의해 부가하여, 평균분자량 약 7000의 폴리에틸렌옥사이드트리올을 얻었다.

상술한 바와 같이 하여 얻은 폴리에틸렌옥사이드트리올 100g을 증류수 1000mL에 용해한 후, 실온에서, 과망간산 칼륨 12g을 서서히 더하여, 그대로 약 1시간 산화반응시켰다. 고형물을 여과에 의해 제거한 후, 생성물을 클로로포름으로 추출하고, 용매(클로로포름)를 감압증류하여 폴리에틸렌옥사이드트리카르복실체 90g를 얻었다.

상술한 바와 같이 하여 얻은 폴리에틸렌옥사이드트리카르복실체 10g과, 폴리프로필렌옥사이드디아미노체(프로필렌옥사이드 평균 중합도 약 65, 미국 제퍼슨 케미컬사 제품, 상품명: 제퍼민 D-4000, 담점: 약 9℃) 10g을 사염화탄소 1000ml에 용해하고, 디시클로헥실카르보디이미드 1.2g을 더한 후, 비점 환류하에서 6시간 반응시켰다. 반응액을 냉각하고, 고형물을 여과에 의해 제거한 후, 용매(용매화탄소)를 감압증류하고, 나머지를 진공건조하여, 복수의 폴리프로필렌옥사이드와 폴리에틸렌옥사이드가 결합한 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-2)를 얻었다. 이것을 빙냉하, 5 질량%의 농도에서 증류수에 용해하고, 그 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 약 16℃였다.

제조예 3

N-이소프로필아크릴아미드(이스트맨코닥사 제품) 96g, N-아크릴옥시숙신이미드(고쿠산카가쿠 가부시키가이샤 제품) 17g, 및 n-부틸메타크릴레이트(간토카가쿠 가부시키가이샤 제품) 7g을 클로로포름 4000ml에 용해하고, 질소 치환 후, N,N'-아조비스이소부티로니트릴(azobisisobutyronitrile) 1.5g을 더하여, 60℃에서 6시간 중합시켰다. 반응액을 농축한 후, 디에틸에테르에 재침(다시 침전)하였다. 여과에 의해 고형물을 회수한 후, 진공 건조하여, 78g의 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-N-아크릴옥시숙신이미드-코-n-부틸메타크릴레이트)를 얻었다.

상기에 의해 얻은 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-N-아크릴옥시숙신이미드-코-n-부틸메타크릴레이트)에, 과잉 이소프로필아민을 더하여 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-n-부틸메타크릴레이트)를 얻었다. 이 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-n-부틸메타크릴레이트)의 수용액의 담점은 19℃였다.

상술한 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-N-아크릴옥시숙신이미드-코-n-부틸메타크릴레이트) 10g, 및 양 끝단 아미노화 폴리에틸렌옥사이드(분자량 6,000, 카와켄 파인 케미컬 가부시키가이샤 제품) 5g을 클로로포름 1000ml에 용해하고, 50℃에서 3시간 반응시켰다. 실온까지 냉각한 후, 이소프로필아민 1g을 더하여, 1시간 방치한 후, 반응액을 농축하고, 찌꺼기를 디에틸에테르 안에 침전시켰다. 여과에 의해 고형물을 회수한 후, 진공건조하여, 복수의 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-n-부틸메타크릴레이트)와 폴리에틸렌옥사이드가 결합한 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-3)를 얻었다.

이와 같이 하여 얻은 TGP-3을 빙냉하, 5질량%의 농도에서 증류수에 용해하여, 그 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 약 21℃였다.

제조예 4

(멸균방법)

상술한 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-3) 2.0g을, EOG(에틸렌옥사이드가스) 멸균 백(호기메디컬사 제품, 상품명: 하이브리드 멸균백)에 넣고, EOG 멸균장치(이지팩, 이우치 세이에이도 제품)으로 EOG를 백에 충전하고, 실온에서 하루 밤낮을 방치하였다. 또한 40℃에서 한나절 방치한 후, EOG를 백에서 꺼내,통기(aeration)시켰다. 백을 진공 건조기(40℃)에 넣고, 때때로 통기시키면서 한나절 방치함으로써 멸균하였다.

이 멸균조작에 의해 고분자의 졸-겔 전이온도가 변화하지 않는 것을 별도로 확인하였다.

제조예 5

N-이소프로필아크릴아미드 37g과, n-부틸메타크릴레이트 3g과, 폴리에틸렌옥사이드모노아크릴레이트(분자량 4,000 니혼유시 가부시키가이샤 제품: PME-4000) 28g을 벤젠 340ml에 용해한 후, 2,2'-아조비스이소부티로니트릴 0.8g을 더하여, 60℃에서 6시간 반응시켰다. 얻은 반응생성물에 클로로포름 600ml을 더하여 용해하고, 이 용액을 에테르 20L(리터)에 적하하여 침전시켰다. 얻어진 침전을 여과에 의해 회수하고, 이 침전을 약 40℃에서 24시간 진공 건조한 후, 증류수 6L에 다시 용해하여, 분획분자량 10만의 할로우 화이버(hollow fiber)형 한외여과막(아미콘사 제품 H1P100-43)을 사용하여 10℃에서 2ℓ까지 농축하였다.

이 농축액에 증류수 4ℓ더하여 희석하고, 상기 희석조작을 다시 하였다. 상기의 희석, 한외여과 농축조작을 다시 5회 반복하여, 분자량 10만 이하인 것을 제거하였다. 이 한외여과에 의해 여과되지 않은 것(한외여과막 안에 잔류한 것)을 회수하여 동결 건조하고, 분자량 10만 이상인 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-4) 60g을 얻었다.

상술한 바와 같이 하여 얻은 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-4) 1g을, 9g의 증류수에 빙냉하에서 용해하였다. 이 수용액의 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 상기 졸-겔 전이온도는 25℃였다.

제조예 6

제조예 3의 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-3)를 10질량%의 농도로 증류수에 용해하여, 37℃에서의 정상유동 점도를 측정하였더니 5.8×10⁵Pa·sec였다. 이 정상유동 점도η의 측정에서는, 스트레스식 유량계(CSL 500), 및 측정 디바이스로서 아크릴제 원반(직경 4cm)을 사용하고, 시료 두께 600㎛으로 하여, 10N/m²의 전단 응력을 적용하여, 5분후부터 5분간의 크리프(creep)를 관측하였다.

한편, 한천을 2질량%의 농도로 증류수에 90℃에서 용해하고, 10℃에서 1시간 겔화시킨 후, 37℃에서의 η을 측정하였더니, 그 η은 기기의 측정한계(1×10⁷Pa· sec)를 넘었다.

제조예 7

(섬유아세포의 증식성 평가)

제조예 3에서 제작한 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-3)를 제조예 4의 방법으로 멸균한 후, 상기 폴리머의 최종 농도가 약 8%가 되도록 20%의 태아소혈청(FCS;Dainippon Pharmaceutical사 제품, 상품명: Fetal Calf Serum) 및 항생제(Life Technologies사 제품, 상품명: penicillin; 최종농도 10,000U/ml)를 함유하는 RPMI-1640(Life Technologies사 제품)에서 4℃에서 24시간, 교반하에서 용해하였다. 이 조작은 무균 상태에서 실시하였다.

상기 본 발명의 담체(TGP-3/RPMI)에 정상인 폐섬유아세포(Normal Human LungFibroblasts, NHLF, 다카라 슈조 가부시키가이샤 제품)를 6×10⁴개/ml의 세포밀도가 되도록 분산시켰다. 이 NHLF 분산액을 24 웰-플레이트[flat bottom multiwell tissue culture plate(FALCON, Becton Dickinson & Company)]의 각 웰에 0.2ml씩 나누어 주입하고, 37℃에서 겔화시킨 후, 배양액 0.4ml를 첨가하여 37℃, 5% CO₂대기압 하에서 배양하였다. 24 웰- 플레이트는 현미경 관찰용과 섬유아세포 증식율 측정용의 각 2장을 0, 1, 3, 7일째용으로서 총 8장을 준비하였다.

이와는 별도로 비교용으로 TGP-3을 사용하지 않고 상기 배양액에 6×10⁴개/ml의 세포밀도가 되도록 분사시킨 NHLF 분산액을 조제하고, 마찬가지로 하여 24 웰-플레이트 8장을 준비하여 마찬가지 배양시험을 행하였다.

위상차 현미경(올림푸스사 제품, 상품명: IMT-2,10배)으로 시간에 따라(0, 1, 3, 7일) 관찰한 결과, 비교예(RPMI)의 배양에서는 1일후부터 섬유아세포에 특징적인 나뭇가지모양의 증식이 보였고, 7일후에는 융합(confluent) 상태가 된것에 반해, 본 발명의 담체(TGP-3/RPMI) 안에서는 7일후까지 섬유아세포가 단세포의 형태를 유지한채로 증식의 모습은 확인되지 않았다.

소정 배양일이 경과한 후, 24 웰-플레이트의 온도를 4℃로 내림으로써 상기 담체를 용해한 후, 각 웰 안에 호박산 탈수소효소 활성측정용 시약인 WST-8시약(도진 카가쿠 가부시키가이샤 제품) 50㎕을 첨가하였다. 이 24 웰-플레이트를 4℃에서 10시간 반응시킨 후, 완전히 균일한 수용액 상태로 하였다.

상기 수용액을 96-웰- 플레이트에 200㎕씩 나누어 주입하고, 마이크로플레이트용 비색계를 사용하여 450nm(참조파장 620nm)에서 흡광도(OD(450))를 측정하였다. 섬유아세포의 증식율은 배양개시시(0일)의 흡광도 OD_f=(OD(450))와, 배양 후(1,3,7일 후)의 흡광도 OD_L=(OD(450))의 비(OD_L/OD_f)로 구하였다.

본 발명의 담체(TGP-3/RPMI) 안에서는 1,3,7일후의 섬유아세포의 증식율 (OD_L/OD_f)이 각각 105%, 120%, 125% 였는데 반하여, 비교예 (RPMI)에서는, 1, 3, 7일후의 섬유아세포의 증식율 (OD_L/OD_f)이 각각 170%, 370%, 420%였다.

실시예 1

비글계 잡견(9.0~11.0kg 체중)을 펜토바르비탈(pentobarbital)로 정맥 마취한 후, 개복하여, 췌장을 전부 적출하였다. 췌장관에 직경 100㎛의 가이드와이어를 삽입하고, 가이드와이어를 따라 췌조직을 절제, 제거해가면 췌장관만 채취할 수 있었다. 길이 약 6cm, 직경 150~200㎛의 췌장관을 0.5m폭으로 가늘게 잘랐다.

제조예 3의 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-3)를 10질량%의 농도로 배양액(RPMI-1640, Life Technologies사 제품)에 용해한 용액(본 발명의 담체)을 4℃로 냉각하여, 상기 췌장관을 가늘게 자른 조각을 분산시켜, 12웰-플레이트[flat bottom multiwell tissue culture plate(FALCON, Becton Dickinson & Company)]의 각 웰에 0.4ml 씩 나누어 주입하고, 37℃에서 겔화시킨 후, 배양액 0.4ml을 첨가하여 37℃, 5% CO₂대기압하에서 배양하였다. 또한, 배양액 RPMI-1640에는 개의 혈청(개의 혈액 50~100ml를 채혈하여, 실온에서 30분 정치하여 상청을 채취한 것) 10%,10mM 니코틴아미드(Sigma사 제품, 상품명: NIACINAMIDE), 10ng/ml 케라티노사이트(keratinocyte) 증식인자(KGF; PEPROTECH FC Ltd.사 제품, 상품명: Recombinant Keratinocyte Growth Factor)를 첨가하였다.

시일이 지남에 따라 실체 현미경(올림푸스사 제품, 상품명: 도립형 시스템 현미경; 100배)으로 관찰하면, 배양 5일째부터 췌장관 조직 조각 바깥쪽부터, 세포가 분열, 증식한 집괴가 확인되었다(도 1). 상기 세포집괴는 시일이 지남에 따라 크기가 늘어나, 14일째에는 150㎛- 30일째에는 300㎛가 되었다(도 2). 30일째의 조직상에서는 세포집괴에 인슐린 양성 세포가 존재하고, 란게르한스섬 (Langerhans)의 클러스터(cluster)가 형성된 것을 나타내었다.

상기 세포집괴를 함유하는 본 발명의 담체를 4℃로 냉각하여 원심분리함으로써, 상기 세포집괴와, 이 냉각에 의해 졸화한 본 발명의 담체를 용이하게 분리할 수 있었다.

실시예 2

루이스계의 4주된 수컷 쥐의 늑 연골을 무균 상태로 채취하고, 부착되어 있는 연조직을 제거하여 추출한 연골을 가늘게 잘라 조각으로 만들었다. 이어서, 효소액{제 1액: 0.1% EDTA(나카라이 테스크사 제품)/ PBS(-)(로만고교사 제품), 제 2 액: 0.25% 트립신(trypsin)-EDTA(기브코사 제품)/PBS(-)(로만고교사 제품), 제 3 액: 0.1% 콜라게나제(collagenase)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품)/PBS(+)(기브코사 제품)} 을 각각 넣은 시험관 안에 이 연골 조직을 넣고, 37℃에서 각각 15분간, 1시간, 3시간 처리하여 연골조직을 분해하였다.

채취한 연골분산액을 배지 중 {D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium: (기브코사 제품)+10% FCS(Fetal Bovine Serum) + 페니실린(penicillin)+ 스트렙토마이신(streptomycin)}에 넣어, 융합 상태가 될 때까지 약 2주간, 37℃, 5% CO₂대기압하에서 배양하였다. 얻어진 배양액을 0.25% 트립신/PBS(-)에서 5분간 처리하여, 1000rpm, 10분간 원심분리하여, 연골세포를 회수하였다.

제조예 3의 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-3)를 10 질량%의 농도에서 배양액(RPMI-1640, Life Technologies사 제품)에 용해한 용액(본 발명의 담체)을 4℃로 냉각하여, 상기 연골세포를 6×10⁵개/ml의 세포밀도가 되도록 분산시키고, 12웰-플레이트[flat bottom multiwell tissue culture plate(FALCON, Becton Dickinson $ Company)]의 각 웰에 0.4ml씩 나누어 주입하고, 37℃에서 겔화시킨 후, 배양액 0.4ml을 첨가하여 37℃, 5% CO₂대기압하에서 배양하였다. 한편, 배양액 RPMI-1640에는 실시예 1과 마찬가지로, 쥐 혈청(쥐혈액을 실온에서 30분 정치하여 상청을 채취한 것) 10%, 10mM 니코틴아미드, 10ng/ml 케라티노사이트 증식인자(KGF)를 첨가하였다.

시일이 지남에 따라 실체 현미경으로 관찰하면, 배양 5일째부터, 세포가 분열, 증식한 집괴가 확인되었다. 상기 세포 집괴는 시일이 지남에 따라 크기가 늘어나, 14일째에는 150㎛- 30일째에는 300㎛가 되었다. 30일째의 조직상(아잔(Azan) 염색 및 어그리칸(Aggrecan) 면역염색)에서, 세포집괴에 연골 덩이의 형성을 나타내는 염색상이 확인되었다.

제조예 8

N-이소프로필아크릴아미드 71.0g 및 n-부틸메타크릴레이트 4.4g을 에탄올 1117g에 용해하였다. 이것에 폴리에틸렌글리콜디메타크릴레이트(PDE 6000, 니혼 유시 가부시키가이샤 제품) 22.6g을 물 773g에 용해한 수용액을 더하여, 질소기류하 70℃로 가온하였다. 질소기류하 70℃를 유지하면서, N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 0.8ml와 10% 과황산 암모늄(APS) 수용액 8ml를 더하여 30분간 교반 반응시켰다. 더욱이 TEMED 0.8ml와 10% APS 수용액 8ml를 30분 간격으로 4회 더하여 중합반응을 완결시켰다. 반응액을 10℃ 이하로 냉각한 후, 10℃의 냉각증류수 5L를 더하여 희석하고, 분획분자량 10만의 한외여과막을 사용하여 10℃에서 2L까지 농축하였다.

상기 농축액에 냉각증류수 4L을 더하여 희석하고, 상기 한외여과 농축조작을 다시 하였다. 상기의 희석, 한외여과 농축조작을 다시 5회 반복하고, 분자량 10만 이하인 것을 제거하였다. 이 한외여과에 의해 여과되지 않은 것(한외여과막안에 잔류한 것)을 회수하여 동결 건조하고, 분자량 10만 이상인 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-5) 72g을 얻었다.

상기와 같이 하여 얻은 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-5) 1g을 9g의 증류수에 빙냉하에서 용해하였다. 이 수용액의 졸-겔 전이온도를 측정하였더니,상기 졸-겔 전이온도는 20℃였다.

제조예 9

N-이소프로필아크릴아미드 42.0g 및 n-부틸메타크릴레이트 4.0g을 에탄올 592g에 용해하였다. 이것에 폴리에틸렌글리콜디메타크릴레이트(PDE 6000, 니혼 유시 가부시키가이샤 제품) 11.5g을 물 65.1g에 용해한 수용액을 더하여, 질소기류하 70℃로 가온하였다. 질소기류하 70℃를 유지하면서, N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 0.4ml와 10% 과황산 암모늄(APS) 수용액 4ml를 더하여 30분간 교반 반응시켰다. 더욱이 TEMED 0.4ml와 10% APS 수용액 4ml를 30분 간격으로 4회 더하여 중합반응을 완결시켰다. 반응액을 5℃ 이하로 냉각한 후, 5℃의 냉각증류수 5L를 더하여 희석하고, 분획분자량 10만의 한외여과막을 사용하여 5℃에서 2L까지 농축하였다.

상기 농축액에 냉각증류수 4L을 더하여 희석하고, 상기 한외여과 농축조작을 다시 하였다. 상기의 희석, 한외여과 농축조작을 다시 5회 반복하고, 분자량 10만 이하인 것을 제거하였다. 이 한외여과에 의해 여과되지 않은 것(한외여과막안에 잔류한 것)을 회수하여 동결 건조하고, 분자량 10만 이상인 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-6) 40g을 얻었다.

상기와 같이 하여 얻은 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-6) 1g을 9g의 증류수에 빙냉하에서 용해하였다. 이 수용액의 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 상기 졸-겔 전이온도는 7℃였다.

제조예 10

N-이소프로필아크릴아미드 45.5g 및 n-부틸메타크릴레이트 0.56g을 에탄올 592g에 용해하였다. 이것에 폴리에틸렌글리콜디메타크릴레이트(PDE 6000, 니혼 유시 가부시키가이샤 제품) 11.5g을 물 65.1g에 용해한 수용액을 더하여, 질소기류하 70℃로 가온하였다. 질소기류하 70℃를 유지하면서, N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 0.4ml와 10% 과황산 암모늄(APS) 수용액 4ml를 더하여 30분간 교반 반응시켰다. 더욱이 TEMED 0.4ml와 10% APS 수용액 4ml를 30분 간격으로 4회 더하여 중합반응을 완결시켰다. 반응액을 10℃ 이하로 냉각한 후, 10℃의 냉각증류수 5L를 더하여 희석하고, 분획분자량 10만의 한외여과막을 사용하여 10℃에서 2L까지 농축하였다.

상기 농축액에 냉각증류수 4L을 더하여 희석하고, 상기 한외여과 농축조작을 다시 하였다. 상기의 희석, 한외여과 농축조작을 다시 5회 반복하고, 분자량 10만 이하인 것을 제거하였다. 이 한외여과에 의해 여과되지 않은 것(한외여과막안에 잔류한 것)을 회수하여 동결 건조하고, 분자량 10만 이상인 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-7) 22g을 얻었다.

상기와 같이 하여 얻은 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-7) 1g을 9g의 증류수에 빙냉하에서 용해하였다. 이 수용액의 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 상기 졸-겔 전이온도는 37℃였다.

실시예 3

제조예 8에서 얻어진 하이드로겔 형성성 고분자 TGP-5를, 페놀레드(Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품) 3mM를 함유하는 인산 완충액(1/15M, pH7),메틸블루(Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품) 6mM를 함유하는 인산완충액(1/15M, pH7), 미오글로빈(Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품) 0.9%를 함유하는 인산완충액(1/15M, pH7), 각각에 9wt%의 농도로 빙냉하 용해하였다. 이들 용액을 길이 1.3mm, 내직경 6mm의 유리관 안에 충전하고 37℃로 승온하여 겔화하였다. 이 원반형상의 하이드로겔을 유리관마다 3mL의 인산완충액(1/15M, pH7)이 들어간 분광용 셀에 넣고, 37℃로 보온하여 교반하면서, 흡광도를 연속적으로 측정하였다.

흡광도의 측정파장은 페놀레드, 메틸블루, 미오글로빈 각각에 대하여, 558nm, 571nm, 409nm에서 행하였다. 시간에 따른 3mL의 인산완충액(1/15M, pH7) 안으로의 페놀레드, 메틸블루, 미오글로빈의 용출율을 흡광도 측정으로 구하고, 식 1의 관계에서 각각의 확산계수를 구하였더니, 1.6×10^-6(cm²/sec), 7.5×10^-9(cm²/sec), 2.1×10^-7(cm²/sec)였다.

TGP-5 하이드로겔 중 37℃에서의 수용성 친수성 물질인 페놀레드와 수용성 소수성 물질인 메틸블루의 확산계수의 비 (D_PR/D_MB)는 213이었다.

TGP-5 하이드로겔 중 37℃에서의 수용성 친수성 저분자 물질인 페놀레드와 수용성 친수성 고분자 물질인 미오글로빈의 확산계수의 비 (D_PR/D_MG)는 7.6이었다.

비교예 1

저융점 아가로스(Sea Prep®agarose, BMA(Rockland USA)사 제품, 융점 50℃이하, 겔화점 8℃~17℃)를, 페놀레드(Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품) 3mM를 함유하는 인산 완충액(1/15M, pH7), 메틸블루(Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품) 6mM를 함유하는 인산완충액(1/15M, pH7), 미오글로빈(Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품) 0.9%를 함유하는 인산완충액(1/15M, pH7), 각각에 1wt%의 농도로 가온 용해하였다. 이들 용액을 길이 10mm, 내직경 2mm의 유리관 안에 충전하고 2℃로 냉각하여 겔화하였다. 이 원반형상의 하이드로겔을 유리관마다 3mL의 인산완충액(1/15M, pH7)이 들어간 분광용 셀에 넣고, 37℃로 보온하여 교반하면서, 흡광도를 연속적으로 측정하였다.

흡광도의 측정파장은 페놀레드, 메틸블루, 미오글로빈 각각에 대하여, 558nm, 571nm, 409nm에서 행하였다. 시간에 따른 3mL의 인산완충액(1/15M, pH7) 안으로의 페놀레드, 메틸블루, 미오글로빈의 용출율을 흡광도 측정으로 구하고, 식 1의 관계에서 각각의 확산계수를 구하였더니, 4.7×10^-6(cm²/sec), 7.1×10^-6(cm²/sec), 2.6×10^-5(cm²/sec)였다.

저융점 아가로스 하이드로겔 중 37℃에서의 수용성 친수성 물질인 페놀레드와 수용성 소수성 물질인 메틸블루의 확산계수의 비 (D_PR/D_MB)는 0.7이었다.

저융점 아가로스 하이드로겔 중 37℃에서의 수용성 친수성 저분자 물질인 페놀레드와 수용성 친수성 고분자 물질인 미오글로빈의 확산계수의 비 (D_PR/D_MG)는 0.18이었다.

실시예 4

제조예 8로 얻어진 하이드로겔 형성성 고분자 TGP-5를 생리식염수에 용해하여 고분자 농도 10질량%(wt%), 8질량%(wt%), 6질량%(wt%)의 용액을 조제하였다. 각각의 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 각각 18℃, 20℃, 22℃였다. 각 생리식염수 수용액을 그 졸-겔 전이온도 이하로 냉각하여, 1군 10마리의 생후 6주째 되는 쥐(숫컷 5마리, 암컷 5마리)의 복강내에 1mL/kg 씩 투여하였다. 투여법은 쥐의 복부의 털을 전기 면도기로 제거하고, 소독용 에탄올로 투여부위를 소독한 후, 시린지 및 유치침(22G)을 사용하여 투여하였다. 투여 후 1일째, 3일째, 7일째, 14일째, 21일째에 각 군 2마리(숫컷 1마리, 암컷 1마리)를 에테르 마취하에서 방혈치사시키고, 복강내의 하이드로겔(본 발명의 재생용 재료)의 잔존을 검사하였다. 고분자 농도 6질량%(wt%)의 하이드로겔은 투여후 3일째에 복강내에서 소실, 고분자 농도 8질량%(wt%)의 하이드로겔은 투여후 14일째에 복강내에서 소실, 고분자 농도 10질량%(wt%)의 하이드로겔은 투여후 21일째에 복강내에서 소실하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 세포·조직배양용 담체 안에는, 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않기 때문에, 목적으로 하는 세포·조직(예를 들어, 회복·재생 등을 목적으로 하는 장기나 조직의 세포)을 선택적으로 증식시켜, 목적으로 하는 장기나 조직의 재생을 효과적으로 달성할 수 있다.

본 발명의 세포·조직배양용 담체는, 소정의 온도(예를 들어, 사람 또는 동물의 체온)에서 겔화하여 삼차원 그물망 구조를 형성하고, 세포성장 인자 등을 장기간 보유할 수 있기 때문에, 목적으로 하는 장기나 조직의 재생을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 세포·조직배양용 담체는 저온에서 졸상태, 체온에서 겔화하는 하이드로겔 형성성 고분자로 구성되기 때문에, 저온의 졸상태에서 본 발명의 담체중에 간세포나 전구세포 또는 이들을 함유하는 조직 등을 파종, 혼화할 수 있어, 그대로 소정 온도(예를 들어, 사람 또는 동물의 체온)에서 겔화시킴으로써 상기 담체를 겔상태로 하여, 조직이나 장기를 재생하는 간세포나 전구세포의 접착·분화·형태형성을 위한 인공담체로서 기능하게 할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 세포·조직배양용 담체는 그 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도로 냉각함으로써 졸상태로 되돌아가기 때문에, 겔내에서 재생한 조직이나 장기에 실질적으로 손상을 주지 않고 회수할 수 있다.

Claims

그 수용액이 저온에서 졸상태, 고온에서 겔상태가 되는 열가역적인 졸-겔 전이를 나타내는 하이드로겔 형성성 고분자를 적어도 포함하는 세포·조직배양용 담체로서, 상기 하이드로겔 형성성 고분자에 근거한 겔내에서 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않는 것을 특징으로 하는 세포·조직배양용 담체.
제 1 항에 있어서,

상기 하이드로겔 형성성 고분자가, 담점을 가지는 복수의 블록과 친수성 블록이 결합한 고분자인 세포·조직배양용 담체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 졸-겔 전이온도가 0℃보다 높고 42℃이하인 세포·조직배양용 담체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

화학중개물질을 더욱 함유하는 세포·조직배양용 담체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 하이드로겔 형성성 고분자의 수용액이 고온의 겔상태에서 실질적으로 수불용성을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포·조직배양용 담체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

물을 더욱 포함하는 세포·조직배양용 담체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

페놀 레드(phenol red)(PR), 메틸블루(MB), 및 미오글로빈(myoglobin)(MG)의 확산계수의 비가 (D_PR/D_MB)≥2 및 (D_PR/D_MG)≥1.2인 세포·조직배양용 담체.
그 수용액이 저온에서 졸상태, 고온에서 겔상태가 되는 열가역적인 졸-겔 전이를 나타내는 하이드로겔 형성성 고분자와, 물을 적어도 포함하는 담체로서, 상기 겔 내에서 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않는 담체를 사용하여,

상기 졸-겔 전이온도보다 저온의 졸상태에서, 상기 담체에 세포 또는 조직을 더하고,

상기 졸-겔 전이온도보다 고온의 겔상태에서, 상기 담체를 사용하여 세포 또는 조직을 배양하며,

상기 담체를 다시 졸-겔 전이온도보다 저온의 졸상태로 하여, 배양후의 세포 또는 조직을 회수하는 것을 특징으로 하는 세포·조직의 배양방법.