KR20040017297A

KR20040017297A - 조직·장기 재생용 재료 및 조직·장기 재생 방법

Info

Publication number: KR20040017297A
Application number: KR10-2004-7000488A
Authority: KR
Inventors: 요시오카히로시; 구보타스나오; 모리유이치; 노이시키야스하루
Original assignee: 메비올 가부시키가이샤
Priority date: 2001-07-13
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2004-02-26
Also published as: CA2453408A1; US20040172061A1; JPWO2003006081A1; WO2003006081A1; IL159795A0; EP1407791A1

Abstract

본 발명은 섬유아세포의 과잉 증식을 억제하면서, 생체내의 조직이나 장기의 괴사부나 결손 공간에 쉽게 충전할 수 있어, 목적으로 하는 조직이나 장기를 효과적으로 재생할 수 있는 조직·장기 재생용 재료, 및 조직·장기 재생 방법에 관한 것이다. 그 수용액이 저온에서 졸 상태, 고온에서 겔상태가 되는 열가역적인 졸-겔 전이를 나타내는 하이드로겔 형성성 고분자를 사용하여, 상기 하이드로겔 형성성 고분자에 따른 겔안에서 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않는 조직·장기 재생용 재료를 구성한다.

Description

조직·장기 재생용 재료 및 조직·장기 재생 방법{MATERIAL FOR TISSUE/ORGAN REGENERATION AND METHOD OF TISSUE/ORGAN REGENERATION}

어떠한 원인에 의해 생체내의 조직이나 장기에 커다란 결손 공간이 발생하면, 일반적으로 그 공간은 신생의 콜라겐성 섬유조직으로 충전되거나, 다른 조직에 의해 점거된다. 이와 같은 충전 내지 점거 상태가 발생하면, 상기 충전 등의 현상에 기인하여, 그 조직 결손부로의 본래의 생체 조직 재생이 장소적·공간적으로 불가능해지거나, 체내의 조직이나 장기 사이의 유착(癒着) 발생이라는 중대한 장해가 생긴다. 전형적인 예는, 간장부분 절제후의 간절제 부위와 복벽의 유착이나, 절단한 말초신경이나 치주염에 의해 소실된 치주 조직(이들은 조직결손부로의 조직재생이 장소적·공간적으로 불가능)이다.

이러한 장해를 피하기 위하여 종래부터, 발생한 결손부위에 다른 조직이 투입하는 것을 방지하고, 원래의 조직이나 장기를 재생하기 위한 세포증식용 발판이나 스페이스 확보막을 결손 부위에 보충하는 것이 효과적이라고 생각되어져 왔다. 예를 들어, 이와 같은 목적으로, 소 추출 콜라겐 type Ⅰ을 동결건조한 콜라겐 스폰지, 폴리유산이나 폴리글리콜산 수지 등의 생분해성 폴리머, 피브린 접착제 등이, 세포 증식용 발판이나 스페이스 확보막 재료로서 이용되고 있다(상세한 것은, 우에다 미노루 편, 「티슈·엔지니어링」, 1999년, 나고야 대학 출판회를 참조할 수 있다).

하지만, 상술한 바와 같은 종래의 세포증식용 발판이나 스페이스 확보막에는 체내 결손 부위로의 충전이 곤란하거나, 세포의 증식성이 불충분하거나, 재료가 항원성을 가지는 등의 문제가 있었다.

또한, 종래의 세포증식용 발판이나 스페이스 확보막, 특히 콜라겐, 젤라틴, 피브린 등에는 간염 바이러스, HIV 바이러스, 프리온(prion) 등의 주지 혹은 미지의 병원 물질이 포함되어 있을 가능성이 커, 커다란 부작용을 발현할 가능성이 높다는 중대한 문제가 있다.

더욱이 가장 중대한 문제는, 종래의 재료를 세포나 장기의 결손부에 유치하면, 원래의 조직이나 장기의 재생에 필요한 세포의 증식보다도 섬유아세포의 증식이 활발하게 일어나, 그 결과 상술한 바와 같이, 목적으로 하는 조직이나 세포의 재생이 어려워지는 것이다.

본 발명은 동물(사람을 포함)의 조직 또는 장기의 괴사부 또는 결손부에 주입하여, 상기 조직 또는 장기를 재생시킬 때 적절하게 사용할 수 있는 조직·장기재생용 재료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생체내(in vivo)의 조직·장기의 재생에 특히 적절하게 사용할 수 있는 조직·장기재생용 재료 및 이 재료를 사용하는 조직·장기재생 방법에 관한 것이다.

본 발명의 조직·장기재생용 재료를 사용함으로써, 예를 들어, 인비보 티슈·엔지니어링에 의한 조직·장기재생이 용이해진다.

도 1은 간좌엽(肝左葉)면에 2.0×2.0×1.0cm 크기의 결손창을 만든 상태를 나타내는 사진이다.

도 2는 간결손창에 본 발명의 재생용 재료를 주입하고, 체온으로 겔화하여 결손창을 완전히 충전한 상태를 나타내는 사진이다.

도 3은 본 발명의 재생용 재료 사용군의 12주째 상태를 나타내는 사진이다. 창 치유면은 완전히 정상조직화되었다.

도 4는 본 발명의 재생용 재료 사용군의 4주째 조직학적 소견을 나타내는 사진이다. 도면에서, 「A」는 간 결손창에 본 발명의 재생용 재료를 주입한 부분에유약한 간세포가 재생하고 있는 부분이다. 「B」는 정상 간조직면과의 경계에 보이는 선유조직이다. 「C」는 정상간조직이다.

도 5는 집토끼 경골 절제부에 본 발명의 재생용 재료를 주입한 직후의 X-ray(Roentgen) 사진이다.

도 6은 집토끼 경골 절제부에 본 발명의 재생용 재료를 주입하고 나서, 15일후의 X-ray 사진이다.

도 7은 쥐의 등에 투여된 졸-겔 전이온도가 5℃인 TGP-6의 잔존을 나타내는, 실시예 4에서 얻은 사진이다.

도 8은 쥐의 등에 투여된 졸-겔 전이온도가 5℃인 TGP-6 주위를 나타내는, 실시예 4에서 얻어진 HE(hematoxylin eosin) 염색조직상(배율:100배)이다.

도 9는 쥐의 등에 투여된 졸-겔 전이온도가 5℃인 TGP-6의 잔존을 나타내는, 실시예 5에서 얻어진 사진이다.

도 10은 쥐의 등에 투여된 졸-겔 전이온도가 5℃인 TGP-6 주위를 나타내는, 실시예 5에서 얻어진 HE 염색조직상(배율:100배)이다

본 발명의 목적은 상술한 종래의 조직·장기 재생용 재료의 결점을 해소한 재생용 재료 내지 세포외 매트릭스(Extra Cellular Matrix, ECM)로서 기능하는 조직·장기재생용 재료, 및 상기 재료를 사용한 조직·장기 재생 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 섬유아세포의 과잉증식을 억제하면서, 생체내의 조직이나 장기의 괴사부, 결손공간에 쉽게 충전할 수 있으며, 목적으로 하는 조직이나 장기를 효과적으로 재생할 수 있는 조직·장기재생용 재료, 및 상기 재료를 이용한 조직·장기재생 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 실질적으로 항원성을 나타내지 않으면서, 주지 혹은 미지의 병원물질을 실질적으로 포함하지 않는 조직·장기 재생용 재료, 및 상기 재료를 사용한 조직·장기재생 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 여러가지 세포(간세포, 전구세포 등) 또는 이 세포들을 함유하는 생체조직 등의 접착·분화·형태형성을 위한 ECM 으로서 기능할 수 있는 조직·장기 재생용 재료, 및 이 재료를 사용한 조직·장기 재생방법을 제공하는데 있다.

본 발명자들은 세밀히 연구한 결과, 보다 저온에서 졸상태, 보다 고온에서 겔상태가 되는 졸-겔 전이 온도를 가지며, 상기 졸-겔 전이가 열가역적인 것을 특징으로 하는 하이드로겔 형성성 고분자를 사용하여 조직·장기 재생용 재료를 구성하는 것이, 상기 고분자에 근거한 겔내의 섬유아세포의 증식을 실질적으로 억제하는 것을 가능하게 하며, 상기 목적의 달성을 위해 매우 효과적임을 알아내었다.

본 발명의 조직·장기 재생용 재료는 상기 발견에 근거한 것이며, 보다 구체적으로는 그 수용액이 저온에서 졸상태, 고온에서 겔상태가 되는 열가역적인 졸-겔 전이를 나타내는 하이드로겔 형성성 고분자를 적어도 포함하는 조직·장기 재생용 재료로서, 상기 하이드로겔 형성성 고분자에 근거한 겔 내에서 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명에 따르면, 더욱이 그 수용액이 저온에서 졸상태, 고온에서 겔상태가 되는 열가역적인 졸-겔 전이를 나타내는 하이드로겔 형성성 고분자와, 물을 적어도 포함하는 재료로서, 상기 겔 내에서 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않는 조직·장기 재생용 재료를 사용하며, 상기 졸-겔 전이온도보다 저온의 졸상태에서, 상기 재생용 재료를 조직 및/또는 장기의 괴사부 또는 손실부에 주입함으로써, 상기 조직·장기 재생용 재료를 체온으로 겔화시켜 상기 괴사부 또는 결손부에 배치하고, 상기 조직 및/또는 장기를 재생시키는 것을 특징으로 하는 조직·장기 재생 방법이 제공된다.

상기 구성을 가지는 조직·장기 재생용 재료에서, 상기 고분자는 담점(曇点)을 가지는 복수의 블록과 친수성 블록이 결합한 고분자를 적어도 포함하는 것이 바람직하다.

상기 하이드로겔 형성성 고분자의 졸-겔 전이온도는 0℃보다 높고 42℃ 이하인 것이 바람직하다.

상기 조직·장기 재생용 재료는 더욱이 생체내 조직·장기의 재생을 촉진하는 화학 중개물질을 함유하는 것이 바람직하다.

더욱이 상기 조직·장기 재생용 재료는 생체내 조직·장기의 재생을 촉진하기 위하여 특히, 배성(胚性) 또는 체성 간세포 등을 함유하는 것이 가능하다.

상기 하이드로겔 형성성 고분자 수용액은, 고온의 겔 상태에서 실질적으로 수불용성을 나타내는 것이 바람직하다.

상기 조직·장기 재생용 재료는, 상기 하이드로겔 형성성 고분자와 물을 적어도 포함하는 것이 바람직하다.

(조직·장기 재생의 추정 메카니즘)

생물의 몸은 통상 1개의 수정란에서 시작한다. 그 수정란은 세포분열을 반복하여, 외배엽, 중배엽, 내배엽의 세포로 분화한다. 각각의 배엽은 더욱 세포분열이나 이동을 반복하여, 손이나 발, 여러가지 조직·장기가 된다.

넓은 의미에서의 간세포란, 발생과정에서의 형태 형성이나, 성체(成體)의 항상성·생식세포의 유지에 작용하는 일군의 세포이다. 배간(胚幹) 세포(ES 세포)란, 배반포(胚盤胞)의 내부세포 덩이에서 유래하며, 암화(癌化)하지 않고 생체 밖에서 안정하게 증식하는 세포이며, 이른바 세포로 분화할 수 있는 유일한 간세포라고 할 수 있다.

좁은 의미에서 사용되는 간세포란, 성체에서도 또한 조직이나 장기의 항상성의 유지나 손상시의 재생에 작용하는 세포의 일군이라고 할 수 있다. 지금까지, 조혈조직, 골격근, 신경, 유선, 표피, 장관, 정자 등에서, 간세포의 존재가 확인되고 있다. 하지만, 이 간세포들이나 전구세포만으로는 생체내조직·장기의 재생이 불가능하며, 통상은 간세포나 전구세포의 접착·분화·형태형성을 위한 재생용 재료가 필요하다.

일반적으로 재생용 재료(내지 인공세포외 매트릭스)로서 널리 이용되고 있는 소 추출 콜라겐 타입 I을 동결건조한 콜라겐 스폰지 등의 안에서는 섬유아세포의 증식이 활발하게 일어나기 때문에, 이와 같은 종래의 재생용 재료를 조직이나 장기의 결손 공간 보충하면, 이 결손공간은 섬유아세포나 신생 콜라겐성 섬유조직으로 충전되어, 그 충전에 의해 조직결손부로의 생체조직 재생이 장소적으로 불가능해지거나, 체내의 조직이나 장기 사이에서의 유착 발생이라는 중대한 장해가 발생한다.

이에 대하여, 본 발명의 조직·장기재생용 재료는 섬유아세포의 과잉 증식을 억제하는 기능이 있기 때문에, 섬유아세포의 과잉 증식에 따른, 목적으로 하는 세포·조직의 재생 저해라는 현상이 실질적으로 발생하지 않고, 따라서, 생체내에서 결손한 조직·장기 재생의 발판으로서 효과적으로 기능하다. 즉, 여러가지 세포(예를 들어, 간세포, 전구세포)의 접착·분화·형태형성을 위한 인공세포외 매트릭스로서의 역할을 수행하기 때문에, 양호한 조직·장기의 재생을 달성할 수 있다.

본 발명의 조직·장기재생용 재료를 수용액으로 한 경우에는, 저온에서 유동성이 있는 졸 상태이기 때문에, 생체내의 조직이나 장기에 발생한 결손 공간 또는 괴사부에 액체 상태로 용이하게 충전할 수 있다. 본 발명자들이 아는 바에 따르면, 본 발명의 조직·장기 재생용 재료는 그대로 체온(사람의 경우에는 37℃)에서 겔화하기 때문에, 본 발명의 조직·장기 재생용 재료와 결손이 발생한 생체내의 조직이나 장기가 밀착하여, 상기 결손공간에 다른 조직이나 콜라겐성 섬유조직이 침입하는 것을 방지하기 때문에, 양호한 조직·장기의 재생을 달성할 수 있다고 추정된다.

생체조직의 재생에는, 전구 세포 등의 세포뿐만 아니라, 그 분화나 증식을 촉진하는 세포성장 인자 등의 여러가지 화학 중개물질(chemical mediator)이 필요한 경우가 있다. 이들 화학중개물질은 통상 세포자체에서 분비되지만, 생체내의 조직이나 장기에 발생한 결손공간 혹은 괴사부에 이들 화학중개물질을 장기간에 걸쳐 보유해 두는 것이 보통은 곤란하다. 본 발명의 조직·장기재생용 재료는 체온에서 겔화하여 3차원적인 그물망 구조를 형성하고 있으며, 후술하는 바와 같이 상기 재료를 구성하는 하이드로겔은 겔내에 다수의 소수성(疎水性) 영역을 가지고 있어 소수성이 강한 화학중개물질을 소수성 결합에 의해 장기간에 걸쳐 하이드로겔 내에 보유해 둘 수 있기 때문에, 양호한 조직·장기의 재생을 달성할 수 있다.

이하, 필요에 따라 도면을 참조하면서, 본 발명을 상세히 설명한다. 이하의 기재에서 양비(量比)를 나타내는 「부」및 「%」는 특히 단정하지 않는 한, 질량 기준으로 한다.

(조직·장기재생용 재료)

본 발명의 조직·장기 재생용 재료는, 졸-겔 전이온도를 가지는 하이드로겔형성성 고분자를 적어도 포함한다. 상기 조직·장기재생용 재료는, 보다 저온에서 졸상태, 보다 고온에서 겔상태가 되는 열가역적인 졸-겔 전이를 나타낸다.

본 발명의 조직·장기 재생용 재료는, 조직 및/또는 장기의 재생(좁은 의미)뿐만 아니라, 복원에도 이용할 수 있다.

(복원)

본 발명에서 「복원」(repair)이란, 어떠한 원인(외상이나, 질병, 외과적 수술 등)에 의해 손상된 세포, 조직, 기관, 장기 등이, 잔존하는 동일 세포나 조직의 증식에 의해, 그 연속성을 회복하는 것을 말한다.

(재생)

본 발명에서 좁은 의미의 「재생」(regeneration)이란, 어떠한 원인(외상이나, 질병, 외과적 수술 등)에 의해 손상된 세포, 조직, 기관, 장기 등이, 잔존하는 동일 세포나 조직의 증식에 의해, 원래의 모습으로 돌아가는 것을 말한다(좁은 의미의 「재생」은 통상 분화를 동반한다). 이후의 본 명세서에서 「재생」이란 말은, 통상은 넓은 의미로 사용한다. 즉, 넓은 의미의 「재생」은, 잔존하는 동일 세포나 조직의 증식뿐만 아니라, 외부로부터 부여된 세포나 조직의 증식에 의해 원래 조직의 연속성이나 기능이 회복되는 「복원」도 포함한다.

(항원성)

본 발명의 조직·장기 재생용 재료의 항원성은, 예를 들어, 아나필락시스 쇼크(anaphylactic shock)의 유무로 판단할 수 있다. 예를 들어, 후술하는 실시예 1의 조건에서 비글(beagle) 견의 체내에, 본 발명의 조직·장기 재생용 재료를 주입한 경우, 만약 아나필락시스 쇼크가 일어난다면, 그 비글견은 사망하기 때문이다.

(IgE 항체의 생산 레벨)

본 발명의 조직·장기 재생용 재료의 항원성은 예를 들어, IgE 항체의 생산 레벨로 판단할 수도 있다. 보다 구체적으로는, 혈중의 IgE 농도가 250IU(국제단위)/ml 이상 나타났을 때, 항원성이 있다고 판정한다. 이 경우, IgE는 예를 들어, RIA법 등에 의해 측정하는 것이 가능하다(IgE 측정방법에 대한 구체적인 내용은, 예를 들어, 카나이 이즈미 외 편 「임상검사법제요」제 949~950 페이지, (1998), 가나하라 출판을 참조).

(염증의 유무)

본 발명의 조직·장기 재생용 재료의 항원성은, 염증의 유무로 판단할 수 있다. 후술하는 실시예 1의 조건에서 비글견의 체내에, 본 발명의 조직·장기 재생용 재료를 주입한 경우, 만약 염증이 생기면, 해당 조직의 조각을 HE(hematoxylin eosin) 염색한 후, 광학현미경(약 200배)으로 관찰했을 때, 「거(巨)세포」가 관찰되는지 여부로 판단할 수 있다. 「거세포」가 관찰되지 않으면, 실질적으로 염증이 발생하지 않았다고 판단할 수 있다. 이와 같은 염증 유무의 판단에 관해서는, 예를 들어 츠루다 사다지 외 편 「바이오마테리얼사이언스 제 1 집」제 151~170 페이지, (1982), 남강당,을 참조할 수 있다.

(하이드로겔 형성성 고분자)

본 발명의 하이드로겔을 구성하는 「하이드로겔 형성성 고분자」란, 가교(crosslinking) 구조 내지 그물망 구조를 가지며, 이 구조에 따라, 그 내부에물 등의 분산액체를 보유함으로써 하이드로겔을 형성할 수 있는 성질을 가지는 고분자를 말한다. 또한, 「하이드로겔」이란 고분자로 이루어지는 가교 내지 그물망구조와 이 구조 안에 지지 내지 보유된(분산액체인) 물을 적어도 포함하는 겔을 말한다.

가교 내지 그물망 구조 안에 보유된 「분산액체」는 물을 주요 성분으로 하여 포함하는 액체라면, 특히 제한되지 않는다. 보다 구체적으로 말하면, 분산액체는 물 자체여도 좋고, 또한 수용액 및/또는 함수액체 중의 어느 하나여도 좋다. 이 함수액체는, 이 함수액체의 전체 100부에 대하여, 물을 80부 이상, 더욱 바람직하게는 90부 이상 포함하는 것이 좋다.

(졸-겔 전이온도)

본 발명에서 「졸 상태」, 「겔 상태」 및 「졸-겔 전이온도」는 아래와 같이 정의된다. 이 정의에 대해서는 문헌(Polymer Journal.18(5), 411~416(1986))을 참조할 수 있다.

보다 구체적으로는, 졸 형상의 하이드로겔 1mL를 내직경이 1cm인 시험관에 넣고, 소정 온도(일정 온도)로 한 물욕조 안에 12시간 유지한다. 그 후, 시험관의 상하를 거꾸로 한 경우에, 용액/공기의 경계면(메니스커스;meniscus)이 용액의 자체 무게로 변형된 경우(용액이 유출된 경우를 포함)에는, 상기 소정 온도에서 하이드로겔은 「졸 상태」라고 정의한다. 한편, 상기 시험관의 상하를 거꾸로 하여도, 상기 용액/공기의 경계면(메니스커스)이 용액의 자체 무게에 의해 변형하지 않는 경우, 상기 하이드로겔은 상기 소정온도에서「겔 상태」이라고 정의한다.

상기 측정에서, 농도가 예를 들어 약 3질량%인 졸 형상의 하이드로겔(용액)을 사용하고, 상술한 「소정 온도」를 서서히(예를 들어 1℃단위로) 상승시켜 「졸 상태」가 「겔 상태」로 전이하는 온도를 구한 경우, 이에 의해 구해진 전이온도를 「졸-겔 전이온도」라고 정의한다(이 때, 「소정 온도」를 예를 들어 1℃단위로 하강시켜, 「겔 상태」가 「졸 상태」로 전이한 온도를 구해도 좋다).

(졸-겔 전이온도)

본 발명에서 「졸 상태」, 「겔 상태」 및 「졸-겔 전이온도」의 정의 및 측정은, 문헌(H.Yoshioka 외, Journal of Macromolecular Science, A31(1), 113(1994))에 기재된 정의 및 방법에 따라, 아래와 같이 구하여도 좋다.

즉, 관측주파수 1Hz에서의 시료의 동적 탄성율을 저온에서 고온으로 서서히 온도를 변화(1℃/1분)시켜 측정하고, 이 시료의 저장탄성율(G′, 탄성항)이 손실탄성율(G″,점성항)을 상회하는 점의 온도를 졸-겔 전이온도라고 한다. 일반적으로, G″＞G′인 상태가 졸이며, G″＜G′인 상태가 겔이라고 정의한다. 이 졸-겔 전이온도의 측정시에, 아래의 측정조건을 적절하게 사용할 수 있다.

<동적·손실탄성율의 측정조건>

측정기기(상품명): 스트레스 제어식 유량계(rheometer) CSL700, Carri-Med사 제품

시료용액(내지 분산액)의 농도(단, 「졸-겔 전이온도를 가지는 고분자 화합물」 의 농도로서) : 10(중량) %

시료용액의 양 : 약 0.8g

측정용 셀의 형상·칫수: 아크릴제 평행원반(직경 4.0cm), 갭 600㎛

측정주파수 : 1Hz

적용스트레스: 선형 영역 내

(적절한 졸-겔 전이온도)

본 발명에서, 세포나 생체 조직의 열적 손상을 방지한다는 점에서는, 상기 졸-겔 전이온도가 0℃보다 높고, 45℃이하인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0℃보다 높고 42℃이하(특히, 4℃이상 40℃이하인)인 것이 좋다.

이와 같은 적절한 졸-겔 전이온도를 가지는 하이드로겔은, 후술하는 바와 같은 구체적인 화합물 중에서, 상술한 스크리닝(screening) 방법(졸-겔 전이온도 측정법)에 따라 쉽게 선택할 수 있다. 본 발명의 재생용 재료를 사용하여 생물체 조직·장기를 재생시키는 일련의 조작에서는, 상술한 졸-겔 전이온도(a℃)를 생물체 조직·장기재생시의 온도(b℃)와 생물체 조직·장기의 결손부로 주입하기 위한 냉각시의 온도(c℃) 사이에서 설정하는 것이 바람직하다. 즉, 상술한 3 종류의 온도 a℃, b℃ 및 c℃는 b＞a＞c의 관계에 있는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, (b-a)는 1~40℃, 더욱 바람직하게는 2~30℃인 것이 좋고, 또한 (a-c)는 1~40℃, 더욱 바람직하게는 2~30℃인 것이 좋다.

(재생용 재료의 동작에 대한 추종성)

본 발명의 재생용 재료에 근거한 하이드로겔은, 그 생체조직의 재생에 따른 조직의 형태변화에 대한 추종성 균형이라는 점에서, 보다 높은 주파수에 대해서는 고체적인 거동을 나타내고, 다른 한편, 보다 낮은 주파수에 대해서는 액체적인 거동을 나타내는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 이 하이드로겔의 동작에 대한 추종성은 아래의 방법으로 적절하게 측정할 수 있다.

(동작에 대한 추종성의 측정방법)

하이드로겔 형성성 고분자를 포함하는 본 발명의 재생용 재료(하이드로겔로서 1mL)를 졸 상태(졸-겔 전이온도보다 낮은 온도)에서 내직경이 1cm인 시험관에 넣고, 이 재생용 재료의 졸-겔 전이온도보다도 충분히 높은 온도(예를 들어, 이 졸-겔 전이온도보다 약 10℃ 높은 온도)로 한 수욕조 안에서 상기 시험관을 12시간 유지하여, 이 하이드로겔을 겔화한다.

이어서, 이 시험관의 상하를 거꾸로 한 경우에 용액/공기의 경계면(메니스커스)이 용액의 자체 무게로 변형될 때까지의 시간(T)을 측정한다. 여기서 1/T(sec^-1)보다 낮은 주파수의 동작에 대하여 이 하이드로겔은 액체로서 움직이고, 1/T(sec^-1)보다 높은 주파수의 동작에 대하여 이 하이드로겔은 고체로서 움직이게 된다. 본 발명의 하이드로겔의 경우, T는 1분~24시간, 바람직하게는 5분~10시간이다.

(정상 유동 점도)

본 발명의 재생용 재료에 따른 하이드로겔의 겔적 성질은, 정상 유동 점도의 측정에 의해서도 적절하게 측정할 수 있다. 정상 유동 점도η(이타)는 예를 들어, 크리프 (creep) 실험에 의해 측정할 수 있다.

크리프 실험에서는 일정한 전단 응력을 시료에 가하여, 전단 변형의 시간 변화를 관측한다. 일반적으로 점탄성체의 크리프 거동에서는, 초기에 전단 속도가 시간과 함께 변화하지만, 그 후 전단 속도가 일정해진다. 이 때의 전단 응력과 전단 속도의 비를 정상 유동점도(η)라고 정의한다. 이 정상 유동 점도는 뉴튼 점도라고 부르는 경우도 있다. 단, 여기서 정상 유동 점도는 전단 응력에 거의 의존하지 않는 선형 영역안에서 결정한다.

구체적인 측정방법은, 측정장치로서 스트레스 제어식 점탄성 측정장치 CSL형 유량계(CSL500, 미국 Carri-Med사 제품)를, 측정 디바이스에 아크릴제 원반(직경 4cm)을 사용하고, 시료 두께를 600㎛로 하여 적어도 5분 이상의 측정시간 동안 크리프 거동(지연곡선)을 관측한다. 샘플링 시간은 처음 100초 동안에는 1초에 한 번, 그 후에는 10초에 한번으로 한다.

적용하는 「전단 응력」(스트레스)의 결정에 있어서는, 10초간 전단응력을 부하하여 편이(偏移;굴곡) 각도가 2×10^-3rad 이상 검출되는 최저치로 설정한다. 해석에는 5분 이후의 적어도 20 이상의 측정치를 채용한다. 본 발명의 재생용 재료에 따른 하이드로겔은 그 졸-겔 전이온도보다 약 10℃ 높은 온도에서, η가 5×10³~5×10⁶Pa·sec인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 8×10³~2×10⁶Pa·sec, 특히 1×10⁴Pa·sec이상, 1×10⁶Pa·sec이하인 것이 바람직하다.

상기 η가 5×10³Pa·sec미만에서는 단시간의 관측으로도 유동성이 비교적 높아져, 겔에 의한 조직이나 장기 결손부로의 배치 내지 체류가 불충분해지기 쉬워, 재생용 재료로서 기능하기 어려워지는 경향이 있다. 한편, η가 5×10⁶Pa·sec를 넘으면, 장시간의 관측으로도 겔이 유동성을 거의 나타내지 않게 되는 경향이 강하여, 생물체 조직의 재생에 따른 움직임에 추종하기가 더욱 어려워진다. 또한, η가 5×10⁶Pa ·sec를 넘으면 겔이 물러질 가능성이 높아져, 약간의 순탄성 변형 후, 한번에 무르게 파괴되는 취성 파괴가 일어나기 쉬운 경향이 강해진다.

(동적 탄성율)

본 발명의 재생용 재료에 따른 하이드로겔의 겔적 성질은, 동적 탄성율에 의해서도 적절하게 측정할 수 있다. 이 겔에 진폭 γ₀, 진동수를 ω/2π로 하는 변형 γ(t)=γ₀cosωt(t는 시간)을 주었을 때, 일정 응력을 σ₀, 위상차를 δ로 하는 σ(t)=σ₀cos(ωt+δ)가 얻어졌다고 한다. ｜G｜=σ₀/γ₀으로 하면, 동적탄성율 G′(ω)=｜G｜cosδ와, 손실탄성율 G″(ω)=｜G｜sinδ의 비(G″/G′)가 겔적 성질을 나타내는 지표가 된다.

본 발명의 재생용 재료에 따른 하이드로겔은, ω/2π=1Hz의 변형(빠른 동작에 대응한다)에 대해서는 고체로서 거동하며, ω/2π=10^-4Hz의 변형(느린 동작에 대응한다)에 대해서는 액체로서 거동한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 재생용 재료에 따른 하이드로겔은, 아래의 성질을 나타내는 것이 바람직하다(이와 같은 탄성율 측정에 대한 상세한 것은 예를 들어, 문헌 고다 요시히라 외 편집, 근대공업화학19, 359페이지, 아사쿠라서점, 1985를 참조할 수 있다).

ω/2π=1Hz(겔이 고체로서 거동하는 진동수)일 때, (G″/G′)_S=(tanδ)_S가 1미만인 것이 바람직하다. 이 (G″/G′)_S=(tanδ)_S는 보다 바람직하게는 0.8이하, 특히 바람직하게는 0.5이하가 좋다.

ω/2π=10^-4Hz(겔이 액체로서 거동하는 진동수)일 때, (G″/G′)_L=(tanδ)_L가 1 이상인 것이 바람직하다. 이 (G″/G′)_L=(tanδ)_L는 보다 바람직하게는 1.5이상, 특히 바람직하게는 2이상이 좋다.

상기 (tanδ)_S와 (tanδ)_L의 비{(tanδ)_S/(tanδ)_L}이 1 미만인 것이 바람직하다. 이 비{(tanδ)_S/(tanδ)_L}은 보다 바람직하게는 0.8이하, 특히 바람직하게는 0.5이하가 좋다.

<측정조건>

하이드로겔 형성성 고분자(재생용 재료)의 농도: 약 8질량 %

온도: 재생용 재료의 졸-겔 전이온도보다 약 10℃ 높은 온도

측정기기: 스트레스 제어식 유량계(기기명: CSL 500, 미국 Carri-Med사 제품)

(생체내 잔존성의 제어)

본 발명의 하이드로겔은 필요에 따라, 생체 내(복강내, 피하 등)에서의 잔존성을 임의로 제어할 수 있다.

본 발명의 하이드로겔의 졸-겔 전이온도를 저하시키면, 하이드로겔은 생체내에서 장기간 잔존하게 되고, 졸-겔 전이온도를 상승시키면 생체내에서 하이드로겔의 소실이 빨라진다. 또한, 하이드로겔 안의 하이드로겔 형성성 고분자의 농도를 높이면, 하이드로겔은 생체내에서 장기간 잔존하게 되며, 하이드로겔 안의 하이드로겔 형성성 고분자의 농도를 저하시키면, 생체내에서 하이드로겔의 소실이 빨라진다.

본 발명의 하이드로겔에서는 본 발명의 하이드로겔의 졸-겔 전이온도를 저하시키면, 생체온도(37℃)에서의 하이드로겔의 저장탄성율(G′)이 상승한다. 또한, 하이드로겔 안의 하이드로겔 형성성 고분자의 농도를 높이면, 생체온도(37℃)에서의 하이드로겔의 저장탄성율(G″)이 상승한다. 즉, 생체내에서의 잔존성을 제어하기 위해서는, 37℃에서의 G′를 제어하면 좋다.

이 G′를 측정할 때는, 아래의 측정조건을 적절히 사용할 수 있다.

<동적·손실탄성율의 측정조건>

측정기기(상품명): 스트레스 제어식 유량계 CSL 500, Carri-Med사 제품

시료용액의 양 : 약 0.8g

측정주파수 : 1Hz

적용스트레스: 선형 영역 내

본 발명의 하이드로겔의 생체내에서의 잔존기간과 G′의 관계는 생체내의 부위에 따라서도 다르기 때문에 일률적으로 말할 수는 없지만, 예를 들어 복강내에서의 잔존기간과, 관측 주파수 1Hz에서의 G′의 관계는 본 발명자들이 아는 바에 따르면, 아래와 같다.

즉, 3일 이내에 소실시키기 위한 G′의 바람직한 범위는 10~500Pa, 3일 이상 잔존하고 14일 이내에 소실시키기 위한 G′의 바람직한 범위는 200~1500Pa, 14일 이상 잔존시키기 위한 G′의 바람직한 범위는 400~10000Pa이다.

(섬유아세포의 증식성)

본 발명에서, 재생용 재료를 구성하는 하이드로겔 형성성 고분자에 근거한 하이드로겔에서는, 이 겔 안에서 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않는다. 섬유아세포는 통상 세포배양 티슈(플레이트) 위의 단층 배양이나 콜라겐겔 안에서의 배양에서, 섬유아세포에 특징적인 나뭇가지 형상의 형태변화를 동반한 현저한 증식이 확인된다(예를 들어, 에노키나미 준페이 문헌 :배양세포를 사용하는 방법. 와타나베 메이지 편, 세포외 매트릭스, 메티칼 리뷰사). 이에 대하여, 본 발명의 하이드로겔 안에서는, 섬유아세포는 구(球)형상의 형태를 유지한 채 실질적으로 증식을 나타내지 않는다.

(섬유아세포 증식억제의 추정 메카니즘)

본 발명의 조직·장기재생용 재료에 있어서, 섬유아세포의 증식이 억제되는 메카니즘은 반드시 명확하지 않지만, 본 발명자가 아는 바에 따르면, 아래와 같이 추정할 수 있다.

즉, 섬유아세포는 단층배양, 즉 지지체 표면을 인식하여 접착함으로써 2차원적으로 활발하게 증식하는 성질을 가진다. 콜라겐겔의 구조는 길이 300nm, 직경 1.5nm의 콜라겐 분자(분자량 30만)가 다수 집합하여, 규칙적으로 배열되어 섬유 상태(collagen fibril)가 되어 수중에 그물망 구조를 만든 것이다. 이 그물망 구조는가시광의 파장보다 큰 구조(400nm이상)이기 때문에, 콜라겐겔은 통상 뿌옇게 보인다. 콜라겐겔은 3차원 배양담체로서 이용되고 있지만, 섬유아세포는 이 두꺼운 콜라겐 섬유(collagen fibril)의 표면을 지지체로 인식하여 접착하기 때문에, 콜라겐겔 안에서 2차원적으로 현저하게 증식성을 나타낸다고 추정된다.

이에 대하여, 본 발명의 조직·장기 재생용 재료는 하이드로겔 형성성 고분자가 분자상태에서 3차원 그물망 구조를 형성한 하이드로겔이 되기 때문에, 그 구조의 불균질성은 가시광의 파장보다 작고 비교적 투명성이 높다. 따라서, 본 발명의 재료중에서는 섬유아세포가 명확한 2차원적 지지체 표면을 인식하지 않고, 그 결과 본 발명의 재료중에는 섬유아세포가 과잉 증식하는 것이 억제된다고 추정된다.

(섬유아세포의 증식성 평가)

섬유아세포의 증식성은 아래의 방법에 따라 평가할 수 있다(이 방법에 대한 상세한 내용은, 예를 들어 요시가와 다케시, 츠키가와 켄, 성마리안나 의과대학 잡지, 제28권, 제4호, 161-170(2000)을 참조할 수 있다).

본 발명의 조직·장기재생용 재료를 구성하는 하이드로겔 형성성 고분자를 배양액, 예를 들어 RPMI-1640(Life Technologies, N.Y., USA)에 저온(예를 들어, 4℃)하에서 교반용해하여, 정상인의 폐섬유아세포(Normal Human Lung Fibro blasts, NHLF, 다카라슈조(주) 제품)를 6×10⁴개/ml의 세포밀도가 되도록 분산시킨다. 이 NHLF 분산액 0.2mL를 24 웰-플레이트(재료: 플라스틱제, 웰 1개의 크기는 세로15mm, 가로15mm, 깊이 20mm정도, 시판품으로는 예를 들어 Becton-Dickinson사 제품의 상품명: Multiwell)의 각 웰 안에 주입하여, 37℃에서 겔화시킨 후, 배양액 0.4mL를 첨가하여 37℃, 5% CO₂대기압하에서 배양한다. 섬유아세포의 증식 모습은 시간이 지남에 따라(예를 들어, 0, 1, 3, 7일) 위상차 현미경에 의한 관찰로 확인한다.

(섬유아세포의 증식율)

더욱이, 아래의 효소활성을 이용하는 방법에 의해, 배양기간 중의 섬유아세포의 증식율을 측정하는 것이 가능하다.

예를 들어, 상술한 바와 같이 24 웰-플레이트를 사용하여, 본 발명의 조직·장기재생용 재료 중에서 섬유아세포를 소정 기간 배양한 후, 이 재생용 재료를 그 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도(예를 들어, 졸-겔 전이온도보다 10℃낮은 온도)로 떨어뜨림으로써 이 재생용 재료를 용해하고, 이어서 각 웰 안에 호박산 탈수소효소 활성측정용 시약인 WST-8 시약(도진 카가쿠 가부시키가이샤 제품) 50㎕를 첨가한다.

이 24 웰-플레이트를 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도(예를 들어, 졸-겔 전이온도보다 10℃낮은 온도, 예를 들어, 10℃)에서 10시간 반응시킨 후, 약 4℃로 1시간 유지하여 완전히 균일한 수용액 상태로 한다. 이 수용액을 96 웰-플레이트에 200㎕씩 나누어 주입하고, 마이크로플레이트용 비색계(比色計)를 사용하여 450nm(참조파장 620nm)에서 흡광도(OD(450))를 측정한다. 이 OD(450)와 살아 있는 세포수는 비례 관계에 있는 것이 확실시되고 있다(예를 들어, 문헌 Furukawa, T.외, "High in vitro-in vitro correlation of drug response using spongegel-supported three-dimensional histoculture and MTT end point", Int. J. Cancer 51:489, 1992을 참조). 즉, 섬유아세포의 증식율은 배양개시시의 흡광도 OD_f=(OD(450))와 배양후의 흡광도 OD_L=(OD(450))의 비 (OD_L/OD_f)에 의해 구할 수 있다.

본 발명에서 3일간 37℃에서 배양한 후의 섬유아세포의 증식율 P_F=(OD_L/OD_f)은 70%에서 200%의 범위인 것이 바람직하다. 이 증식율 (OD_L/OD_f)은, 또한 80%에서 150%의 범위, 특히 90%에서 120%의 범위인 것이 바람직하다.

(섬유아세포의 상대적인 증식성)

본 발명에서, 하이드로겔 형성성 고분자에 기인하여 겔 안에서, 섬유아세포의 증식은 억제되는 한편, 목적으로 하는(섬유아세포 이외의) 세포의 증식은, 상대적으로 억제되지 않는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 목적으로 하는 세포의 증식율(P_T)과, 상술한 섬유아세포의 증식율(P_F)의 비(P_T/P_F)는 1.1 이상인 것이 바람직하다. 더욱이, 이 비 (P_T/P_F)는 1.5 이상, 특히 2.0 이상인 것이 바람직하다. 이 목적으로 하는 세포의 증식율 P_T는 아래와 같이 하여 구할 수 있다.

상술한 섬유아세포의 증식율(P_F) 측정에서 정상인의 폐섬유아세포(NHLF) 대신에, 사람의 대장암 세포(SW-948, 상품명:대장선암세포주, 다이니혼세이야쿠 가부시키가이샤 제품)를 사용하는 것 이외에는, 상기 증식율(P_F) 측정과 마찬가지로 하여, 섬유아세포 이외의 세포의 증식율(P_F)을 구한다(이 증식율 P_T및 P_F측정은, 마찬가지 조건하에서 행한다).

상술한 바와 같이 측정한 증식율 P_T및 P_F값에 따라, 이들의 비(P_T/P_F)를 구한다.

(하이드로겔 형성성 고분자)

상술한 바와 같은 열가역적인 졸-겔 전이를 나타내는 한(즉, 졸-겔 전이온도를 가지는 한), 본 발명의 재생용 재료에 사용가능한 하이드로겔 형성성 고분자는 특히 제한되지 않는다. 생리적 온도(0~42℃)에서 적절한 졸-겔 변화를 나타내는 것이 쉽다는 점에서는, 예를 들어 상기 하이드로겔 형성성 고분자 안의 담점을 가지는 복수의 블록과 친수성 블록의 담점, 두 블록의 조성 및 두 블록의 소수성도, 친수성도 및/또는 분자량 등을 각각 조정함으로써, 적절한 졸-겔 전이온도를 달성하는 것이 바람직하다.

이 수용액이 졸-겔 전이온도를 가지고, 이 전이온도보다 낮은 온도에서 가역적으로 졸상태를 나타내는 고분자의 구체예로서는, 예를 들어 폴리플로필렌옥사이드와 폴리에틸렌옥사이드의 블록 공중합체 등으로 대표되는 폴리알킬렌옥사이드 (polyalkyleneoxide) 블록 공중합체; 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 에테르(ether)화 셀루로오스; 키토산 유도체(K.R. Holme. et al. Macromolecules, 24, 3828(1991)) 등이 알려져 있다.

폴리알킬렌옥사이드 블록 공중합체로서, 폴리프로필렌옥사이드(polypro pyleneoxide)의 양단에 폴리에틸렌옥사이드가 결합된 플루로닉(Pluronic) F-127(상품명, BASF Wyandotte Chemicals Co. 제) 겔이 개발되고 있다. 이 플루로닉 F-127의 고농도 수용액은 약 20℃ 이상에서 하이드로겔이 되며, 이보다 낮은 온도에서 수용액이 되는 것으로 알려져 있다. 하지만, 이 재료의 경우에는 약 20질량 %이상의 고농도에서만 겔 상태로 되지는 않고, 또한 약 20질량% 이상의 고농도에서 겔화 온도보다 높은 온도로 유지하여도, 더욱이 물을 더하면 겔이 용해되어 버린다. 또한, 플루로닉 F-127은 분자량이 비교적 작고, 약 20질량 % 이상의 고도의 겔 상태에서 매우 높은 침투압을 나타낼 뿐만 아니라, 세포막을 쉽게 투과하기 때문에, 생체의 조직·장기에 악영향을 줄 가능성이 있다.

한편, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등으로 대표되는 에테르화 셀룰로오스의 경우에는, 통상은 졸-겔 전이온도가 높고 약 45℃이상이다(N. Sarkar, J.Appl. Polym. Science,24, 1073, 1979). 이에 대하여 생체의 체온은 통상 37℃ 부근의 온도이기 때문에, 상기 에테르화 셀룰로오스는 졸상태이며, 이 에테르화 셀루로오스를 조직·장기의 재생용 재료로서 사용하는 것은 사실상 곤란하다.

상기와 같이, 그 수용액이 졸-겔 전이점을 가지며, 이 전이온도보다 낮은 온도에서 가역적으로 졸상태를 나타내는 종래 고분자의 문제점은 1) 졸-겔 전이온도보다 높은 온도에서 일단 겔화하여도, 더욱이 물을 첨가하면 겔이 용해해버리는 것, 2) 졸-겔 전이온도가 생체의 체온(37℃ 부근)보다도 높고, 체온에서는 졸 상태인 것, 3) 겔화시키기 위해서는, 수용액의 고분자 농도를 매우 높일 필요가 있는 것 등이다.

이에 대하여, 본 발명자들의 검토에 따르면, 바람직하게는 0℃보다 높고 42℃이하인 졸-겔 전이온도를 가지는 하이드로겔 형성성 고분자(예를 들어, 담점을 가지는 복수의 블록과 친수성 블록이 결합하여 이루어지고, 그 수용액이 졸-겔 전이온도를 가지며, 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도에서 가역적으로 졸 상태를 나타내는 고분자)를 사용하여 본 발명의 재생용 재료를 구성한 경우, 상기 문제는 해결되는 것으로 판명되고 있다.

(적절한 하이드로겔 형성성 고분자)

본 발명의 재생용 재료로서 적절하게 사용할 수 있는 소수 결합을 이용한 하이드로겔 형성성 고분자는, 담점을 가지는 복수의 블록과 친수성 블록이 결합하여 이루어지는 것이 바람직하다. 이 친수성 블록은 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도에서 상기 하이드로겔이 수용성이 되기 위하여 존재하는 것이 바람직하고, 또한 담점을 가지는 복수의 블록은 하이드로겔이 졸-겔 전이온도보다 높은 온도에서 겔 상태로 변화하기 위하여 존재하는 것이 바람직하다. 바꿔말하면, 담점을 가지는 블록은 이 담점보다 낮은 온도에서는 물에 용해하고, 이 담점보다 높은 온도에서는 물에 불용성으로 변화하기 때문에, 담점보다 높은 온도에서, 상기 블록은 겔을 형성하기 위한 소수 결합으로 이루어지는 가교점으로서의 역할을 한다. 즉, 소수성 결합에 유래하는 담점이 상기 하이드로겔의 졸-겔 전이온도에 대응한다.

단, 이 담점과 졸-겔 전이온도는 반드시 일치하지 않아도 된다. 이것은 상술한 「담점을 가지는 블록」의 담점은 일반적으로 이 블록과 친수성 블록의 결합에 의해 영향을 받기 때문이다.

본 발명에 사용하는 하이드로겔은 소수성 결합이 온도의 상승과 함께 강해질 뿐만 아니라, 그 변화가 온도에 대하여 가역적이라는 성질을 이용한 것이다. 1 분자 안에 복수개의 가교점이 형성되어, 안정성이 뛰어난 겔이 형성된다는 점에서는, 하이드로겔 형성성 고분자가 「담점을 가지는 블록」을 복수개 가지는 것이 바람직하다.

한편, 상술한 하이드로겔 형성성 고분자 안의 친수성 블록은, 상술한 바와 같이, 상기 하이드로겔 형성성 고분자가 졸-겔 전이온도보다도 낮은 온도에서 수용성으로 변화시키는 기능을 가지며, 상기 전이온도보다 높은 온도에서 소수성 결합력이 지나치게 증대되어 상기 하이드로겔이 응집 침전해버리는 것을 방지하면서, 함수(含水)겔의 상태를 형성시키는 기능을 가진다.

더욱이 본 발명에서 사용하는 하이드로겔은, 생체 내에서 분해, 흡수되는 것인 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자가 생체 내에서 가수분해 반응이나 효소반응에 의해 분해되어, 생체에 무해한 저분자량체가 되어 흡수, 배설되는 것이 바람직하다. 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자가 담점을 가지는 복수의 블록과 친수성 블록이 결합하여 이루어진 것인 경우에는, 담점을 가지는 블록과 친수성 블록의 적어도 어느 한 쪽, 바람직하게는 양 쪽 모두가 생채 내에서 분해, 흡수되는 것인 것이 바람직하다.

(담점을 가지는 복수의 블록)

담점을 가지는 블록으로는, 물에 대한 용해도-온도계수가 음을 나타내는 고분자 블록인 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는 폴리프로필렌옥사이드, 프로필렌옥사이드와 다른 알킬렌옥사이드와의 공중합체, 폴리 N-치환 아크릴아미드 유도체, 폴리 N-치환 메타아크릴아미드 유도체, N-치환 아크릴아미드 유도체와 N-치환 메타아크릴아미드 유도체와의 공중합체, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐알코올 부분 초화물로 이루어지는 군에서 선택되는 고분자를 바람직하게 사용할 수 있다.

담점을 가지는 블록을 생체 내에서 분해, 흡수되는 것으로 하기 위해서는, 담점을 가지는 블록을 소수성 아미노산과 친수성 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로 하는 것이 효과적이다. 혹은 폴리유산이나 폴리글리콜산 등의 폴리에스테르형 생분해성 폴리머를 생체 내에서 분해, 흡수되는 담점을 가지는 블록으로서 이용할 수 있다.

상기 고분자(담점을 가지는 블록)의 담점이 4℃보다 높고 40℃이하인 것이, 본 발명에서 사용하는 고분자(담점을 가지는 복수의 블록과 친수성 블록이 결합한 화합물)의 졸-겔 전이온도를 4℃보다 높고 40℃이하로 한다는 점에서 바람직하다.

여기서 담점의 측정은 예를 들어, 상기 고분자(담점을 가지는 블록)의 약 1 질량%의 수용액을 냉각하여 투명한 균일 용액으로 한 후, 서서히 온도를 상승시켜(온도 상승 속도 1℃/min), 이 용액이 처음으로 뿌옇게 되는 점을 담점으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 폴리 N-치환 아크릴아미드 유도체, 폴리 N-치환 메타아크릴아미드 유도체의 구체적인 예를 아래에 열거한다.

폴리-N-아크로일피페리딘; 폴리-N-n-프로필메타아크릴아미드; 폴리-N-이소프로필아크릴아미드; 폴리-N,N-디에틸아크릴아미드; 폴리-N-이소프로필메타아크릴아미드; 폴리-N-시클로프로필아크릴아미드; 폴리-N-아크릴로일피롤리딘(acryloyl pyrrolidine); 폴리-N,N-에틸메틸아크릴아미드; 폴리-N-시클로프로필메타아크릴아미드; 폴리-N-에틸아크릴아미드.

상기 고분자는 단독중합체(호모폴리머)여도, 상기 중합체를 구성하는 단량체(單量體)와 다른 단량체의 공중합체여도 좋다. 이와 같은 공중합체를 구성하는 다른 단량체로서는, 친수성 단량체, 소수성 단량체 모두 사용할 수 있다. 일반적으로는, 친수성 단량체와 공중합하면 생성물의 담점이 상승하고, 소수성 단량체와 공중합하면 생성물의 담점이 하강한다. 따라서, 이 공중합해야 할 단량체를 선택함으로써, 원하는 담점(예를 들어, 4℃보다 높고 40℃이하인 담점)을 가지는 고분자를 얻을 수 있다.

(친수성 단량체)

상기 친수성 단량체로서는, N-비닐피롤리돈(vinylpyrrolidone), 비닐피리딘, 아크릴아미드, 메타아크릴아미드, N-메틸아크릴아미드, 히드록시에틸메타아크릴레이트, 히드록시에틸아크릴레이트, 히드록시메틸메타아크릴레이트, 히드록시메틸아크릴레이트, 산성기를 가지는 아크릴산, 메타아크릴산 및 이들의 염, 비닐술폰산, 스티렌술폰(styrene sulfone)산 등, 및 염기성기를 가지는 N,N-디메틸아미노에틸메타크릴레이트, N,N-디에틸아미노에틸메타크릴레이트, N,N-디메틸아미노프로필아크릴아미드 및 이들의 염 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.

(소수성 단량체)

한편, 상기 소수성 단량체로서는, 에틸아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트, 글리시딜메타크릴레이트 등의 아크릴레이트 유도체 및 메타크릴레이트 유도체, N-n-부틸메타아크릴아미드 등의 N-치환 알킬메타아크릴아미드 유도체, 염화비닐, 아크릴로니트릴(acrylonitrile), 스티렌(tyrene), 초산비닐 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.

(친수성 블록)

한편, 상술한 담점을 가지는 블록과 결합해야 할 친수성 블록으로서 구체적으로는, 메틸셀룰로오스, 덱스트란(dextran), 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알코올, 폴리N-비닐피롤리든, 폴리비닐피리딘, 폴리아크릴아미드, 폴리메타아크릴아미드, 폴리N-메틸아크릴아미드, 폴리히드록시메틸아크릴레이트, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리비닐술폰산, 폴리스티렌술폰산 및 이들의 염; 폴리N,N-디메틸아미노에틸메타크릴레이트, 폴리N,N-디에틸아미노에틸메타크릴레이트, 폴리N,N-디메틸아미노프로필아크릴아미드 및 이들의 염 등을 들 수 있다.

또한, 친수성 블록은 생체 내에서 분해, 대사, 배설되는 것이 바람직하다. 상기 블록으로서는, 예를 들어, 알부민, 젤라틴 등의 단백질, 히알루론산 (hyaluronic acid), 헤파린(heparin), 키틴(chitin), 키토산 등의 다당류 등의 친수성 생체고분자가 적절하게 사용가능하다.

(블록의 결합)

담점을 가지는 블록과 상기 친수성 블록을 결합하는 방법은 특별히 제한되지않지만, 예를 들어 이 블록들을 가지는 블록 공중합체, 그래프트(grafting) 공중 합체 또는 덴드리머(dendrimers)형 공중합체로서 얻는 것이 바람직하다.

담점을 가지는 블록과 친수성 블록의 결합은, 상기 어느 한 블록 중에 중합성 관능기(예를 들어, 아크릴로일(acryloyl)기)를 도입하고, 다른 쪽 블록을 부여하는 단량체를, 이와 같이 중합성 관능기를 도입한 블록과 공중합시킴으로써 행할 수 있다. 또한, 담점을 가지는 블록과 상기 친수성 블록의 결합물은, 담점을 가지는 블록을 부여하는 단량체와, 친수성 블록을 부여하는 단량체의 블록 공중합에 의해 얻을 수도 있다. 또한, 담점을 가지는 블록과 친수성 블록의 결합은 미리 양자에 반응활성의 관능기(예를 들어, 수산기, 아미노기, 카르복실기, 이소시아네이트기 등)를 도입하고, 양자를 화학반응에 의해 결합시킴으로써 행할 수도 있다. 이 때, 친수성 블록 중에는 통상, 반응활성의 관능기를 복수개 도입한다.

또한, 담점을 가지는 폴리프로필렌옥사이드와 친수성 블록의 결합에 관해서는, 예를 들어, 아니온(anion) 중합 또는 카티온(cation) 중합으로, 프로필렌옥사이드와 「다른 친수성 블록」을 구성하는 모노머(예를 들어, 에틸렌옥사이드)를 반복 차례로 중합시킴으로써, 폴리프로필렌옥사이드와 「친수성 블록」(예를 들어, 폴리에틸렌옥사이드)이 결합한 블록 공중합체를 얻을 수 있다. 이와 같은 블록 공중합체는, 폴리프로필렌옥사이드의 말단에 중합성 기(예를 들어, 아크릴로일기)를 도입한 후, 친수성 블록을 구성하는 모노머를 공중합시킴으로써도 얻을 수 있다. 더욱이, 친수성 블록 안에, 폴리프로필렌옥사이드 말단의 관능기(예를 들어, 수산기)와 결합반응할 수 있는 관능기를 도입하여, 양자를 반응시킴으로써도, 본 발명에 사용하는 고분자를 얻을 수 있다. 또한, 폴리프로필렌글리콜의 양끝에 폴리에틸렌글리콜이 결합한, 플루로닉 F-127(상품명, 아사히덴카고교 가부시키가이샤 제품) 등의 재료를 연결시킴으로써도, 본 발명에서 사용하는 하이드로겔 형성성 고분자를 얻을 수 있다.

이 담점을 가지는 블록을 포함하는 태양에서의 본 발명의 고분자는, 담점보다 낮은 온도에서는, 분자 안에 존재하는 상기 「담점을 가지는 블록」이 친수성 블록과 함께 수용성이기 때문에, 완전히 물에 용해하여 졸 상태를 나타낸다. 하지만, 이 고분자 수용액의 온도를 상기 담점보다 높은 온도로 가열하면, 분자 안에 존재하는 「담점을 가지는 블록」이 소수성이 되어, 소수적 상호 작용에 의해, 별개의 분자 사이에서 회합한다.

한편, 친수성 블록은 이 때(담점보다 높은 온도로 가열되었을 때)에도 수용성이기 때문에, 본 발명의 고분자는 수중에서, 담점을 가지는 블록간의 소수성 회합부를 가교점으로 한 3차원 그물망 구조를 가지는 하이드로겔을 생성한다. 이 하이드로겔의 온도를 다시, 분자 안에 존재하는 「담점을 가지는 블록」의 담점보다 낮은 온도로 냉각하면, 상기 담점을 가지는 블록이 수용성이 되고, 소수성 회합에 의한 가교점이 해방되어, 하이드로겔 구조가 소실되고, 본 발명의 고분자는 다시 완전한 수용액이 된다. 이와 같이, 바람직한 태양에서의 본 발명의 고분자의 졸-겔 전이는, 분자안에 존재하는 담점을 가지는 블록의 상기 담점에서의 가역적인 친수성, 소수성의 변화에 따른 것이기 때문에, 온도변화에 대응하여, 완전한 가역성을 가진다.

(겔의 용해성)

상술한 바와 같이 수용액 중에서 졸-겔 전이 온도를 가지는 고분자를 적어도 포함하는 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자는, 상기 졸-겔 전이온도보다 높은 온도(d℃)에서 실질적으로 수불용성을 나타내고, 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도(e℃)에서 가역적으로 수가용성을 나타낸다.

상술한 높은 온도(d℃)는 졸-겔 전이 온도보다 1℃이상 높은 온도인 것이 바람직하다. 2℃ 이상(특히 5℃이상) 높은 온도인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 「실질적으로 수불용성」이라는 것은, 상기 온도(d℃)에서 물 100mL에 용해하는 상기 고분자의 양이 5.0g 이하(더욱이 0.5g이하, 특히 0.1g이하)인 것이 바람직하다.

한편, 상술한 낮은 온도(e℃)는 졸-겔 전이 온도보다(절대치로) 1℃ 이상 낮은 온도인 것이 바람직하고, 2℃ 이상(특히, 5℃이상) 낮은 온도인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 「수가용성」이란, 상기 온도(e℃)에서, 물 100mL에 용해하는 상기 고분자의 양이 0.5g 이상(더욱이 1.0g이상)인 것이 바람직하다. 또한, 「가역적으로 수가용성을 나타낸다」라는 것은, 상기 하이드로겔 형성성 고분자의 수용액이, 일단(졸-겔 전이온도보다 높은 온도에서) 겔화된 후에도, 졸-겔 전이온도보다 낮은 온도에서는, 상술한 수가용성을 나타내는 것을 말한다.

상기 고분자는 그 10% 수용액이 5℃에서, 10~3,000mPa·s(10~3,000센티포이즈(centipoise)), 더욱이 50~1,000mPa·s(50~1,000센티포이즈)의 점도를 나타내는 것이 바람직하다. 이와 같은 점도는, 예를 들어 아래와 같은 측정 조건에서 측정하는 것이 바람직하다.

점도계: 스트레스 제어식 유량계(기종명: CSL 500, 미국 Carri-Med사 제품)

로터 직경: 60mm

로터 형상: 평행 평판

측정주파수 : 1 Hz(헤르츠)

본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자의 수용액은, 상기 졸-겔 전이온도보다 높은 온도에서 겔화시킨 후, 다량의 물 속에 침지하여도, 상기 겔은 실질적으로 용해하지 않는다. 상기 재생용 재료의 상기 특성은, 예를 들어, 아래와 같이 하여 확인할 수 있다.

즉, 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자 0.15g을 상기 졸-겔 전이 온도보다 낮은 온도(예를 들어, 빙냉하)에서, 증류수 1.35g에 용해하여 10W%의 수용액을 제작하고, 이 수용액을 직경이 35mm인 플라스틱 샬레 안에 주입하여, 37℃로 가열함으로써, 두께 약 1.5mm의 겔을 상기 샬레 안에 형성시킨 후, 이 겔을 포함하는 샬레 전체의 질량(f 그램)을 측정한다. 이어서, 이 겔을 포함하는 샬레 전체를 250mL 의 수중에 37℃에서 10시간 정치한 후, 이 겔을 포함하는 샬레 전체의 질량(g 그램)을 측정하여, 겔 표면에서부터 상기 겔이 용해했는지 여부를 평가한다. 이 때, 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자에서는, 상기 겔의 질량감소율, 즉 (f-g)/f가 5.0% 이하인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1.0% 이하(특히, 0.1% 이하)인 것이 좋다.

본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자의 수용액은, 상기 졸-겔 전이 온도보다 높은 온도에서 겔화시킨 후, 다량(체적비로, 겔의 0.1~100배 정도)의 물 안에 침지하여도, 장기간에 걸쳐 상기 겔은 용해되지 않는다. 이와 같은 본 발명에서 사용하는 고분자의 성질은 예를 들어, 상기 고분자 안에 담점을 가지는 블록이 2개 이상(복수개) 존재함으로써 달성된다.

이에 대하여, 폴리프로필렌옥사이드의 양 끝에 폴리에틸렌옥사이드가 결합되어 이루어지는 상술한 플루로닉 F-127을 사용하여 마찬가지의 겔을 작성한 경우에는, 수시간의 정치로 상기 겔이 완전히 물에 용해하는 것을 본 발명자들은 발견하였다.

겔화되지 않았을 때의 세포독성을 가능한 한 낮은 레벨로 억제한다는 점에서는, 물에 대한 농도, 즉 {(고분자)/(고분자+물)}×100(%)로, 20%이하(더욱이 15%이하, 특히 10%이하)의 농도에서 겔화가 가능한 하이드로겔 형성성 고분자를 사용하는 것이 바람직하다.

(다른 성분)

본 발명의 재생용 재료는, 상술한 졸-겔 전이온도를 가지는 고분자를 적어도 포함하는 것이지만, 필요에 따라 다른 성분을 포함하고 있어도 좋다. 이와 같은 태양에서의 「다른 성분」으로서는, 예를 들어 항생제, 항암제, 콜라겐, 젤라틴 등의 ECM, 후술하는 국소성 화학중개물질, 인슐린, 세포성장 인자 등의 호르몬류, 외래 유전자 등을 들 수 있다.

더욱이, 전구세포 등의 생체 내의 조직·장기 재생에 직접 기여하는 세포군을 본 발명의 재생용 재료에 미리 포함시킬 수도 있다.

이와 같은 「다른 성분」의 사용량은 소정의 효과를 나타내는 양이면서, 하이드로겔 형성성 고분자에 따른 겔 안에 소정 시간(예를 들어, 세포·조직의 배양에 필요한 시간) 보유 가능한 양이라면, 특별히 제한되지 않는다. 보통은, 하이드로겔 형성성 고분자를 기준(10배)으로 하여, 2배 이하 정도, 더욱이는 1배 이하 정도인 것이 바람직하다.

(화학중개물질)

생체조직의 재생에는, 전구세포 등의 세포뿐만 아니라, 그 분화나 증식을 촉진하는 세포성장인자 등의 여러가지 화학중개물질(chemical mediator)이 필요한 경우가 있다. 이 화학중개물질들은 통상은 세포 자체에서 분비되지만, 재생을 효율적으로 진행하기 위하여 본 발명의 조직·장기재생용 재료에 미리 이 화학중개물질들을 함유시켜 외부로부터 보급하는 것이 효과적이다.

이 화학중개물질로서는, 1) 세포의 매우 근방에서밖에 작용하지 않는 국소성 화학중개물질(local chemical mediator), 2) 신경세포에서 분비되어 유효 작용거리가 매우 짧은 신경전달물질(neurotransmitter), 3) 내분비 세포에서 분비되어 혈류 등을 통하여 전신의 표적세포에 작용하는 호르몬(hormone) 혹은 세포간 정보전달 물질인 세포증식인자 등을 들 수 있다.

상기 1)의 국소성 화학중개물질로서는, 신경세포 성장인자 등의 단백, 주화성(走化性) 인자 등의 펩티드, 히스타민 등의 아미노산 유도체, 프로스타글란딘 (prostaglandin) 등의 지방산 유도체 등을 들 수 있다.

상기 2)의 신경전달 물질로서는, 글리신(glycine) 등의 아미노산, 노르아드레날린, 아세틸콜린, 엔케팔린(Enkephalin)등의 저분자 펩티드 등의 저분자량 물질을 들 수 있다.

상기 3)의 세포증식 인자 혹은 호르몬으로는, 선유아세포 성장인자 (fibroblast growth factor, FGF), 상피세포 성장인자(epithelial growth factor, EGF), 혈관내피 세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 간세포 증식인자(hepatocyte growth factor, HGF) 등의 세포성장 인자, 인슐린, 소마토트로핀(somatotropin), 소마토메딘(somatomedin), 부신피질자극 호르몬(ACTH), 부갑상선 호르몬(PTH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 등의 단백, 또는 당단백, TSH 방출인자, 바소프레신(vasopressin), 소마토스타틴(somatostatin) 등의 아미노산 유도체, 코티솔(cortisol), 에스트라디올(estradiol), 테스토스테론 (testosterone) 등의 스테로이드 등을 들 수 있다.

(겔 안에서의 화학중개물질의 확산)

본 발명의 하이드로겔은, 하이드로겔 안의 화학중개물질의 확산 속도를 임의로 제어할 수 있다. 특히, 친수성 물질과 수소성 물질을 서로 다른 확산 속도로 확산시킬 수 있다. 수용성 친수성 물질의 확산은 하이드로겔 형성성 고분자의 3차원 그물망 구조에 의한 분자 선별 효과에 의해 제어된다. 따라서, 수용성 친수성 물질의 확산속도를 저하시키기 위해서는, 하이드로겔을 구성하는 하이드로겔 형성성 고분자의 농도를 높이면 좋다. 또한, 수용성 친수성 물질의 확산은 그 물질의 분자량에도 의존한다. 하이드로겔을 구성하는 하이드로겔 형성성 고분자의 농도가 일정하면 분자량이 큰 물질일수록 그 확산속도가 느려진다.

본 발명의 하이드로겔 안에서의 수용성 소수성 물질의 확산은, 하이드로겔형성성 고분자의 3차원 그물망 구조에 의한 분자 선별 효과에 더하여, 하이드로겔 형성성 고분자의 소수성 부분으로의 분배에 의해서도 영향을 받으며, 하이드로겔 형성성 고분자 안의 소수성 부분의 비율에 의해서도 제어되기 때문에, 수용성 친수성 물질의 확산보다도 통상 늦어진다.

하이드로겔 안의 용질의 확산계수는 문헌(Eric K.L.Lee, et al, Journal of Membrane Science, 24, 125-143(1985))에 기재된 "early-time" 근사법에 의해 구할 수 있다. 이 방법에서는, 균일한 두께 L(cm)의 하이드로겔 평판 중에 균일하게 분산된 용질이 하이드로겔 평판의 양표면으로부터 용출하는 과정을 시간 경과에 따라 관측한다. 시간 t(sec)에서의 용질의 용출량을 M_t, 무한대 시간후의 용출량을 M_∞이라고 하면, M_t/M_∞＜0.6의 범위에서 용질의 하이드로겔 중의 확산계수 D(cm²/sec)에 대해서 아래의 식 1이 성립한다.

M_t/M_∞=(Dt/π)^1/2×4/L ………(1)

따라서, 경과시간(t)의 제곱근에 대해서, 시간 t까지의 용출율을 따라 그린 직선의 기울기로부터 확산계수(D)를 산출할 수 있다.

여러가지 물질의 보유/확산(내지 방출) 성능의 균형이라는 점에서는, 본 발명의 세포·조직 배양용 담체는, 페놀 레드(phenol red)(PR), 메틸블루(MB), 및 미오글로빈(myoglobin)(MG)의 확산계수의 비가 (D_PR/D_MB)≥2 및 (D_PR/D_MG)≥1.2인 것이 바람직하다. 이들 값의 보다 바람직한 범위는 아래와 같다.

(1) (D_PR/D_MB): 보다 바람직하게는 10이상, 더욱이 20이상, 특히 50이상

바람직하게는 1×10⁵이하, 보다 바람직하게는 1×10⁴이하, 더욱이 1×10³이하,

(2) (D_PR/D_MG): 보다 바람직하게는 1.5이상, 더욱이 3이상, 특히 5이상

바람직하게는 1×10⁴이하, 보다 바람직하게는 1×10³이하, 더욱이 1×10²이하

(콜라겐 등의 경우)

상술한 바와 같이, 종래의 조직·장기 재생용 재료인 콜라겐은 친수성 고분자이고, 본 발명의 하이드로겔에서와 같이, 그 친수성/소수성의 밸런스를 임의로 제어할 수 없으며, 따라서 콜라겐 안의 화학중개물질의 확산속도를 억제하는 것이 어려웠다.

또한, 폴리유산 또는 폴리글리콜산 등의 경우에는, 역으로 소수성이 강하고, 이들 폴리머 안의 화학중개물질의 확산속도를 제어하는 것은 역시 어려웠다.

이에 대하여, 본 발명의 하이드로겔은, 상술한 바와 같이, 친수성/소수성의 밸런스를 실질적으로 임의로 제어할 수 있기 때문에, 본 발명의 겔 안의 화학중개물질의 확산속도도 실질적인 자유도로 제어할 수 있다.

본 발명의 겔을 콜라겐 등의 공지의 겔 형성성 고분자와 함께 사용했을 경우(즉, 겔 형성성 고분자로서, 본 발명에서 사용하는 고분자와 콜라겐 등의 공지의 겔 형성성 고분자가 공존하는 경우)에는, 콜라겐 등의 공지의 겔 형성성 고분자를 함유하는 겔 안에서도, 화학중개물질의 확산속도를 실질적인 자유도에서 제어할 수 있다.

(생체내 조직·장기)

본 발명에서 「생체조직·장기」란, 동물(특히, 사람)의 생체 내부에 있는 조직, 기관, 장기를 말한다. 본 발명의 배양용 재생용 재료에 의해 배양가능한 생체조직·장기는 특히 제한되지 않지만, 예를 들어, 식도, 위, 소장, 대장, 췌장, 간장, 심장, 혈관, 뼈, 연골, 신경, 각막, 진피 등을 예로 들 수 있다.

(조직·장기의 재생방법)

본 발명의 재생용 재료는 섬유아세포의 증식을 억제하고, 원래 세포의 증식이나 분화를 촉진하는 특징을 가지기 때문에, 이와 같은 작용을 필요로 하는 부위에, 특별히 제한없이 적용할 수 있다. 본 발명의 재생용 재료를 적용할 때에는, 일단 액체 상태(졸-겔 전이온도보다 저온)로 함으로써, 적당한 부위에 주입 등에 의해 배치하는 것이 용이해진다. 이 본 발명의 재생용 재료의 배치 방법도, 특히 제한되지 않는다. 또한 본 발명의 재생용 재료는, 졸-겔 전이온도보다도 고온에서 빠르게 겔화하기 때문에, 적용 부위(표면 굴곡이 있는 경우에도)에 밀착시키기가 쉽다.

본 발명의 재생용 재료를, 예를 들어, 생체내의 조직이나 장기의 결손 공간 또는 괴사부(예를 들어, 간장 부분 절제 후의 결손 부위나 연골의 손상 또는 결손부위 또는 심근의 괴사부 등)에 배치 내지 충전함으로써, 결손된 간장이나 연골 혹은 괴사 조직을 재생시킬 수 있다.

본 발명의 재생용 재료를 생체 내의 조직이나 장기의 결손 공간 등에 충전하는 방법으로서, 종래의 콜라겐 스폰지 등과 마찬가지로, 건조상태의 본 발명의 재생용 재료를 상기 결손 공간 등에 보충하는 방법을 사용할 수도 있다. 이 경우에는, 건조 상태의 본 발명의 재생용 재료가 액체를 흡수하여 팽창하여, 상기 결손 공간을 충전하게 된다.

더욱이, 보다 바람직한 방법으로서, 본 발명의 재생용 재료를 수용액 상태로 하여 생체내의 조직이나 장기의 결손공간 혹은 괴사부에 배치 내지 충전하는 방법이 있다. 이 경우에는, 본 발명의 재생용 재료를 그 졸-겔 전이온도보다 저온의 수용액(졸) 상태로 생체 내의 조직이나 장기의 결손 공간 등에 쉽게 주입할 수 있으며, 상기 재료는 그대로 체온(졸-겔 전이온도보다 고온)에서 겔화하기 때문에, 생체 내의 조직이나 장기의 결손 표면과, 본 발명의 재생용 재료 사이에 간격이 생기지 않고 밀착되기 때문에, 다른 조직(섬유아세포에 근거한 조직, 등)의 침투를 보다 확실하게 방지할 수 있다.

(실시예)

아래에 실시예를 나타내어, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하겠지만, 본 발명의 범위는 특허청구의 범위에 의해 한정되는 것이며, 아래의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예 1

폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드 공중합체(프로필렌옥사이드/에틸렌옥사이드 평균 중합도 약 60/180, 아사히덴카고교 가부시키가이샤 제품: 플루로닉 F-127) 10g을 건조 클로로포름 30mL에 용해하고, 오산화인(1g) 공존하, 헥사메틸렌디이소시아네이트 0.13g을 더하여, 비점 환류(沸点還流)하에서 6시간 반응시켰다. 용매를 감압증류한 후, 나머지를 증류수에 용해하고, 분획분자량 3만인 한외여과막(아미콘 PM-30)을 사용하여 한외여과(ultrafiltration)하여, 고분자량 중합체와 저분자량 중합체를 분획하였다. 얻어진 수용액을 동결하여, F-127 고중합체 및 F-127 저중합체를 얻었다.

상기에 의해 얻어진 F-127 고중합체(본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자, TGP-1)를 빙냉하, 8질량 %의 농도로 증류수에 용해하였다. 이 수용액을 천천히 가열해가면, 21℃부터 서서히 점도가 상승하여, 약 27℃에서 고화(固化)하고, 하이드로겔이 되었다. 이 하이드로겔을 냉각하면, 21℃에서 수용액으로 돌아갔다. 이 변화는 가역적으로 반복 관측되었다.

한편, 상기 F-127 저중합체를 빙점하 8질량 %의 농도로 증류수에 용해한 것은, 60℃이상으로 가열하여도 전혀 겔화하지 않았다.

제조예 2

트리메티롤프로판 1몰에 대하여, 에틸렌옥사이드 160몰을 카티온 중합에 의해 부가하여, 평균분자량 약 7000의 폴리에틸렌옥사이드트리올을 얻었다.

상술한 바와 같이 하여 얻은 폴리에틸렌옥사이드트리올 100g을 증류수 1000mL에 용해한 후, 실온에서, 과망간산 칼륨 12g을 서서히 더하여, 그대로 약 1시간 산화반응시켰다. 고형물을 여과에 의해 제거한 후, 생성물을 클로로포름으로 추출하고, 용매(클로로포름)를 감압증류하여 폴리에틸렌옥사이드트리카르복실체90g를 얻었다.

상술한 바와 같이 하여 얻은 폴리에틸렌옥사이드트리카르복실체 10g과, 폴리프로필렌옥사이드디아미노체(프로필렌옥사이드 평균 중합도 약 65, 미국 제퍼슨 케미컬사 제품, 상품명: 제퍼민 D-4000, 담점: 약 9℃) 10g을 사염화탄소 1000ml에 용해하고, 디시클로헥실카르보디이미드 1.2g을 더한 후, 비점 환류하에서 6시간 반응시켰다. 반응액을 냉각하고, 고형물을 여과에 의해 제거한 후, 용매(용매화탄소)를 감압증류하고, 나머지를 진공건조하여, 복수의 폴리프로필렌옥사이드와 폴리에틸렌옥사이드가 결합한 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-2)를 얻었다. 이것을 빙냉하, 5 질량%의 농도로 증류수에 용해하고, 그 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 약 16℃였다.

제조예 3

N-이소프로필아크릴아미드(이스트맨코닥사 제품) 96g, N-아크릴옥시숙신이미드(고쿠산카가쿠 가부시키가이샤 제품) 17g, 및 n-부틸메타크릴레이트(간토카가쿠 가부시키가이샤 제품) 7g을 클로로포름 4000ml에 용해하고, 질소 치환 후, N,N'-아조비스이소부티로니트릴(azobisisobutyronitrile) 1.5g을 더하여, 60℃에서 6시간 중합시켰다. 반응액을 농축한 후, 디에틸에테르에 재침(다시 침전)하였다. 여과에 의해 고형물을 회수한 후, 진공 건조하여, 78g의 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-N-아크릴옥시숙신이미드-코-n-부틸메타크릴레이트)를 얻었다.

상기에 의해 얻은 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-N-아크릴옥시숙신이미드-코-n-부틸메타크릴레이트)에, 과잉 이소프로필아민을 더하여 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-n-부틸메타크릴레이트)를 얻었다. 이 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-n-부틸메타크릴레이트)의 수용액의 담점은 19℃였다.

상술한 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-N-아크릴옥시숙신이미드-코-N-부틸메타크릴레이트) 10g, 및 양 끝단 아미노화 폴리에틸렌옥사이드(분자량 6,000, 카와켄 파인 케미컬 가부시키가이샤 제품) 5g을 클로로포름 1000ml에 용해하고, 50℃에서 3시간 반응시켰다. 실온까지 냉각한 후, 이소프로필아민 1g을 더하여, 1시간 방치한 후, 반응액을 농축하고, 찌꺼기를 디에틸에테르 안에 침전시켰다. 여과에 의해 고형물을 회수한 후, 진공건조하여, 복수의 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-n-부틸메타크릴레이트)와 폴리에틸렌옥사이드가 결합한 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-3)를 얻었다.

이와 같이 하여 얻은 TGP-3을 빙냉하, 5질량%의 농도로 증류수에 용해하여, 그 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 약 21℃였다.

제조예 4

(멸균방법)

상술한 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-3) 2.0g을, EOG(에틸렌옥사이드가스) 멸균 백(호기메디컬사 제품, 상품명: 하이브리드 멸균백)에 넣고, EOG 멸균장치(이지팩, 이우치 세이에이도 제품)로 EOG를 백에 충전하고, 실온에서 하루 밤낮을 방치하였다. 또한 40℃에서 한나절 방치한 후, EOG를 백에서 꺼내, 통기(aeration)시켰다. 백을 진공 건조기(40℃)에 넣고, 때때로 통기시키면서 한나절 방치함으로써 멸균하였다.

이 멸균조작에 의해 고분자의 졸-겔 전이온도가 변하지 않는 것을 별도로 확인하였다.

제조예 5

N-이소프로필아크릴아미드 37g과, n-부틸메타크릴레이트 3g과, 폴리에틸렌옥사이드모노아크릴레이트(분자량 4,000 니혼유시 가부시키가이샤 제품: PME-4000) 28g을 벤젠 340ml에 용해한 후, 2,2'-아조비스이소부티로니트릴 0.8g을 더하여, 60℃에서 6시간 반응시켰다. 얻어진 반응생성물에 클로로포름 600ml을 더하여 용해하고, 이 용액을 에테르 20L(리터)에 적하하여 침전시켰다. 얻어진 침전을 여과에 의해 회수하고, 이 침전을 약 40℃에서 24시간 진공 건조한 후, 증류수 6L에 다시 용해하여, 분획분자량 10만의 할로우 화이버(hollow fiber)형 한외여과막(아미콘사 제품 H1P100-43)을 사용하여 10℃에서 2ℓ까지 농축하였다.

이 농축액에 증류수 4ℓ더하여 희석하고, 상기 희석조작을 다시 하였다. 상기의 희석, 한외여과 농축조작을 다시 5회 반복하여, 분자량 10만 이하인 것을 제거하였다. 이 한외여과에 의해 여과되지 않은 것(한외여과막 안에 잔류한 것)을 회수하여 동결 건조하고, 분자량 10만 이상인 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-4) 60g을 얻었다.

상술한 바와 같이 하여 얻은 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-4) 1g을, 9g의 증류수에 빙냉하에서 용해하였다. 이 수용액의 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 상기 졸-겔 전이온도는 25℃였다.

제조예 6

제조예 3의 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-3)를 10질량%의 농도로 증류수에 용해하여, 37℃에서의 정상유동 점도(η)를 측정하였더니, 5.8× 10⁵Pa·sec였다. 이 정상유동 점도(η)의 측정에서는, 스트레스식 유량계(CSL 500), 및 측정 디바이스로서 아크릴제 원반(직경 4cm)을 사용하며, 시료 두께를 600㎛로 하고, 10N/m²의 전단 응력을 적용하여, 5분후부터 5분간의 크리프(creep)를 관측하였다.

한편, 한천을 2질량%의 농도로 증류수에 90℃에서 용해하고, 10℃에서 1시간 겔화시킨 후, 37℃에서의 η을 측정하였더니, 그 η은 기기의 측정한계(1×10⁷Pa· sec)를 넘었다.

제조예 7

(섬유아세포의 증식성 평가)

제조예 3에서 제작한 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-3)를 제조예 4의 방법으로 멸균한 후, 상기 폴리머의 최종 농도가 약 8%가 되도록 20%의 태아소혈청(FCS;Dainippon Pharmaceutical사 제품, 상품명: Fetal Calf Serum) 및 항생제(Life Technologies사 제품, 상품명: penicillin; 최종농도 10,000U/ml)를 함유하는 RPMI-1640(Life Technologies사 제품)에서 4℃에서 24시간, 교반하에서 용해하였다. 이 조작은 무균 상태에서 실시하였다.

상기 본 발명의 재생용 재료(TGP-3/RPMI)에 정상인 폐섬유아세포(NormalHuman Lung Fibroblasts, NHLF, 다카라 슈조 가부시키가이샤 제품)를 6×10⁴개/ml의 세포밀도가 되도록 분산시켰다. 이 NHLF 분산액을 24 웰-플레이트[flat bottom multiwell tissue culture plate(FALCON, Becton Dickinson & Company)]의 각 웰에 0.2ml씩 나누어 주입하고, 37℃에서 겔화시킨 후, 배양액 0.4ml를 첨가하여 37℃, 5% CO₂대기압 하에서 배양하였다. 24 웰- 플레이트는 현미경 관찰용과 섬유아세포 증식율 측정용의 각 2장을 0, 1, 3, 7일째용으로서 총 8장을 준비하였다.

이와는 별도로 비교용으로 TGP-3을 사용하지 않고 상기 배양액에 6×10⁴개/ml의 세포밀도가 되도록 분사시킨 NHLF 분산액을 조제하고, 마찬가지로 하여 24 웰-플레이트 8장을 준비하여 마찬가지 배양시험을 행하였다.

위상차 현미경(올림푸스사 제품, 상품명: IMT-2, 배율 10배)으로 시간에 따라(0, 1, 3, 7일) 관찰한 결과, 비교예(RPMI)의 배양에서는 1일 후부터 섬유아세포에 특징적인 나뭇가지모양의 증식이 보였고, 7일 후에는 융합(confluent) 상태가 된 것에 반해, 본 발명의 재생용 재료(TGP-3/RPMI) 안에서는 7일 후까지 섬유아세포가 단세포의 형태를 유지한 채로 증식의 모습은 확인되지 않았다.

소정 배양일이 경과한 후, 24 웰-플레이트의 온도를 4℃로 내림으로써 상기 재생용 재료를 용해한 후, 각 웰 안에 호박산 탈수소효소 활성측정용 시약인 WST-8시약(도진 카가쿠 가부시키가이샤 제품) 50㎕을 첨가하였다. 이 24 웰-플레이트를 4℃에서 10시간 반응시킨 후, 완전히 균일한 수용액 상태로 하였다.

상기 수용액을 96-웰- 플레이트에 200㎕씩 나누어 주입하고, 마이크로플레이트용 비색계를 사용하여 450nm(참조파장 620nm)에서 흡광도(OD(450))를 측정하였다. 섬유아세포의 증식율은 배양개시시(0일)의 흡광도 OD_f=(OD(450))와, 배양 후(1,3,7일 후)의 흡광도 OD_L=(OD(450))의 비(OD_L/OD_f)로 구하였다.

본 발명의 재생용 재료(TGP-3/RPMI) 안에서는 1,3,7일후의 섬유아세포의 증식율 (OD_L/OD_f)이 각각 105%, 120%, 125% 였는데 반하여, 비교예 (RPMI)에서는, 1, 3, 7일후의 섬유아세포의 증식율 (OD_L/OD_f)이 각각 170%, 370%, 420%였다.

실시예 1

비글계 잡견(9.0~11.0kg 체중)을 펜토바르비탈(pentobarbital)로 정맥 마취한 후, 개복하였다. 간좌엽면에 메스를 사용하여 2.0×2.0×1.0cm 크기의 결손창을 만들었다(도 1). 이어서, 가제를 사용하여 약 10분간 압박 지혈하였다.

제조예 3의 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-3)를 10질량%의 농도로 생리식염수에 용해한 용액(본 발명의 재생용 재료)을 4℃로 냉각하여, 그 약 3ml를 주사기를 사용하여 상술한 결손창에 주입하였다. 이 재생용 재료는 30~50초 후에 개의 체온으로 겔화하여, 결손창을 완전히 충전하였다(도 2).

결손창으로의 재생용 재료의 주입 후, 4, 8 및 12주째에 결손창 수축율 및 조직학적 소견(헤마톡실린-에오진(hematoxylin eosin) 염색 후, 200배의 광학현미경으로 관찰)을 검토하였다. 이 때의 창상의 크기를 측정기(measure)로 측정하였다.

또한, 비교대조군으로서 별도의 비글계 잡견에 같은 크기의 결손창을 마찬가지로 만든 후, 피브린(fibrin) 풀(가케츠켄사 제품, 상품명 Bolheal) 약 3ml로 충전한 군, 및 아무런 충전제도 사용하지 않고 개방창(開放創)으로 놔둔 군을 사용하였다.

본 발명의 재생용 재료 사용군의 창수축율은 2주째 45%, 4주째 80%, 8주째 100%였다. 육안으로는 12주째 때 창치유면은 완전히 정상조직화 되었다(도 3).

본 발명의 재생용 재료 사용군의 조직학적 소견에서, 4주째에 유약한 간세포가 본 발명의 재생용 재료 안에 있고, 정상 간조직면과의 경계에는 선유조직이 보였다(도 4). 이 도 4의 「A」부분에서는, 간결손창에 본 발명의 재생용 재료를 주입한 부분에 유약한 간세포가 재생하고 있다. 「B」부분에서는 정상 간조직면과의 경계면에 선유조직이 보인다. 「C」부분은 정상 간조직이다. 또한, 8주째 조직학적 소견으로는 간 표면의 굴곡 부정면이 관찰되었는데, 거의 정상 간조직을 형성하였다. 12주째의 조직학적 소견에서는, 결손창 부분에 정상간 조직이 재생하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

이에 대하여, 피브린풀 사용군, 개방창군에서는 주변의 조직(복강내 망, 복벽)과의 유착이 강하고, 창 안이 충전되어 있었다. 조직학적으로는 모든 군에서 12주째에도 간세포의 증식은 관찰되지 않고 선유조직뿐이었다.

실시예 2

체중 3.0kg의 일본 집토키(숫컷)의 좌경골을 뼈절단용 가위로 약 1.0cm길이 절제하였다. 제조예 3의 재생용 고분자(TGP-3)를 10질량%의 농도로 RPMI-1640(10% 집토끼 혈청을 첨가)에 용해한 용액(본 발명의 재생용 재료)을 4℃로 냉각하여, 그약 2ml를 같은 상기 결손부에 주입하고, 좌경골을 플레이트에 고정하였다(도 5).

상기 재생용 재료를 주입한 후, 15일째의 단순 X선 촬영에서 골(骨)결손부에 석탄화 음영이 보여(도 6), 골화(ossification)가 일어나고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 골결손부의 HE 염색상에서는, 골아세포, 골세포 및 석탄화가 확인되어, 정상적인 화골기능이 작용하는 것으로 나타났다.

제조예 8

N-이소프로필아크릴아미드 71.0g 및 n-부틸메타크릴레이트 4.4g을 에탄올 1117g에 용해하였다. 이것에 폴리에틸렌글리콜디메타크릴레이트(PDE 6000, 니혼 유시 가부시키가이샤 제품) 22.6g을 물 773g에 용해한 수용액을 더하여, 질소기류하 70℃로 가온하였다. 질소기류하 70℃를 유지하면서, N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 0.8ml와 10% 과황산 암모늄(APS) 수용액 8ml를 더하여 30분간 교반 반응시켰다. 더욱이 TEMED 0.8ml와 10% APS 수용액 8ml를 30분 간격으로 4회 더하여 중합반응을 완결시켰다. 반응액을 10℃ 이하로 냉각한 후, 10℃의 냉각증류수 5L를 더하여 희석하고, 분획분자량 10만인 한외여과막을 사용하여 10℃에서 2L까지 농축하였다.

상기 농축액에 냉각증류수 4L을 더하여 희석하고, 상기 한외여과 농축조작을 다시 하였다. 상기의 희석, 한외여과 농축조작을 다시 5회 반복하고, 분자량 10만 이하인 것을 제거하였다. 이 한외여과에 의해 여과되지 않은 것(한외여과막안에 잔류한 것)을 회수하여 동결 건조하고, 분자량 10만 이상인 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-5) 72g을 얻었다.

상기와 같이 하여 얻은 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-5) 1g을 9g의 증류수에 빙냉하에서 용해하였다. 이 수용액의 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 상기 졸-겔 전이온도는 20℃였다.

제조예 9

N-이소프로필아크릴아미드 42.0g 및 n-부틸메타크릴레이트 4.0g을 에탄올 592g에 용해하였다. 이것에 폴리에틸렌글리콜디메타크릴레이트(PDE 6000, 니혼 유시 가부시키가이샤 제품) 11.5g을 물 65.1g에 용해한 수용액을 더하여, 질소기류하 70℃로 가온하였다. 질소기류하 70℃를 유지하면서, N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 0.4ml와 10% 과황산 암모늄(APS) 수용액 4ml를 더하여 30분간 교반 반응시켰다. 더욱이 TEMED 0.4ml와 10% APS 수용액 4ml를 30분 간격으로 4회 더하여 중합반응을 완결시켰다. 반응액을 5℃ 이하로 냉각한 후, 5℃의 냉각증류수 5L를 더하여 희석하고, 분획분자량 10만인 한외여과막을 사용하여 5℃에서 2L까지 농축하였다.

상기 농축액에 냉각증류수 4L을 더하여 희석하고, 상기 한외여과 농축조작을 다시 하였다. 상기의 희석, 한외여과 농축조작을 다시 5회 반복하고, 분자량 10만 이하인 것을 제거하였다. 이 한외여과에 의해 여과되지 않은 것(한외여과막안에 잔류한 것)을 회수하여 동결 건조하고, 분자량 10만 이상인 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-6) 40g을 얻었다.

상기와 같이 하여 얻은 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-6) 1g을 9g의 증류수에 빙냉하에서 용해하였다. 이 수용액의 졸-겔 전이온도를 측정하였더니,상기 졸-겔 전이온도는 7℃였다.

제조예 10

N-이소프로필아크릴아미드 45.5g 및 n-부틸메타크릴레이트 0.56g을 에탄올 592g에 용해하였다. 이것에 폴리에틸렌글리콜디메타크릴레이트(PDE 6000, 니혼 유시 가부시키가이샤 제품) 11.5g을 물 65.1g에 용해한 수용액을 더하여, 질소기류하 70℃로 가온하였다. 질소기류하 70℃를 유지하면서, N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 0.4ml와 10% 과황산 암모늄(APS) 수용액 4ml를 더하여 30분간 교반 반응시켰다. 더욱이 TEMED 0.4ml와 10% APS 수용액 4ml를 30분 간격으로 4회 더하여 중합반응을 완결시켰다. 반응액을 10℃ 이하로 냉각한 후, 10℃의 냉각증류수 5L를 더하여 희석하고, 분획분자량 10만인 한외여과막을 사용하여 10℃에서 2L까지 농축하였다.

상기 농축액에 냉각증류수 4L을 더하여 희석하고, 상기 한외여과 농축조작을 다시 하였다. 상기의 희석, 한외여과 농축조작을 다시 5회 반복하고, 분자량 10만 이하인 것을 제거하였다. 이 한외여과에 의해 여과되지 않은 것(한외여과막안에 잔류한 것)을 회수하여 동결 건조하고, 분자량 10만 이상인 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-7) 22g을 얻었다.

상기와 같이 하여 얻은 본 발명의 하이드로겔 형성성 고분자(TGP-7) 1g을 9g의 증류수에 빙냉하에서 용해하였다. 이 수용액의 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 상기 졸-겔 전이온도는 37℃였다.

실시예 3

제조예 8, 9, 10에서 얻어진 하이드로겔 형성성 고분자 TGP-5, TGP-6, TGP-7 각각을 생리식염수에 용해하여 10wt%의 용액을 제조하였다. 각각의 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 18℃(TGP-5), 5℃(TGP-6), 35℃(TGP-7)였다. 각 생리식염수 수용액을 그 졸-겔 전이온도 이하로 냉각하여, 1군 10마리의 생후 6주된 쥐(숫컷 5마리, 암컷 5마리)의 복강내에 20ml/kg씩 투여하였다.

투여법은 쥐의 복부를 전기 면도기로 제거하고, 소독용 에탄올로 투여부위를 소독한 후, 시린지 및 유치침(22G)을 사용하여 투여하였다. 모든 군에서 대조로서 생리식염수를 복강내에 20ml/kg 씩 투여한 군과 동등한 체중증가를 나타냈고, 7일동안의 관찰기간 중 이상한 소견은 전혀 보이지 않았다. 투여 후 7일째에 에테트 마취하에서 방혈치사시키고, 모든 기관 및 조직에 대하여 이상 유무와 함께, 복강내의 하이드로겔(본 발명의 재생용 재료)의 잔존을 검사하였다. 모든 군에서 모든 기관 및 조직에 대하여 전혀 이상이 확인되지 않았다. TGP-5 및 TGP-6에 대해서는 복강 내에 하이드로겔의 잔존이 확인되었지만, 졸-겔 전이온도가 35℃로 높은 TGP-7에 대해서는 투여 후 7일째에 복강내에서 하이드로겔의 잔존을 확인할 수 없었다.

실시예 4

제조예 8, 9에서 얻은 하이드로겔 형성성 고분자 TGP-5, TGP-6 각각을 생리식염수에 용해하여 10wt%의 용액을 조제하였다. 각 생리식염수 용액을 그 졸-겔 전이온도 이하로 냉각하여, 쥐의 등부분 피하에 1ml씩 주입하였다. 투여법은 쥐의 등 부분을 전기 면도기로 제거하고, 소독용 에탄올로 투여부위를 소독한 후, 시린지 및 유치침(22G)을 사용하여 투여하였다.

졸-겔 전이온도가 18℃인 TGP-5는 투여 23일째에 쥐의 피하에서 소실되어, 육안으로 그 잔존을 확인할 수 없었다. 한편, 졸-겔 전이온도가 5℃인 TGP-6은 투여 37일째에 부검하였더니, 그 잔존이 육안으로 확인되었고(도 7), HE 염색조직상(도 8)에서도 주위 조직에 이물 반응 등의 이상 소견은 확인되지 않았다.

실시예 5

제조예 8, 9에서 얻은 하이드로겔 형성성 고분자 TGP-5, TGP-6 각각을 인간 염기성 선유아세포 증식인자(FGF-b, 코스모바일사 제품, 100-18B)를 함유하는 생리식염수(FGF-b: 50㎍/mL)에 용해하여 10wt%의 용액을 조제하였다. 각 생리식염수 용액을 그 졸-겔 전이온도 이하로 냉각하여, 쥐의 등부위 피하에 1ml씩 주입하였다. 투여법은 쥐의 등부분을 전기 면도기로 제거하고, 소독용 에탄올로 투여부위를 소독한 후, 시린지 및 유치침(22G)을 사용하여 투여하였다.

졸-겔 전이온도가 18℃인 TGP-5는 투여 23일째에 쥐의 피하에서 소실되어, 육안으로 그 잔존을 확인할 수 없었다. 한편, 졸-겔 전이온도가 5℃인 TGP-6은 투여 37일째에 부검하였더니, 하이드로겔(본 발명의 재생용 재료)의 잔존을 육안으로 확인할 수 있었으며(도 9), HE 염색조직상(도 10)으로부터 그 주위에 무수한 무세혈관망이 형성된 것이 확인되었다. 이것은 본 발명의 재생재료로부터 성장인자(FGF-6)가 서서히 방출되어, 모세혈관의 재생이 촉진된 결과라고 생각된다.

실시예 6

실시예 8에서 얻어진 하이드로겔 형성성 고분자 TGP-5를, 페놀레드(WakoPure Chemical Industries, Ltd 제품) 3mM를 함유하는 인산 완충액(1/15M, pH7), 메틸블루(Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품) 6mM를 함유하는 인산완충액(1/15M, pH7), 미오글로빈(Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품) 0.9%를 함유하는 인산완충액(1/15M, pH7), 각각에 9wt%의 농도로 빙냉하 용해하였다. 이들 용액을 길이 1.3mm, 내직경 6mm의 유리관 안에 충전하고 37℃로 승온하여 겔화하였다. 이 원반형상의 하이드로겔을 유리관마다 3mL의 인산완충액(1/15M, pH7)이 들어간 분광용 셀에 넣고, 37℃로 보온하여 교반하면서, 흡광도를 연속적으로 측정하였다. 흡광도의 측정파장은 페놀레드, 메틸블루, 미오글로빈 각각에 대하여, 558nm, 571nm, 409nm에서 행하였다. 시간에 따른 3mL의 인산완충액(1/15M, pH7) 안으로의 페놀레드, 메틸블루, 미오글로빈의 용출율을 흡광도 측정으로 구하고, 식 1의 관계에서 각각의 확산계수를 구하였더니, 1.6×10^-6(cm²/sec), 7.5×10^-9(cm²/sec), 2.1×10^-7(cm²/sec)였다.

TGP-5 하이드로겔 중 37℃에서의 수용성 친수성 물질인 페놀레드와 수용성 소수성 물질인 메틸블루의 확산계수의 비 (D_PR/D_MB)는 213이었다.

TGP-5 하이드로겔 중 37℃에서의 수용성 친수성 저분자 물질인 페놀레드와 수용성 친수성 고분자 물질인 미오글로빈의 확산계수의 비 (D_PR/D_MG)는 7.6이었다.

비교예 1

저융점 아가로스(Sea Prep®agarose, BMA(Rockland USA)사 제품, 융점 50℃이하, 겔화점 8℃~17℃)를, 페놀레드(Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품) 3mM를 함유하는 인산 완충액(1/15M, pH7), 메틸블루(Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품) 6mM를 함유하는 인산완충액(1/15M, pH7), 미오글로빈(Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품) 0.9%를 함유하는 인산완충액(1/15M, pH7), 각각에 1wt%의 농도로 가온 용해하였다. 이들 용액을 길이 10mm, 내직경 2mm의 유리관 안에 충전하고 2℃로 냉각하여 겔화하였다. 이 원기둥 형상의 하이드로겔을 유리관마다 3mL의 인산완충액(1/15M, pH7)이 들어간 분광용 셀에 넣고, 37℃로 보온하여 교반하면서, 흡광도를 연속적으로 측정하였다. 흡광도의 측정파장은 페놀레드, 메틸블루, 미오글로빈 각각에 대하여, 558nm, 571nm, 409nm에서 행하였다. 시간에 따른 3mL의 인산완충액(1/15M, pH7) 안으로의 페놀레드, 메틸블루, 미오글로빈의 용출율을 흡광도 측정으로 구하고, 식 1의 관계에서 각각의 확산계수를 구하였더니, 4.7×10^-6(cm²/sec), 7.1×10^-6(cm²/sec), 2.6×10^-5(cm²/sec)였다.

저융점 아가로스 하이드로겔 중 37℃에서의 수용성 친수성 물질인 페놀레드와 수용성 소수성 물질인 메틸블루의 확산계수의 비 (D_PR/D_MB)는 0.7이었다.

저융점 아가로스 하이드로겔 중 37℃에서의 수용성 친수성 저분자 물질인 페놀레드와 수용성 친수성 고분자 물질인 미오글로빈의 확산계수의 비 (D_PR/D_MG)는 0.18이었다.

실시예 7

제조예 8로 얻어진 하이드로겔 형성성 고분자 TGP-5를 생리식염수에 용해하여 고분자 농도 10질량%(wt%), 8질량%(wt%), 6질량%(wt%)의 용액을 조제하였다. 각각의 졸-겔 전이온도를 측정하였더니, 각각 18℃, 20℃, 22℃였다. 각 생리식염수 수용액을 그 졸-겔 전이온도 이하로 냉각하여, 1군 10마리의 생후 6주째 되는 쥐(숫컷 5마리, 암컷 5마리)의 복강내에 1mL/kg 씩 투여하였다. 투여법은 쥐의 복부의 털을 전기 면도기로 제거하고, 소독용 에탄올로 투여부위를 소독한 후, 시린지 및 유치침(22G)을 사용하여 투여하였다. 투여 후 1일째, 3일째, 7일째, 14일째, 21일째에 각 군 2마리(숫컷 1마리, 암컷 1마리)를 에테르 마취하에서 방혈치사시키고, 복강내의 하이드로겔(본 발명의 재생용 재료)의 잔존을 검사하였다. 고분자 농도 6질량%(wt%)의 하이드로겔은 투여후 3일째에 복강내에서 소실, 고분자 농도 8질량%(wt%)의 하이드로겔은 투여후 14일째에 복강내에서 소실, 고분자 농도 10질량%(wt%)의 하이드로겔은 투여후 21일째에 복강내에서 소실하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 조직·장기 재생용 재료는 저온에서 졸상태, 체온에서 겔화하는 하이드로겔 형성성 고분자로 구성되기 때문에, 저온의 졸상태로 조직·장기의 결손부 또는 괴사부에 용이하게 주입할 수 있으며, 그대로 체온으로 겔화시킴으로써 상기 재생용 재료와 조직·장기와의 경계면을 밀착시킬 수 있다.

따라서, 발명의 조직·장기 재생용 재료를 사용하면, 상기 결손부에 다른 조직 등이 침입하는 것을 효과적으로 방지할 수 있으며, 목적으로 하는 세포(예를 들어, 조직이나 장기를 재생하는 간세포나 전구세포)의 접착·분화·형태형성을 위한 인공세포외 매트릭스로서 기능시키는 것이 쉽다.

더욱이 본 발명의 조직·장기재생용 재료안에서는, 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않기 때문에, 재생을 목적으로 하는 장기나 조직의 세포를 선택적으로 증식시켜, 목적으로 하는 장기나 조직의 재생을 효과적으로 달성할 수 있다.

또한 본 발명의 조직·장기재생용 재료는 체온에서 겔화하여 3차원 그물망 구조를 형성하며, 세포 성장 인자 등을 조직·장기의 결손부 또는 괴사부에 장기간 보유할 수 있기 때문에, 목적으로 하는 장기나 조직의 재생을 촉진시킬 수 있다.

Claims

그 수용액이 저온에서 졸상태, 고온에서 겔상태가 되는 열가역적인 졸-겔 전이를 나타내는 하이드로겔 형성성 고분자를 적어도 포함하는 조직·장기 재생용 재료로서, 상기 하이드로겔 형성성 고분자에 근거한 겔내에서 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않는 것을 특징으로 하는 조직·장기 재생용 재료.
제 1 항에 있어서,

상기 하이드로겔 형성성 고분자가, 담점을 가지는 복수의 블록과 친수성 블록이 결합한 고분자인 조직·장기 재생용 재료.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 졸-겔 전이온도가 0℃보다 높고 42℃이하인 조직·장기 재생용 재료.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

화학중개물질을 더욱 함유하는 조직·장기 재생용 재료.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 하이드로겔 형성성 고분자의 수용액이 고온의 겔상태에서 실질적으로 수불용성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조직·장기 재생용 재료.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

물을 더욱 포함하는 조직·장기 재생용 재료.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

페놀 레드(phenol red)(PR), 메틸블루(MB), 및 미오글로빈(myoglobin)(MG)의 확산계수의 비가 (D_PR/D_MB)≥2 및 (D_PR/D_MG)≥1.2인 조직·장기 재생용 재료.
그 수용액이 저온에서 졸상태, 고온에서 겔상태가 되는 열가역적인 졸-겔 전이를 나타내는 하이드로겔 형성성 고분자와, 물을 적어도 포함하는 재료이며, 상기 겔 내에서 섬유아세포가 실질적으로 증식하지 않는 조직·장기 재생용 재료를 사용하고,

상기 졸-겔 전이온도보다 저온의 졸상태에서, 상기 재생용 재료를 조직 및/또는 장기의 괴사부 또는 결손부에 주입함으로써, 상기 조직·장기 재생용 재료를 체온에서 겔화시켜 상기 괴사부 또는 결손부에 배치하여,

상기 조직 및/또는 장기를 재생시키는 것을 특징으로 하는 조직·장기 재생방법.