KR20130124797A - 단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 얻어진 이중층 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법 - Google Patents

단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 얻어진 이중층 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 얻어진 이중층 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법에 관한 것으로, 상기 이중층 스캐폴드 제조방법은 각각의 고분자 스캐폴드를 따로 제조한 뒤 부착하는 과정을 거쳐 2단계 공정으로 제조한 종래 이중층 스캐폴드의 제조방법과 달리 별도의 부착공정 없이 단일공정을 통해 완벽하게 부착된 형태의 이중층 스캐폴드를 제조할 수 있다. 또한, 이렇게 제조된 이중층 스캐폴드에 세포를 배양하여 피부결손부위의 조직재생에 적용하거나, 연골세포와 뼈세포를 공배양하여 뼈와 연골같이 조직이 맞닿아 있는 부분에 적용하여 조직재생을 촉진시킬 수 있다.

Description

단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 얻어진 이중층 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법{Preparation method of bilayer scaffold in one-step and tissue regeneration method of bilayer scaffold obtained thereby}
본 발명은 단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 얻어진 이중층 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법에 관한 것이다.
스캐폴드(Scaffold)는 조직 세포의 체외 배양과 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체 및 점착 기질을 칭하는 것으로, 이러한 스캐폴드는 인체조직 재생을 위한 세포 이식에 사용되고 있으며, 또한 세포의 대량배양 및 증식에 있어서 그 중요성은 매우 높다. 왜냐하면 세포와 기질 간의 접촉부분에서 세포의 점착 및 이에 수반되는 상피세포의 이동과 증식에 기인하기 때문이다.
즉, 생물학적으로 활성을 지니고 있는 대부분의 세포는 체내 또는 체외의 물질과 접촉 시 생존하기 위하여 반드시 거쳐야 되는 기본 단계가 있으며, 그 첫 단계는 세포의 점착이다. 특히, 섬유아세포 및 조직세포의 생존단계를 살펴보면, 세포는 우선적으로 기질에 점착을 하며 점착 후 세포질에서의 세포기관(organelle)의 대사가 활발해지고, 증식 및 양분의 공급을 원활히 하기 위하여 새로운 부위로 이동하게 된다.
따라서, 세포의 증착을 활성화시키는 표면은 세포의 증식을 배가하는데 가장 기본이 되는 수단이다. 이러한 세포의 기질에 대한 점착 능은 기질의 성분에 의하여 인위적으로 조절될 수 있다. 스캐폴드는 세포의 재생과 이들이 성장할 때 지지체가 되어주는 담체, 즉 인공기질의 근간이 되는 물질로서, 최근 세포의 대량배양 및 증식용기 또는 플라스크에 코팅되어 사용된다.
한편, 대한민국 공개특허 제2004-0016984호에는 세포 및 조직 배양용 담체 및 배양방법에 관한 것으로서, 섬유아세포의 과잉증식을 억제하면서 목적으로 하는 조직이나 장기를 효과적으로 재생할 수 있는 세포 및 조직배양용 담체, 및 세포 및 조직배양 방법을 개시한다. 그러나, 상기 특허에 공지된 스캐폴드는 세포의 대량배양에 적합할 만큼 기질에 대한 점착 능과 물리적 특성이 우수하지 않을 뿐 아니라, 제조공정 또한 간단하지 않고 바람직하지 않은 점이 많은 문제가 있다.
또한, 종래 이중층 스캐폴드 제조 시에는 각각의 고분자 스캐폴드를 따로 제조한 뒤 부착하는 과정을 거쳐 이중층 스캐폴드를 제조하였는데, 이렇게 제조된 이중층 스캐폴드는 완벽하게 부착이 되지 않아 이후에 분리될 가능성이 농후하고 각각의 고분자 스캐폴드를 제조하는 2단계(two-step) 공정을 거치므로 공정이 복잡해지는 문제가 있다.
따라서, 본 발명자들은 두 고분자가 블렌딩된 용액에 계면활성제를 첨가하여 고온고속 교반 반응을 통해 상분리가 일어나게 함으로써 얻어진 스캐폴드가 구조적으로 명확한 이중층 스캐폴드임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 간단한 단일공정을 통해 분리되지 않는 이중층 스캐폴드를 제조하는 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 이중층 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1 고분자 수용액을 준비하는 단계; 상기 제1 고분자 수용액에 제2 고분자를 첨가하여 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물에 계면활성제를 첨가하여 고온고속 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물을 동결건조시켜 스폰지를 얻는 단계; 상기 스폰지를 가교제에 담구어 가교시키는 단계; 및 상기 가교된 반응물을 재차 동결건조시키는 단계를 포함하는 단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
상기 제1 고분자 및 제2 고분자는 서로 다른 고분자로서, 젤라틴, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 하이드록시아파타이트, 알지네이트, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1 고분자는 젤라틴이고, 제2 고분자는 폴리비닐알코올(PVA)일 수 있다.
상기 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate; SDS), 암모늄 라우릴 설페이트(Ammonium Lauryl Sulfate; ALS), 소듐 라우릴 에틸렌 설페이트(Sodium Lauryl Ethylene Sulfate; SLES), 선형 알킬벤젠 설포네이트(Linear Alkylbenzene Sulfonate; LAS), 알파-올레핀 설포네이트(α-Olefin Sulfonate; AOS), 알킬 설페이트(Alkyl Sulfate; AS), 알킬 에테르 설페이트(Alkyl Ether Sulfate; AES) 및 소듐 알칸 설포네이트(Sodium Alkane Sulfonate; SAS)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate; SDS)일 수 있다.
상기 고온고속 교반은 80 내지 120℃의 온도에서 800 내지 2000 rpm으로 교반하는 것이 바람직하다.
상기 가교제는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde), 에틸디에틸아미노프로필카보디이미드(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide; EDC), 제니핀(genepin), 및 트랜스글루타미나제(transglutaminase; TG)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 젤라틴이 물에 완전히 용해되도록 60 내지 70℃에서 100 내지 300 rpm으로 교반하여 젤라틴 수용액을 준비하는 단계; 상기 젤라틴 수용액에 폴리비닐알콜(PVA)을 첨가하여 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물에 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate)를 첨가하여 80 내지 120℃에서 800 내지 2000 rpm으로 하여 고온고속 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물을 동결건조시켜 스폰지를 얻는 단계; 상기 스폰지를 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 EDC(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) 중에서 선택된 가교제에 담구어 가교시키는 단계; 및 상기 가교된 반응물을 재차 동결건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 제조방법에 따른 이중층 스캐폴드에 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조직 재생방법을 제공한다.
상기 세포는 연골세포, 뼈세포 및 피부세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 상기 세포는 이중층 스캐폴드의 상층과 하층에 각각 다른 세포를 배양하여 공배양(co-culture)할 수도 있다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 각각의 고분자 스캐폴드를 따로 제조한 뒤 부착하는 과정을 거쳐 2단계 공정으로 제조한 종래 이중층 스캐폴드의 제조방법과 달리 별도의 부착공정 없이 단일공정을 통해 완벽하게 부착된 형태의 이중층 스캐폴드를 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 이중층 스캐폴드에 세포를 배양하여 피부결손부위의 조직재생에 적용하거나, 연골세포와 뼈세포를 공배양하여 뼈와 연골같이 조직이 맞닿아 있는 부분에 적용하여 조직재생을 촉진시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드 제조공정을 순서도로 개시한 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드의 디지털 이미지이고,
도 3은 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드의 주사전자현미경 이미지이고,
도 4는 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드에서 1일 동안 배양된 세포의 주사전자현미경 사진이고,
도 5는 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드에서 5일 동안 배양된 세포의 주사전자현미경 사진이다.
이하, 상기 제1 고분자로 젤라틴을, 상기 제2 고분자로 폴리비닐알코올(PVA)을, 상기 계면활성제로 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate; SDS)를, 그리고, 상기 가교제로 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 에틸디에틸아미노프로필카보디이미드(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide; EDC)를 사용한 이중층 스캐폴드의 제조방법을 본 발명의 일실시예로 하여 상세하게 설명한다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 젤라틴이 물에 완전히 용해되도록 60 내지 70℃에서 100 내지 300 rpm으로 교반하여 젤라틴 수용액을 준비하는 단계; 상기 젤라틴 수용액에 폴리비닐알콜(PVA)을 첨가하여 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물에 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate)를 첨가하여 80 내지 120℃에서 800 내지 2000 rpm으로 하여 고온고속 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물을 -80℃에서 24시간 내지 48시간 동안 동결건조시켜 스폰지를 얻는 단계; 상기 스폰지를 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 EDC(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) 중에서 선택된 가교제에 담구어 가교시키는 단계; 및 상기 가교된 반응물을 -80℃에서 동결건조시는 단계를 거쳐 이중층 스캐폴드를 제조할 수 있다.
먼저, 천연 고분자인 젤라틴을 물에 넣고 60 내지 70℃에서 100 내지 300 rpm으로 교반하여 완전히 용해시킨 젤라틴 수용액을 준비한다. 상기 젤라틴 수용액은 1 내지 99 중량%의 젤라틴 수용액, 바람직하게는 2.5 중량%의 젤라틴 수용액인 것이 바람직하다. 만약, 젤라틴 수용액 중 젤라틴 함량이 상기 범위를 벗어나면 층분리가 일어남을 시각적으로 확인하지 못하는 문제가 야기될 수 있다.
그리고, 상기 교반 조건을 벗어나면 젤라틴 수용액이 균일하게 용해되지 않거나, 층분리가 일어나지 않는 문제가 야기될 수 있다.
상기 젤라틴 수용액에 폴리비닐알콜(PVA)을 첨가하고 교반하여 PVA가 1 내지 99 중량%, 바람직하게는 10 중량%로 함유되도록 고분자 브렌드 용액을 제조한다. 만약, PVA 함량이 상기 범위를 벗어나면 층분리가 일어남을 시각적으로 확인하지 못하는 문제가 야기될 수 있다.
상기 교반한 고분자 브렌드 용액에 계면활성제로서 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate; SDS)를 첨가하여 80 내지 120℃에서 800 내지 2000 rpm으로 하여 고온고속 교반한다. 이때, SDS는 고분자 브렌드 용액 전체에 대해 0.01 내지 2 중량%로 함유되도록 첨가한다. 만약, SDS 함량이 상기 범위를 벗어나면 층분리의 반응을 조절하지 못하거나 취급이 어려워지는 등의 문제가 야기될 수 있다.
또한, 상기 고온고속 교반 조건을 벗어나면 균일하게 층분리가 일어나지 않거나, 층분리의 반응을 조절하지 못하는 등의 문제가 야기될 수 있다.
상기 교반한 반응물을 -80℃에서 24시간 내지 (48)시간 동안 동결건조시켜 스폰지를 얻고, 상기 스폰지를 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 EDC(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) 중에서 선택된 가교제에 담구어 가교시킨다. 이때, 가교제는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 EDC(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide)와 같은 가교제를 0.1 내지 1 중량%로 함유한 수용액을 사용하며, 3시간 내지 24시간 동안 가교시킨다. 만약, 가교제 함량이 상기 범위를 벗어나면 가교반응이 일어나지 않아 용액상에서 분해가 되거나, 또는 반응이 일어나지 않은 가교제의 잔기로 인해 세포배양 하는 데에 문제가 야기될 수 있다.
상기 가교된 반응물을 -80℃에서 재차 동결건조시켜 이중층 스캐폴드를 제조한다.
상기 일실시예에 따르면, 고분자 스캐폴드를 각각 제조하여 부착하는 공정을 거쳐 제조된 종래 이중층 스캐폴드 제조방법과 달리 부착공정 없이 단일공정을 통해 층분리 가능성이 없는 도 2 및 도 3과 같은 이중층 스캐폴드를 간단히 제조할 수 있다.
또한, 상기 이중층 스캐폴드를 이용하여 세포를 배양한 결과, 도 4와 같이 세포 분주 1일 후에는 세포들이 스캐폴드에 부착되고 증식되기 시작하였으며, 도 5와 같이 세포 분주 5일 후에는 세포들이 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 분비하여 스캐폴드 내에 ECM이 증착되어 있음을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드는 조직공학, 의학, 약학 및 재료과학 분야에서 약물, 세포, 단백질 및 성장인자 전달용 재료 또는 인공피부 등으로 폭넓게 사용할 수 있다.
즉, 상기 제조방법에 따른 이중층 스캐폴드에 세포를 배양하여 조직 재생에 이용할 수 있다. 상기 세포로는 연골세포, 뼈세포 및 피부세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 상기 세포는 이중층 스캐폴드의 상층과 하층에 각각 다른 세포를 배양하여 공배양(co-culture)할 수도 있다.
특히, 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드는 피부결손부위에 적용할 수 있다. 즉, 천연 고분자로 이루어진 하층(bottom layer) 스캐폴드에 세포를 배양하여 조직재생층으로 사용하며, 합성 고분자로 이루어진 상층(top layer) 스캐폴드에 약물을 로딩하여 조직이 재생되는 동안 외부로부터의 세균 감염을 차단할 수 있다. 상기 천연 고분자 스캐폴드는 조직재생이 진행되면서 생분해되어 제거되며, 상기 합성 고분자 스캐폴드는 조직재생이 완료되면 제거한다.
또한, 본 발명에 따른 이중층 스캐폴드는 2종류의 세포를 공배양하여 뼈와 연골같이 조직이 맞닿아 있는 부분에 적용하여 동시에 재생을 도울 수 있다. 즉, 천연 고분자로 이루어진 하층(bottom layer) 스캐폴드에 연골세포를 배양하고, 합성 고분자로 이루어진 상층(top layer) 스캐폴드에 뼈세포를 배양한 후, 조직이 맞닿아있는 부분에 상기 이중층 스캐폴드를 적용하여 조직 재생에 도움을 줄 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 이중층 스캐폴드의 제조
젤라틴 수용액을 2.5 중량%로 제조하여 80℃에서 300 rpm으로 교반하였다. 젤라틴이 완전히 용해된 후, 폴리비닐알콜(PVA)이 10 중량%가 되도록 첨가하여 교반하였다. 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate)를 0.2 중량%가 되도록 첨가하여 95℃에서 900 rpm으로 하여 고온고속 교반하였다. 상기 교반한 용액을 페트리디쉬(petri dish)에 부어 -80℃에서 24시간 이상 동결건조시켜 스폰지를 얻었다. 상기 스폰지를 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)가 0.5 중량%로 함유된 수용액에 12시간 이상 담구어 가교시켰다. 다시, -80℃에서 동결건조시켜 이중층의 스캐폴드를 제조하였다.
이렇게 제조된 이중층 스캐폴드를 전계방사형 주사전자현미경 (FE-SEM), S-4100, HITACHI, LTD로 촬영한 디지털 이미지는 도 2와 같으며, 전계방사형 주사전자현미경 (FE-SEM), S-4100, HITACHI, LTD으로 관찰한 SEM 이미지는 도 3과 같다. 즉, 상기 이중층 스캐폴드는 완벽하게 일체형으로 부착되어 있어 분리 가능성이 없는 안전한 이중층 구조의 스캐폴드임을 확인할 수 있었다.
<실험예 1> 이중층 스캐폴드의 성능 평가
실시예에서 제조한 이중층 스캐폴드를 직경 1cm로 준비한 후, 상기 이중층 스캐폴드에 2X104 개 CRL-2310(ATCC Number), keratinocyte, human papillomavirus 16(HPV-16) E6/E7 transformed 를 분주하였다. 세포 분주 후 SEM 관찰한 결과, 도 4와 같이 세포 분주 1일 후에는 세포들이 스캐폴드에 부착되고 증식되기 시작하였으며, 도 5와 같이 세포 분주 5일 후에는 세포들이 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 분비하여 스캐폴드 내에 ECM이 증착되어 있음을 확인할 수 있다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (10)

  1. 제1 고분자 수용액을 준비하는 단계;
    상기 제1 고분자 수용액에 제2 고분자를 첨가하여 교반하는 단계;
    상기 교반한 반응물에 계면활성제를 첨가하여 고온고속 교반하는 단계;
    상기 교반한 반응물을 동결건조시켜 스폰지를 얻는 단계;
    상기 스폰지를 가교제에 담구어 가교시키는 단계; 및
    상기 가교된 반응물을 재차 동결건조시키는 단계
    를 포함하는 단일공정에 의한 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 고분자 및 제2 고분자는 서로 다른 고분자로서, 젤라틴, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 하이드록시아파타이트, 알지네이트, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 고분자는 젤라틴이고, 제2 고분자는 폴리비닐알코올(PVA)인 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate; SDS), 암모늄 라우릴 설페이트(Ammonium Lauryl Sulfate; ALS), 소듐 라우릴 에틸렌 설페이트(Sodium Lauryl Ethylene Sulfate; SLES), 선형 알킬벤젠 설포네이트(Linear Alkylbenzene Sulfonate; LAS), 알파-올레핀 설포네이트(α-Olefin Sulfonate; AOS), 알킬 설페이트(Alkyl Sulfate; AS), 알킬 에테르 설페이트(Alkyl Ether Sulfate; AES) 및 소듐 알칸 설포네이트(Sodium Alkane Sulfonate; SAS)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 고온고속 교반은 80 내지 120℃의 온도에서 800 내지 2000 rpm으로 교반하는 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 가교제는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde), 에틸디에틸아미노프로필카보디이미드(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide; EDC), 제니핀(genepin), 및 트랜스글루타미나제(transglutaminase; TG)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 젤라틴이 물에 완전히 용해되도록 60 내지 70℃에서 100 내지 300 rpm으로 교반하여 젤라틴 수용액을 준비하는 단계; 상기 젤라틴 수용액에 폴리비닐알콜(PVA)을 첨가하여 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물에 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate)를 첨가하여 80 내지 120℃에서 800 내지 2000 rpm으로 하여 고온고속 교반하는 단계; 상기 교반한 반응물을 동결건조시켜 스폰지를 얻는 단계; 상기 스폰지를 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 EDC(Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide) 중에서 선택된 가교제에 담구어 가교시키는 단계; 및 상기 가교된 반응물을 재차 동결건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중층 스캐폴드의 제조방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 제조방법에 따른 이중층 스캐폴드에 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조직 재생방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 세포는 연골세포, 뼈세포 및 피부세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 조직 재생방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 세포는 이중층 스캐폴드의 상층과 하층에 각각 다른 세포를 배양하여 공배양하는 것을 특징으로 하는 조직 재생방법.
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