WO2003006635A1 - Support pour culture de cellules et de tissus et procede de culture - Google Patents

Support pour culture de cellules et de tissus et procede de culture Download PDF

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WO2003006635A1
WO2003006635A1 PCT/JP2002/007130 JP0207130W WO03006635A1 WO 2003006635 A1 WO2003006635 A1 WO 2003006635A1 JP 0207130 W JP0207130 W JP 0207130W WO 03006635 A1 WO03006635 A1 WO 03006635A1
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carrier
sol
cell
temperature
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PCT/JP2002/007130
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Hiroshi Yoshioka
Sunao Kubota
Yuichi Mori
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Mebiol Inc.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • the present invention relates to a carrier for cell / tissue culture that can be suitably used for culturing animal cells / tissue, and a method for culturing cells / tissue using the carrier. More specifically, the present invention relates to a cell / tissue culture which can be particularly preferably used as a three-dimensional culture in vitro (for example, for obtaining a tissue-engineering material). The present invention relates to a carrier and a method for culturing cells / tissues using the carrier.
  • the carrier for cell and tissue culture of the present invention for example, three-dimensionally culturing cells that can be differentiated or tissues containing the same (including organs) in a suitable state, Can be differentiated
  • tissue engineering is gaining traction.
  • the basic strategy of tissue engineering is to use cells (for example, stem cells) together with bioactive substances such as growth factors, if necessary, along with artificial extracellular carriers (extracellular in tissue engineering). And regenerate specific organs, tissues and organs.
  • various natural or synthetic extracellular carriers for example, collagen sponge obtained by freeze-drying ⁇ collagen Type I, polylactic acid ⁇ polyglycol Invitro tissue using biodegradable polymer such as colic acid
  • the existing carriers for cell growth as described above are solid, it is difficult to inoculate or mix cells or tissues with the carrier, or the proliferation and differentiation of the cells are insufficient. There was a problem.
  • the tissue regenerated in the carrier is damaged due to the treatment.
  • the most serious problem with conventional carriers is that fibroblasts proliferate more actively in the carrier than do the proliferation and differentiation of cells required for regeneration of the target tissue or organ. Regeneration of tissues and organs became difficult. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a cell which functions as an artificial carrier or extracellular matrix (Extra Cellular Matrix, ECM) which has solved the above-mentioned disadvantages of the conventional carrier for cell and tissue culture.
  • An object of the present invention is to provide a carrier for tissue culture and a cell / tissue culture method using the same.
  • Another object of the present invention is to provide a cell / tissue culture carrier and a cell / tissue culture method capable of effectively regenerating a target tissue or organ while suppressing excessive proliferation of fibroblasts. is there.
  • Another object of the present invention is to provide various cells (stem cells, progenitor cells, etc.) or living tissues containing these cells that can be easily seeded and mixed, and that regenerate target tissues and organs.
  • An object of the present invention is to provide a cell and a tissue culture carrier that can function as an ECM for adhesion, differentiation and morphogenesis of cells, and a cell and tissue culture method using the same.
  • the present inventor has a hydrogel formation characterized by having a sol-gel transition temperature at a lower temperature in a sol state and a gel state at a higher temperature, and wherein the sol-gel transition is thermoreversible.
  • the use of a water-soluble polymer to constitute a carrier for cell and tissue culture makes it possible to substantially suppress the proliferation of fibroblasts in a gel based on the polymer, thereby achieving the above object.
  • the carrier for cell / tissue culture of the present invention is based on the above findings. More specifically, a carrier exhibiting a thermoreversible sol-gel transition in which an aqueous solution becomes a sol state at low temperature and a gel state at high temperature.
  • Oral gel-forming polymer A carrier for cell / tissue culture containing at least, and characterized in that fibroblasts do not substantially grow in a gel based on the hydrogel-forming polymer.
  • a carrier comprising at least a water-soluble gel-forming polymer exhibiting a thermoreversible sol-gel transition in which the aqueous solution becomes a sol state at a low temperature and a gel state at a high temperature, and water. And using a carrier in which fibroblasts do not substantially grow in the gel,
  • a cell / tissue culture method wherein the carrier is again brought into a sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and the cell or tissue after the culture is collected.
  • the polymer preferably contains at least a high molecule in which a plurality of blocks having a cloud point and a hydrophilic block are bound.
  • the sol-gel transition temperature of the hydrogel-forming polymer is preferably higher than o ° C and not higher than 42 ° C.
  • the carrier for cell / tissue culture further contains a chemical mediator that promotes regeneration of tissues / organs in vivo.
  • the carrier for cell / tissue culture may further contain collagen, gelatin, etc. which have been conventionally used as extracellular carriers.
  • the aqueous hydrogel-forming polymer solution preferably exhibits substantially water insolubility in a high temperature gel state.
  • the carrier for cell / tissue culture is a polymer capable of forming a hydrogel. And at least water.
  • the body of an organism usually starts from a single fertilized egg.
  • the fertilized egg repeats cell division and differentiates into ectoderm, mesoderm, and endoderm cells.
  • Each germ layer repeatedly undergoes cell division and migration, and becomes hands, feet, and various tissues and organs.
  • ES cells are a group of cells that play a role in morphogenesis during development and maintenance of homeostasis and germ cells in adults.
  • Embryonic stem cells are cells that are derived from the inner cell mass of the blastocyst, proliferate stably in vitro without causing cancer, and can be differentiated into any type of cells It can be said that it is the only stem cell.
  • Stem cells which are used in a narrow sense, can be considered as a group of cells that maintain the homeostasis of tissues and organs and regenerate in the event of injury.
  • stem cells have been confirmed in hematopoietic tissues, skeletal muscle, nerves, mammary gland, epidermis, intestinal tract, sperm, and the like.
  • these stem cells and progenitor cells alone cannot regenerate in vivo tissues and organs, and usually require the presence of carriers for adhesion, differentiation and morphogenesis of stem cells and progenitor cells. I have.
  • fibroblasts proliferate in lyophilized collagen sponges and the like, which are widely used as carriers (or artificial extracellular matrix). This is a cell
  • the carrier for cell and tissue culture of the present invention since the carrier for cell and tissue culture of the present invention has a function of suppressing excessive proliferation of fibroblasts, it effectively functions as a scaffold for proliferation and differentiation of target cells and the like. . That is, the cells of the present invention
  • Tissue culture carriers are cells of interest (eg stem cells, progenitor cells) Since it effectively serves as a carrier (or artificial extracellular matrix) for adhesion, differentiation, and morphogenesis, good regeneration of living tissues and organs can be achieved.
  • the carrier for cell and tissue culture of the present invention When used as an aqueous solution, the solution is in a fluid sol state at a temperature lower than the sol-gel transition, and therefore, cells and tissues and organs of a living organism are easily seeded and mixed. be able to. Since such a solution is directly gelled at body temperature (37 ° C.), the target cells (eg, stem cells and progenitor cells) can be three-dimensionally transformed in the cell / tissue culture carrier of the present invention in the same manner as in vivo. Cultivation, and good regeneration of in vivo tissues and organs can be achieved.
  • the target cells eg, stem cells and progenitor cells
  • Regeneration of living tissues may require not only cells such as progenitor cells, but also various chemical mediators (chemi cal med i a t o r) such as cell growth factors that promote their differentiation and proliferation.
  • the carrier for cell and tissue culture of the present invention gels at body temperature to form a three-dimensional network structure, and, as described later, the hydrogel constituting the carrier has a large number of hydrophobic regions in the gel.
  • a good regenerating of in vivo tissues and organs can be achieved because a strong hydrophobic chemical mediator can be retained in the cell • tissue culture support for a long period of time by hydrophobic bonding. can do.
  • the carrier After culturing cells and tissues in the cell / tissue culture carrier of the present invention, the carrier is returned to a low-temperature and fluid sol state by cooling again. In addition, it can be recovered without substantially damaging the regenerated organs or tissues.
  • FIG. 1 is a photomicrograph showing clumps in which cells were divided and proliferated from the outside of the duct tissue in Example 1 (day 5, magnification: X100).
  • FIG. 2 shows the cell mass that increased in size over time in Example 1. This is a photomicrograph (30 days, magnification: X100). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the carrier for cell / tissue culture of the present invention contains at least a polymer having a sol-gel transition temperature and a high-mouth gel-forming polymer.
  • the carrier for cell / tissue culture exhibits a thermoreversible sol-gel transition from a sol state at a lower temperature to a gel state at a higher temperature.
  • the carrier for cell / tissue culture of the present invention can be used not only for regeneration and repair of cells and / or tissues.
  • “repair” means that cells, tissues, organs, organs, etc., lost due to any cause (trauma, disease, surgical operation, etc.) are the same as the remaining cells or tissues. To restore that continuity.
  • regeneration refers to the same cells in which cells, tissues, organs, organs, and the like lost due to some cause (trauma, disease, surgical operation, etc.) remain. Or the regrowth of tissue or tissue ("regeneration” usually involves differentiation).
  • regeneration refers to repair in which the continuity and function of the original tissue are restored not only by the proliferation of the same remaining cells and tissues but also by the proliferation of cells and tissues given from outside. Including.
  • the “hydrogel-forming polymer” that constitutes the hydrogel of the present invention has a crosslinking structure or a network structure. Based on the structure, it is possible to hold a dispersion liquid such as water therein. A polymer having the property of forming a hydrogel.
  • the “hide mouth gel” refers to a gel containing at least a crosslinked or network structure composed of a polymer and water (supporting or held in the structure) (dispersed liquid).
  • the “dispersed liquid” retained in the crosslinked or network structure is not particularly limited as long as it is a liquid containing water as a main component. More specifically, the dispersion liquid may be water itself, or may be any of an aqueous solution and / or a hydrated liquid.
  • the hydrated liquid preferably contains at least 80 parts, and more preferably at least 90 parts of water with respect to 100 parts of the entire hydrate liquid.
  • 1 mL of the hydrogel in a sol state is placed in a test tube having an inner diameter of 1 cm, and kept in a water bath at a predetermined temperature (constant temperature) for 12 hours. Thereafter, when the test tube is turned upside down, if the interface (meniscus) of the solution Z air is deformed by the weight of the solution (including the case where the solution flows out), the hydrogel at the above-mentioned predetermined temperature becomes “ Sol state ". On the other hand, if the solution-air interface (meniscus) does not deform due to the weight of the solution even when the test tube is turned upside down, the hydrogel is defined as being in a “gel state” at the predetermined temperature. I do.
  • the “sol-gel transition temperature” is defined as the “sol-gel transition temperature”.
  • the “predetermined temperature” may be decreased by, for example, 1 ° C, and the temperature at which the “gel state” transitions to the “sol state” may be determined. Good
  • the dynamic elastic modulus of a sample at an observation frequency of 1 Hz was measured by gradually changing the temperature from a low temperature side to a high temperature side (1 ° C / 1 minute), and the storage elastic modulus (G-I, elasticity) of the sample was measured.
  • Term is the sol-gel transition temperature at the point where the modulus of elasticity exceeds the loss modulus (G ", viscous term).
  • G " viscous term
  • Measuring equipment (trade name): Stress control rheometer CSL700, manufactured by Carri-Med
  • Concentration of sample solution (or dispersion) (however, as “concentration of polymer compound having sol-gel transition temperature”): 10 (weight)%
  • Applicable stress Within the linear region.
  • the sol-gel transition temperature is higher than 0 ° C, preferably 45 ° C or lower, more preferably 0 ° C or lower. It is preferable that the temperature be higher than 42 ° C (particularly, not lower than 4 ° C and not higher than 40 ° C).
  • sol-gel transition temperature measurement method Such a gel having a suitable sol-gel transition temperature can be easily selected from the specific compounds described below according to the above-described screening method (sol-gel transition temperature measurement method).
  • the above-mentioned sol-gel transition temperature (a ° C.) is set to the cell culture temperature (b ° C.) and the cells and tissues are seeded. It is preferable to set the temperature between the temperature at the time of cooling for mixing or recovery (c ° C.). That is, it is preferable that the above three temperatures a ° C, b ° C, and c ° C have a relationship of b> a> c.
  • (b ⁇ a) is preferably 1 to 40 ° C., more preferably 2 to 30 ° C.
  • (a ⁇ c) is:! ⁇ 40 ° C, more preferably 2-30 ° C.
  • the hydrogel based on the carrier of the present invention shows a solid behavior at higher frequencies in view of the balance of its ability to follow the morphological change of the tissue accompanying the regeneration of the living tissue, whereas It is preferable to exhibit liquid behavior at lower frequencies. More specifically, the ability to follow the operation of the hide gel can be suitably measured by the following method.
  • the carrier of the present invention containing a hydrogel-forming polymer (Hydrogel Lm L) in a sol state (a temperature lower than the sol-gel transition temperature) in a test tube with an inner diameter of 1 cm, and a temperature sufficiently higher than the sol-gel transition temperature of the carrier (for example, higher than the sol-gel transition temperature).
  • the test tube is kept for 12 hours in a water bath at a temperature of about 10 ° C. higher) to gel the hide-port gel.
  • the hydrogel behaves as a liquid for operation at a frequency lower than 1 / T (sec- 1 ), and operates at a frequency higher than 1 ZT (sec- 1 ).
  • the mouth gel behaves as a solid.
  • T is 1 minute to 24 hours, preferably 5 minutes to 10 hours.
  • the gel-like properties of the hydrogel based on the carrier of the present invention can be suitably measured also by measuring the steady flow viscosity.
  • the steady flow viscosity 77 (ita) can be measured, for example, by creep experiments.
  • a stress control type viscoelasticity measuring device CSL type rheometer (CSL500, manufactured by Carrymed USA) was used as a measuring device, and an Ataryl disc ( With a sample thickness of 600 ⁇ m and a measurement time of at least 5 minutes. Observe the behavior (delay curve). The sampling time is once every second for the first 100 seconds and once every 100 seconds thereafter.
  • shear stress stress
  • eta is 5 X 1 0 3 ⁇ 5 XI 0 6 P a ⁇ sec Dearuko and preferably, more 8 X 1 0 3 ⁇ 2 XI 0 6 P a ⁇ sec, in particular l X l 0 4 P a ⁇ sec or more, 1 X 1 0 6 P a ⁇ sec or less is preferable.
  • the gel-like properties of the hydrogel based on the carrier of the present invention can be suitably measured also by the dynamic elastic modulus.
  • cos ( ⁇ t + ⁇ ) is obtained.
  • IGI ⁇ . / ⁇ .
  • the hydrogel based on the carrier of the present invention preferably exhibits the following properties (for details of such elastic modulus measurement, see, for example, Reference: Ryohei Oda, Modern Industrial Chemistry 19, p. 359, Asakura Shoten, 1989).
  • ⁇ / 2 ⁇ 1 ⁇ (frequency at which the gel behaves as a solid)
  • the ratio ⁇ (tan ⁇ ) S Z (tan ⁇ ) L ⁇ of (tan S) s and (tan S) L is less than 1.
  • This ratio ⁇ (tan ⁇ ) s / (tan S) J is more preferably 0.8 or less, particularly preferably 0.5 or less.
  • Measuring equipment Stress-controlled rheometer (Model: CSL500, manufactured by Carry Med, USA)
  • the hydrogel of the present invention can optionally control the persistence in a living body (intraperitoneal, subcutaneous, etc.) as needed.
  • C of the present invention Hydrogel is mainly intended for use in in vitro, but depending on its use (for example, when a tissue grown using the hydrogel of the present invention is returned to a living body, etc.), the hydrogel may be used. This is because control of the in vivo persistence may be preferable.
  • the hydrogel transition temperature of the hydrogel of the present invention When the sol-gel transition temperature of the hydrogel of the present invention is lowered, the hydrogel remains in the living body for a long period of time, and when the sol-gel transition temperature is raised, the disappearance of the hydrogel in the living body becomes faster.
  • the concentration of the hydrogel forming polymer in the hydrogel when the concentration of the hydrogel forming polymer in the hydrogel is increased, the hydrogel will remain in the living body for a long period of time, and when the concentration of the hydrogel-forming polymer in the hydrogel is reduced, the hydrogel will decrease. However, the disappearance of the gel in the living body becomes faster.
  • the storage modulus (G ′) of the gel at the living body temperature (37 ° C.) is increased.
  • the concentration of the hydrogel-forming polymer in the hydrogel is increased, the storage elastic modulus (G ') of the hydrogel at the living body temperature (37 ° C) increases. That is, in order to control the survivability in the living body, it is sufficient to control 0 'in 37.
  • Measuring equipment (trade name): Stress control rheometer CSL500, manufactured by Carri-Med
  • the relationship between the remaining time of the hydrogel of the present invention in vivo and G ′ cannot be unconditionally determined because it differs depending on the site in the living body, but, for example, the remaining time in the abdominal cavity and the G at the observation frequency of 1 Hz According to the findings of the present inventors, the relationship is as follows.
  • the desirable range of G 'for disappearing within 3 days is 10 to 500 Pa
  • the desirable range of G' for remaining for 3 days or more and within 14 days is 200 to 15 Pa
  • Desirable range of G 'for remaining 400 Pa or more than 14 days is 400 to 100 Pa.
  • fibroblasts do not substantially grow in the gel. Fibroblasts are usually found in monolayer culture on cell culture dishes (plates). In culture in collagen gel, remarkable proliferation accompanied by dendritic morphological changes characteristic of fibroblasts is observed.
  • Junpei Nami Method using cultured cells, see Meiji Watanabe, Extracellular Matrix, Medical Review, Tokyo, 1996, pp108-115).
  • fibroblasts do not substantially proliferate while maintaining a spherical morphology.
  • the mechanism by which the proliferation of fibroblasts is suppressed in the tissue / organ regeneration material of the present invention is not necessarily clear, but according to the findings of the present inventors, it is estimated as follows.
  • fibroblasts have the property of proliferating two-dimensionally by monolayer culture, that is, by recognizing and adhering to the support surface.
  • the collagen gel has a structure in which a large number of collagen molecules (molecular weight 300,000) with a length of 300 nm and a diameter of 1.5 nm are assembled and arranged regularly. It is a state of “collagen fibril” and a network structure is created in water. Because this network structure is larger than the wavelength of visible light (over 400 nm), the collagen gel usually looks cloudy. Although collagen gel is used as a three-dimensional culture carrier, fibroblasts recognize and adhere to the surface of this thick collagen fibril as a support and adhere to it. It is presumed to show significant reproductive potential.
  • the tissue / organ regeneration material of the present invention is a hydrogel having a hydrogel-forming polymer in a molecular state to form a three-dimensional network structure
  • the heterogeneity of the structure is as follows. Smaller than the wavelength of visible light and relatively high transparency. Therefore, the fibroblasts do not recognize a clear two-dimensional support surface in the material of the present invention, and as a result, excessive proliferation of fibroblasts in the material of the present invention is suppressed. It is estimated that
  • the proliferation of fibroblasts can be evaluated by the following method (for details of this method, see, for example, Tsuyoshi Yoshikawa, Ken Tsukikawa, St. Marianna University School of Medicine, Vol. 28, No. 4, 1 6 1 — 17 0 (2 0 0 0) can be referred to).
  • the hydrogel-forming polymer constituting the carrier for cell and tissue culture of the present invention is dissolved by stirring in a culture solution, for example, RPMI_164 (Life Technologies, NY, USA) at a low temperature (for example, 4 ° C).
  • a culture solution for example, RPMI_164 (Life Technologies, NY, USA)
  • a low temperature for example, 4 ° C.
  • Normal human lung fibroblasts Normal Human Lung Fibroblasts, NHLF, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • 0.2 mL of this NH LF dispersion was added to 24 L plate
  • the carrier is cooled to a temperature lower than its sol-gel transition temperature (eg, The carrier was dissolved by lowering the temperature to 10 ° C lower than the sol-gel transition temperature, and then the WST-8 reagent (Dohin Chemical Co., Ltd.), a reagent for measuring succinate dehydrogenase activity, was added to each well. Add 50 ⁇ l.
  • the reaction is performed at about 4 ° C.
  • the aqueous solution was dispensed into 200 ⁇ l plates at a volume of 200 ⁇ l, and the absorbance (OD (450 nm) at 45 O nm (reference wavelength: 62 nm) was measured using a colorimeter for microplate. )) Is measured. It has been confirmed that the OD (450) is proportional to the number of viable cells (eg, L i, Wen Furukawa, T.
  • the proliferation rate of fibroblasts is determined by the absorbance at the start of culture.
  • the proliferation rate P F (OD L / OD f ) of fibroblasts after culturing at 37 ° C. for 3 days is preferably in the range of 70% to 200%.
  • the growth of fibroblasts is suppressed, while the growth of target cells (other than fibroblasts) is relatively not suppressed.
  • the growth rate [rho tau in cells of interest, the ratio of the growth rate p F of fibroblasts above (P T / P F) is arbitrary preferred that: 1. 1 or more. Further, the ratio ( ⁇ ) is preferably 1.5 or more, particularly preferably 2.0 or more. Growth rate [rho tau in cells of this objective can be obtained Te good Unishi follows.
  • the hydrogel-forming polymer that can be used for the carrier of the present invention is not particularly limited as long as it exhibits the thermoreversible sol-gel transition as described above (that is, it has a sol-gel transition temperature). Is it easy to show suitable sol-gel change at physiological temperature (about 0 to 42 ° C)
  • a suitable sol-gel transition temperature be achieved by adjusting the degree, hydrophilicity, and / or molecular weight, respectively.
  • polystyrene resin whose aqueous solution has a sol-gel transition temperature and exhibits a reversible sol state at a temperature lower than the transition temperature
  • polypropylene oxide and polyethylene oxide examples include, for example, polypropylene oxide and polyethylene oxide.
  • Ethenolide senorelose such as methinoresenorelose and hydroxypropinoresenorelose; chitosan derivatives (KR Holme, et al. Macromolecules, 24, 3828 (1991)) and the like. Are known.
  • Pluronic F-127 (trade name, BASF Wyandotte Chemica Is Co.), which is a polyalkylene oxide block copolymer, in which polyethylene oxide is bonded at both ends to polyethylene oxide.
  • a gel is being developed. It is known that the high-concentration aqueous solution of the pull-mouth nick F-127 becomes a gel at a hide-mouth gel at about 20 ° C or higher, and becomes an aqueous solution at a lower temperature. However, in the case of this material, it becomes a gel state only at a high concentration of about 20% by mass or more, and even if the material is kept at a temperature higher than the gelation temperature at a high concentration of about 20% by mass or more, The gel dissolves when water is added.
  • Pluronic F-127 has a relatively small molecular weight, exhibits not only a very high osmotic pressure in a high gel state of about 20% by mass or more, but also easily penetrates cell membranes. ⁇ May have a negative effect on the organization.
  • the sol-gel transition temperature is usually high and is about 45 ° C or higher (N. Sarkar, J. Appl. Polym. Scien ce, 24, 107, 197).
  • the body temperature of a living body is usually around 37 ° C.
  • the above-mentioned etherified cellulose is in a zole state, and it is a fact that the etherified cellulose is used as a carrier for tissues and organs. Above is difficult.
  • the problems of the conventional polymer in which the aqueous solution has a sol-gel transition point and reversibly shows a sol state at a temperature lower than the transition temperature are as follows: 1) Higher than the sol-gel transition temperature 2) Sol-gel transition temperature is higher than the body temperature of the living body (around 37 ° C), and it becomes sol-like at body temperature. 3) It is necessary that the concentration of the polymer in the aqueous solution be extremely high in order to cause gelation.
  • a hydrogel-forming polymer having a sol-gel transition temperature preferably higher than 0 ° C. and not higher than 42 ° C. for example, having a cloud point A polymer in which a plurality of blocks are combined with a hydrophilic block, and the aqueous solution has a sol-gel transition temperature, and reversibly exhibits a sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature. It has been found that the above problem can be solved when the carrier of the present invention is constituted by using).
  • the polymer for forming a mouth-opening gel utilizing a hydrophobic bond which can be suitably used as the carrier of the present invention, comprises a plurality of blocks having a cloud point and a hydrophilic block.
  • the hydrophilic block is preferably present because the hydrogel becomes water-soluble at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and the plurality of blocks having a cloud point are preferably the hydrogel. It is preferably present to change to a gel state at a temperature higher than the sol-gel transition temperature. In other words, a block having a cloud point dissolves in water at a temperature lower than the cloud point and is higher than the cloud point.
  • the block acts as a cross-linking point consisting of hydrophobic bonds to form a gel because it changes to insoluble in water at temperature. That is, the cloud point derived from the hydrophobic bond corresponds to the sol-gel transition temperature of the above-mentioned hide-opening gel.
  • the cloud point and the sol-gel transition temperature do not necessarily have to match. This is because the cloud point of the above-mentioned “block having a cloud point” is generally affected by the binding between the block and the hydrophilic block.
  • the hydrogel used in the present invention utilizes the property that the hydrophobic bond not only becomes stronger with increasing temperature, but that the change is reversible with respect to temperature. Multiple crosslinking points are formed in one molecule
  • the hydrogel-forming polymer has a plurality of “blocks having a cloud point”.
  • the hydrophilic block in the hydrogel-forming polymer has a function of changing the hydrogel-forming polymer to water-soluble at a temperature lower than the sol-gel transition temperature.
  • it has a function of forming a state of a hydrogel while preventing the hydrogel from agglomerating and precipitating due to an excessive increase in hydrophobic binding force at a temperature higher than the transition temperature.
  • the block having a cloud point is preferably a block of a polymer having a solubility in water and a negative temperature coefficient, and more specifically, a block of polypropylene and a block of polypropylene.
  • Copolymers with other alkylenoxides poly N-substituted acrylamide derivatives, poly N-substituted metaacrylamide derivatives, copolymers of N-substituted acrylamide derivatives and N-substituted metaacrylamide derivatives
  • Polymer poly A polymer selected from the group consisting of vinyl methyl ether and partially acetylated polyvinyl alcohol can be preferably used.
  • the cloud point of the polymer (block having a cloud point) is higher than 4 ° C.
  • the polymer (a plurality of blocks having a cloud point) used in the present invention is used. It is preferable because the sol-gel transition temperature of the compound having a hydrophilic block bonded thereto is set to be higher than 4 ° C and 40 ° C or lower.
  • the cloud point is measured by, for example, cooling an aqueous solution of about 1% by mass of the above polymer (a block having a cloud point) into a transparent and homogeneous solution, and then gradually increasing the temperature (heating rate). This can be done by setting the point at which the solution becomes cloudy for the first time as the cloud point after about 1 ° CZ min).
  • poly N-substituted acrylamide derivatives and poly N-substituted methacrylamide derivatives that can be used in the present invention are listed below.
  • Poly-N-acylylbiperidine Poly-N-n-Propyrmethata ataline oleamide; Poly-I-N-isopropylpyracuriamide; Poly-N, N-N-Jetylacryluamide; Poly-1 N-Isopropyrmethacrylamide; Poly-N-cyclopropylacrylamide; Poly-N-acrylonitrile pyridine; Poly-N, N-ethylmethylacrylamide; Poly-N-cyclopropyl tertiary amide; Poly-N-ethyl acrylamide.
  • the above polymer may be a homopolymer (homopolymer) or a copolymer of a monomer constituting the above polymer and another monomer.
  • the other monomer constituting such a copolymer any of a hydrophilic monomer and a hydrophobic monomer can be used.
  • copolymerization with a hydrophilic monomer increases the cloud point of the product, and copolymerization with a hydrophobic monomer lowers the cloud point of the product. Therefore, even by selecting these monomers to be copolymerized, it is possible to obtain a polymer having a desired cloud point (for example, a cloud point higher than 4 ° C and 40 ° C or lower). Can be. (Hydrophilic monomer)
  • hydrophilic monomer examples include N-bulpyrrolidone, vinylpyridine, atalinoleamide, metalinoleamide, N-methylatalinoleamide, hydroxetchinolemetaatalate, and hydroxetino.
  • the hydrophobic monomers include acrylate derivatives such as ethyl acrylate, methyl methacrylate, and glycidyl methacrylate, and methacrylate derivatives; __________________________________________ N-Substituted alkyl methacrylamide derivatives such as butyl methata linoleamide, biel chloride, atalyl nitro linole, styrene, vinyl acetate and the like, but are not limited thereto.
  • the hydrophilic block to be bound to the block having the above cloud point includes, specifically, methylcellulose, dextran, polyethylene oxide, polybutyl alcohol, and polyN.
  • Polyvinylpyridine Polyacrylamide, Polyacrylamide, PolyN —Methylacrylamide, Polyhydroxymethylacrylate, Polyacrylic acid, Polymethacrylic acid, Polyvinyl acid Sulfonic acid, polystyrene sulfonic acid and salts thereof; poly N, N—dimethylaminoethyl methacrylate, poly N, N—ethyl Examples include luminoethylmethacrylate, poly N, N-dimethylaminopropylacrylamide, and salts thereof.
  • the method of bonding the block having a cloud point and the above-mentioned hydrophilic block is not particularly limited.
  • a block copolymer having these blocks or a graft copolymer may be used.
  • it is preferably obtained as a dendrimer-type copolymer.
  • the bond between the cloud point block and the hydrophilic block is achieved by introducing a polymerizable functional group (eg, an acryloyl group) into one of the above blocks and the other block. It can be carried out by copolymerizing a monomer that gives a block with a block into which a polymerizable functional group is introduced in this way.
  • a combination of a block having a cloud point and the above-described hydrophilic block includes a monomer that provides a block having a cloud point and a monomer that provides a hydrophilic block. It can also be obtained by block copolymerization.
  • the binding between the block having a cloud point and the hydrophilic block is performed by introducing a reactive group (for example, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, an isocyanate group, etc.) into both of them in advance. It can also be performed by combining both by a chemical reaction. At this time, a plurality of reactive groups are generally introduced into the hydrophilic block.
  • a reactive group for example, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, an isocyanate group, etc.
  • an anion polymerization or a cationic polymerization forms a model that forms the propylene oxide and the “other hydrophilic block”.
  • a block copolymer in which propylene oxide and a “hydrophilic block” for example, poly (ethylene oxide)
  • a monomer for example, ethylene oxide
  • Such a block copolymer is obtained by introducing a polymerizable group (for example, an acryloyl group) into the terminal of propylene oxide, and then copolymerizing a monomer constituting a hydrophilic block.
  • a functional group capable of binding and reacting with a functional group (for example, a hydroxyl group) at the end of a polypropylene oxide is introduced into a hydrophilic block, and the two are reacted with each other.
  • Molecule by connecting a material such as Pull Mouth Nick F-127 (trade name, manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) in which polyethylene glycol is bonded to both ends of polypropylene glycol.
  • the polymer of the present invention in the embodiment containing the block having the cloud point can be obtained at the temperature lower than the cloud point.
  • the “block having a cloud point” is water-soluble together with the hydrophilic block, it is completely dissolved in water and shows a sol state. However, when the temperature of the aqueous solution of the polymer is heated to a temperature higher than the above-mentioned cloud point, the “block having a cloud point” existing in the molecule becomes hydrophobic, and due to the hydrophobic interaction. Associates between distinct molecules.
  • the polymer of the present invention can be used as a block having a cloud point in water.
  • a hydrogel having a three-dimensional network structure in which the hydrophobic association part between them is a cross-linking point is generated.
  • the temperature of the hydrogel is re-cooled to a temperature lower than the cloud point of the “block having a cloud point” existing in the molecule, the block having the cloud point becomes water-soluble and becomes hydrophobic.
  • the crosslinking points are released by the association, the hydrogel structure disappears, and the polymer of the present invention becomes a complete aqueous solution again.
  • the sol-gel transition of the polymer of the present invention in a preferred embodiment is based on a reversible change in hydrophilicity and hydrophobicity at a cloud point of a block having a cloud point present in the molecule. Therefore, it has complete reversibility in response to temperature changes. (Solubility of gel)
  • the hydrogel-forming polymer of the present invention containing at least a polymer having a sol-gel transition temperature in an aqueous solution is substantially water-insoluble at a temperature (d ° C) higher than the sol-gel transition temperature.
  • a temperature (d ° C) higher than the sol-gel transition temperature which shows reversible water solubility at a temperature lower than the sol-gel transition temperature (e ° C) .
  • the above-mentioned high temperature (d ° C) may be at least 1 ° C higher than the sol-gel transition temperature.
  • the temperature is preferably 2 ° C or higher (particularly 5 ° C or higher), and more preferably a high temperature.
  • substantially water-insoluble means that the amount of the polymer dissolved in 100 mL of water at the temperature (d ° C) is 5.0 g or less (further, 0.5 g or less). g or less, especially 0.1 lg or less).
  • the above-mentioned low temperature (e ° C) is preferably 1 ° C or more (in absolute value) lower than the sol-gel transition temperature, and 2 ° C or more (particularly 5 ° C or more) lower. Is more preferable.
  • water-soluble means that the amount of the polymer dissolved in 100 mL of water at the temperature (e ° C) is 0.5 g or more (furthermore, 1.0 g or more). It is preferred that Further, “reversibly water-soluble” means that the aqueous solution of the above-mentioned hydrogel-forming polymer is gelled (at a temperature higher than the sol-gel transition temperature) even after the sol-gel transition temperature.
  • the polymer exhibits the above-mentioned water solubility, and the above-mentioned polymer is 10 to 3,000 mPa ⁇ s (10 to 3, 0% aqueous solution at 5 ° C). , 0.000 centivoise), and more preferably 50 to 1,000 mPa ⁇ s (50 to 1,000 centivoise).
  • Via viscosity is preferably measured, for example, under the following measurement conditions. Viscometer: Stress-controlled rheometer (Model name: CSL500, manufactured by Carry Med, USA)
  • the aqueous solution of the hydrogel-forming polymer of the present invention is gelled at a temperature higher than the sol-gel transition temperature and then immersed in a large amount of water, the gel is not substantially dissolved.
  • the properties of the carrier can be confirmed, for example, as follows.
  • 0.15 g of the polymer for forming a mouth-opening gel of the present invention is dissolved in 1.35 g of distilled water at a temperature lower than the above-mentioned sol-gel transition temperature (for example, under ice-cooling).
  • a W% aqueous solution is prepared, and the aqueous solution is poured into a plastic petri dish having a diameter of 35 mm, and heated to 37 ° C, whereby a gel having a thickness of about 1.5 mm is put into the petri dish. After the formation, the mass (f gram) of the whole petri dish containing the gel is measured.
  • the whole petri dish containing the gel was allowed to stand in water at 250 m 1 at 37 for 10 hours, and then the mass (g gram) of the whole petri dish containing the gel was measured. The presence or absence of dissolution of the gel from the gel surface is evaluated.
  • the mass reduction rate of the gel that is, (f ⁇ g) / f is preferably 5.0% or less, and more preferably 1.0%. % Or less (especially 0.1% or less).
  • the aqueous solution of the hydrogel-forming polymer of the present invention is formed into a gel at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and then a large amount (approximately 0.1 to 100 times the volume of the gel, by volume) of water. Even if immersed in the gel, the gel does not dissolve for a long time.
  • the properties of the polymer used in the present invention include, for example, two or more blocks having a cloud point in the polymer (multiple blocks). It is achieved by being present.
  • the concentration with respect to water that is, ⁇ (polymer) / (polymer + water) ⁇ XI 00 (%) is 20% or less (further, Is preferably 15% or less, particularly 10% or less).
  • the carrier of the present invention contains at least the polymer having the above-mentioned sol-gel transition temperature, but may contain other components as necessary.
  • the “other components” in such an embodiment include, for example, antibiotics, anticancer agents, ECM such as collagen and gelatin, local chemical mediators described below, hormones such as insulin and cell growth factor, Examples include exogenous genes and other cells and tissues that secrete these chemical mediators, cell growth factors, and the like.
  • the amount of such “other components” used is an amount that achieves a predetermined effect, and is used in a gel based on a hydrogel-forming polymer for a predetermined time (for example, necessary for culturing cells and tissues).
  • the time is not particularly limited as long as the amount can be held. Usually, it is preferably about 2 parts or less, more preferably about 1 part or less, based on a hydrogel-forming polymer (10 parts).
  • the chemical mediators include 1) a local chemical mediator that acts only in the immediate vicinity of the cell, and 2) a neurotransmitter that is secreted from the nerve cell and has a very short effective working distance. neurotransmitter), 3) Hormones that are secreted from endocrine cells and act on target cells throughout the body through the bloodstream or the like, or cell growth factors that are intercellular signaling substances.
  • Examples of the local chemical mediator 1) include proteins such as nerve cell growth factor, peptides such as chemotactic factor, amino acid derivatives such as histamine, and fatty acid derivatives such as prostaglandin. Can be
  • Examples of the neurotransmitter in the above 2) include amino acids such as glycine, and low molecular weight substances such as low molecular weight peptides such as noradrenaline, acetylcholine and enkephalin.
  • the cell growth factors or hormones of the above 3) include fibroblast growth factor (FGF), epithelial growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor ⁇ VEGF), cell growth factors such as hepatocyte growth factor (HGF), insulin, somatotropin, somatomedin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), parathyroid hormone (PTH), proteins such as thyroid stimulating hormone (TSH), glycoproteins, TSH-releasing factors, amino acid derivatives such as vasopressin and somatostatin, and steroids such as cortisol, estradiol and testosterone.
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF epithelial growth factor
  • ⁇ VEGF vascular endothelial growth factor
  • cell growth factors such as hepatocyte growth factor (HGF), insulin, somatotropin, somatomedin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), parathyroid hormone (PTH), proteins such as thyroid stimulating hormone (TSH), glycoproteins,
  • the hydrogel of the present invention can arbitrarily control the diffusion rate of a chemical mediator in the hydrogel.
  • hydrophilic and hydrophobic substances can be diffused at different diffusion rates. Diffusion of the water-soluble hydrophilic substance is controlled by the molecular sieving effect of the three-dimensional network structure of the hydrogel-forming polymer. Therefore, the diffusion rate of the water-soluble hydrophilic substance can be reduced by increasing the concentration of the hydrogel-forming polymer constituting the hydrogel.
  • the diffusion of a water-soluble hydrophilic substance also depends on the molecular weight of the substance. If the concentration of the hydrogel-forming polymer constituting the hydrogel is constant, the diffusion rate of the substance having a higher molecular weight becomes slower.
  • Diffusion of the water-soluble hydrophobic substance in the hydrogel of the present invention is not only due to the molecular sieve effect due to the three-dimensional network structure of the high-mouth gel-forming polymer, but also to the hydrophobic portion of the hydrogel-forming polymer. It is also affected by partitioning and is also controlled by the percentage of hydrophobic moieties in the hydrogel-forming polymer, which is usually slower than the diffusion of water-soluble hydrophilic substances.
  • the carrier for cell / tissue culture of the present invention is characterized in that phenol red (PR), methyl blue (MB), and myoglobin (MG) the ratio of the diffusion coefficient, it is preferable that (D PR ZD MB) ⁇ 2 and (D PR / D MG) ⁇ 1. 2.
  • PR phenol red
  • MB methyl blue
  • MG myoglobin
  • X 1 0 5 or less good Ri preferably 1 X 1 0 4 or less, further 1 XI 0 3 or less
  • X 1 0 4 or less good Ri preferably 1 X 1 0 3 or less, further 1 XI 0 2 or less
  • collagen which is a conventional “scaffold” (cell, tissue culture carrier) for cell growth, is a hydrophilic polymer, and as in the hide-mouth gel of the present invention, its hydrophilicity and hydrophobicity It was not possible to arbitrarily control the balance of the proteins, and therefore it was difficult to control the diffusion rate of the chemical mediator in collagen.
  • the hydrogel of the present invention can substantially arbitrarily control the balance between hydrophilicity and hydrophobicity as described above.
  • the diffusion rate of the chemical mediator in the gel of the present invention can also be controlled with a substantial degree of freedom.
  • the gel of the present invention When the gel of the present invention is used together with a known gel-forming polymer such as collagen (that is, as the gel-forming polymer, the polymer used in the present invention and a known gel-forming polymer such as collagen are used. (When molecules coexist), the diffusion rate of the chemical mediator can be controlled with a substantial degree of freedom even in a gel containing a known gel-forming polymer such as collagen. .
  • biological tissues and organs refer to tissues, organs and organs of animals (particularly humans).
  • the biological tissues and organs that can be cultured by the culture carrier of the present invention are not particularly limited, but include, for example, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, kidney, liver, heart, blood vessels, bone, cartilage, nerve, cornea, dermis, etc. Can be exemplified.
  • the cells and tissues that can be cultured using the culture carrier of the present invention are not particularly limited.
  • the culture carrier of the present invention can be used particularly effectively for differentiating cells and tissues.
  • Such differentiating cells include, for example, stem cells (stemcells) and progenitor cells.
  • stem cells stemcells
  • progenitor cells progenitor cells.
  • Differentiated cells include any of monopotent, pluripotent, or totipotent cells.
  • the method for repairing and regenerating cells and tissues using the carrier of the present invention is not particularly limited. However, from the viewpoint of facilitating seeding and recovery of the cells and the like, the sol-gel transition of the hydrogel-forming polymer is performed. It is preferable to use it. (Aspect using sol-gel transition)
  • cells for example, stem cells or progenitor cells
  • a tissue containing them are seeded and mixed in the carrier of the present invention.
  • a cell-forming gel-forming polymer constituting the carrier for cell or tissue culture of the present invention is mixed with a culture solution, for example, RPMI-164 (Lifetime). Technologies, NY, USA) under low temperature (for example, 4 ° C) with stirring, dissolving the carrier of the present invention in an aqueous solution (sol) below its sol-gel transition temperature, and adding and suspending the cells and tissues. You can do it.
  • the culture solution used here is not particularly limited, and a culture solution in which target cells (stem cells, progenitor cells, etc.) are easily proliferated and differentiated may be appropriately selected and used.
  • the above-mentioned chemical mediator that promotes the proliferation and differentiation of the target stem cells or progenitor cells may be contained in this culture solution, if necessary.
  • ECM such as collagen and gelatin may be added.
  • the above-mentioned suspension is heated to a temperature higher than the sol-gel transition temperature of the carrier of the present invention (usually 37 ° C.) to form a gel.
  • the target cells or tissues containing the cells may be cultured at the temperature (usually 37 ° C.).
  • the carrier of the present invention When the carrier of the present invention is gelled, it can be gelled by imparting a desired shape using a mold having a desired shape.
  • the carrier of the present invention can be easily formed by culturing the chondrocytes and shaping the cartilage tissue to have a shape suitable for the application site of the ear or nose. It can be used after being molded into a desired shape.
  • the target tissue / organ After the target tissue / organ has been regenerated in the carrier of the present invention, these can be recovered from the carrier of the present invention by subjecting the carrier of the present invention containing the target tissue / organ to a temperature lower than the sol-gel transition temperature (The carrier of the present invention is returned to the sol state by cooling to, for example, 4 ° C) and centrifuged or another ordinary separation method. What is necessary is just to separate the target tissue and organ from the carrier of the present invention.
  • the carrier of the present invention can suppress the growth or differentiation of target cells (stem cells, progenitor cells, etc.) while suppressing the growth of fibroblasts. Therefore, the target tissues and organs can be efficiently regenerated in the carrier of the present invention.
  • Polypropylene oxide copolymer (Propylene oxide Z ethylene oxide average degree of polymerization: approx. 10 g was dissolved in 30 ml of dry black-mouthed form, and 0.13 g of hexamethylene diisocynate was added thereto in the presence of phosphorus pentoxide (1 g), and the mixture was reacted at the boiling point of reflux for 6 hours. After distilling off the solvent under reduced pressure, the residue was dissolved in distilled water, and subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration membrane (AMICON PM-30) with a molecular weight cut off of 30,000 to obtain a low molecular weight polymer. The molecular weight polymer was fractionated. The obtained aqueous solution was frozen to obtain an F-127 high polymer and an F-127 low polymer.
  • AMICON PM-30 ultrafiltration membrane
  • the F-127 high polymer obtained above (the hydrogel-forming polymer of the present invention, TGP-1) was dissolved in distilled water at a concentration of 8% by mass under ice-cooling.
  • TGP-1 hydrogel-forming polymer of the present invention
  • the hydrogel-forming polymer (TGP-2) of the present invention to which is bound was obtained. This was dissolved in distilled water at a concentration of 5% by mass under ice cooling, and its sol-gel transition temperature was measured to be about 16 ° C.
  • the TGP-3 thus obtained was distilled at a concentration of 5% by mass under ice-cooling. It was dissolved in water and its sol-gel transition temperature was measured to be about 21 ° C.
  • Og of the above-mentioned gel-forming polymer of the present invention (TGP-3) was placed in an EOG (ethylene oxide gas) sterilization bag (manufactured by Hogi Medical Co., Ltd., trade name: hybrid sterilization bag).
  • EOG ethylene oxide gas
  • the bag was filled with EOG using an EOG sterilizer (Easy Pack, manufactured by Inuchi Seieido), and left at room temperature for 24 hours. After leaving at 40 ° C. for a further half day, the EOG was removed from the bag, and aeration was performed.
  • the bag was placed in a vacuum dryer (40 ° C) and sterilized by leaving it for half a day with occasional air-rate.
  • sol-gel transition temperature of the polymer did not change by this sterilization operation.
  • the resulting precipitate was collected by filtration, and the precipitate was vacuum-dried at about 40 ° C for 24 hours, then dissolved again in 6 L of distilled water to obtain a hollow fiber having a molecular weight cut off of 100,000. It was concentrated to 21 at 10 ° C using a fiber type ultrafiltration membrane (H1P100-43, manufactured by Amicon).
  • the hide-mouth gel-forming polymer of the present invention (TGP-3) of Production Example 3 was dissolved in distilled water at a concentration of 10% by mass to give 5.8 X 10 5 Pa-sec.
  • a stress type rheometer (CSL 500) and an Acryl disk (diameter 4 cm) were used as the measuring device, and the sample thickness was 600 ⁇ m.
  • a shear stress of 10 NZ m 2 was applied as ⁇ , and creep was observed for 5 minutes from 5 minutes later.
  • Carrier (TGP- 3 / RPMI) in normal human lung fibroblasts was 6 X 1 0 4 cells / ml density of the invention described above Were dispersed so that Dispense 0.2 ml of this NHLF dispersion into each well of a 24-well plate [flat bottom mu 11 iwe 11 tissue culture plate (FALC ON, Becton Dickinson & Company)] and gel at 37 ° C. After the culture, 0.4 ml of the culture solution was added, and the cells were cultured at 37 ° C under 5% CO 2 atmospheric pressure. A total of 8 pieces of 24 ⁇ eluate were prepared for microscopy and measurement of fibroblast proliferation rate, each for the 0th, 1st, 3rd and 7th days.
  • an NH LF dispersion was prepared in the above culture solution without using TGP-3 to a cell density of 6 ⁇ 10 4 cells / m 1, and the same procedure was performed.
  • the same culture test was performed by preparing eight 24-plate plates.
  • the carrier was dissolved by lowering the 24-well plate to 4 ° C, and the succinate dehydrogenase activity measuring reagent WST-8 reagent (Dojindo) was added to each well. 50 ⁇ 1 was added. After reacting this 24 ⁇ l plate at 4 ° C. for 10 hours, a completely uniform aqueous solution was obtained.
  • the aqueous solution was dispensed into a 96-well plate at a volume of 200 ⁇ l, and the absorbance (OD (4,0 nm) at 450 nm (reference wavelength, 6200 nm) was measured using a colorimeter for a microplate. 50)) was measured.
  • the proliferation rates (OD L / OD f ) of the fibroblasts after 1, 3, and 7 days were 105%, 120%, and 125%, respectively.
  • the proliferation rates (OD L ZO D f ) of the fibroblasts after 1, 3, and 7 days were 170%, 370%, and 420%, respectively.
  • Beagle dogs (9.0-11.0 kg body weight) were anesthetized intravenously with bentanorebital, then laparotomized, and the whole kidney was removed.
  • a guide wire with a diameter of 100 ⁇ m was inserted into the ⁇ tube, and ⁇ tissue was excised and removed along the guide wire, only ⁇ tube could be collected.
  • a ⁇ tube having a length of about 6 cm and a diameter of 150 to 200111 was minced at a width of 0.5 mm.
  • the carrier of the present invention was cooled to 4 ° C., and the above-mentioned knee tube fine slice was dispersed, and 12 ⁇ l-plate [flat bottom mulitwe ⁇ 1 tissue culture plate, FAL ON, Becton Dickinson & Company) 0.4 ml was dispensed into each well of [], gelled with 37, added 0.4 ml of culture solution, and cultured at 37 ° C and 5% CO 2 atmospheric pressure .
  • the culture medium RPMI — 1640 contains dog serum.
  • the carrier of the present invention containing the cell clumps is cooled to 4 ° C. and centrifuged to easily separate the cell clumps and the carrier of the present invention solubilized by the cooling. We were able to.
  • Lewis strain 4-week-old male rat costal cartilage was aseptically collected, the attached soft tissue was removed, and the removed cartilage was fragmented.
  • an enzyme solution ⁇ first solution: 0.1% EDTA (manufactured by Nacalai Tesque) / PBS (-) (manufactured by Roman Industries), second solution: 0.25% trypsin-EDTA (Gibco ) ZP BS (—) (Roman Kogyo), third liquid: 0.1% collagenase (Wako Pure Chemical Industries) ZP BS (+) (Gibco) ⁇
  • the cartilage tissue was placed in the flask and treated at 37 ° C for 15 minutes, 1 hour and 3 hours, respectively, to decompose the cartilage tissue.
  • the collected cartilage dispersion was placed in a medium ⁇ D—MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium: (manufactured by Gibco) + 10% FCS (Fetal Bovine (Serum) + penicillin + streptomicin) and cultured at 37 ° C, 5% CO 2 atmospheric pressure for about 2 weeks until it became confluent.
  • the resulting culture was treated with 0.25% trypsin /? 83 (-) for 5 minutes, centrifuged at 100 rpm for 10 minutes, and the chondrocytes were collected.
  • the culture was performed under the atmospheric pressure of% CO 2 .
  • the culture medium RPMI-1640 contained rat serum (rat blood was left at room temperature for 30 minutes and the supernatant was collected), 10%, Nicotinamide, 10 ng / ml keratinocyte growth factor (KGF) was added.
  • the carrier of the present invention containing the cell clumps By cooling the carrier of the present invention containing the cell clumps to 4 ° C. and centrifuging the same, the cell clumps and the carrier of the present invention solubilized by the cooling can be easily obtained. could be separated.
  • N-isopropyl acrylamide 71.0 g and n-butylmeth 4.4 g of tacylate was dissolved in 117 g of ethanol.
  • an aqueous solution of 22.6 g of polyethylene glycol dimethacrylate (PDE 600, manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) in 773 g of water was added to 70 ° C under a nitrogen stream. Warmed.
  • N, N, N,, N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) 0.8 mL and 10% ammonium persulfate (APS) aqueous solution while maintaining 70 ° C under nitrogen flow 8 mL was added and the mixture was stirred and reacted for 30 minutes.
  • PDE 600 polyethylene glycol dimethacrylate
  • APS ammonium persulfate
  • the concentrated solution was diluted by adding 4 L of cold distilled water, and the ultrafiltration and concentration operation was performed again. The above dilution and ultrafiltration / concentration operations were further repeated five times to remove those having a molecular weight of 100,000 or less.
  • the polymer not filtered by the ultrafiltration (the one remaining in the ultrafiltration membrane) is collected, lyophilized, and dried to form a hydrogel-forming polymer having a molecular weight of 100,000 or more (TGP-5). ) 72 g were obtained.
  • TEMED tetramethylethylenediamine
  • APS ammonium persulfate
  • the concentrated solution was diluted by adding 4 L of cold distilled water, and the ultrafiltration and concentration operation was performed again. The above dilution and ultrafiltration / concentration operations were further repeated five times to remove those having a molecular weight of 100,000 or less.
  • the polymer not filtered by the ultrafiltration (the one remaining in the ultrafiltration membrane) is collected, lyophilized, and dried to form a hydrogel-forming polymer having a molecular weight of 100,000 or more (TGP-6). ) 40 g were obtained.
  • TEMED N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine
  • APS ammonium persulfate
  • the concentrated solution was diluted by adding 4 L of cold distilled water, and the ultrafiltration and concentration operation was performed again. The above dilution and ultrafiltration / concentration operations were further repeated five times to remove those having a molecular weight of 100,000 or less.
  • the material not filtered by the ultrafiltration (remaining in the ultrafiltration membrane) is collected, lyophilized, and dried to form a hydrogel-forming polymer having a molecular weight of 100,000 or more (TGP-7 ) 22 g were obtained.
  • TGP_7 Ig of the above-mentioned gel-forming polymer of the present invention (TGP_7) obtained above was dissolved in 9 g of distilled water under ice-cooling. When the sol-gel transition temperature of this aqueous solution was measured, it was found that the sol-gel transition temperature was 37 ° C.
  • the hide-mouth gel-forming polymer TGP-5 obtained in Production Example 8 was used as a phosphate buffer (1/15 M, pH 7) containing 3 mM phenol red (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the buffer solutions (1Z15M, pH7) were each dissolved at a concentration of 9 wt% under ice cooling.
  • the ratio of the diffusion coefficient (D PR ZD MB ) between phenol red, a water-soluble hydrophilic substance, and methyl blue, a water-soluble hydrophobic substance, at 37 ° C in TGP-5 hydrogel was 211. .
  • TGP- 5 High Dorogeru in a water-soluble hydrophilic low molecular substance in 3 7 ° C full Roh Ruretsu de and a water-soluble hydrophilic polymer material Miogu b ratio of the diffusion coefficient bin (D PR / D MG) was 7.6.
  • the absorbance was measured at 558 nm, 571 nm, and 409 nm for phenol red, methyl blue, and myoglobin, respectively.
  • the elution rate of phenol red, methyl blue, and myoglobin into 3 mL of phosphate buffer (1Z15M, pH7) over time was determined by absorbance measurement, and the equation (1) ) To calculate the respective diffusion coefficients. As a result, it was 4.7 X 10 " 6 (cm 2 / sec), 7.1 X 10" 6 (cm 2 / sec), 2.6 X 10 " 5 (cm 2 / sec) .
  • the ratio of the diffusion coefficient of methyl blue is Fuweno one Rure' de and a water-soluble hydrophobic substance is a water-soluble hydrophilic substance in 3 7 ° C in a low-melting Agarosuhai Dorogeru (D PR ZD MB) is 0.7 met Was.
  • the hydrogel-forming polymer TGP_5 obtained in Production Example 8 was dissolved in physiological saline, and the polymer concentration was 10% by mass (wt%), 8% by mass (wt%), 6% by mass (wt%). ) was prepared.
  • the respective sol-gel transition temperatures were measured and found to be 18 ° C, 20 ° C, and 22 ° C, respectively.
  • Each saline solution was cooled to below its sol-gel transition temperature and administered intraperitoneally to 10 rats per group in 6-week-old rats (5 males and 5 females) intraperitoneally.
  • the abdomen of the rat was shaved with an electric balkan, the administration site was disinfected with ethanol for disinfection, and then administered using a syringe and an indwelling needle (22 G).
  • a syringe and an indwelling needle 22 G
  • 2 animals (1 male and 1 female) were exsanguinated and killed under ether anesthesia on two days intraperitoneally.
  • the remaining hydrogel (the material for reproduction of the present invention) was examined.
  • the carrier for cell and tissue culture of the present invention gels at a predetermined temperature (for example, human or animal body temperature) to form a three-dimensional network structure and can retain cell growth factors and the like for a long period of time, Regeneration of the organs and tissues to be promoted.
  • a predetermined temperature for example, human or animal body temperature
  • the cell / tissue culture carrier of the present invention is composed of a hydrogel-forming polymer that gels at a low temperature and a sol state at body temperature, it can be used in a low temperature sol state in the carrier of the present invention. Can be seeded and mixed, and the carrier is brought into a gel state by gelling at a predetermined temperature (for example, human or animal body temperature) to regenerate tissues and organs It can function as an artificial carrier for adhesion and differentiation of stem cells and progenitor cells.
  • a predetermined temperature for example, human or animal body temperature
  • the carrier for cell and tissue culture of the present invention returns to a sol state by cooling to a temperature lower than the sol-gel transition temperature, it can be recovered without substantially damaging tissues and organs regenerated in the gel.

Description

明 細 書 細胞 · 組織培養用担体および培養方法 技術分野
本発明は、 動物細胞 · 組織の培養に好適に使用可能な細胞 · 組織 培養用担体および該担体を用いる細胞 · 組織の培養方法に関する。 よ り詳しく は、 本発明は、 イ ンビ ト ロ （in v i t r o ) における三次元 培養 （例えば、 ティ ッシュ ' エンジニアリ ング用材料の取得のため ) と して特に好適に使用できる細胞 · 組織培養用担体および該担体 を用いる細胞 · 組織の培養方法に関する。
本発明の細胞 · 組織培養用担体を用いるこ とによ り、 例えば、 分 化可能な細胞ないしこれを含む組織 （臓器を含む） を好適な状態で 三次元培養して、 該細胞ないし組織を分化させるこ とが可能となる
背景技術
移植医療のみならず、 遺伝子解析、 有用な細胞産生物の生産を目 的と したバイオリ アクター、 薬剤の生物活性評価、 等を始めとする 種々の研究 · 開発分野において、 動物細胞ないし組織の培養は広範 に利用されている。
例えば、 現在の移植医療の現場においては、 ドナー不足が深刻な こ とが緊急の問題である。 ヒ トまたは動物のいずれを ドナーとする にせよ、 「生体 ドナー」 の確保は、 今後においても極めて困難な問 題である。
他方、 この ドナー不足の問題を解決するための極めて有力な一手 法と して、 移植用の臓器や組織、 器官をイ ンビ ト ロで作成しよ う と するイ ンビ ト ロ ティ ッシュ · エンジニア リ ング （生体外組織工学 ) が脚光をあびている。 このティ ッシュ ' エンジニアリ ングの基本 戦略は、 細胞 （例えば幹細胞） を、 必要に応じて成長因子等の生理 活性物質と ともに人工的な細胞外担体 （ティ ッシュ · エンジニアリ ングにおいては 「細胞外マ ト リ ックス」 とも称する） に組み込み、 特定の臓器や組織、 器官を再生させるこ とである。
従来よ り、 細胞 · 組織培養における担体の役割は、 組織や臓器の 骨組みを構成し、 組織 · 臓器の形を決め、 さ らに組織 · 臓器の固さ 、 強さ、 柔軟性を決める という、 単に物理的で構造的なものと考え られてきた。 しかしながら、 最近の発生生物学、 細胞生物学の進展 によって、 細胞外担体は細胞の分化 · 増殖、 移動、 接着、 シグナル 伝達、 遺伝子発現、 ホルモン作用、 イオンチャ ンネルなど細胞活動 への多様な調節作用を担っているこ とが明らかにされてきた。
このよ うな状況下で、 細胞外担体の細胞分化 · 増殖機能に期待し て、 天然または合成の様々な細胞外担体、 例えばゥシコラーゲン Ty pe I を凍結乾燥したコラーゲンスポンジ、 ポリ乳酸ゃポリ グリ コー ル酸等の生分解性ポリ マーなどを利用したイ ンビ ト ロ ティ ッシュ
• エンジニアリ ングが盛んに試みられている （例えば、 上田実編 「 ティ ッシュ ' エンジニア リ ング」 、 1 9 9 9年、 名古屋大学出版会 を参照） 。
しかしながら、 上述したよ うな既存の細胞増殖用担体は固体であ るために、 該担体への細胞や組織の播種または混和が困難であった り、 細胞の増殖性や分化が不充分であるなどの問題があった。 加え て、 既存の細胞増殖用担体中で再生した組織を回収するために、 該 担体を溶解させるこ とが困難であったり、 回収の際に担体を溶解さ せるために高温にしたり、 または酵素処理したりするために、 該担 体中において再生した組織が傷害を受ける という 問題があった。 更に、 従来の担体における最も重大な問題は、 該担体中では目的 とする組織や臓器の再生に必要な細胞の増殖 · 分化よ り も繊維芽細 胞の増殖が盛んに起こるため、 目的とする組織や臓器の再生が困難 となることであった。 発明の開示
本発明の目的は、 上記した従来の細胞 · 組織培養用担体の欠点を 解消した人工担体ないし細胞外マ ト リ ッ クス （Ext ra Ce l lular Mat r ix、 E C M ) と して機能する細胞 ♦ 組織培養用担体、 およびそれ を用いた細胞 · 組織培養方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、 繊維芽細胞の過剰増殖を抑制しつつ、 目的 とする組織や臓器を効果的に再生できる細胞 · 組織培養用担体、 お よび細胞 ·組織培養方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、 種々の細胞 （幹細胞、 前駆細胞等） または これらの細胞を含有する生体組織等を容易に播種、 混和することが でき、 目的の組織や臓器を再生する種々の細胞の接着 · 分化 · 形態 形成のための E C Mと して機能できる細胞 · 組織培養用担体、 およ びそれを用いた細胞 ·組織培養方法を提供することにある。
本発明者は鋭意研究の結果、 よ り低温でゾル状態、 よ り高温でゲ ル状態となるゾルーゲル転移温度を有し、 且つ該ゾルーゲル転移が 熱可逆的であることを特徴とするハイ ドロゲル形成性の高分子を用 いて細胞 · 組織培養用担体を構成することが、 該高分子に基づくゲ ル内における繊維芽細胞の増殖を実質的に抑制することを可能と し 、 上記目的の達成のために極めて効果的であることを見出した。 本発明の細胞 · 組織培養用担体は上記知見に基づく ものであり、 よ り詳しく は、 その水溶液が低温でゾル状態、 高温でゲル状態とな る熱可逆的なゾル—ゲル転移を示すハイ ド口ゲル形成性の高分子を 少なく とも含む細胞 · 組織培養用担体であって、 且つ、 該ハイ ドロ ゲル形成性の高分子に基づく ゲル内で繊維芽細胞が実質的に増殖し ないこ とを特徴とするものである。
本発明によれば、 更に、 その水溶液が低温でゾル状態、 高温でゲ ル状態となる熱可逆的なゾルーゲル転移を示すハイ ド口ゲル形成性 の高分子と、 水とを少なく と も含む担体であって、 且つ、 該ゲル内 で繊維芽細胞が実質的に増殖しない担体を用い、
前記ゾルーゲル転移温度よ り低温のゾル状態で、 該担体に細胞ま たは組織を加え、
該ゾルーゲル転移温度よ り高温のゲル状態で、 前記担体を用いて 細胞または組織を培養し、
前記担体を再度ゾルーゲル転移温度よ り低温のゾル状態と して、 培養後の細胞または組織を回収するこ とを特徴とする細胞 · 組織の 培養方法が提供される。
上記構成を有する細胞 · 組織培養用担体において、 前記高分子は 、 曇点を有する複数のブロ ック と親水性のプロ ック とが結合した高 分子を少なく とも含むこ とが好ましい。
前記ハイ ドロゲル形成性の高分子のゾル—ゲル転移温度は、 o °c よ り高く 4 2 °C以下であるこ とが好ましい。
前記細胞 · 組織培養用担体は、 更に、 生体内組織 · 臓器の再生を 促進する化学仲介物質を含有するこ とが好ましい。
前記細胞 · 組織培養用担体は更に従来から細胞外担体と して使用 されてきたコラーゲン、 ゼラチンなどを含有するこ とも可能である
前記ハイ ドロゲル形成性の高分子水溶液は、 高温のゲル状態にお いて実質的に水不溶性を示すこ とが好ましい。 前記細胞 · 組織培養用担体は、 前記ハイ ドロゲル形成性の高分子 と、 水とを少なく とも含むこ とが好ましい。
(組織 · 臓器再生の推定メカニズム）
生物の体は、 通常は 1個の受精卵からスター トする。 その受精卵 は細胞分裂を繰り返し、 外胚葉、 中胚葉、 内胚葉の細胞に分化する 。 それぞれの胚葉は更に細胞分裂や移動を繰り返し、 手や足や種々 の組織 · 臓器となる。
広義の意味での幹細胞とは、 発生過程における形態形成や、 成体 における恒常性 · 生殖細胞の維持に働く一群の細胞である。 胚幹細 胞 （E S細胞） とは、 胚盤胞の内部細胞塊に由来し、 癌化するこ と なくイ ンビ ト ロで安定に増殖する細胞であり、 あらゆる細胞に分化 するこ とができる唯一の幹細胞といえる。
狭義の意味で使われる幹細胞とは、 成体でもなお組織や臓器の恒 常性の維持や傷害時の再生に働く細胞の一群といえる。 これまで、 造血組織、 骨格筋、 神経、 乳腺、 表皮、 腸管、 精子等において、 幹 細胞の存在が確認されている。 しかしながら、 これらの幹細胞や前 駆細胞のみでは生体内組織 ， 臓器の再生は起こ り えず、 通常は、 幹 細胞や前駆細胞の接着 · 分化 · 形態形成のための担体の存在が必要 と されている。
一般に担体 （ないし人工細胞外マ ト リ ッ クス） と して広く利用さ れているゥシコラーゲン T y p e I を凍結乾燥したコラーゲンスポ ンジ等の中では繊維芽細胞の増殖が盛んに起こるため、 これを細胞
• 組織培養用担体と した場合には （前記繊維芽細胞の増殖によ り） 目的とする細胞の増殖 · 分化が阻害されてしま う。
これに対して、 上記した本発明の細胞 · 組織培養用担体は繊維芽 細胞の過剰な増殖を抑制する機能があるため、 目的とする細胞等の 増殖 · 分化の足場と して有効に機能する。 すなわち、 本発明の細胞
• 組織培養用担体は、 目的とする細胞 （例えば幹細胞、 前駆細胞） の接着 · 分化 · 形態形成のための担体 （ないし人工細胞外マ ト リ ツ クス） と しての役割を効果的に果たすため、 良好な生体組織 · 臓器 の再生を達成することができる。
本発明の細胞 · 組織培養用担体を水溶液と した場合は、 該溶液は ゾルーゲル転移よ り低温では流動性のあるゾル状態であるため、 生 体の細胞や組織、 器官を容易に播種、 混和するこ とができる。 この ような溶液は、 そのまま体温 （ 3 7 °C ) でゲル化するため、 本発明 の細胞 · 組織培養用担体中で目的とする細胞 （例えば幹細胞、 前駆 細胞） を生体内と同様に三次元的に培養することができ、 良好な生 体内組織 ·臓器の再生を達成することができる。
生体組織の再生には、 前駆細胞等の細胞のみならず、 その分化や 増殖を促す細胞成長因子等の種々の化学仲介物質 （chem i ca l med i a t o r ) が必要な場合がある。 本発明の細胞 · 組織培養用担体は体温 でゲル化して三次元的な網目構造を形成しており、 且つ後述するよ うに該担体を構成するハイ ドロゲルはゲル内に多数の疎水性領域を 有していて、 疎水性の強い化学仲介物質を疎水結合によつて該細胞 • 組織培養用担体中に長期間にわたって保持しておく こ とができる ため、 良好な生体内組織 ·臓器の再生を達成することができる。 本発明の細胞 · 組織培養用担体中で細胞や組織等を培養した後、 再び冷却することにより該担体は低温で流動性のあるゾル状態に戻 るため、 再生された臓器や組織等を容易に、 且つ再生された臓器や 組織等に実質的に傷害を与えることなく、 回収することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1 において腌管組織外側から、 細胞が分裂、 増殖 した集塊を示す顕微鏡写真である （ 5 日 目、 倍率 X 1 0 0 ) 。
図 2は、 実施例 1 において、 経日的に大きさを増した細胞塊を示 す顕微鏡写真である （ 3 0 日 目、 倍率 X 1 0 0 ) 。 発明を実施するための最良の形態
以下、 必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明 する。 以下の記載において量比を表す 「部」 および 「％」 は、 特に 断らない限り質量基準とする。
(細胞 · 組織培養用担体）
本発明の細胞 · 組織培養用担体は、 ゾルーゲル転移温度を有する ハイ ド口ゲル形成性の高分子を少なく とも含む。 該細胞 ·組織培養 用担体は、 よ り低い温度でゾル状態、 よ り高い温度でゲル状態とな る熱可逆的なゾルーゲル転移を示す。
本発明の細胞 · 組織培養用担体は、 細胞および 又は組織の再生 のみならず修復にも利用することができる。
(修復）
本発明において、 「修復」 （r epa i r ) とは、 何らかの原因 （外傷 や疾病、 外科的手術等） により失われた細胞、 組織、 器官、 臓器等 が、 残存する同一の細胞や組織の増殖によって、 その連続性を回復 することをレ、う。
(再生）
本発明において、 「再生」 （r egene rat i on) とは、 何らかの原因 (外傷や疾病、 外科的手術等） によ り失われた細胞、 組織、 器官、 臓器等が、 残存する同一の細胞や組織の増殖によって、 元の姿に復 することをいう （ 「再生」 は、 通常は分化を伴う） 。 本発明におい て 「再生」 は、 残存する同一の細胞や組織の増殖のみによらず、 外 部から付与された細胞や組織の増殖によつて元の組織の連続性や機 能が回復する修復をも含む。
(ハイ ドロゲル形成性高分子） 本発明のハイ ドロゲルを構成する 「ハイ ドロゲル形成性高分子」 とは、 架橋 （crosslinking) 構造ないし網目構造を有し、 該構造に 基づき、 その内部に水等の分散液体を保持することによ りハイ ドロ ゲルを形成可能な性質を有する高分子をいう。 又、 「ハイ ド口ゲル 」 とは高分子からなる架橋ないし網目構造と該構造中に支持ないし 保持された （分散液体たる） 水を少なく とも含むゲルをいう。
架橋ないし網目構造中に保持された 「分散液体」 は水を主要成分 と して含む液体である限り、 特に制限されない。 よ り具体的に言え ば、 分散液体は水自身であってもよく又、 水溶液及び/又は含水液 体のいずれであってもよい。 この含水液体は、 該含水液体の全体 1 0 0部に対して、 水を 8 0部以上、 更には 9 0部以上含むことが好 ましい。
(ゾルーゲル転移温度）
本発明において 「ゾル状態」 、 「ゲル状態」 および 「ゾル—ゲル 転移温度」 は以下のよ うに定義される。 この定義については文献 （ Polymer Journal. 1 8 ( 5 ) 、 4 1 1 〜 4 1 6 ( 1 9 8 6 ) ) を 参照することができる。
よ り詳しく は、 ゾル状のハイ ドロゲル 1 m Lを内径 1 c mの試験 管に入れ、 所定の温度 （一定温度） と した水浴中で 1 2時間保持す る。 この後、 試験管の上下を逆にした場合に、 溶液 Z空気の界面 （ メニスカス） が溶液の自重で変形した場合 （溶液が流出した場合を 含む） には、 上記所定温度においてハイ ドロゲルは 「ゾル状態」 で あると定義する。 他方、 上記試験管の上下を逆にしても、 上記した 溶液 空気の界面 （メニスカス） が溶液の自重で変形しない場合に は、 該ハイ ドロゲルは、 上記所定温度において 「ゲル状態」 である と定義する。
上記測定において、 濃度が例えば約 8質量％のゾル状のハイ ドロ ゲル （溶液） を用い、 上記した 「所定温度」 を徐々に （例えば 1 °C きざみで） 上昇させて 「ゾル状態」 が 「ゲル状態」 に転移する温度 を求めた場合、 これによつて求められる転移温度を 「ゾル—ゲル転 移温度」 と定義する （この際、 「所定温度」 を例えば 1 °Cきざみで 下降させ、 「ゲル状態」 が 「ゾル状態」 に転移する温度を求めても よい） 。
(ゾルーゲル転移温度）
本発明において 「ゾル状態」 、 「ゲル状態」 および 「ゾル—ゲル 転移温度の定義および測定は、 文献 （H. Yoshioka ら、 Journal of Macromolecular science, A 3丄 、 1 ) ， 1 1 o ( 1 9 9 4 ) ) 【こ 記載された定義および方法に基づき、 以下のよ うにして求めてもよ レヽ
即ち、 観測周波数 1 H z における試料の動的弾性率を低温側から 高温側へ徐々に温度を変化 （ 1 °C/ 1 分） させて測定し、 該試料の 貯蔵弾性率 （G一、 弾性項） が損失弾性率 （G "、 粘性項） を上回 る点の温度をゾルーゲル転移温度とする。 一般に、 G" 〉 G ' の状 態がゾルであり 、 G" く G 'の状態がゲルであると定義される。 こ のゾルーゲル転移温度の測定に際しては、 下記の測定条件が好適に 使用可能である。
く動的 · 損失弾性率の測定条件〉
測定機器 （商品名） ： ス ト レス制御式レオメーター C S L 7 0 0 、 Carri-Med社製
試料溶液 （ないし分散液） の濃度 （ただし 「ゾルーゲル転移温度 を有する高分子化合物」 の濃度と して） ： 1 0 (重量） ％
試料溶液の量 ： 約 0. 8 g
測定用セルの形状 · 寸法 ： ァク リル製平行円盤 （直径 4. 0 c m ) 、 ギャップ 6 0 0 μ πι 測定周波数 ： 1 H Z
適用ス ト レス ： 線形領域内。
(好適なゾルーゲル転移温度）
本発明においては、 細胞や生体組織の熱的損傷を防ぐ点からは、 上記ゾル一ゲル転移温度は 0 °Cよ り高く、 4 5 °C以下であることが 好ましく 、 更には、 0 °Cよ り高く 4 2 °C以下 （特に 4°C以上 4 0 °C 以下である） ことが好ましい。
このよ うな好適なゾルーゲル転移温度を有するハイ ド口ゲルは、 後述するような具体的な化合物の中から、 上記したスク リーニング 方法 （ゾルーゲル転移温度測定法） に従って容易に選択することが できる。 本発明の担体を用いて生物体組織 ·臓器を再生させる一連 の操作においては、 上記したゾルーゲル転移温度 （ a °C) を細胞 ' 組織の培養温度 （ b °C) と、 細胞 · 組織を播種、 混和または回収す るための冷却時の温度 （ c °C) との間に設定することが好ましい。 すなわち、 上記した 3種の温度 a °C、 b °C、 および c °Cの間には、 b〉 a > cの関係があることが好ましい。 更には、 （ b— a ) は 1 〜 4 0 °C、 更には 2〜 3 0 °Cであることが好ましく、 また （ a — c ) は：！〜 4 0 °C、 更には 2〜 3 0 °Cであることが好ましい。
(担体の動作に対する追従性）
本発明の担体に基づくハイ ドロゲルは、 その生体組織の再生に伴 う組織の形態変化への追従性のバランスの点から、 よ り高い周波数 に対しては固体的な挙動を示し、 他方、 よ り低い周波数に対しては 液体的な挙動を示すことが好ましい。 よ り具体的には、 該ハイ ド口 ゲルの動作に対する追従性は以下の方法で好適に測定することが可 能である。
(動作に対する追従性の測定方法）
ハイ ドロゲル形成性の高分子を含む本発明の担体 （ハイ ドロゲル と して l m L) をゾル状態 （ゾルーゲル転移温度よ り低い温度） で 内径 1 c mの試験管に入れ、 該担体のゾルーゲル転移温度よ り も充 分高い温度 （たとえば該ゾルーゲル転移温度よ り も約 1 0°C高い温 度） と した水浴中で上記試験管を 1 2時間保持し、 該ハイ ド口ゲル をゲル化させる。
次いで、 該試験管の上下を逆にした場合に溶液/空気の界面 （メ ニスカス） が溶液の自重で変形するまでの時間 （T) を測定する。 ここで 1 /T ( s e c—1) よ り低い周波数の動作に対しては該ハイ ドロゲルは液体と して振舞い、 1 ZT ( s e c—1) よ り高い周波数 の動作に対しては該ハイ ド口ゲルは固体と して振舞う こ とになる。 本発明のハイ ドロゲルの場合には Tは 1分〜 2 4時間、 好ま しく は 5分〜 1 0時間である。
(定常流動粘度）
本発明の担体に基づくハイ ドロゲルのゲル的性質は、 定常流動粘 度の測定によっても好適に測定可能である。 定常流動粘度 77 (ィー タ） は、 例えばク リ ープ実験によって測定するこ とができる。
ク リ ーブ実験では一定のずり応力を試料に与え、 ずり歪の時間変 化を観測する。 一般に粘弾性体のク リ ープ挙動では、 初期にずり速 度が時間と ともに変化するが、 その後ずり速度が一定となる。 この 時のずり応力とずり速度の比を定常流動粘度 7? と定義する。 この定 常流動粘度は、 ニュー ト ン粘度と呼ばれるこ ともある。 ただし、 こ こで定常流動粘度は、 ずり応力にほとんど依存しない線形領域内で 決定する。
具体的な測定方法は、 測定装置と してス ト レス制御式粘弾性測定 装置 C S L型レオメーター （C S L 5 0 0、 米国キャ リ ーメ ド社製 ) を、 測定デバイスにアタ リル製円盤 （直径 4 c m) を使用し、 試 料厚み 6 0 0 μ mと して少なく と も 5分間以上の測定時間ク リーブ 挙動 （遅延曲線） を観測する。 サンプリ ング時間は、 最初の 1 0 0 秒間は 1秒に 1 回、 その後は 1 0秒に 1 回とする。
適用する 「ずり応力」 （ス ト レス） の決定にあたっては、 1 0秒 間ずり応力を負荷して偏移角度が 2 X 1 0 "3 r a d以上検出される 最低値に設定する。 解析には 5分以降の少なく と も 2 0以上の測定 値を採用する。 本発明の担体に基づくハイ ドロゲルは、 そのゾルー ゲル転移温度よ り約 1 0 °C高い温度において、 η が 5 X 1 03〜 5 X I 06 P a · s e c であるこ とが好ましく、 更には 8 X 1 03〜 2 X I 06 P a · s e c 、 特に l X l 04 P a · s e c以上、 1 X 1 0 6 P a · s e c以下であるこ とが好ま しい。
上記 ηが 5 X 1 03 P a · s e c未満では短時間の観測でも流動 性が比較的高く な り、 ゲルによる細胞や組織の三次元的な保持が不 充分となり易く 、 担体と して機能するこ とが困難となる傾向がある 。 他方、 7?が 5 X l 06 P a · s e c を超える と、 長時間の観測で もゲルが流動性をほとんど示さなく なる傾向が強ま り、 生物体組織 の再生に伴う動きに追従するこ との困難性が増大する。 また、 η が 5 X 1 06を超えるとゲルが脆さを呈する可能性が強ま り、 わずか の純弾性変形の後、 一挙にもろく破壊する脆性破壊が生起しゃすい 傾向が強まる。
(動的弾性率）
本発明の担体に基づくハイ ドロゲルのゲル的性質は、 動的弾性率 によっても好適に測定可能である。 該ゲルに振幅 γ。、 振動数を ω 2 π とする歪み τ/ ( t ) = y。 c o s o> t ( t は時間） を与えた 際に、 一定応力を σ。、 位相差を δ とする σ ( t ) = o。 c o s ( ω t + δ ) が得られたとする。 I G I = σ。/ γ。とする と、 動的弾性 率 G ' ( o) ) = | G | c o s S と、 損失弾性率 G " ( ω ) = I G | s i η δ との比 （G " Z G ' ) 力 S、 ゲル的性質を表す指標となる。 本発明の担体に基づくハイ ド口ゲルは、 ノ 2 π = 1 Η ζ の歪み (速い動作に対応する） に対しては固体と して挙動し、 且つ、 2 π = 1 0—4 Η ζ の歪み （遅い動作に対応する） に対しては固体と して挙動する。 よ り具体的には、 本発明の担体に基づくハイ ドロゲ ルは、 以下の性質を示すこ とが好ま しい （このよ う な弾性率測定の 詳細については、 例えば、 文献 ： 小田良平ら編集、 近代工業化学 1 9、 第 3 5 9頁、 朝倉書店、 1 9 8 5 を参照するこ とができる） 。 ω / 2 π = 1 Η ζ (ゲルが固体と して挙動する振動数） の際に、 ( G " / G ' ) s = ( t a n δ ) sが 1未満であるこ とが好ましい 。 この （G " G， ) s = ( t a n δ ) sは、 よ り好ましく は 0 . 8以下、 特に好ましく は 0 . 5以下である。
ω 2 π = 1 0—4 Η ζ (ゲルが液体と して挙動する振動数） の際 に、 （ G " G， ） L = ( t a η δ ) Lが 1以上であることが好ま しい。 この （ G " Z G ' ) L = ( t a n δ ) Lは、 よ り好ま しく は 1 . 5以上、 特に好ましく は 2以上である。
上記 （ t a n S ) sと、 （ t a n S ) Lとの比 { ( t a n δ ) S Z ( t a n δ ) L } が 1未満であるこ とが好ま しい。 この比 { ( t a n δ ) s / ( t a n S ) J は、 よ り好ま しく は 0 . 8以 下、 特に好ま しく は 0 . 5以下である。
く測定条件 >
ハイ ド口ゲル形成性高分子の濃度 ： 約 8質量％
温度 ： 担体のゾル—ゲル転移温度よ り約 1 0 °C高い温度
測定機器 ： ス ト レス制御式レオメータ （機種名 ： C S L 5 0 0 、 米国キヤ リ ーメ ド社製）
(生体内残存性の制御）
本発明のハイ ドロゲルは、 必要に応じて、 生体内 （腹腔内、 皮下 など） における残存性を任意に制御するこ とができる。 本発明のハ ィ ドロゲルは、 主にインビト ロにおける使用を目的とするが、 その 使用法 （例えば、 本発明のハイ ドロゲルを用いて増殖させた組織を 、 生体内に戻す場合等） によっては、 該ハイ ドロゲルの生体内残存 性の制御が好ましい場合があるからである。
本発明のハイ ドロゲルのゾルーゲル転移温度を低下させると、 ハ ィ ドロゲルは生体内で長期間残存するようになり、 ゾル—ゲル転移 温度を上昇させると生体内でハイ ドロゲルの消失が速く なる。 また 、 ハイ ド口ゲル中のハイ ド口ゲル形成性高分子の濃度を高くすると ハイ ドロゲルは生体内で長期間残存するようになり、 ハイ ドロゲル 中のハイ ドロゲル形成性高分子の濃度を低くすると、 生体内でハイ ド口ゲルの消失が速くなる。
本発明のハイ ドロゲノレでは、 本発明のハイ ドロゲルのゾル -ゲノレ 転移温度を低下させると、 生体温度 （ 3 7 °C) におけるハイ ド口ゲ ルの貯蔵弾性率 （G' ) が上昇する。 また、 ハイ ドロゲル中のハイ ドロゲル形成性高分子の濃度を高くすると、 生体温度 （ 3 7 °C) に おけるハイ ドロゲルの貯蔵弾性率 （G' ) が上昇する。 すなわち、 生体内での残存性を制御するためには、 3 7でにぉける 0' を制御 すれば良い。
この G' の測定測定に際しては、 下記の測定条件が好適に使用可 能である。
<動的 · 損失弾性率の測定条件 >
測定機器 （商品名） ： ス ト レス制御式レオメーター C S L 5 0 0、 Carri- Med社製
試料溶液の量 ： 約 0. 8 g
測定用セルの形状 · 寸法 アク リル製平行円盤 （直径 4. 0 c m) 、 ギャ ップ 6 0 0 μ ΐη、
測定周波数 ： 1 H z 適用ス ト レス ： 線形領域内。
本発明のハイ ドロゲルの生体内での残存期間と G' の関係は生体 内の部位によっても異なるので一概には言えないが、 例えば腹腔内 での残存期間と、 観測周波数 1 H zでの G' の関係は、 本発明者ら の知見によれば、 以下の通りである。
すなわち、 3 日以内に消失させるための G' の望ましい範囲は 1 0〜 5 0 0 P a、 3 日以上残存し 1 4 日以内にさせるための G' の 望ましい範囲は 2 0 0〜 1 5 0 0 P a、 1 4 日以上残存させるため の G' の望ましい範囲は 4 0 0〜 1 0 0 0 0 P aである。
(繊維芽細胞の増殖性）
本発明において、 担体を構成するハイ ドロゲル形成性高分子に基 づくハイ ドロゲルにおいては、 該ゲル内で繊維芽細胞が実質的に増 殖しない。 繊維芽細胞は通常、 細胞培養ディ ッシュ （プレー ト） 上 の単層培養ゃコラーゲンゲル内での培養において、 繊維芽細胞に特 徴的な樹枝状の形態変化を伴った著しい増殖が認められる （例えば 、 文献檟並淳平 ： 培養細胞を用いる方法。 渡辺明治編、 細胞外マ ト リ ッ クス、 メディカルレビュー社、 東京、 1 9 9 6， p p 1 0 8 - 1 1 5を参照） 。 これに対して、 本発明のハイ ドロゲル内では、 繊 維芽細胞は球状の形態を保ったままで実質的に増殖を示さない。
(繊維芽細胞増殖抑制の推定メ力二ズム）
本発明の組織 · 臓器再生用材料において、 繊維芽細胞の増殖が抑 制されるメカニズムは必ずしも明確ではないが、 本発明者の知見に よれば、 以下のよ うに推定される。
すなわち、 繊維芽細胞は単層培養、 すなわち支持体表面を認識し て接着することによ り 2次元的に活発に増殖する性質を有する。 コ ラーゲンゲルの構造は、 長さ 3 0 0 n m、 直径 1. 5 n mのコラ一 ゲン分子 （分子量 3 0万） が多数集合し、 規則正しく配列して繊維 の状態 （collagen fibril) となって水中に網目構造を作ったもの である。 この網目構造は可視光の波長よ り大きい構造 （ 4 0 0 n m 以上） のため、 コラーゲンゲルは通常白濁して見える。 コラーゲン ゲルは 3次元培養担体と して利用されているが、 繊維芽細胞はこの 太いコラーゲン繊維 （collagen fibril) の表面を支持体と して認 識して接着するため、 コラーゲンゲル内で 2次元的に著しい増殖性 を示すものと推定される。
これに対して、 本発明の組織 ·臓器再生用材料はハイ ドロゲル形 成性の高分子が分子状態で 3次元網目構造を形成したハイ ド口ゲル となるため、 その構造の不均質性は、 可視光の波長よ り小さく比較 的透明性が高い。 従って、 本発明の材料中では繊維芽細胞が明確な 2次元的支持体表面を認識することがなく、 その結果、 本発明の材 料中では繊維芽細胞が過剰に増殖することが抑制されるものと推定 される。
(繊維芽細胞の増殖性の評価）
繊維芽細胞の増殖性は、 以下の方法によ り評価できる （この方法 の詳細に関しては、 例えば、 吉川剛司、 月川賢、 聖マリ アンナ医科 大学雑誌、 第 2 8卷、 第 4号、 1 6 1 — 1 7 0 ( 2 0 0 0 ) を参照 することができる） 。
本発明の細胞 · 組織培養用担体を構成するハイ ドロゲル形成性高 分子を培養液、 例えば R P M I _ 1 6 4 0 (Life Technologies, N. Y. 、 U S A) に低温 （例えば 4 °C) 下で攪拌溶解し、 正常ヒ ト 肺繊維芽細胞 （Normal Human Lung Fibroblasts, NH L F、 宝酒 造 （株） 社製） ) を 6 X 1 04個 Zm lの細胞密度になるように分 散させる。 この NH L F分散液 0. 2 m Lを 2 4 ゥエル—プレー ト
(材料 ： プラスチック製、 ゥエル 1個の大きさは縦 1 5 mm、 横 1 5 mm, 深さ 2 0 mm程度 ； 市販品では、 例えば Becton- Dickinson 社製の商品名 ： Multiwell) の各ゥエル中に注入し、 3 7 °Cでゲル 化させた後、 培養液 0. 4 m Lを添加して 3 7 °C、 5 % C O2大気 圧下で培養する。 繊維芽細胞の増殖の様子は、 経日的に （例えば、 0、 1 、 3、 7 0 ) 位相差顕微鏡による観察で確認する。
(繊維芽細胞の増殖率）
更に、 以下の酵素活性を利用する方法によ り、 培養期間中の繊維 芽細胞の増殖率を測定することが可能である。
例えば、 上記したように 2 4—ゥヱループレー トを用いて、 本発 明の細胞 · 組織培養用担体中で繊維芽細胞を所定期間培養した後、 該担体をそのゾルーゲル転移温度よ り低い温度 （例えば、 ゾルーゲ ル転移温度よ り 1 0 °C低い温度） に下げることによって該担体を溶 解し、 次いで各ゥエル中にコハク酸脱水素酵素活性測定用試薬たる W S T - 8試薬 （同仁化学 （株） 製） 5 0 μ 1 を添加する。
この 2 4 —ゥエル—プレー トを、 ゾル—ゲル転移温度より低い温 度 （例えばゾルーゲル転移温度より 1 0 °C低い温度、 例えば 1 0 °C ) で 1 0時間反応させた後、 約 4 °Cに 1時間保存し完全に均一な水 溶液の状態にする。 該水溶液を 9 6 ゥヱル一プレー トに 2 0 0 μ 1 づっ分注し、 マイク ロプレー ト用比色計を用いて 4 5 O n m (参照 波長 6 2 0 n m) で吸光度 （O D ( 4 5 0 ) ) を測定する。 この O D ( 4 5 0 ) と、 生細胞数とは比例関係にあることが確かめられて レヽる （例； L i 、 文默 Furukawa、 T. ら、 High in vitro— in vitro correlation of drug response using spongegel- supported thr e e - dimensional histoculture and MTT end point" 、 Int. J. Can cer 5 1 : 4 8 9、 1 9 9 2を参照） 。 すなわち、 繊維芽細胞の 増殖率は、 培養開始時の吸光度 O Df = (O D ( 4 5 0 ) ) と培養 後の吸光度 O DL = (O D ( 4 5 0 ) ) の比 （O DL/O Df) によ り求められる。 本発明において、 3 日間 3 7 °Cで培養した後の繊維芽細胞の増殖 率 PF = ( O DL/ O D f ) は、 7 0 %から 2 0 0 %の範囲であるこ とが好ましい。 この増殖率 （O
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は、 更には 8 0 %から 1 5 0 %の範囲、 特に 9 0 %から 1 2 0 %の範囲であることが望ま しい。
(繊維芽細胞の相対的な増殖性）
本発明において、 ハイ ドロゲル形成性の高分子に基づくゲル中で 、 繊維芽細胞の増殖は抑制される一方で、 目的とする （繊維芽細胞 以外の） 細胞の増殖は、 相対的に抑制されないことが好ましい。 よ り詳しくは、 目的とする細胞の増殖率 Ρτと、 上記した繊維芽細胞 の増殖率 pFとの比 （PT/PF) は、 1. 1以上であることが好ま しい。 更には、 この比 （ΡτΖΡρ) は、 1. 5以上、 特に 2. 0以 上であることが好ましい。 この目的とする細胞の増殖率 Ρτは、 以 下のよ うにして求めることができる。
上記した繊維芽細胞の増殖率 PF測定における正常ヒ ト肺繊維芽 細胞 （NH L F) に代えて、 ヒ ト大腸ガン細胞 （ SW— 9 4 8、 商 品名 ： 大腸腺癌細胞株、 大日本製薬 （株） 製） を用いる以外は、 上 記増殖率 PF測定と同様にして、 繊維芽細胞以外の細胞の増殖率 Ρτ を求める （これらの増殖率 Ρτおよび PFの測定は、 同様の条件下で 行う） 。
上記により測定した増殖率 Ρτおよび PFの値に基づき、 これらの 比 （ PTZPF) を求める。
(ハイ ドロゲル形成性の高分子）
上述したよ うな熱可逆的なゾルーゲル転移を示す （すなわち、 ゾ ルーゲル転移温度を有する） 限り、 本発明の担体に使用可能なハイ ドロゲル形成性の高分子は特に制限されない。 生理的温度 （ 0〜 4 2 °C程度） において好適なゾルーゲル変化を示すことが容易な点か らは、 例えば、 該ハイ ドロゲル形成性の高分子中の曇点を有する複 数のプロ ック と親水性のブロ ックの曇点、 両ブロ ックの組成および 両ブロ ックの疎水性度、 親水性度、 および/又は分子量等をそれぞ れ調整するこ とによって、 好適なゾルーゲル転移温度を達成するこ とが好ましい。
その水溶液がゾルーゲル転移温度を有し、 該転移温度よ り低い温 度で可逆的にゾル状態を示す高分子の具体例と しては、 例えば、 ポ リ プロ ピレンォキサイ ドとポリ エチレンォキサイ ドとのブロ ック共 重合体等に代表されるポリ アルキレンオキサイ ドブロ ック共重合体
； メ チノレセノレロース、 ヒ ドロ キシプロ ピノレセノレロース等のエーテノレ ィ匕セノレロース ； キ トサン誘導体 （K. R. Holme, et al. Macromol ecules、 2 4、 3 8 2 8 ( 1 9 9 1 ) ) 等が知られている。
ポリ アルキレンォキサイ ドブロ ック共重合体と して、 ポリ プロ ピ レンォキサイ ドの両端にポリ エチレンォキサイ ドが結合したプル口 ニック (Pluronic) F - 1 2 7 (商品名、 BASF Wyandotte Chemica Is Co. 製） ゲルが開発されている。 このプル口ニック F— 1 2 7 の高濃度水溶液は、 約 2 0 °C以上でハイ ド口ゲルとな り、 これよ り 低い温度で水溶液となるこ とが知られている。 しかしながら、 この 材料の場合は約 2 0質量％以上の高濃度でしかゲル状態にはならず 、 また約 2 0質量％以上の高濃度でゲル化温度よ り高い温度に保持 しても、 更に水を加える とゲルが溶解してしま う。 また、 プルロニ ック F— 1 2 7は分子量が比較的小さ く 、 約 2 0質量％以上の高度 のゲル状態で非常に高い浸透圧を示すのみならず細胞膜を容易に透 過するため、 細胞 · 組織に悪影響を及ぼす可能性がある。
一方、 メ チノレセノレロース、 ヒ ドロ キシプロ ピノレセルロース等に代 表されるエーテル化セルロースの場合は、 通常は、 ゾル—ゲル転移 温度が高く約 4 5 °C以上である （N. Sarkar、 J . Appl. Polym. Scien ce、 2 4 、 1 0 7 3 、 1 9 7 9 ) 。 これに対して、 生体の体温は 通常 3 7 °C近辺の温度であるため、 上記エーテル化セルロースはゾ ル状態であり、 該エーテル化セルロースを組織 · 臓器の担体と して 用いるこ とは事実上は困難である。
上記したよ う に、 その水溶液がゾルーゲル転移点を有し、 且つ該 転移温度よ り低い温度で可逆的にゾル状態を示す従来の高分子の問 題点は、 1 ) ゾルーゲル転移温度よ り高い温度でー且ゲル化しても 、 更に水を添加する とゲルが溶解してしま う こ と、 2 ) ゾルーゲル 転移温度が生体の体温 （ 3 7 °C近辺） よ り も高く 、 体温ではゾル状 態であるこ と、 3 ) ゲル化させるためには、 水溶液の高分子濃度を 非常に高くする必要があるこ と、 等である。
これに対して、 本発明者らの検討によれば、 好ましく は 0 °Cよ り 高く 4 2 °C以下であるゾルーゲル転移温度を有するハイ ドロゲル形 成性の高分子 （例えば、 曇点を有する複数のブロ ック と親水性のブ ロ ックが結合してなり、 その水溶液がゾル—ゲル転移温度を有し、 且つ、 ゾルーゲル転移温度よ り低い温度で可逆的にゾル状態を示す 高分子） を用いて本発明の担体を構成した場合に、 上記問題は解決 されるこ とが判明している。
(好適なハイ ドロゲル形成性の高分子）
本発明の担体と して好適に使用可能な疎水結合を利用したハイ ド 口ゲル形成性の高分子は、 曇点を有する複数のブロ ック と親水性の ブロ ックが結合してなるこ とが好ま しい。 該親水性のブロ ックは、 ゾルーゲル転移温度よ り低い温度で該ハイ ドロゲルが水溶性になる ために存在するこ とが好ま しく 、 また曇点を有する複数のブロ ック は、 ハイ ドロゲルがゾルーゲル転移温度よ り高い温度でゲル状態に 変化するために存在するこ とが好ましい。 換言すれば、 曇点を有す るブロ ックは該曇点よ り低い温度では水に溶解し、 該曇点よ り高い 温度では水に不溶性に変化するために、 曇点よ り高い温度で、 該ブ ロ ックはゲルを形成するための疎水結合からなる架橋点と しての役 割を果たす。 すなわち、 疎水性結合に由来する曇点が、 上記ハイ ド 口ゲルのゾルーゲル転移温度に対応する。
ただし、 該曇点とゾル—ゲル転移温度とは必ずしも一致しなくて もよい。 これは、 上記した 「曇点を有するブロ ック」 の曇点は、 一 般に、 該ブロ ック と親水性プロ ック との結合によって影響を受ける ためである。
本発明に用いるハイ ドロゲルは、 疎水性結合が温度の上昇と共に 強くなるのみならず、 その変化が温度に対して可逆的であるという 性質を利用したものである。 1分子内に複数個の架橋点が形成され
、 安定性に優れたゲルが形成される点からは、 ハイ ドロゲル形成性 の高分子が 「曇点を有するブロ ック」 を複数個有することが好まし レヽ
一方、 上記ハイ ドロゲル形成性の高分子中の親水性ブロックは、 前述したように、 該ハイ ドロゲル形成性の高分子がゾル—ゲル転移 温度よ り も低い温度で水溶性に変化させる機能を有し、 上記転移温 度よ り高い温度で疎水性結合力が増大しすぎて上記ハイ ドロゲルが 凝集沈澱してしまうことを防止しつつ、 含水ゲルの状態を形成させ る機能を有する。
(曇点を有する複数のブロ ック）
曇点を有するブロ ック と しては、 水に対する溶解度一温度係数が 負を示す高分子のブロ ックであることが好ましく、 よ り具体的には 、 ポリ プロ ピレンォキサイ ド、 プロ ピレンォキサイ ドと他のアルキ レンォキサイ ドとの共重合体、 ポリ N _置換アク リ ルアミ ド誘導体 、 ポリ N—置換メタアク リ ルアミ ド誘導体、 N—置換アク リ ルアミ ド誘導体と N—置換メタアク リルアミ ド誘導体との共重合体、 ポリ ビニルメ チルエーテル、 ポ リ ビュルアルコール部分酢化物からなる 群よ り選ばれる高分子が好ましく使用可能である。 上記の高分子 （ 曇点を有するブロ ック） の曇点が 4 °Cよ り高く 4 0 °C以下であるこ とが、 本発明に用いる高分子 （曇点を有する複数のブロ ック と親水 性のブロ ックが結合した化合物） のゾルーゲル転移温度を 4 °Cよ り 高く 4 0 °C以下とする点から好ましい。
ここで曇点の測定は、 例えば、 上記の高分子 （曇点を有するプロ ック） の約 1質量％の水溶液を冷却して透明な均一溶液と した後、 除々に昇温 （昇温速度約 1 °C Z m i n ) して、 該溶液がはじめて白 濁する点を曇点とするこ とによって行う こ とが可能である。
本発明に使用可能なポリ N—置換アク リルアミ ド誘導体、 ポリ N —置換メ タァク リルアミ ド誘導体の具体的な例を以下に列挙する。 ポリ 一 N—ァク ロイルビペリ ジン ； ポリ 一 N— n —プロ ピルメ タ アタ リ ノレアミ ド ； ポリ 一 N—イ ソプロ ピルアク リ ルア ミ ド ； ポ リ 一 N、 N—ジェチルアク リ ルア ミ ド ； ポリ 一 N—イ ソプロ ピルメ タァ ク リ ノレア ミ ド ； ポ リ 一 N—シク ロ プロ ピルアク リ ルア ミ ド ； ポ リ 一 N—ァク リ ロイノレピロ リ ジン ； ポリ 一 N、 N—ェチルメチルァク リ ルア ミ ド ； ポリ 一 N—シク ロ プロ ピルメ タァク リ ノレア ミ ド ； ポ リ 一 N—ェチルァク リルアミ ド。
上記の高分子は単独重合体 （ホモポリ マー） であっても、 上記重 合体を構成する単量体と他の単量体との共重合体であってもよい。 このよ うな共重合体を構成する他の単量体と しては、 親水性単量体 、 疎水性単量体のいずれも用いるこ とができる。 一般的には、 親水 性単量体と共重合する と生成物の曇点は上昇し、 疎水性単量体と共 重合する と生成物の曇点は下降する。 従って、 これらの共重合すベ き単量体を選択するこ とによつても、 所望の曇点 （例えば 4 °Cよ り 高く 4 0 °C以下の曇点） を有する高分子を得るこ とができる。 (親水性単量体）
上記親水性単量体と しては、 N —ビュルピロ リ ドン、 ビニルピリ ジン、 アタ リノレアミ ド、 メ タァク リノレアミ ド、 N —メチルアタ リノレ アミ ド、 ヒ ドロキシェチノレメ タアタ リ レー ト、 ヒ ドロキシェチノレア ク リ レー ト、 ヒ ドロキシメチルメ タアタ リ レー ト、 ヒ ドロキシメチ ルアタ リ レー ト、 酸性基を有するアク リル酸、 メタアク リル酸およ びそれらの塩、 ビニルスルホン酸、 スチレンスルホン酸等、 並びに 塩基性基を有する N、 N—ジメチルアミ ノエチルメ タク リ レー ト、 N、 N —ジェチルアミ ノエチルメ タク リー ト、 N、 N—ジメチルァ ミ ノプロ ピルァク リルアミ ドおよびそれらの塩等が挙げられる力 これらに限定されるものではない。
(疎水性単量体）
一方、 上記疎水性単量体と しては、 ェチルアタ リ レー ト、 メチル メ タク リ レ一 ト、 グリ シジルメ タク リ レー ト等のァク リ レー ト誘導 体およびメ タク リ レー ト誘導体、 N _ n —ブチルメ タアタ リノレアミ ド等の N —置換アルキルメ タアク リルアミ ド誘導体、 塩化ビエル、 アタ リ ロニ ト リノレ、 スチレン、 酢酸ビニル等が挙げられるが、 これ らに限定されるものではない。
(親水性のプロ ック）
一方、 上記した曇点を有するプロ ック と結合すべき親水性のプロ ック と しては、 具体的には、 メチルセルロース、 デキス ト ラ ン、 ポ リエチレンオキサイ ド、 ポリ ビュルアルコール、 ポリ N—ビュルピ 口 リ ドン、 ポリ ビニルピリ ジン、 ポリ アク リルアミ ド、 ポリ メ タァ ク リノレアミ ド、 ポリ N —メチルアク リルアミ ド、 ポリ ヒ ドロキシメ チルァク リ レー ト、 ポリ アク リル酸、 ポリ メ タク リル酸、 ポリ ビニ ルスルホン酸、 ポリ スチレンスルホ ン酸およびそれらの塩 ； ポリ N 、 N —ジメチルアミ ノエチルメ タク リ レー ト、 ポリ N、 N —ジェチ ルアミ ノエチルメ タタ リ レー ト、 ポリ N、 N —ジメチルァミ ノプロ ピルァク リ ルアミ ドおよびそれらの塩等が挙げられる。
曇点を有するブロ ック と上記の親水性のブロ ック とを結合する方 法は特に制限されないが、 例えば、 これらのブロ ックを有するプロ ック共重合体、 またはグラフ ト共重合体またはデン ドリ マ一型共重 合体と して得るこ とが好ましい。
曇点を有するブロ ック と親水性のプロ ック との結合は、 上記いず れかのブロ ック中に重合性官能基 （例えばァク リ ロイル基） を導入 し、 他方のブロ ックを与える単量体を、 このよ う に重合性官能基を 導入したブロ ック と共重合させるこ とによつて行う こ とができる。 また、 曇点を有するプロ ック と上記の親水性のプロ ック との結合物 は、 曇点を有するブロ ックを与える単量体と、 親水性のブロ ックを 与える単量体とのプロ ック共重合によって得るこ と も可能である。 また、 曇点を有するブロ ック と親水性のブロ ック との結合は、 予め 両者に反応活性な官能基 （例えば水酸基、 アミ ノ基、 カルボキシル 基、 イ ソシァネー ト基等） を導入し、 両者を化学反応によ り結合さ せるこ とによって行う こ ともできる。 この際、 親水性のブロ ック中 には通常、 反応活性な官能基を複数導入する。
また、 曇点を有するポ リ プロ ピレンオキサイ ドと親水性のブロ ッ ク との結合に関しては、 例えば、 ァニオン重合またはカチオン重合 で、 プロ ピレンオキサイ ドと 「他の親水性ブロ ック」 を構成するモ ノ マー （例えばエチレンォキサイ ド） とを繰り返し逐次重合させる こ とで、 ポリ プロ ピレンオキサイ ドと 「親水性ブロ ック」 （例えば ポリ エチレンオキサイ ド） が結合したブロ ック共重合体を得るこ と ができる。 このよ うなブロ ック共重合体は、 ポリ プロ ピレンォキサ イ ドの末端に重合性基 （例えばァク リ ロイル基） を導入後、 親水性 のブロ ックを構成するモノマーを共重合させるこ とによつても得る ことができる。 更には、 親水性のブロ ック中に、 ポリプロピレンォ キサイ ド末端の官能基 （例えば水酸基） と結合反応し得る官能基を 導入し、 両者を反応させることによつても、 本発明に用いる高分子 を得ることができる。 また、 ポリ プロ ピレングリ コールの両端にポ リエチレングリ コールが結合した、 プル口ニック F— 1 2 7 (商 品名、 旭電化工業 （株） 製） 等の材料を連結させることによつても 、 本発明に用いるハイ ド口ゲル形成性の高分子を得ることができる この曇点を有するプロ ックを含む態様における本発明の高分子は 、 曇点より低い温度においては、 分子内に存在する上記 「曇点を有 するブロック」 が親水性のブロ ック と ともに水溶性であるため、 完 全に水に溶解し、 ゾル状態を示す。 しかしながら、 この高分子の水 溶液の温度を上記曇点よ り高い温度に加温すると、 分子内に存在す る 「曇点を有するブロ ック」 が疎水性となり、 疎水的相互作用によ つて、 別個の分子間で会合する。
一方、 親水性のブロ ックは、 この時 （曇点よ り高い温度に加温さ れた際） でも水溶性であるため、 本発明の高分子は水中において、 曇点を有するブロ ック間の疎水性会合部を架橋点と した三次元網目 構造を持つハイ ドロゲルを生成する。 このハイ ドロゲルの温度を再 び、 分子内に存在する 「曇点を有するブロ ック」 の曇点よ り低い温 度に冷却すると、 該曇点を有するブロ ックが水溶性となり、 疎水性 会合による架橋点が解放され、 ハイ ドロゲル構造が消失して、 本発 明の高分子は、 再び完全な水溶液となる。 このよ う に、 好適な態様 における本発明の高分子のゾルーゲル転移は、 分子内に存在する曇 点を有するブロ ックの該曇点における可逆的な親水性、 疎水性の変 化に基づく ものであるため、 温度変化に対応して、 完全な可逆性を 有する。 (ゲルの溶解性）
上述したよ うに水溶液中でゾルーゲル転移温度を有する高分子を 少なく とも含む本発明のハイ ドロゲル形成性の高分子は、 該ゾルー ゲル転移温度よ り高い温度 （ d °C) で実質的に水不溶性を示し、 ゾ ルーゲル転移温度よ り低い温度 （ e °C) で可逆的に水可溶性を示す 上記した高い温度 （ d °C) は、 ゾルーゲル転移温度よ り 1 °C以上 高い温度であることが好ましく、 2 °C以上 （特に 5 °C以上） 高い温 度であることが更に好ましい。 また、 上記 「実質的に水不溶性」 と は、 上記温度 （ d °C) において、 水 1 0 0 m Lに溶解する上記高分 子の量が、 5. 0 g以下 （更には 0. 5 g以下、 特に 0. l g以下 ) であることが好ましい。
一方、 上記した低い温度 （ e °C) は、 ゾル—ゲル転移温度より （ 絶対値で） 1 °C以上低い温度であることが好ましく、 2 °C以上 （特 に 5 °C以上） 低い温度であることが更に好ましい。 また、 上記 「水 可溶性」 とは、 上記温度 （ e °C) において、 水 1 0 0 m Lに溶解す る上記高分子の量が、 0. 5 g以上 （更には 1 . 0 g以上） である ことが好ましい。 更に 「可逆的に水可溶性を示す」 とは、 上記ハイ ドロゲル形成性の高分子の水溶液が、 ー且 （ゾルーゲル転移温度よ り高い温度において） ゲル化された後においても、 ゾル—ゲル転移 温度よ り低い温度においては、 上記した水可溶性を示すことをいう 上記高分子は、 その 1 0 %水溶液が 5 °Cで、 1 0〜3， 0 0 0 m P a · s ( 1 0〜3， 0 0 0センチボイズ） 、 更には 5 0〜： 1， 0 0 0 m P a · s ( 5 0〜 1， 0 0 0センチボイズ） の粘度を示すこ とが好ましい。 このような粘度は、 例えば以下のような測定条件下 で測定することが好ましい。 粘度計 ： ス ト レス制御式レオメータ （機種名 ： C S L 5 0 0 、 米国 キャ リ ーメ ド社製）
ロータ一直径 : 6 0 mm
口一ター形状 ： 平行平板
測定周波数 ： 1 H z (ヘルツ）
本発明のハイ ドロゲル形成性の高分子の水溶液は、 上記ゾルーゲ ル転移温度よ り高い温度でゲル化させた後、 多量の水中に浸漬して も、 該ゲルは実質的に溶解しない。 上記担体の上記特性は、 例えば 、 以下のよ う にして確認するこ とが可能である。
すなわち、 本発明のハイ ド口ゲル形成性の高分子 0. 1 5 g を、 上記ゾルーゲル転移温度よ り低い温度 （例えば氷冷下） で、 蒸留水 1 . 3 5 gに溶解して 1 0 W%の水溶液を作製し、 該水溶液を径が 3 5 mmのプラスチックシャーレ中に注入し、 3 7 °Cに加温するこ とによって、 厚さ約 1 . 5 mmのゲルを該シャーレ中に形成させた 後、 該ゲルを含むシャーレ全体の質量 （ f グラム） を測定する。 次 いで、 該ゲルを含むシャーレ全体を 2 5 0 m 1 中の水中に 3 7でで 1 0時間静置した後、 該ゲルを含むシャ一レ全体の質量 （ g グラム ) を測定して、 ゲル表面からの該ゲルの溶解の有無を評価する。 こ の際、 本発明のハイ ドロゲル形成性の高分子においては、 上記ゲル の質量減少率、 すなわち （ f — g ) / f が、 5 . 0 %以下であるこ とが好ましく 、 更には 1 . 0 %以下 （特に 0. 1 %以下） であるこ とが好ましい。
本発明のハイ ドロゲル形成性の高分子の水溶液は、 上記ゾルーゲ ル転移温度よ り高い温度でゲル化させた後、 多量 （体積比で、 ゲル の 0. 1〜 1 0 0倍程度） の水中に浸漬しても、 長期間に亘つて該 ゲルは溶解するこ とがない。 このよ うな本発明に用いる高分子の性 質は、 例えば、 該高分子内に曇点を有するブロ ックが 2個以上 （複 数個） 存在することによって達成される。
これに対して、 ポリ プロ ピレンォキサイ ドの両端にポリエチレン ォキサイ ドが結合してなる前述のプル口ニック F— 1 2 7を用いて 同様のゲルを作成した場合には、 数時間の静置で該ゲルは完全に水 に溶解することを、 本発明者らは見出している。
非ゲル化時の細胞毒性をできる限り低いレベルに抑える点からは 、 水に対する濃度、 すなわち { (高分子） / (高分子 +水） } X I 0 0 ( % ) で、 2 0 %以下 （更には 1 5 %以下、 特に 1 0 %以下） の濃度でゲル化が可能なハイ ド口ゲル形成性の高分子を用いること が好ましい。
(他の成分）
本発明の担体は、 上記したゾルーゲル転移温度を有する高分子を 少なく とも含むものであるが、 必要に応じて他の成分を含んでいて もよい。 このような態様における 「他の成分」 と しては、 例えば、 抗生剤、 抗癌剤、 コラーゲン、 ゼラチン等の E C M、 後述の局所性 化学仲介物質、 イ ンス リ ン、 細胞成長因子等のホルモン類、 外来遺 伝子等あるいはこれら化学仲介物質や細胞成長因子等を分泌するそ の他の細胞や組織などが挙げられる。
このような 「他の成分」 の使用量は、 所定の効果を奏する量であ つて、 且つハイ ドロゲル形成性の高分子に基づくゲル内に所定の時 間 （例えば、 細胞 · 組織の培養に必要な時間） 保持可能な量である 限り、 特に制限されない。 通常は、 ハイ ドロゲル形成性の高分子を 基準 （ 1 0部） と して、 2部以下程度、 更には 1部以下程度である ことが好ましい。
(化学仲介物質）
生体組織の再生には、 前駆細胞等の細胞のみならず、 その分化や 増殖を促す細胞成長因子等の種々の化学仲介物質 （chem i ca l med i a tor) が必要な場合がある。 これらの化学仲介物質は、 通常は細胞 自身から分泌されるが、 再生を効率良く進めるために本発明の細胞
• 組織培養用担体に予めこれらの化学仲介物質を含有させて外部か ら補給するこ とが効果的である。
この化学仲介物質と しては、 1 ) 細胞のごく近傍でしか作用しな い局所性化学仲介物質 （local chemical mediator) 、 2 ) 神経細 胞から分泌され有効作用距離がごく短い神経伝達物質 （neurotrans mitter) 、 3 ) 内分泌細胞から分泌され血流等を通じて全身の標的 細胞に作用するホルモン （hormone) あるいは細胞間の情報伝達物 質である細胞増殖因子等が挙げられる。
上記 1 ) の局所性化学仲介物質としては、 神経細胞成長因子等の タンパク、 走化性因子等のペプチ ド、 ヒスタ ミ ン等のアミ ノ酸誘導 体、 プロスタグランジン等の脂肪酸誘導体等が挙げられる。
上記 2 ) の神経伝達物質と しては、 グリ シン等のアミ ノ酸、 ノル ア ドレナリ ン、 アセチルコ リ ン、 エンケフア リ ン等の低分子べプチ ド等の低分子量物質が挙げられる。
上記 3 ) の細胞増殖因子あるいはホルモンと しては、 線維芽細胞 成長因子 （fibroblast growth factor, F G F ) 、 上皮細胞成長因 子 （epithelial growth factor, E G F ) 、 血管内皮細胞成長因子 (vascular endothelial growth factor ^ V E G F ) 、 肝細胞増^ k 因子 (hepatocyte growth factor, H G F ) 等の細胞成長因子、 ィ ンス リ ン、 ソマ ト ト ロ ピン、 ソマ トメ ジン、 副腎皮質刺激ホルモン (A C TH) 、 副甲状腺ホルモン （ P T H) 、 甲状腺刺激ホルモン (T S H) 等のタンパク、 または糖タンパク、 T S H放出因子、 バ ソプレシン、 ソマ トスタチン等のアミ ノ酸誘導体、 コルチゾール、 エス トラジオール、 テス トステロ ン等のステロイ ド等が挙げられる (ゲル中における化学仲介物質の拡散）
本発明のハイ ドロゲルは、 ハイ ドロゲル中の化学仲介物質の拡散 速度を任意に制御することができる。 特に親水性物質と疎水性物質 を異なる拡散速度で拡散させることができる。 水溶性親水性物質の 拡散は、 ハイ ドロゲル形成性高分子の 3次元網目構造による分子篩 い効果によって制御される。 従って水溶性親水性物質の拡散速度を 低下させるには、 ハイ ドロゲルを構成するハイ ドロゲル形成性高分 子の濃度を高めれば良い。 また、 水溶性親水性物質の拡散は、 その 物質の分子量にも依存する。 ハイ ドロゲルを構成するハイ ドロゲル 形成性高分子の濃度が一定であれば分子量の大きな物質ほどその拡 散速度は遅くなる。
本発明のハイ ドロゲル中における水溶性疎水性物質の拡散は、 ハ イ ド口ゲル形成性高分子の 3次元網目構造による分子篩い効果に加 えて、 ハイ ドロゲル形成性高分子の疎水性部分への分配によっても 影響を受け、 ハイ ドロゲル形成性高分子中の疎水性部分の割合によ つても制御されるため、 水溶性親水性物質の拡散よ り も通常遅くな る。
ハイ ドロゲル中の溶質の拡散係数は文献 （Eric K. L. Lee, et a 1, Journal of Membrane Science, 2 4， 丄 2 5 — 1 4 3 ( 1 9 8 5 ) ) に記載された "early-time" 近似法によ り求めることがで きる。 この方法では、 均一な厚さ L ( c m) のハイ ド口ゲル平板中 に均一に分散された溶質がハイ ドロゲル平板の両表面から溶出する 過程を経時的に観測する。 時間 t ( s e c ) における溶質の溶出量 を Mt、 無限大時間後の溶出量を M∞ とすると、 MtZM∞ < 0. 6 の範囲で溶質のハイ ドロゲル中における拡散係数 D ( c m2/ s e c ) について下記の式 （ 1 ) が成立する。
Mt/M∞ = (D t / π ) 1 / 2 X 4 / L ( 1 ) 従って、 経過時間 t の平方根に対して、 時間 t までの溶出率をプ ロ ッ 卜 した直線の傾きから拡散係数 Dを算出することができる。 種々の物質の保持ノ拡散 （ないし放出） 性能のバラ ンスの点から は、 本発明の細胞 · 組織培養用担体は、 フエノ ールレッ ド （P R) 、 メチルブル一 （MB) 、 およびミオグロビン （MG) の拡散係数 の比が、 （DPRZDMB) ≥ 2および （DPR/DMG) ≥ 1 . 2である ことが好ましい。 これらの値の、 よ り好ましい範囲は、 以下の通り である。
( 1 ) (DPR/DMB) ： よ り好ましく は 1 0以上、 更には 2 0以 上、 特に 5 0以上
好ましく は 1 X 1 05以下、 よ り好ましくは 1 X 1 04以下、 更に は 1 X I 03以下
( 2 ) (DPR/DMG) ： よ り好ましく は 1 . 5以上、 更には 3以 上、 特に 5以上
好ましくは 1 X 1 04以下、 よ り好ましくは 1 X 1 03以下、 更に は 1 X I 02以下
(コラーゲン等の場合）
前述したよ うに、 従来の細胞増殖用の 「足場」 （細胞 ，組織培養 担体） であるコラーゲンは、 親水性の高分子であり、 本発明のハイ ド口ゲルにおけるよ うに、 その親水性 疎水性のバランスを任意に 制御することができず、 したがって、 コラーゲン中の化学仲介物質 の拡散速度を制御することが困難であった。
また、 ポリ乳酸またはポリ グリ コール酸等の場合には、 逆に疎水 性が強く、 これらのポリマー中の化学仲介物質の拡散速度を制御す ることは、 やはり困難であった。
これに対して、 本発明のハイ ドロゲルは、 上述したように、 親水 性ノ疎水性のバランスを実質的に任意に制御することができるため 、 本発明のゲル中の化学仲介物質の拡散速度をも実質的な自由度で 制御することができる。
本発明のゲルをコラ一ゲン等の公知のゲル形成性高分子と ともに 用いた場合 （すなわち、 ゲル形成性高分子と して、 本発明に用いる 高分子とコラーゲン等の公知のゲル形成性高分子とが共存する場合 ) には、 コラーゲン等の公知のゲル形成性高分子を含有するゲル中 においても、 化学仲介物質の拡散速度を、 実質的な自由度で制御す る こ とができ る。
(生体内組織 ·臓器）
本発明において 「生体組織 ， 臓器」 とは、 動物 （特にヒ ト） の組 織、 器官、 臓器をいう。 本発明の培養用担体によ り培養可能な生体 組織 ·臓器は特に制限されないが、 例えば食道、 胃、 小腸、 大腸、 腌臓、 肝臓、 心臓、 血管、 骨、 軟骨、 神経、 角膜、 真皮等を例示す る こ とができ る。
(細胞 · 組織）
本発明の培養用担体によ り培養可能な細胞 · 組織は、 特に制限さ れない。
本発明の培養用担体は、 分化性の細胞 ·組織に対して特に効果的 に利用可能である。 このような分化性の細胞と しては、 例えば、 幹 細胞 （s t em c e l l ) および前駆細胞を挙げることができる。 分化性 の細胞は、 分化単能性、 分化多能性、 ないし分化全能性のいずれの 細胞をも包含する。
(生体組織 ·臓器の修復 · 再生方法）
本発明の担体を用いて、 細胞 · 組織を修復 · 再生する方法は特に 制限されないが、 該細胞等の播種および回収を容易とする点からは 、 ハイ ドロゲル形成性高分子のゾル—ゲル転移を利用することが好 ましい。 (ゾルーゲル転移を利用する態様）
このようなゾルーゲル転移を利用する態様においては、 先ず、 本 発明の担体中に細胞 （例えば、 幹細胞や前駆細胞） またはそれらを 含有する組織等を播種、 混和する。 このよ う な播種、 混和を行うた めには、 例えば、 本発明の細胞 ， 組織培養用担体を構成するハイ ド 口ゲル形成性高分子を、 培養液、 例えば R P M I - 1 6 4 0 (Life Technologies, N. Y.、 U S A) に低温 （例えば 4°C) 下で攪拌 溶解し、 本発明の担体をそのゾルーゲル転移温度以下の水溶液 （ゾ ル） の状態と して該細胞や組織を添加、 懸濁させれば良い。 ここで 用いる培養液には特に制限はなく、 目的とする細胞 （幹細胞、 前駆 細胞等） が増殖 · 分化し易いものを適宜選択して用いれば良い。 ま たこの培養液に目的の幹細胞や前駆細胞の増殖 · 分化を促進する前 述の化学仲介物質を、 必要に応じて含有させてもよい。 更にコラー ゲン、 ゼラチンなどの E CMを添加させてもよい。
本発明の担体中で生体組織 · 臓器を再生させるには、 例えば、 上 記懸濁液を本発明の担体のゾルーゲル転移温度よ り高い温度 （通常 は 3 7 °C) に昇温してゲル化させた後、 該温度 （通常 3 7 °C) で目 的とする細胞またはそれを含有する組織等を培養すればよい。
また、 本発明の担体をゲル化させる際、 所望の形状の型を用いて 所望の形状を付与してゲル化させることもできる。 例えば軟骨組織 を耳や鼻の再建に用いる場合等に、 本発明の担体を耳や鼻の適用部 位に適合する形状と して軟骨細胞を培養し、 軟骨組織を再生させれ ば、 容易に所望の形状に成型して使用することができる。
本発明の担体中で目的の組織 · 臓器が再生された後に、 これらを 本発明の担体から回収するには、 目的の組織 ·臓器を含む本発明の 担体を該ゾルーゲル転移温度よ り低い温度 （例えば 4 °C) に冷却し て本発明の担体をゾル状態に戻し、 遠心分離等の通常の分離方法で 目的の組織 ·臓器と本発明の担体を分離すれば良い。
上述したように、 本発明の担体は繊維芽細胞の増殖を抑える一方 で、 目的とする細胞 （幹細胞、 前駆細胞等） の増殖や分化を実質的 に阻害しない （ないしは促進させる） ことが可能であるため、 本発 明の担体中で目的とする組織 ·臓器を効率よく再生させることがで きる。 実施例
以下に実施例を示し、 本発明を更に具体的に説明するが、 本発明 の範囲は特許請求の範囲によ り限定されるものであり、 以下の実施 例によって限定されるものではない。
製造例 1
ポ リ プロ ピレンォキサイ ドーポ リ エチレンォキサイ ド共重合体 （ プロ ピレンォキサイ ド Zエチレンォキサイ ド平均重合度約 6 0 / 1 8 0、 旭電化工業 （株） 製 ： プル口ニック F— 1 2 7 ) 1 0 gを乾 燥ク ロ 口ホルム 3 0 m l に溶解し、 五酸化リ ン （ 1 g ) 共存下、 へ キサメチレンジイ ソシァネー ト 0. 1 3 gを加え、 沸点還流下に 6 時間反応させた。 溶媒を減圧留去した後、 残さを蒸留水に溶解し、 分画分子量 3万の限外濾過膜 （ア ミ コン PM— 3 0 ) を用いて限外 濾過を行い、 高分子量重合体と低分子量重合体を分画した。 得られ た水溶液を凍結して、 F— 1 2 7高重合体および F _ 1 2 7低重合 体を得た。
上記によ り得た F— 1 2 7高重合体 （本発明のハイ ドロゲル形成 性高分子、 T G P— 1 ) を、 氷冷下、 8質量％の濃度で蒸留水に溶 解した。 この水溶液をゆるやかに加温していく と、 2 1 °Cから徐々 に粘度が上昇し、 約 2 7 °Cで固化して、 ハイ ド口ゲルとなった。 こ のハイ ド口ゲルを冷却すると、 2 1 °Cで水溶液に戻った。 この変化 は、 可逆的に繰り返し観測された。
一方、 上記 F— 1 2 7低重合体を、 氷点下 8質量％の濃度で蒸留 水に溶解したものは、 6 0 °C以上に加熱しても全く ゲル化しなかつ た。
製造例 2
ト リ メチロールプロパン 1モルに対し、 エチレンォキサイ ド 1 6
0モルをカチオン重合によ り付加して、 平均分子量約 7 0 0 0のポ リエチレンォキサイ ド ト リ オールを得た。
上記によ り得たポリエチレンォキサイ ド ト リ オール 1 0 0 gを蒸 留水 1 0 0 0 m l に溶解した後、 室温で過マンガン酸カ リ ウム 1 2 gを徐々に加えて、 そのまま約 1時間、 酸化反応させた。 固形物を 濾過によ り除いた後、 生成物をク ロ 口ホルムで抽出し、 溶媒 （ク ロ 口ホルム） を減圧留去してポリエチレンォキサイ ド ト リ カルボキシ ノレ体 9 0 gを得た。
上記によ り得たポリ エチレンォキサイ ド ト リ カルボキシル体 1 0 g と、 ポリ プロ ピレンォキサイ ドジァミ ノ体 （プロ ピレンォキサイ ド平均重合度約 6 5、 米国ジェフ ァーソ ンケミカル社製、 商品名 ： ジェフ ァーミ ン D— 4 0 0 0、 曇点 ： 約 9 °C) 1 0 g とを四塩化炭 素 1 0 0 0 m 1 に溶解し、 ジシク ロへキシルカルボジイ ミ ド 1. 2 gを加えた後、 沸点還流下に 6時間反応させた。 反応液を冷却し、 固形物を濾過によ り 除いた後、 溶媒 （四塩化炭素） を減圧留去し、 残さを真空乾燥して、 複数のポ リ プロ ピレンオキサイ ドとポリ ェチ レンォキサイ ドとが結合した本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P— 2 ) を得た。 これを氷冷下、 5質量％の濃度で蒸留水に溶 解し、 そのゾル—ゲル転移温度を測定したと ころ、 約 1 6 °Cであつ た。
製造例 3 N—ィ ソプロ ピルァク リ ノレア ミ ド （ィ ース トマンコダック社製） 9 6 g 、 N _アタ リ ロキシスク シンイ ミ ド （国産化学 （株） 製） 1 7 g、 および n—プチルメ タク リ レー ト （関東化学 （株） 製） 7 g をク ロ 口ホルム 4 0 0 0 m 1 に溶解し、 窒素置換後、 N 、 N ' —了 ゾビスイ ソプチロニ ト リノレ 1 . 5 g を加え、 6 0 °Cで 6時間重合さ せた。 反応液を濃縮した後、 ジェチルエーテルに再沈 （再沈殿） し た。 濾過によ り 固形物を回収した後、 真空乾燥して、 7 8 gのポリ ( N—ィ ソプロ ピルァク リ ノレア ミ ド一 コ 一 N—ァク リ ロ キシスク シ ンイ ミ ドーコ _ n —ブチルメ タク リ レー ト） を得た。
上記によ り得たポ リ （N—イ ソプロ ピルァク リ ノレア ミ ド一コ 一 N ーァク リ ロ キシスク シンィ ミ ド一 コ 一 n —ブチルメ タク リ レー ト） に、 過剰のイ ソプロ ピルア ミ ンを加えてポリ （N—イ ソプロ ピルァ ク リ ルア ミ ド一コ一 n —ブチルメ タ ク リ レー ト） を得た。 このポ リ ( N—イ ソプロ ピルァク リ ノレア ミ ド一 コ 一 n —ブチルメ タク リ レー ト） の水溶液の曇点は 1 9 °Cであった。
前記のポ リ （N—イ ソプロ ピルアク リ ルア ミ ドーコ 一 N—ァク リ ロ キシスク シンイ ミ ド一 コ 一 n —ブチルメ タ ク リ レー ト） 1 0 g 、 および両末端アミ ノ化ポリ エチレンオキサイ ド （分子量 6 、 0 0 0 、 川研ファイ ンケミカル （株） 製） 5 g をク ロ 口ホルム 1 0 0 0 m 1 に溶解し、 5 0 °Cで 3時間反応させた。 室温まで冷却した後、 ィ ソプロ ピルアミ ン 1 g を加え、 1時間放置した後、 反応液を濃縮し 、 残渣をジェチルエーテル中に沈澱させた。 濾過によ り 固形物を回 収した後、 真空乾燥して、 複数のポリ （N—イ ソプロ ピルアク リ ル アミ ド―コ— n 一ブチルメ タク リ レー ト） とポリ エチレンォキサイ ドとが結合した本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （T G P _ 3 ) を得た。
このよ う にして得た T G P— 3 を氷冷下、 5質量％の濃度で蒸留 水に溶解し、 そのゾル—ゲル転移温度を測定したところ、 約 2 1 °C であった。
製造例 4
(滅菌方法）
上記した本発明のハイ ド口ゲル形成性高分子 （T G P— 3 ) の 2 . O gを、 E O G (エチレンオキサイ ドガス） 滅菌バッグ （ホギメ ディカル社製、 商品名 ： ハイブリ ッ ド滅菌バッグ） に入れ、 E O G 滅菌装置 （イージーパック、 井内盛栄堂製） で E O Gをバッグに充 填し、 室温にて一昼夜放置した。 更に 4 0 °Cで半日放置した後、 E O Gをバッグから抜き、 エアレーシ ヨ ンを行った。 バッグを真空乾 燥器 （ 4 0 °C) に入れ、 時々エアレーシヨンしながら半日放置する ことによ り滅菌した。
この滅菌操作によ り高分子のゾルーゲル転移温度が変化しないこ とを、 別途確認した。
製造例 5
N—イ ソプロ ピルァク リ ルア ミ ド 3 7 g と、 n—ブチルメ タ ク リ レー ト 3 g と、 ポリ エチレンオキサイ ドモノ アタ リ レー ト （分子量 4， 0 0 0、 日本油脂 （株） 製 ： PME— 4 0 0 0 ) 2 8 g とを、 ベンゼン 3 4 0 m 1 に溶解した後、 2、 2 —ァゾビスイソブチロ 二 ト リ ル 0. 8 gを加え、 6 0 °Cで 6時間反応させた。 得られた反 応生成物にク口 口ホルム 6 0 0 m 1 を加えて溶解し、 該溶液をエー テル 2 0 L ( リ ッ ト ノレ） に滴下して沈澱させた。 得られた沈殿を濾 過によ り回収し、 該沈澱を約 4 0 °Cで 2 4時間真空乾燥した後、 蒸 留水 6 Lに再び溶解し、 分画分子量 1 0万のホロ一フ ァイバー型限 外濾過膜 （アミコン社製 H 1 P 1 0 0 - 4 3 ) を用いて 1 0 °Cで 2 1 まで濃縮した。
該濃縮液に蒸留水 4 1 を加えて希釈し、 上記希釈操作を再度行つ た。 上記の希釈、 限外濾過濃縮操作を更に 5回繰り返し、 分子量 1 0万以下のものを除去した。 この限外濾過によ り濾過されなかった もの （限外濾過膜内に残留したもの） を回収して凍結乾燥し、 分子 量 1 0万以上の本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （T G P— 4 ) 6 0 gを得た。
上記によ り得た本発明のハイ ド口ゲル形成性高分子 （T G P— 4 ) l gを、 9 gの蒸留水に氷冷下で溶解した。 この水溶液のゾル— ゲル転移温度を測定したところ、 該ゾルーゲル転移温度は 2 5でで めった。
製造例 6
製造例 3の本発明のハイ ド口ゲル形成性高分子 （T G P— 3 ) を 1 0質量％の濃度で蒸留水に溶解し、 5 . 8 X l 05 P a - s e c であった。 この定常流動粘度 7} の測定においては、 ス ト レス式レオ メータ （C S L 5 0 0 ) 、 および測定デバイスと してアク リ ル製円 盤 （直径 4 c m) を使用し、 試料厚み 6 0 0 μ πιと して、 1 0 NZ m2のずり応力を適用して、 5分後から 5分間のク リープを観測し た。
一方、 寒天を 2質量％の濃度で蒸留水に 9 0 °Cで溶解して、 1 0 °Cで 1時間ゲル化させた後、 3 7 °Cにおける ηを測定したところ、 その 77は機器の測定限界 （ l x i 07 P a · s e c ) を越えていた 製造例 7
(繊維芽細胞の増殖性評価）
製造例 3で作製した本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （T G P — 3 ) を製造例 4の方法によって滅菌した後、 該ポリマーの最終濃 度が約 8 %になるよ うに 2 0 %の胎児牛血清 （ F C S ； Dainippon Pharmaceutical社製、 商品名 ： Fetal Calf Serum) および抗生剤 （ Life Technologies社製、 商品名 ： penicillin； 最終濃度 1 0， 0 O O UZm l ) を含有する R P M I — 1 6 4 0 (Life Technologie s社製） 中に、 4でで 2 4時間、 撹拌下に溶解した。 この操作は無 菌的に実施した。
上記の本発明の担体 （T G P— 3 /R P M I ) に正常ヒ ト肺繊維 芽細胞 （Normal Human Lung Fibroblasts, NH L F , 宝酒造 （株 ) 社製） ) を 6 X 1 04個/ m l の細胞密度になるように分散させ た。 この N H L F分散液を 2 4ゥエル一プレート [flat bottom mu 11 iwe 11 tissue culture plate ( F A L C ON、 Becton Dickinson & Company) ] の各ゥエルに 0. 2 m l ずつ分注し、 3 7 °Cでゲル 化させた後、 培養液 0. 4 m 1 を添加して 3 7 °C、 5 % C O2大気 圧下で培養した。 2 4ゥエループレー トは顕微鏡観察用と繊維芽細 胞増殖率測定用の各 2枚を 0、 1 、 3、 7 日 目用の分と して、 合計 8枚用意した。
これとは別に比較用と して T G P— 3を用いないで上記の培養液 に 6 X 1 04個/ m 1 の細胞密度になるように分散させた NH L F 分散液を調製し、 同様にして 2 4ゥヱル—プレー ト 8枚を用意して 同様の培養試験を行った。
位相差顕微鏡 （ォリ ンパス社製、 商品名 ： I MT— 2、 1 0倍） によ り経日的 （ 0、 1 、 3、 7 日） に観察した結果、 比較例 （R P M I ) の培養では 1 日後から繊維芽細胞に特徴的な樹枝状の増殖が 見られ、 7 日後にはコ ンフルェン トの状態となったのに対し、 本発 明の担体 （ T G P— 3 R P M I ) 中では 7 3後まで繊維芽細胞が 単細胞の形態を保ったままで増殖の様子は認められなかった。
所定培養日数の経過後、 2 4ゥエル一プレー トを 4 °Cに下げるこ とによって該担体を溶解した後、 各ゥ ル中にコハク酸脱水素酵素 活性測定用試薬たる W S T— 8試薬 （同仁化学 （株） 製） 5 0 μ 1 を添加した。 この 2 4 ゥヱル—プレー トを 4 °Cで 1 0時間反応させ た後、 完全に均一な水溶液の状態にした。
該水溶液を 9 6—ゥエル一プレートに 2 0 0 μ 1 づっ分注し、 マ イク 口プレー ト用比色計を用いて 4 5 0 n m (参照波長 6 2 0 n m ) で吸光度 （O D ( 4 5 0 ) ) を測定した。 繊維芽細胞の増殖率は 、 培養開始時 （ 0 日） の吸光度 O Df = (O D ( 4 5 0 ) ) と、 培 養後 （ 1、 3、 7 日後） の吸光度 ODL= (O D ( 4 5 0 ) ) の比 (O DL/0 Df ) によ り求めた。
本発明の担体 （T G P— 3 /R PM I ) 中では 1、 3、 7 日後の 繊維芽細胞の増殖率 （O DL/O Df) がそれぞれ 1 0 5 %、 1 2 0 %、 1 2 5 %であったのに対し、 比較例 （ R P M I ) では 1、 3、 7 日後の繊維芽細胞の増殖率 （O DLZO Df) がそれぞれ 1 7 0 % 、 3 7 0 %、 4 2 0 %であった。
実施例 1
ビーグル系雑犬 （ 9. 0〜 1 1 . 0 k g体重） をベン トバノレビタ ールにて静脈麻酔後、 開腹し、 脬臓を全摘出した。 腌管に直径 1 0 0 μ mのガイ ドワイヤーを挿入し、 ガイ ドワイヤーにそって腌組織 を切除、 除去していく と脖管のみが採取できた。 約 6 c m長、 径 1 5 0〜 2 0 0 111の腌管を 0. 5 mm幅にて細切した。
製造例 3の本発明のハイ ド口ゲル形成性高分子 （T G P— 3 ) を 1 0質量％の濃度で培養液 （ R P M I — 1 6 4 0、 Life Techno log ies社製） に溶解した溶液 （本発明の担体） を 4 Cに冷却して、 上 記膝管細切片を分散させ、 1 2 ゥヱル—プレー ト [flat bottom mu ltiwe丄 1 tissue culture plate 、F A Lし ON、 Becton Dicki nson & Company) ] の各ゥエルに 0. 4 m lずつ分注し、 3 7でで ゲル化させた後、 培養液 0. 4 m 1 を添加して 3 7 °C、 5 % C O 2 大気圧下で培養した。 尚、 培養液 R P M I — 1 6 4 0にはィヌ血清 (ィヌ血液 5 0〜 1 0 0 m 1 を採血し、 室温 3 0分静置して上清を 採取したもの） 1 0 %、 1 O mMニコチンアミ ド （ S i g m a社製 、 商品名 ： N I A C I NAM I D E) 、 1 0 n g /m l ケラチノサ イ ト増殖因子 （K G F ； P E P R◦ T E C H F C L t d . 社製 、 商品名 ： Recombinant Keratinocyte Growth Factor) 添カロした 経日的に実体顕微鏡 （O l y m p u s社製、 商品名 ： 倒立型シス テム顕微鏡 ； 1 0 0倍） で観察すると、 培養 5 日 目より腌管組織片 外側より、 細胞が分裂、 増殖した集塊が認められた （図 1 ) 。 該細 胞集塊は経日的に大きさを増し、 1 4 日 目には 1 5 0 )u M_ 3 0 日 目には 3 0 0 μ πιとなった （図 2 ) 。 3 0 日 目の組織像では細胞集 塊にイ ンス リ ン陽性細胞が存在し、 ラ ンゲルハンス島のク ラスタ一 が形成されたことを示した。
該細胞集塊を含有する本発明の担体を 4 °Cに冷却して遠心分離す ることによ り、 該細胞集塊と、 この冷却によ り ゾル化した本発明の 担体を容易に分離するこ とができた。
実施例 2
L e w i s系 4週令雄性ラッ ト肋軟骨を無菌的に採取し、 付着す る軟組織を除去して取り出した軟骨を細片化した。 次いで、 酵素液 {第一液 ： 0. 1 % E D TA (ナカライテスク社製） /P B S (- ) (ローマン工業社製） 、 第二液 ： 0. 2 5 % ト リ プシン— E D T A (ギブコ社製） ZP B S (—） （ローマン工業社製） 、 第三液 ： 0. 1 %コラゲナ一ゼ （和光純薬社製） ZP B S ( + ) (ギブコ社 製） } をそれぞれ入れた試験管中にこの軟骨組織を入れ、 3 7 °Cで それぞれ 1 5分間、 1時間、 3時間処理して軟骨組織を分解した。 採取した軟骨分散液を培地中 { D— MEM (Dulbecco's Modifie d Eagle Medium: (ギブコ社製） + 1 0 % F C S (Fetal Bovine Serum) + ペニシ リ ン + ス ト レプ トマイ シン） に入れ、 コ ン フルェント状態になるまで約 2週間、 3 7 °C、 5 % C O 2大気圧下 で培養した。 得られた培養液を 0. 2 5 % ト リ プシン/ ? 8 3 (— ) で 5分間処理して、 1 0 0 0 r p m、 1 0分間遠心分離し、 軟骨 細胞を回収した。
製造例 3の本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （T G P— 3 ) を 1 0質量％の濃度で培養液 （R P M I — 1 6 4 0、 Life Technolog ies社製） に溶解した溶液 （本発明の担体） 'を 4 °Cに冷却して、 上 記軟骨細胞を 6 X 1 05個ノ m l の細胞密度になるように分散させ 、 1 2 ヮエノレープレ1 ~ ト [flat bottom mult iwel 1 tissue culture plate (F A L C O N, Becton Dickinson & Company) ] の各 ゥヱルに 0. 4 m lずつ分注し、 3 7 °Cでゲル化させた後、 培養液 0. 4 m 1 を添加して 3 7 °C、 5 % C O 2大気圧下で培養した。 尚 、 培養液 R P M I — 1 6 4 0には、 実施例 1 と同様に、 ラッ ト血清 (ラッ ト血液を室温 3 0分静置して上清を採取したもの） 1 0 %、 1 O mMニコチンアミ ド、 1 0 n g / m 1 ケラチノサイ ト增殖因子 (K G F ) を添加した。
経日的に実体顕微鏡で観察すると、 培養 5 日 目より、 細胞が分裂 、 増殖した集塊が認められた。 該細胞集塊は経日的に大きさを増し 、 1 4 日 目には 1 5 0 μ Μ_ 3 0 日 目には 3 0 θ Αί Πΐとなった。 3 0 日 目の組織像 （A z a n染色および Aggrecan免疫染色） において 、 細胞集塊に軟骨塊の形成を示す染色像が認められた。
該細胞集塊を含有する本発明の担体を 4 °Cに冷却して遠心分離す るこ とによ り、 該細胞集塊と、 この冷却によ り ゾル化した本発明の 担体を容易に分離することができた。
製造例 8
N—イ ソプロ ピルアク リルアミ ド 7 1 . 0 gおよび n —ブチルメ タク リ レー ト 4. 4 gをエタ ノール 1 1 1 7 gに溶解した。 これに ポリエチレングリ コールジメ タタ リ レー ト （P D E 6 0 0 0、 日本 油脂 （株） 製） 2 2. 6 gを水 7 7 3 gに溶解した水溶液を加え、 窒素気流下 7 0 °Cに加温した。 窒素気流下 7 0 °Cを保ちながら、 N ， N , N， ， N ' —テ トラメチルエチレンジァミ ン （T EME D) 0. 8 m L と 1 0 %過硫酸アンモニゥム （A P S ) 水溶液 8 m Lを 加え 3 0分間攪拌反応させた。 さらに T EME D O . 8 m L と 1 0 % A P S水溶液 8 m Lを 3 0分間隔で 4回加えて重合反応を完結さ せた。 反応液を 1 0 °C以下に冷却後、 1 0 ° の冷却蒸留水 5 1^を加 えて希釈し、 分画分子量 1 0万の限外ろ過膜を用いて 1 0 °Cで 2 L まで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水 4 Lを加えて希釈し、 上記限外ろ過濃縮操 作を再度行った。 上記の希釈、 限外ろ過濃縮操作を更に 5回繰り返 し、 分子量 1 0万以下のものを除去した。 この限外ろ過によ りろ過 されなかったもの （限外ろ過膜内に残留したもの） を回収して凍結 乾燥し、 分子量 1 0万以上の本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P— 5 ) 7 2 gを得た。
上記によ り得た本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （T G P— 5 ) l gを、 9 gの蒸留水に氷冷下で溶解した。 この水溶液のゾルー ゲル転移温度を測定したところ、 該ゾルーゲル転移温度は 2 0でで あった。
製造例 9
N—イ ソプロ ピルァク リルアミ ド 4 2. 0 gおよび n—ブチルメ タク リ レー ト 4. 0 gをエタノール 5 9 2 gに溶解した。 これにポ リエチレングリ コールジメ タク リ レー ト （P D E 6 0 0 0、 日本油 脂 （株） 製） 1 1. 5 gを水 6 5. 1 gに溶解した水溶液を加え、 窒素気流下 7 0 °Cに加温した。 窒素気流下 7 0 °Cを保ちながら、 N ， N， N， , N， ーテ トラメチルエチレンジァミ ン （T EME D) 0. 4 m L と 1 0 %過硫酸アンモニゥム （A P S ) 水溶液 4 m Lを 加え 3 0分間攪拌反応させた。 さらに T EME D O . 4 m L と 1 0 %A P S水溶液 4 m Lを 3 0分間隔で 4回加えて重合反応を完結さ せた。 反応液を 5 °C以下に冷却後、 5 °Cの冷却蒸留水 5 Lを加えて 希釈し、 分画分子量 1 0万の限外ろ過膜を用いて 5 °Cで 2 Lまで濃 縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水 4 Lを加えて希釈し、 上記限外ろ過濃縮操 作を再度行った。 上記の希釈、 限外ろ過濃縮操作を更に 5回繰り返 し、 分子量 1 0万以下のものを除去した。 この限外ろ過によ りろ過 されなかったもの （限外ろ過膜内に残留したもの） を回収して凍結 乾燥し、 分子量 1 0万以上の本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P— 6 ) 4 0 gを得た。
上記によ り得た本発明のハイ ド口ゲル形成性高分子 （T G P _ 6 ) l gを、 9 gの蒸留水に氷冷下で溶解した。 この水溶液のゾルー ゲル転移温度を測定したところ、 該ゾルーゲル転移温度は 7 °Cであ つた。
製造例 1 0
N—イ ソプロ ピルアタ リノレアミ ド 4 5. 5 gおよび n—ブチルメ タク リ レート 0. 5 6 gをエタノール 5 9 2 gに溶解した。 これに ポリエチレングリ コールジメ タク リ レー ト （ P D E 6 0 0 0、 日本 油脂 （株） 製） 1 1. 5 gを水 6 5. l gに溶解した水溶液を加え 、 窒素気流下 7 0 °Cに加温した。 窒素気流下 7 0 °Cを保ちながら、 N, N , N ' ， N ' ーテ ト ラメチルエチレンジァミ ン （T EME D ) 0. 4 m L と 1 0 %過硫酸ァンモニゥム （A P S ) 水溶液 4 m L を加え 3 0分間攪拌反応させた。 さ らに T EME D O . 4 m Lと 1 0 % A P S水溶液 4 m Lを 3 0分間隔で 4回加えて重合反応を完結 させた。 反応液を 1 0 °C以下に冷却後、 1 0での冷却蒸留水 5 しを 加えて希釈し、 分画分子量 1 0万の限外ろ過膜を用いて 1 0 °Cで 2 Lまで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水 4 Lを加えて希釈し、 上記限外ろ過濃縮操 作を再度行った。 上記の希釈、 限外ろ過濃縮操作を更に 5回繰り返 し、 分子量 1 0万以下のものを除去した。 この限外ろ過によ り ろ過 されなかったもの （限外ろ過膜内に残留したもの） を回収して凍結 乾燥し、 分子量 1 0万以上の本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P— 7 ) 2 2 gを得た。
上記によ り得た本発明のハイ ド口ゲル形成性高分子 （T G P _ 7 ) l gを、 9 gの蒸留水に氷冷下で溶解した。 この水溶液のゾル— ゲル転移温度を測定したと ころ、 該ゾルーゲル転移温度は 3 7 °Cで めつに。
実施例 3
製造例 8で得られたハイ ド口ゲル形成性高分子 T G P— 5を、 フ ェノールレッ ド （和光純薬製） 3 mMを含有する リ ン酸緩衝液 （ 1 / 1 5 M, p H 7 ) 、 メチルブルー （和光純薬製） 6 mMを含有す る リ ン酸緩衝液 （ 1 / 1 5 M， p H 7 ) 、 ミオグロ ビン （和光純薬 製） 0. 9 %を含有する リ ン酸緩衝液 （ 1 Z 1 5 M, p H 7 ) 、 そ れぞれに 9 w t %の濃度で氷冷下溶解した。 これらの溶液を長さ 1 . 3 mm、 内径 6 mmのガラス管内に充填して 3 7 °Cに昇温しゲル 化させた。 これらの円盤状のハイ ドロゲルをガラス管ごと 3 m Lの リ ン酸緩衝液 （ 1ノ 1 5 M, p H 7 ) の入った分光用セルに入れ、 3 7 °Cに保温して攪拌しながら、 吸光度を連続的に測定した。
吸光度の測定波長はフエノールレッ ド、 メチルブルー、 ミオグロ ビンそれぞれについて、 5 5 8 n m、 5 7 1 n m、 4 0 9 n mで行 つた。 経時的な 3 m Lのリ ン酸緩衝液 （ 1 Z 1 5 M, p H 7 ) 中へ のフエノールレッ ド、 メチルプノレー、 ミオグロ ビンの溶出率を吸光 度測定によ り求め、 式 （ 1 ) の関係からそれぞれの拡散係数を求め たところ、 1 . 6 X 1 0—6 ( c m2Z s e c ) 、 7. 5 X 1 0 '9 ( c m"/ s e c ) ， 2. 1 X 1 0 " 7 ( c m"/ s e c ) でめった。
T G P— 5ハイ ドロゲル中 3 7 °Cにおける水溶性親水性物質であ るフエノールレッ ドと水溶性疎水性物質であるメチルブルーの拡散 係数の比 （DPRZDMB) は 2 1 3であった。
T G P— 5ハイ ドロゲル中 3 7 °Cにおける水溶性親水性低分子物 質であるフ ノ ールレツ ドと水溶性親水性高分子物質である ミオグ ロ ビンの拡散係数の比 （DPR/DMG) は 7. 6であった。
比較例 1
低融点ァガロース （Sea Prep®agarose, BMA(Rockland USA)社製 、 融点 5 0 °C以下、 ゲル化点 8 °C〜 1 7 °C) を、 フエノールレッ ド
(和光純薬製） 3 mMを含有する リ ン酸緩衝液 （ 1 1 5 M， p H 7 ) 、 メチルブル一 （和光純薬製） 6 mMを含有する リ ン酸緩衝液
( 1 / 1 5 M, p H 7 ) 、 ミオグロ ビン （和光純薬製） 0. 9 %を 含有する リ ン酸緩衝液 （ 1 / 1 5 M, p H 7 ) 、 それぞれに l w t %の濃度で加温溶解した。 これらの溶液を長さ 1 0 mm、 内径 2 m mのガラス管内に充填して 2 °Cに冷却しゲル化させた。 これらの円 柱状のハイ ド口ゲルをガラス管ごと 3 m Lのリ ン酸緩衝液 （ 1 1 5 M, p H 7 ) の入った分光用セルに入れ、 3 7 °Cに保温して攪拌 しながら、 吸光度を連続的に測定した。
吸光度の測定波長はフエノールレッ ド、 メチルブルー、 ミオグロ ビンそれぞれについて、 5 5 8 n m、 5 7 1 n m、 4 0 9 n mで行 つた。 経時的な 3 m Lのリ ン酸緩衝液 （ 1 Z 1 5 M, p H 7 ) 中へ のフエノールレッ ド、 メチルブルー、 ミオグロ ビンの溶出率を吸光 度測定によ り求め、 式 （ 1 ) の関係からそれぞれの拡散係数を求め たところ、 4. 7 X 1 0 "6 ( c m2/ s e c ) 、 7. 1 X 1 0 "6 ( c m2 / s e c ) ， 2. 6 X 1 0 "5 ( c m2 / s e c ) であった。 低融点ァガロースハイ ドロゲル中 3 7 °Cにおける水溶性親水性物 質であるフヱノ一ルレッ ドと水溶性疎水性物質であるメチルブルー の拡散係数の比 （DPRZDMB) は 0. 7であった。
低融点ァガロースハイ ドロゲル中 3 7 °Cにおける水溶性親水性低 分子物質であるフエ ノールレツ ドと水溶性親水性高分子物質である ミオグロビンの拡散係数の比 （DPRZDMG) は 0. 1 8であった。 実施例 4
製造例 8で得られたハイ ドロゲル形成性高分子 T G P _ 5を生理 食塩水に溶解して高分子濃度 1 0質量％ ( w t % ) 、 8質量％ (w t %) 、 6質量％ ( w t % ) の溶液を調製した。 それぞれのゾル— ゲル転移温度を測定したところ、 それぞれ 1 8 °C、 2 0 °C、 2 2 °C であった。 各生理食塩水溶液をそのゾルーゲル転移温度以下に冷却 して、 1群 1 0匹の 6週齢のラッ ト （雄 5匹、 雌 5匹） の腹腔内に l m L/ k gずつ投与した。 投与法はラッ 卜の腹部を電気バ リ カ ン にて除毛し、 消毒用エタノールにて投与部位を消毒した後、 シリ ン ジ及び留置針 （ 2 2 G) を用いて投与した。 投与後 1 日 目、 3 日 目 、 7 日 目、 1 4 日 目、 2 1 日 目に各群 2匹 （雄 1 匹、 雌 1匹） をェ 一テル麻酔下で放血致死させ、 腹腔内のハイ ドロゲル （本発明の再 生用材料） の残存を検査した。 高分子濃度 6質量％ ( w t % ) のハ イ ド口ゲルは投与後 3 日 目に腹腔内から消失、 高分子濃度 8質量％ ( w t % ) のハイ ド口ゲルは投与後 1 4 日 目に腹腔内から消失、 高 分子濃度 1 0質量％ (w t %) のハイ ドロゲルは投与後 2 1 日 目に 腹腔内から消失した。 産業上の利用可能性 上述したよ うに、 本発明の細胞 · 組織培養用担体中では、 繊維芽 細胞が実質的に増殖しないため、 目的とする細胞 · 組織 （例えば、 修復 · 再生等を目的とする臓器や組織の細胞） を選択的に増殖させ 、 目的とする臓器や組織の再生を効果的に達成できる。
本発明の細胞 ·組織培養用担体は、 所定の温度 （例えば、 ヒ トま たは動物の体温） でゲル化して三次元網目構造を形成し、 細胞成長 因子等を長期間保持できるため、 目的とする臓器や組織の再生を促 進させることができる。
本発明の細胞 · 組織培養用担体は低温でゾル状態、 体温でゲル化 するハイ ドロゲル形成性の高分子から構成されるため、 低温のゾル 状態で本発明の担体中に幹細胞や前駆細胞またはそれらを含有する 組織等を播種、 混和することができ、 そのまま所定の温度 （例えば 、 ヒ トまたは動物の体温） でゲル化させることによって該担体をゲ ル状態と して、 組織や臓器を再生する幹細胞や前駆細胞の接着 · 分 化 ' 形態形成のための人工担体と して機能させることができる。
更に本発明の細胞 · 組織培養用担体はそのゾルーゲル転移温度よ り低い温度に冷却することによってゾル状態に戻るため、 ゲル内で 再生した組織や臓器に実質的に傷害を与えることなく 回収できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . その水溶液が低温でゾル状態、 高温でゲル状態となる熱可 逆的なゾルーゲル転移を示すハイ ド口ゲル形成性の高分子を少なく とも含む細胞 · 組織培養用担体であって、 且つ、 該ハイ ドロゲル形 成性の高分子に基づく ゲル内で繊維芽細胞が実質的に増殖しないこ とを特徴とする細胞 · 組織培養用担体。
2 . 前記ハイ ド口ゲル形成性の高分子が、 曇点を有する複数の ブロ ック と、 親水性のプロ ック とが結合した高分子である請求項 1 項記載の細胞 · 組織培養用担体。
3 . 前記ゾルーゲル転移温度が、 0 °Cよ り高く 4 2 °C以下であ る請求項 1 または 2記載の細胞 · 組織培養用担体。
4. 更に化学仲介物質を含有する請求項 1 〜 3のいずれかに記 載の細胞 · 組織培養用担体。
5. 前記ハイ ド口ゲル形成性高分子の水溶液が、 高温のゲル状 態で実質的に水不溶性を示すこ とを特徴とする請求項 1 〜 4のいず れかに記載の細胞 · 組織培養用担体。
6. 更に水を含む請求項 1 〜 5のいずれかに記載の細胞 ' 組織 培養用担体。
7 . フエノールレッ ド （ P R ) 、 メ チルブルー （MB ) 、 およ びミオグロ ビン （MG ) の拡散係数の比が、 （DPRZ DMB) ≥ 2お よび （DP RZDM G) ≥ 1 . 2である請求項 1 〜 6のいずれかに記載 の細胞 · 組織培養用担体。
8 . その水溶液が低温でゾル状態、 高温でゲル状態となる熱可 逆的なゾル—ゲル転移を示すハイ ドロゲル形成性の高分子と、 水と を少なく と も含む担体であって、 且つ、 該ゲル内で繊維芽細胞が実 質的に増殖しない担体を用い、 前記ゾルーゲル転移温度よ り低温のゾル状態で、 該担体に細胞ま たは組織を加え、
該ゾルーゲル転移温度よ り高温のゲル状態で、 前記担体を用いて 細胞または組織を培養し、
前記担体を再度ゾルーゲル転移温度よ り低温のゾル状態と して、 培養後の細胞または組織を回収するこ とを特徴とする細胞 ' 組織の 培養方法。
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