WO2015008877A1 - 단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 얻어진 이중층 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법 - Google Patents

단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 얻어진 이중층 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법 Download PDF

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최순모
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    • C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
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    • C08J2489/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a double layer scaffold by a single process and to a tissue regeneration method using the double layer scaffold obtained by the method.
  • Scaffolds refer to physical scaffolds and adhesive substrates made for in vitro culture and transplantation of tissue cells. These scaffolds are used for cell transplantation for human tissue regeneration, and also for mass culture and proliferation of cells. The importance is very high. This is due to the adhesion of the cells at the contact area between the cells and the substrate and the subsequent migration and proliferation of epithelial cells.
  • most biologically active cells have a basic step that must be passed in order to survive in contact with substances in or outside the body.
  • the first step is cell adhesion.
  • the cells preferentially adhere to the substrate, and after adhesion, the metabolism of organelles in the cytoplasm becomes active, and a new site is used to facilitate the proliferation and supply of nutrients. Will move.
  • the surface that activates the deposition of cells is the most basic means of doubling cell proliferation.
  • the adhesion of these cells to the substrate can be artificially controlled by the components of the substrate.
  • Scaffolds are carriers that support scaffolds as they regenerate and grow, that is, the basis of artificial substrates. Recently, scaffolds have been used in mass culture and growth vessels or flasks of cells.
  • Korean Patent Laid-Open No. 2004-0016984 relates to a carrier for culturing cells and tissues and a method for culturing, wherein the carrier for culturing cells and tissues that can effectively regenerate a target tissue or organ while suppressing overproliferation of fibroblasts, And cell and tissue culture methods.
  • the scaffolds known in the patent are not only excellent in adhesion and physical properties to the substrate to be suitable for mass culture of the cells, but also have many problems in that the manufacturing process is not simple and undesirable.
  • a double layer scaffold was manufactured by attaching each polymer scaffold separately and then attaching the double layer scaffold. There is a problem that the process is complicated because it goes through a two-step process of making a thick and individual polymer scaffold.
  • the present inventors completed the present invention by confirming that the scaffold obtained by adding a anionic surfactant to a solution in which two polymers are blended to cause phase separation through a high temperature and high speed stirring reaction is a structurally and chemically clear double layer scaffold.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a structurally and chemically clear double layer scaffold that is not separated through a simple single process.
  • Another object of the present invention is to provide a tissue regeneration method using the bilayer scaffold.
  • the present invention comprises the steps of preparing a first polymer aqueous solution; Adding and stirring a second polymer to the first aqueous polymer solution; Adding a surfactant to the stirred reactant to perform high temperature and high speed stirring; Lyophilizing the stirred reactant to obtain a sponge; Dipping the sponge in a crosslinking agent to crosslink it; And it provides a method for producing a double-layer scaffold by a single process comprising the step of lyophilizing the crosslinked reactant again.
  • the present invention comprises the steps of preparing a gelatin aqueous solution by stirring at 60 to 70 °C 100 to 300 rpm so that the gelatin is completely dissolved in water; Adding and stirring polyvinyl alcohol (PVA) to the gelatin aqueous solution; Adding sodium dodecyl sulfate to the stirred reactant at a high temperature and high speed at 80 to 120 ° C. to 800 to 2000 rpm; Lyophilizing the stirred reactant to obtain a sponge; Dipping the sponge in a crosslinking agent selected from glutaraldehyde or EDC (Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) to crosslink the sponge; And lyophilizing the crosslinked reactant again.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • the present invention provides a tissue regeneration method comprising culturing cells in a bilayer scaffold according to the preparation method.
  • the present invention also provides a composition for tissue regeneration or wound healing comprising the bilayer scaffold.
  • the manufacturing method of the present invention unlike the conventional method of manufacturing a double-layer scaffold manufactured in a two-step process by manufacturing and attaching each polymer scaffold separately, it is completely attached through a single process without a separate attachment process
  • the double-layer scaffold of the present invention can be prepared, and the cells are cultured in the double-layer scaffold thus prepared and applied to tissue regeneration or wound healing of skin defects, or the co-culture of cartilage cells and bone cells is used to treat tissues such as bone and cartilage. It can be applied to these abutments to promote regeneration of skin tissue lost due to wounds, burns, tumors, and the like.
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating a manufacturing process of a double layer scaffold according to the present invention
  • FIG 3 is a digital image of a bilayer scaffold according to the present invention (A: bilayer scaffold in hydrated state, B: bilayer scaffold in dried state, C: bilayer scaffold dried before crosslinking),
  • FIG. 6 shows a bilayer scaffold according to the present invention.
  • Micro-CT image A: double layer scaffold, B: gelatin layer
  • FIG. 7 is a scanning electron micrograph of cells cultured for one day in a bilayer scaffold according to the present invention.
  • 9 and 10 is to treat the wound tissue by treating the bilayer scaffold according to the present invention to examine the effect of tissue regeneration in the wound tissue
  • 11 is a result of RT-PCR analysis by cutting the wound tissue treated with the bilayer scaffold.
  • the present invention comprises the steps of preparing a first polymer aqueous solution; Adding and stirring a second polymer to the first aqueous polymer solution; Adding a surfactant to the stirred reactant to perform high temperature and high speed stirring; Lyophilizing the stirred reactant to obtain a sponge; Dipping the sponge in a crosslinking agent to crosslink it; And it provides a method for producing a double-layer scaffold by a single process comprising the step of lyophilizing the crosslinked reactant again.
  • the first polymer and the second polymer are different polymers , gelatin, Chitosan, elastin, hyaluronic acid, hydroxyapatite, alginate, collagen, cellulose, polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), polycaprolactone (PCL), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), poly [(Lactic-co- (glycolic acid)) (PLGA), poly [(3-hydroxybutyrate) -co- (3-hydroxyvalorate) (PHBV), polydioxanone (PDO), poly [(L Lactide) -co- (caprolactone)], poly (esterurethane) (PEUU), poly [(L-lactide) -co- (D-lactide)], poly [ethylene-co- (vinyl alcohol )] (PVOH), polyacrylic acid (PAA), polyvinyl alcohol (PVA), polyvinylpyrrolidone (PVP), polyst
  • the surfactant may be an anionic surfactant, for example sodium dodecyl sulfate (sds), ammonium lauryl sulfate (als), sodium lauryl ethylene sulfate (sles) ), Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS), Alpha-Olefin Sulfonate (AOS), Alkyl Sulfate (AS), Alkyl Ether Sulfate (AES) and Sodium It may be selected from the group consisting of Alkane Sulfonate (SAS), preferably sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • sds sodium dodecyl sulfate
  • als ammonium lauryl sulfate
  • sodium lauryl ethylene sulfate sles
  • AOS Alpha-Olefin Sulfonate
  • AS Alkyl Sulfate
  • AES Alkyl Ether
  • the high temperature and high speed stirring is preferably stirred at 800 to 2000 rpm at a temperature of 80 to 120 °C.
  • the crosslinking agent may be selected from the group consisting of glutaraldehyde, ethyldiethylaminopropylcarbodiimide (EDC), genepin, and transglutaminase (TG).
  • EDC ethyldiethylaminopropylcarbodiimide
  • TG transglutaminase
  • the present invention comprises the steps of preparing a gelatin aqueous solution by stirring at 100 to 300 rpm at 60 to 70 °C so that the gelatin is completely dissolved in water; Adding and stirring polyvinyl alcohol (PVA) to the gelatin aqueous solution; Adding sodium dodecyl sulfate to the stirred reactant at a high temperature and high speed at 80 to 120 ° C. to 800 to 2000 rpm; Lyophilizing the stirred reactant to obtain a sponge; Dipping the sponge in a crosslinking agent selected from glutaraldehyde or EDC (Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) to crosslink the sponge; And lyophilizing the crosslinked reactant again.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • the present invention provides a tissue regeneration method comprising culturing cells in a bilayer scaffold according to the preparation method.
  • the cells may be any one or two or more selected from the group consisting of chondrocytes, bone cells and skin cells, and the cells may be co-cultured by culturing different cells in the upper and lower layers of the bilayer scaffold, respectively. have.
  • the present invention also provides a composition for tissue regeneration or wound healing comprising the bilayer scaffold.
  • gelatin is used as the first polymer
  • polyvinyl alcohol (PVA) is used as the second polymer
  • sodium dodecyl sulfate (SDS) is used as the surfactant
  • glutaraldehyde is used as the crosslinking agent.
  • EDC Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide
  • preparing a gelatin aqueous solution by stirring at 100 to 300 rpm at 60 to 70 °C so that the gelatin is completely dissolved in water; Adding and stirring polyvinyl alcohol (PVA) to the gelatin aqueous solution; Adding sodium dodecyl sulfate to the stirred reactant at a high temperature and high speed at 80 to 120 ° C. to 800 to 2000 rpm; Lyophilizing the stirred reaction at -80 ° C.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • a sponge Dipping the sponge in a crosslinking agent selected from glutaraldehyde or EDC (Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) to crosslink the sponge; And lyophilizing the crosslinked reactant at -80 ° C to prepare a bilayer scaffold.
  • a crosslinking agent selected from glutaraldehyde or EDC (Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide)
  • gelatin which is a natural polymer
  • the gelatin aqueous solution is preferably 1 to 99% by weight gelatin aqueous solution, preferably 2.5% by weight gelatin aqueous solution. If the gelatin content in the aqueous solution of gelatin is out of the above range, it may cause a problem of not visually confirming that the layer separation occurs.
  • Polyvinyl alcohol (PVA) is added to the gelatin aqueous solution and stirred to prepare a polymer blend solution such that PVA is contained in an amount of 1 to 99% by weight, preferably 12.5% by weight. If the PVA content is out of the above range, it may cause a problem of not visually confirming that delamination occurs.
  • SDS Sodium dodecyl sulfate
  • the stirred reaction was lyophilized at -80 ° C. for 24 to 48 hours to obtain a sponge, and the sponge was immersed in a crosslinking agent selected from glutaraldehyde or EDC (Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) and crosslinked.
  • the crosslinking agent is an aqueous solution containing 0.1 to 1% by weight of a crosslinking agent such as glutaraldehyde or EDC (Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide), and crosslinking for 3 to 24 hours. If the content of the crosslinking agent is out of the above range, the crosslinking reaction may not occur to decompose in solution, or may cause problems in cell culture due to the residue of the crosslinking agent which does not occur.
  • the crosslinked reactant is lyophilized again at -80 ° C to prepare a bilayer scaffold.
  • FIG. 2 shows a bilayer scaffold having a porous gelatin layer on the left side and a high density PVA layer on the right side.
  • FIGS. 4 and 5 show FT-IR microscopic images of the bilayer scaffold and the graphs of the gelatin layer and the PVA layer, respectively, by comparing the prepared gelatin scaffold or the PVA scaffold with a control. As a result, the gelatin layer and the PVA layer were confirmed.
  • A double-layer scaffold
  • B gelatin layer
  • the red portion is a porous gelatin layer
  • the gray portion is a high density PVA layer; Indicates.
  • ECM extracellular matrix
  • the tissue began to fill up from the skin subcutaneously one day after the treatment of the bilayer scaffold according to the present invention.
  • the tissue is integrated into the bilayer scaffold, and after 10 days, the tissue is being regenerated.
  • the gelatin layer is decomposed and the scaffold begins to detach itself, but does not completely detach.
  • the gelatin layer of the bilayer scaffold is almost completely decomposed, and desorption occurs by itself, and the wound is also almost completely regenerated.
  • the control group maintains about 80% of the wound after 5 days.
  • tissue regeneration is performed without contraction of the wound, and the contraction of the wound is a different concept from tissue regeneration and healing, and the wound site becomes hard and dense through the contraction of the wound, thereby becoming a general scar tissue.
  • FIG. 11 is a result of treatment of the bilayer scaffold according to the present invention at the site of injury and RT-PCR analysis by cutting the tissue of the part having the bilayer scaffold after one day, and on the first day, an extracellular matrix (ECM) protein.
  • ECM extracellular matrix
  • ITGA3 is expressed when the integrin reacts with, the expression is not expressed on day 5, IL-8 is not expressed on day 5 was confirmed that the bilayer scaffold according to the present invention does not cause an immune response.
  • CD55 which inhibits the formation of COL16A1
  • a fibrils that form collagen which is a major component of ECM, VEGF, and C5a, which is associated with blood coagulation, is increased.
  • the bilayer scaffold according to the present invention can be widely used as a material for drug, cell, protein and growth factor delivery or artificial skin in tissue engineering, medicine, pharmacy and materials science, and especially for tissue regeneration or wound healing. It can be usefully used as.
  • the cells can be cultured in a bilayer scaffold according to the above production method and used for tissue regeneration or wound healing.
  • the cells may be any one or two or more selected from the group consisting of chondrocytes, bone cells and skin cells, and the cells may be co-cultured by culturing different cells in the upper and lower layers of the bilayer scaffold. It may be.
  • the bilayer scaffold according to the present invention can be applied to skin defects.
  • the cells are cultured in a bottom layer scaffold made of natural polymer and used as a tissue regeneration layer.
  • the drug is loaded into the top layer scaffold made of synthetic polymer and bacteria from outside during tissue regeneration. It can stop infection.
  • the natural polymer scaffold is biodegraded and removed as tissue regeneration proceeds, and the synthetic polymer scaffold is removed when tissue regeneration is completed.
  • the bilayer scaffold according to the present invention may be co-cultured with two kinds of cells and applied to a portion where tissues are in contact with each other, such as bone and cartilage, to help regeneration at the same time. That is, culturing chondrocytes in a bottom layer scaffold made of a natural polymer, culturing bone cells in a top layer scaffold made of a synthetic polymer, and then the double layer scaffold in a part where the tissue is in contact. Apply to help tissue regeneration.
  • Gelatin aqueous solution was prepared at 2.5% by weight and stirred at 80 rpm at 300 rpm. After the gelatin was completely dissolved, polyvinyl alcohol (PVA) was added to 10 wt% and stirred. Sodium dodecyl sulfate was added to 0.2% by weight, and the mixture was stirred at 95 ° C. and 900 rpm at high temperature and high speed. The stirred solution was poured into a petri dish and lyophilized at ⁇ 80 ° C. for at least 24 hours to obtain a sponge. The sponge was immersed in an aqueous solution containing 0.5 wt% of glutaraldehyde and crosslinked for at least 12 hours. Again, lyophilization at ⁇ 80 ° C. yielded a bilayer scaffold.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • Sodium dodecyl sulfate was added to 0.2% by weight, and the mixture was stirred at 95 ° C. and 900 rpm at high temperature and high
  • the SEM images of the double-layer scaffold thus prepared with the field emission scanning electron microscope (FE-SEM), S-4100, HITACHI, LTD are as shown in Figure 2, the field emission scanning electron microscope (FE-SEM), S- Digital images taken with 4100, HITACHI, LTD are shown in FIG. 3.
  • the double-layer scaffold is completely integrally attached to confirm that it is a safe double-layer scaffold without separation.
  • the bilayer scaffolds thus prepared were analyzed by scanning liquid microscope with liquid nitrogen in a microscope FTIR Spectro photometer (Spectrum 100, PerkinElmer, USA) / imaging systems (Spotlight 200, PerkinElmer, USA) chamber. PVA scaffolds were analyzed as a control.
  • the bilayer scaffold thus prepared was analyzed using a SKYSCAN1172 (Skyscan, German) to analyze the micro-CT image, wherein the monochromatic beam 40 kV, the sample and detector distance 45.14 mm, exposure time 147 ms, pixel size
  • the analysis was carried out by fixing to 4.84362 ⁇ m.
  • the micro-CT image of the double-layer scaffold according to the present invention as shown in Figure 6 (A: double-layer scaffold, B: gelatin layer), the red portion is a porous gelatin layer, the gray portion is a high density PVA layer Indicated.
  • a 7 mm wound was made using a biopsy punch, and a 7 mm size bilayer scaffold of the same size was raised and banded with the gelatin layer in contact with the wound area.
  • a 7 mm size bilayer scaffold of the same size was raised and banded with the gelatin layer in contact with the wound area.
  • for sterilization of the scaffold soaked in 20, 40, 60, 80, 100% of ethanol for 1 hour and finally soaked in 70% ethanol for 24 hours, and then soaked in PBS buffer for 3 hours at room temperature Used.
  • the control group was left open with the wound, and the test group was made of the wound and then covered with the double layer scaffold according to the present invention.
  • the tissue when looking at the photograph one day after the double layer scaffold treatment, the tissue began to rise from the subcutaneous of the skin, while in the control group more than 90% of the wound remains, while in the experimental group about 80% wound
  • the size of the site was reduced, and 5 days later, when looking at the photograph, the tissue was inserted into the bilayer scaffold according to the present invention, and the size of the wound site was also reduced to about 80% in the control group, while the experimental group was less than 40% of the initial size.
  • RT-PCR analysis was performed by treating the damaged layer of the bilayer scaffold according to the present invention in the same manner as in Experimental Example 2 and cutting the tissue of the portion having the double layer scaffold after one day.
  • RT-PCR analysis conditions were as follows: 5 minutes at 94 ° C. (initial denaturation), 30 seconds at 94 ° C. 30 cycles (denature), 30 seconds at 55-60 ° C. (annealing), and 72 ° C. depending on the melting point of the primer. 75 cycles (final extension) for 1 minute (extended) and finally 10 minutes at 72 ° C.
  • the PCR product thus obtained was analyzed by gel electrophoresis.
  • the primer set used is as follows.
  • ITGA3 which is expressed when integrins react with ECM (extracellular matrix) protein, is expressed on day 1, and its expression does not appear on day 5, and IL-8 is not expressed on day 5. It was confirmed that the bilayer scaffold according to the present invention did not cause an immune response.
  • the expression of CD55 which inhibits the production of the fibril COL16A1, the vascular endothelial growth factor VEGF, and the inflammatory substance C5a associated with blood coagulation, which forms collagen, which is a major component of ECM, was increased.

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Abstract

본 발명은 단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 얻어진 이중층 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법에 관한 것으로, 상기 이중층 스캐폴드 제조방법은 각각의 고분자 스캐폴드를 따로 제조한 뒤 부착하는 과정을 거쳐 2단계 공정으로 제조한 종래 이중층 스캐폴드의 제조방법과 달리 별도의 부착공정 없이 단일공정을 통해 완벽하게 부착된 형태의 이중층 스캐폴드를 제조할 수 있다. 또한, 이렇게 제조된 이중층 스캐폴드에 세포를 배양하여 피부결손부위의 조직재생 또는 상처치유에 적용하거나, 연골세포와 뼈세포를 공배양하여 뼈와 연골같이 조직이 맞닿아 있는 부분에 적용하여 창상, 화상, 종양 등으로 인한 손실된 피부 조직재생을 촉진시킬 수 있다.

Description

단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 얻어진 이중층 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법
본 발명은 단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 얻어진 이중층 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법에 관한 것이다.
스캐폴드(Scaffold)는 조직 세포의 체외 배양과 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체 및 점착 기질을 칭하는 것으로, 이러한 스캐폴드는 인체조직 재생을 위한 세포 이식에 사용되고 있으며, 또한 세포의 대량배양 및 증식에 있어서 그 중요성은 매우 높다. 왜냐하면 세포와 기질 간의 접촉부분에서 세포의 점착 및 이에 수반되는 상피세포의 이동과 증식에 기인하기 때문이다.
즉, 생물학적으로 활성을 지니고 있는 대부분의 세포는 체내 또는 체외의 물질과 접촉 시 생존하기 위하여 반드시 거쳐야 되는 기본 단계가 있으며, 그 첫 단계는 세포의 점착이다. 특히, 섬유아세포 및 조직세포의 생존단계를 살펴보면, 세포는 우선적으로 기질에 점착을 하며 점착 후 세포질에서의 세포기관(organelle)의 대사가 활발해지고, 증식 및 양분의 공급을 원활히 하기 위하여 새로운 부위로 이동하게 된다.
따라서, 세포의 증착을 활성화시키는 표면은 세포의 증식을 배가하는데 가장 기본이 되는 수단이다. 이러한 세포의 기질에 대한 점착 능은 기질의 성분에 의하여 인위적으로 조절될 수 있다. 스캐폴드는 세포의 재생과 이들이 성장할 때 지지체가 되어주는 담체, 즉 인공기질의 근간이 되는 물질로서, 최근 세포의 대량배양 및 증식용기 또는 플라스크에 코팅되어 사용된다.
한편, 대한민국 공개특허 제2004-0016984호에는 세포 및 조직 배양용 담체 및 배양방법에 관한 것으로서, 섬유아세포의 과잉증식을 억제하면서 목적으로 하는 조직이나 장기를 효과적으로 재생할 수 있는 세포 및 조직배양용 담체, 및 세포 및 조직배양 방법을 개시한다. 그러나, 상기 특허에 공지된 스캐폴드는 세포의 대량배양에 적합할 만큼 기질에 대한 점착 능과 물리적 특성이 우수하지 않을 뿐 아니라, 제조공정 또한 간단하지 않고 바람직하지 않은 점이 많은 문제가 있다.
또한, 종래 이중층 스캐폴드 제조 시에는 각각의 고분자 스캐폴드를 따로 제조한 뒤 부착하는 과정을 거쳐 이중층 스캐폴드를 제조하였는데, 이렇게 제조된 이중층 스캐폴드는 완벽하게 부착이 되지 않아 이후에 분리될 가능성이 농후하고 각각의 고분자 스캐폴드를 제조하는 2단계(two-step) 공정을 거치므로 공정이 복잡해지는 문제가 있다.
따라서, 본 발명자들은 두 고분자가 블렌딩된 용액에 음이온 계면활성제를 첨가하여 고온고속 교반 반응을 통해 상분리가 일어나게 함으로써 얻어진 스캐폴드가 구조적, 화학적으로 명확한 이중층 스캐폴드임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 간단한 단일공정을 통해 분리되지 않는 구조적, 화학적으로 명확한 이중층 스캐폴드를 제조하는 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 이중층 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1 고분자 수용액을 준비하는 단계; 상기 제1 고분자 수용액에 제2 고분자를 첨가하여 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물에 계면활성제를 첨가하여 고온고속 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물을 동결건조시켜 스폰지를 얻는 단계; 상기 스폰지를 가교제에 담구어 가교시키는 단계; 및 상기 가교된 반응물을 재차 동결건조시키는 단계를 포함하는 단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 젤라틴이 물에 완전히 용해되도록 60 내지 70℃에서 100 내지 300 rpm으로 교반하여 젤라틴 수용액을 준비하는 단계; 상기 젤라틴 수용액에 폴리비닐알콜(PVA)을 첨가하여 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물에 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate)를 첨가하여 80 내지 120℃에서 800 내지 2000 rpm으로 하여 고온고속 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물을 동결건조시켜 스폰지를 얻는 단계; 상기 스폰지를 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 EDC(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) 중에서 선택된 가교제에 담구어 가교시키는 단계; 및 상기 가교된 반응물을 재차 동결건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 제조방법에 따른 이중층 스캐폴드에 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조직 재생방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 이중층 스캐폴드를 포함하는 조직 재생 또는 상처 치유용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 각각의 고분자 스캐폴드를 따로 제조한 뒤 부착하는 과정을 거쳐 2단계 공정으로 제조한 종래 이중층 스캐폴드의 제조방법과 달리 별도의 부착공정 없이 단일공정을 통해 완벽하게 부착된 형태의 이중층 스캐폴드를 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 이중층 스캐폴드에 세포를 배양하여 피부결손부위의 조직재생 또는 상처치유에 적용하거나, 연골세포와 뼈세포를 공배양하여 뼈와 연골같이 조직이 맞닿아 있는 부분에 적용하여 창상, 화상, 종양 등으로 인한 손실된 피부 조직재생을 촉진시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드 제조공정을 순서도로 개시한 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드의 주사전자현미경 이미지이고,
도 3은 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드의 디지털 이미지이고(A: 수화된 상태의 이중층 스캐폴더, B: 건조된 상태의 이중층 스캐폴더, C: 가교전 건조된이중층 스캐폴더),
도 4는 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드의 FT-IR 현미경 이미지와 그래프 (젤라틴층)이고,
도 5는 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드의 FT-IR 현미경 이미지와 그래프 (PVA층)이고,
도 6은 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드의 Micro-CT 이미지이고(A: 이중층 스캐폴더, B: 젤라틴층),
도 7는 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드에서 1일 동안 배양된 세포의 주사전자현미경 사진이고,
도 8는 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드에서 5일 동안 배양된 세포의 주사전자현미경 사진이고,
도 9 및 도 10은 상처 조직에 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드를 처리하여 상처 조직에서의 조직 재생 효과를 검토한 것이고,
도 11은 이중층 스캐폴더를 처리한 상처 조직을 잘라서 RT-PCR 분석을 수행한 결과이다.
본 발명은 제1 고분자 수용액을 준비하는 단계; 상기 제1 고분자 수용액에 제2 고분자를 첨가하여 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물에 계면활성제를 첨가하여 고온고속 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물을 동결건조시켜 스폰지를 얻는 단계; 상기 스폰지를 가교제에 담구어 가교시키는 단계; 및 상기 가교된 반응물을 재차 동결건조시키는 단계를 포함하는 단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
상기 제1 고분자 및 제2 고분자는 서로 다른 고분자로서, 젤라틴, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 하이드록시아파타이트, 알지네이트, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1 고분자는 젤라틴이고, 제2 고분자는 폴리비닐알코올(PVA)일 수 있다.
상기 계면활성제는 음이온 계면활성제일 수 있으며, 예를들어 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate; SDS), 암모늄 라우릴 설페이트(Ammonium Lauryl Sulfate; ALS), 소듐 라우릴 에틸렌 설페이트(Sodium Lauryl Ethylene Sulfate; SLES), 선형 알킬벤젠 설포네이트(Linear Alkylbenzene Sulfonate; LAS), 알파-올레핀 설포네이트(α-Olefin Sulfonate; AOS), 알킬 설페이트(Alkyl Sulfate; AS), 알킬 에테르 설페이트(Alkyl Ether Sulfate; AES) 및 소듐 알칸 설포네이트(Sodium Alkane Sulfonate; SAS)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate; SDS)일 수 있다.
상기 고온고속 교반은 80 내지 120℃의 온도에서 800 내지 2000 rpm으로 교반하는 것이 바람직하다.
상기 가교제는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde), 에틸디에틸아미노프로필카보디이미드(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide; EDC), 제니핀(genepin), 및 트랜스글루타미나제(transglutaminase; TG)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 젤라틴이 물에 완전히 용해되도록 60 내지 70℃에서 100 내지 300 rpm으로 교반하여 젤라틴 수용액을 준비하는 단계; 상기 젤라틴 수용액에 폴리비닐알콜(PVA)을 첨가하여 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물에 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate)를 첨가하여 80 내지 120℃에서 800 내지 2000 rpm으로 하여 고온고속 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물을 동결건조시켜 스폰지를 얻는 단계; 상기 스폰지를 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 EDC(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) 중에서 선택된 가교제에 담구어 가교시키는 단계; 및 상기 가교된 반응물을 재차 동결건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 제조방법에 따른 이중층 스캐폴드에 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조직 재생방법을 제공한다.
상기 세포는 연골세포, 뼈세포 및 피부세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 상기 세포는 이중층 스캐폴드의 상층과 하층에 각각 다른 세포를 배양하여 공배양(co-culture)할 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 이중층 스캐폴드를 포함하는 조직 재생 또는 상처 치유용 조성물을 제공한다.
이하, 상기 제1 고분자로 젤라틴을, 상기 제2 고분자로 폴리비닐알코올(PVA)을, 상기 계면활성제로 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate; SDS)를, 그리고, 상기 가교제로 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 에틸디에틸아미노프로필카보디이미드(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide; EDC)를 사용한 이중층 스캐폴드의 제조방법을 본 발명의 일실시예로 하여 상세하게 설명한다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 젤라틴이 물에 완전히 용해되도록 60 내지 70℃에서 100 내지 300 rpm으로 교반하여 젤라틴 수용액을 준비하는 단계; 상기 젤라틴 수용액에 폴리비닐알콜(PVA)을 첨가하여 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물에 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate)를 첨가하여 80 내지 120℃에서 800 내지 2000 rpm으로 하여 고온고속 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물을 -80℃에서 24시간 내지 48시간 동안 동결건조시켜 스폰지를 얻는 단계; 상기 스폰지를 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 EDC(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) 중에서 선택된 가교제에 담구어 가교시키는 단계; 및 상기 가교된 반응물을 -80℃에서 동결건조시는 단계를 거쳐 이중층 스캐폴드를 제조할 수 있다.
먼저, 천연 고분자인 젤라틴을 물에 넣고 60 내지 70℃에서 100 내지 300 rpm으로 교반하여 완전히 용해시킨 젤라틴 수용액을 준비한다. 상기 젤라틴 수용액은 1 내지 99 중량%의 젤라틴 수용액, 바람직하게는 2.5 중량%의 젤라틴 수용액인 것이 바람직하다. 만약, 젤라틴 수용액 중 젤라틴 함량이 상기 범위를 벗어나면 층분리가 일어남을 시각적으로 확인하지 못하는 문제가 야기될 수 있다.
그리고, 상기 교반 조건을 벗어나면 젤라틴 수용액이 균일하게 용해되지 않거나, 층분리가 일어나지 않는 문제가 야기될 수 있다.
상기 젤라틴 수용액에 폴리비닐알콜(PVA)을 첨가하고 교반하여 PVA가 1 내지 99 중량%, 바람직하게는 12.5 중량%로 함유되도록 고분자 브렌드 용액을 제조한다. 만약, PVA 함량이 상기 범위를 벗어나면 층분리가 일어남을 시각적으로 확인하지 못하는 문제가 야기될 수 있다.
상기 교반한 고분자 브렌드 용액에 음이온 계면활성제로서 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate; SDS)를 첨가하여 80 내지 120℃에서 800 내지 2000 rpm으로 하여 고온고속 교반한다. 이때, SDS는 고분자 브렌드 용액 전체에 대해 0.01 내지 2 중량%로 함유되도록 첨가한다. 만약, SDS 함량이 상기 범위를 벗어나면 층분리의 반응을 조절하지 못하거나 취급이 어려워지는 등의 문제가 야기될 수 있다.
또한, 상기 고온고속 교반 조건을 벗어나면 균일하게 층분리가 일어나지 않거나, 층분리의 반응을 조절하지 못하는 등의 문제가 야기될 수 있다.
상기 교반한 반응물을 -80℃에서 24시간 내지 48 시간 동안 동결건조시켜 스폰지를 얻고, 상기 스폰지를 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 EDC(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) 중에서 선택된 가교제에 담구어 가교시킨다. 이때, 가교제는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 EDC(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide)와 같은 가교제를 0.1 내지 1 중량%로 함유한 수용액을 사용하며, 3시간 내지 24시간 동안 가교시킨다. 만약, 가교제 함량이 상기 범위를 벗어나면 가교반응이 일어나지 않아 용액상에서 분해가 되거나, 또는 반응이 일어나지 않은 가교제의 잔기로 인해 세포배양 하는 데에 문제가 야기될 수 있다.
상기 가교된 반응물을 -80℃에서 재차 동결건조시켜 이중층 스캐폴드를 제조한다.
상기 일실시예에 따르면, 고분자 스캐폴드를 각각 제조하여 부착하는 공정을 거쳐 제조된 종래 이중층 스캐폴드 제조방법과 달리 부착공정 없이 단일공정을 통해 층분리 가능성이 없는 도 2 및 도 3과 같은 이중층 스캐폴드를 간단히 제조할 수 있다. 특히, 도 2에서는 왼쪽의 다공성의 젤라틴층과 오른쪽의 밀도가 높은 PVA 층을 갖는 이중층 스캐폴드를 확인할 수 있다.
그리고, 도 4 및 도 5는 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드의 FT-IR 현미경 이미지와 각각 젤라틴층과 PVA층의 그래프를 나타낸 것으로서, 별도로 제조한 젤라틴 스캐폴더나 PVA 스캐폴더를 대조군으로 대조하여 분석한 결과, 젤라틴층과 PVA층을 확인한 것이다.
또한, 도 6는 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드의 Micro-CT 이미지를 나타낸 것으로서(A: 이중층 스캐폴더, B: 젤라틴층), 붉은 색 부분이 다공성 젤라틴층, 회색 부분이 밀도가 높은 PVA층을 나타낸다.
또한, 상기 이중층 스캐폴드를 이용하여 세포를 배양한 결과, 도 7과 같이 세포 분주 1일 후에는 세포들이 스캐폴드에 부착되고 증식되기 시작하였으며, 도 8과 같이 세포 분주 5일 후에는 세포들이 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 분비하여 스캐폴드 내에 ECM이 증착되어 있음을 확인할 수 있다.
또한, 상기 이중층 스캐폴드를 이용하여 상처 조직에서의 조직 재생 효과를 검토한 결과, 도 9 및 도 10과 같이 본 발명에 따른 이중층 스캐폴더의 처리 1일 후 피부의 피하에서부터 조직이 차올라오기 시작하였고, 5일 후 이중층 스캐폴더에 조직이 삽입(integration)되며, 10일 후 조직이 재생되는 중이며, 조직이 재생되면서 젤라틴층은 분해되어 스캐폴더가 저절로 탈착되기 시작하지만 완전히 탈착이 일어나지는 않는다. 그리고, 15일 후 이중층 스캐폴더의 젤라틴층의 분해가 거의 다 이루어져 저절로 탈착이 일어나며, 상처 부위도 조직이 거의 다 재생된다. 한편, 대조군에서는 5일 후에도 80% 정도의 상처 부위를 유지하고 있다.
특히, 본 발명에서는 상처의 수축없이 조직 재생이 이루어지며, 상처의 수축은 조직 재생 및 치유와는 다른 개념으로서, 상처의 수축을 통해 상처 부위가 단단해지고 밀도가 높아져서 일반적인 흉터 조직이 된다.
그리고, 도 11은 손상 부위에 본 발명에 따른 이중층 스캐폴더를 처리하고 1일 후에 이중층 스캐폴더가 있는 부분의 조직을 잘라서 RT-PCR 분석을 수행한 결과로서, 1일째에는 ECM(extracellular matrix) 프로틴과 반응하는 인테그린이 형성될 때 발현되는 ITGA3이 발현되며, 5일째 그 발현이 나타나지 않으며, 5일째에 IL-8이 발현되지 않아 본 발명에 따른 이중층 스캐폴더가 면역반응을 일으키지 않음을 확인할 수 있었으며, ECM 주요성분인 콜라젠을 형성하는 피브릴인 COL16A1, 혈관내피성장인자 VEGF 및 혈액응고와 관련된 염증성물질 C5a의 생성을 억제하는 CD55의 발현이 증가한다.
따라서, 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드는 조직공학, 의학, 약학 및 재료과학 분야에서 약물, 세포, 단백질 및 성장인자 전달용 재료 또는 인공피부 등으로 폭넓게 사용할 수 있으며, 특히 조직 재생 또는 상처 치유용 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.
즉, 상기 제조방법에 따른 이중층 스캐폴드에 세포를 배양하여 조직 재생 또는 상처 치유에 이용할 수 있다. 상기 세포로는 연골세포, 뼈세포 및 피부세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 상기 세포는 이중층 스캐폴드의 상층과 하층에 각각 다른 세포를 배양하여 공배양(co-culture)할 수도 있다.
특히, 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드는 피부결손부위에 적용할 수 있다. 즉, 천연 고분자로 이루어진 하층(bottom layer) 스캐폴드에 세포를 배양하여 조직재생층으로 사용하며, 합성 고분자로 이루어진 상층(top layer) 스캐폴드에 약물을 로딩하여 조직이 재생되는 동안 외부로부터의 세균 감염을 차단할 수 있다. 상기 천연 고분자 스캐폴드는 조직재생이 진행되면서 생분해되어 제거되며, 상기 합성 고분자 스캐폴드는 조직재생이 완료되면 제거한다.
또한, 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드는 2종류의 세포를 공배양하여 뼈와 연골같이 조직이 맞닿아 있는 부분에 적용하여 동시에 재생을 도울 수 있다. 즉, 천연 고분자로 이루어진 하층(bottom layer) 스캐폴드에 연골세포를 배양하고, 합성 고분자로 이루어진 상층(top layer) 스캐폴드에 뼈세포를 배양한 후, 조직이 맞닿아있는 부분에 상기 이중층 스캐폴드를 적용하여 조직 재생에 도움을 줄 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 이중층 스캐폴드의 제조
1) 이중층 스캐폴드 제조
젤라틴 수용액을 2.5 중량%로 제조하여 80℃에서 300 rpm으로 교반하였다. 젤라틴이 완전히 용해된 후, 폴리비닐알콜(PVA)이 10 중량%가 되도록 첨가하여 교반하였다. 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate)를 0.2 중량%가 되도록 첨가하여 95℃에서 900 rpm으로 하여 고온고속 교반하였다. 상기 교반한 용액을 페트리디쉬(petri dish)에 부어 -80℃에서 24시간 이상 동결건조시켜 스폰지를 얻었다. 상기 스폰지를 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)가 0.5 중량%로 함유된 수용액에 12시간 이상 담구어 가교시켰다. 다시, -80℃에서 동결건조시켜 이중층의 스캐폴드를 제조하였다.
2) 이중층 스캐폴드 SEM 및 디지털 이미지
이렇게 제조된 이중층 스캐폴드를 전계방사형 주사전자현미경 (FE-SEM), S-4100, HITACHI, LTD으로 관찰한 SEM 이미지는 도 2와 같으며, 전계방사형 주사전자현미경 (FE-SEM), S-4100, HITACHI, LTD로 촬영한 디지털 이미지는 도 3과 같다. 즉, 상기 이중층 스캐폴드는 완벽하게 일체형으로 부착되어 있어 분리 가능성이 없는 안전한 이중층 구조의 스캐폴드임을 확인할 수 있었다.
3) 이중층 스캐폴드의 FT-IR 이미지 분석
이렇게 제조된 이중층 스캐폴드를 microscope FTIR Spectro photometer (Spectrum 100, PerkinElmer, USA) / imaging systems (Spotlight 200, PerkinElmer, USA) 챔버에 액체 질소를 넣고 현미경으로 스캔하면서 분석하였고, 별도로 제조한 라틴 스캐폴더나 PVA 스캐폴더를 대조군으로 대조하여 분석하였다.
그 결과, 도 4 및 도 5와 같이 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드의 젤라틴층과 PVA층을 확인하였다.
4) 이중층 스캐폴드의 Micro-CT 이미지 분석
이렇게 제조된 이중층 스캐폴드를 SKYSCAN1172(Skyscan, German)를 이용하여 Micro-CT 이미지를 분석하였고, 이때 단색성 빔(mono chromatic beam) 40 kV, 샘플과 디텍터 거리 45.14 mm, 노출시간 147 ms, 픽셀 크기 4.84362 ㎛로 고정하여 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 6과 같이 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드의 Micro-CT 이미지를 나타내며(A: 이중층 스캐폴더, B: 젤라틴층), 붉은 색 부분이 다공성 젤라틴층, 회색 부분이 밀도가 높은 PVA층을 나타내었다.
<실험예 1> 이중층 스캐폴드의 in vitro 성능 검토
실시예에서 제조한 이중층 스캐폴드를 직경 1cm로 준비한 후, 상기 이중층 스캐폴드에 2X104 개 CRL-2310(ATCC Number; keratinocyte, human papillomavirus 16(HPV-16) E6/E7 transformed)를 분주하였다. 세포 분주 후 SEM 관찰한 결과, 도 7과 같이 세포 분주 1일 후에는 세포들이 스캐폴드에 부착되고 증식되기 시작하였으며, 도 8과 같이 세포 분주 5일 후에는 세포들이 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 분비하여 스캐폴드 내에 ECM이 증착되어 있음을 확인할 수 있다.
<실험예 2> 이중층 스캐폴드의 in vivo 상처 재생 효과 검토
생검 펀치를 이용하여 7mm의 상처를 만들었고, 상처크기와 동일한 7mm 사이즈의 이중층 스캐폴더를 젤라틴층이 상처부위와 맞닿게 올리고 밴딩하였다. 이때, 스캐폴더의 살균을 위해 20, 40, 60, 80, 100%의 에탄올에 1시간씩 담궈두고 마지막에 70% 에탄올에 24시간 담궈두었고, 그리고 PBS 버퍼에서 상온, 3시간 동안 담궈두고 실험에 사용하였다. 대조군(control)은 상처를 오픈하여 그대로 두었고, 실험군(Test)은 상처를 만든 후 본 발명에 따른 이중층 스캐폴더로 덮어 주었다.
그 결과, 도 9 및 도 10과 같이, 이중층 스캐폴더 처리 1일 후 사진을 살펴보면 피부의 피하에서부터 조직이 차올라오기 시작하였고, 대조군에서는 상처의 90% 이상이 남아있는 반면, 실험군에서는 80% 정도로 상처 부위의 사이즈가 줄어들었으며, 5일 후 사진을 살펴보면 본 발명에 따른 이중층 스캐폴더에 조직이 삽입(integration)되었으며, 창상 부위 사이즈도 대조군이 80% 정도로 줄어든 반면, 실험군에서는 처음 사이즈의 40% 이하로 줄어 들었다. 그리고, 10일 후 사진을 살펴보면 조직이 재생되는 중이어서 완전히 재생되진 않았지만 창상 부위가 완전히 덮힐 정도로 조직이 차올랐으며, 조직이 재생되면서 젤라틴층은 분해되어 스캐폴더가 저절로 탈착되기 시작하였지만 완전히 탈착이 일어나지는 않았다. 그리고, 15일 후 사진을 살펴보면 이중층 스캐폴더의 젤라틴층의 분해가 거의 다 이루어져 저절로 탈착이 일어났으며, 창상 부위도 조직이 거의 다 재생된 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 3> RT-PCR 분석
실험예 2와 동일한 방법으로 손상 부위에 본 발명에 따른 이중층 스캐폴더를 처리하고 1일 후에 이중층 스캐폴더가 있는 부분의 조직을 잘라서 RT-PCR 분석을 수행하였다. RT-PCR 분석 조건은 다음과 같다: 94℃에서 5분(초기 변성), 94℃에서 30초 30주기(변성), 프라이머의 용융점에 따라 55-60℃에서 30초(어닐링), 및 72℃에서 1분(연장) 및 마지막으로 72℃에서 10분간 75회 주기(최종 연장). 이렇게 얻어진 PCR 산물을 겔 전기영동을 통해 분석하였다. 이때, 사용된 프라이머 세트는 다음과 같다.
표 1
증폭대상 정방향 프라이머 역방항 프라이머
COL16A1 cattggtattggcattgcag (서열 1) tcccaacggagtctttcatc (서열 2)
ITGA3 tattcctccgaaccagcatc (서열 3) ctcttcatctccgccttctg (서열 4)
VEGF ATCTGCATGGTGATGTTGGA (서열 5) GGGCAGAATCATCACGAAGT (서열 6)
CD55 TCCACCCGTCTTGTTTGTCC (서열 7) CTCAGAGACCGACTTGGACC (서열 8)
GAPDH CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTATTGG (서열 9) GCTCCTGGAAGATGGTGATGGGATTTCC (서열 10)
그 결과, 도 11과 같이 1일째에는 ECM(extracellular matrix) 프로틴과 반응하는 인테그린이 형성될 때 발현되는 ITGA3이 발현되며, 5일째 그 발현이 나타나지 않았으며, 5일째에 IL-8이 발현되지 않아 본 발명에 따른 이중층 스캐폴더가 면역반응을 일으키지 않았다는 것을 확인할 수 있었다. 그리고, ECM 주요성분인 콜라젠을 형성하는 피브릴 COL16A1, 혈관내피성장인자 VEGF 및 혈액응고와 관련된 염증성물질 C5a의 생성을 억제하는 CD55의 발현이 증가되었다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (11)

  1. 제1 고분자 수용액을 준비하는 단계;
    상기 제1 고분자 수용액에 제2 고분자를 첨가하여 교반하는 단계;
    상기 교반한 반응물에 계면활성제를 첨가하여 고온고속 교반하는 단계;
    상기 교반한 반응물을 동결건조시켜 스폰지를 얻는 단계;
    상기 스폰지를 가교제에 담구어 가교시키는 단계; 및
    상기 가교된 반응물을 재차 동결건조시키는 단계
    를 포함하는 단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 고분자 및 제2 고분자는 서로 다른 고분자로서, 젤라틴, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 하이드록시아파타이트, 알지네이트, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 고분자는 젤라틴이고, 제2 고분자는 폴리비닐알코올(PVA)인 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate; SDS), 암모늄 라우릴 설페이트(Ammonium Lauryl Sulfate; ALS), 소듐 라우릴 에틸렌 설페이트(Sodium Lauryl Ethylene Sulfate; SLES), 선형 알킬벤젠 설포네이트(Linear Alkylbenzene Sulfonate; LAS), 알파-올레핀 설포네이트(-Olefin Sulfonate; AOS), 알킬 설페이트(Alkyl Sulfate; AS), 알킬 에테르 설페이트(Alkyl Ether Sulfate; AES) 및 소듐 알칸 설포네이트(Sodium Alkane Sulfonate; SAS)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 고온고속 교반은 80 내지 120℃의 온도에서 800 내지 2000 rpm으로 교반하는 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 가교제는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde), 에틸디에틸아미노프로필카보디이미드(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide; EDC), 제니핀(genepin), 및 트랜스글루타미나제(transglutaminase; TG)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 젤라틴이 물에 완전히 용해되도록 60 내지 70℃에서 100 내지 300 rpm으로 교반하여 젤라틴 수용액을 준비하는 단계; 상기 젤라틴 수용액에 폴리비닐알콜(PVA)을 첨가하여 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물에 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate)를 첨가하여 80 내지 120℃에서 800 내지 2000 rpm으로 하여 고온고속 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물을 동결건조시켜 스폰지를 얻는 단계; 상기 스폰지를 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 EDC(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) 중에서 선택된 가교제에 담구어 가교시키는 단계; 및 상기 가교된 반응물을 재차 동결건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 제조방법에 따른 이중층 스캐폴드에 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조직 재생방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 세포는 연골세포, 뼈세포 및 피부세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 조직 재생방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 세포는 이중층 스캐폴드의 상층과 하층에 각각 다른 세포를 배양하여 공배양하는 것을 특징으로 하는 조직 재생방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 제조방법에 따른 이중층 스캐폴드를 포함하는 조직재생 또는 상처치유용 조성물.
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