CN105920680B - 一种软组织工程多孔支架及其制备方法 - Google Patents

一种软组织工程多孔支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种软组织工程多孔支架及其制备方法，由羧甲基纤维素钠、壳聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮复合制得，其中羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1:50～1:0.1，羧甲基纤维素钠与壳聚糖的质量比为1:50～1:0.1，多孔支架厚度为0.8～2.6mm，孔隙率为35.0%～87.0%，拉伸强度为1.4MPa～68.98MPa；该支架的制备方法环保无毒、制备工艺过程简单、成本低廉，制备得到的支架生物相容性好，能替代人工皮肤，用作皮肤敷料和皮肤组织工程材料，帮助皮肤大面积和深度烧伤的患者，在自体皮不够的情况下恢复因皮肤创伤丧失的生理功能。

Description

一种软组织工程多孔支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种软组织工程多孔支架及其制备方法，该多孔的软组织工程支架可被应用于皮肤组织工程，属于生物医学材料领域。
背景技术
组织工程化皮肤是指由细胞或细胞外基质或由两者共同结合组成的皮肤产品，是应用生命科学和工程学的原理与技术将种子细胞与适当的支架材料相结合构建出的用于修复、维护和改善损伤皮肤组织功能和形态的生物替代物。近年来，伴随细胞生物学、分子生物学及生物材料学的迅速发展，组织工程学也取得了巨大的进展，其中皮肤组织工程学的发展尤为引人注目。部分组织工程化皮肤产品甚至取得美国食品与药品管理局(FDA)的许可而应用于临床，在外构建组织工程化皮肤的过程中，种子细胞所赖以存在的支架材料一直是研究的热点之一。传统的支架制造方法包括相分离法、致孔剂析孔法和发泡法等。但这些工艺可控性差，难以构建结构复杂、供多细胞生长的支架微观结构。
壳聚糖（CS）是一种天然高分子聚合物，化学性质稳定，易成膜，有良好的生物相容性，无毒，具有抗凝血等多种生物活性和优良的抗菌性，同时还具有防止伤口感染，促进肉芽生长和皮肤再生，但是纯的壳聚糖膜降解性差、在实际应用中存在着力学性能差、脆性大以及不适用于酸性环境等问题。
羧甲基纤维素钠（CMC）作为含有多羟基及羧基的高分子多糖，对皮肤及粘膜无刺激性，在体内不会产生免疫抗原反应及热源反应，无致突变性，可降解，是一种组织相容性良好的体内植入生物材料，其本身就具有一定的吸水吸湿能力。
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）是由聚合度可变化的线型NVP基团组成的聚合物，是 N-烯烃聚合体中性质最好和使用最广泛的聚合物 ,它具有生物适配性、低毒 、易成膜及可粘性等特点，又具有很好的复配能力，对盐、酸和热溶液保持一定的惰性。
发明内容
本发明提供一种软组织工程多孔支架，由羧甲基纤维素钠、壳聚糖、聚乙烯基吡咯烷酮复合制得，羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1:50～1:0.1，羧甲基纤维素钠与壳聚糖的质量比为1:50～1:0.1，多孔支架的厚度为0.8～2.6mm，孔隙率为35.0%～87.0%，拉伸强度为1.4MPa～68.98MPa。
本发明的另一目的在于提供所述软组织工程多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将羧甲基纤维素钠和聚乙烯基吡咯烷酮按照质量比为1:50～1:0.1的比例混匀后，加水,充分搅拌，得溶液A，其中水的加入量与羧甲基纤维素钠粉体和聚乙烯基吡咯烷酮粉体的总质量的比例为5～30mL/g；
（2）按照羧甲基纤维素钠与壳聚糖的质量比为1:50～1:0.1的比例，将壳聚糖加入到10～30mL浓度为0.5～5mol/L酸溶液中，搅拌均匀，得到溶液B；
（3）将溶液A缓慢加入到溶液B中，并不断搅拌，待出现白色片状时，加入1～2mL浓度为1～6mol/L的盐酸溶液，充分搅拌，至白色片状消失之后，加入1～10mL甘油溶液，继续搅拌至液体均匀稳定；
（4）将步骤（3）得到的溶液进行过滤，滤饼脱泡、流延成膜；
（5）将步骤（4）得到的产物在-30～-50℃的条件下冷冻15～25小时，再在-10～-50℃干燥10～20小时；
（6）将步骤（5）得到的产物进行交联；
（7）将步骤（6）得到的交联产物进行清洗、冷冻干燥，即得到多孔软组织工程支架。
优选的，步骤（2）中所述酸溶液为乙酸溶液、乳酸溶液、苹果酸溶液、柠檬酸溶液中的一种或任意比例的几种混合。
优选的，步骤（3）所述甘油溶液为甘油与水按照体积比为1:100～1:10混合，搅拌均匀得到。
优选的，步骤（4）所述脱泡在400～500毫米汞柱的负压下进行。
优选的，步骤（6）所述交联剂为质量分数1%～15%的磷酸三苯酯或质量分数1%～15%的氢氧化钠，交联时间为2～20小时。
优选的，步骤（7）所述冷冻干燥温度为-40～-10℃，冷冻干燥时间为10～20小时。
本发明支架生物相容性好，能替代人工皮肤，用作皮肤敷料和皮肤组织工程支架材料，帮助皮肤大面积和深度烧伤的患者，在自体皮不够的情况下恢复因皮肤创伤丧失的生理功能；本发明所述支架的制备方法环保无毒、制备工艺过程简单、成本低廉。
附图说明
图1为本发明实施例1得到的多孔支架的扫描电镜图；
图2为本发明实施例6得到的多孔支架的扫描电镜图。
具体的实施方式
以下是结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例所述软组织工程多孔支架，由羧甲基纤维素钠、壳聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮复合制得，羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1:3，羧甲基纤维素钠与壳聚糖的质量比为1:1。
本实施例所述软组织工程多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）按照羧甲基纤维素钠和聚乙烯基吡咯烷酮按照1:3的质量比例，称取1g羧甲基纤维素钠粉体和3g聚乙烯基吡咯烷酮粉体混匀后，加入20mL水搅拌20分钟混合均匀，得到溶液A；
（2）按照羧甲基纤维素钠和壳聚糖1:1的质量比例，称取1g壳聚糖粉体加入到10mL浓度为0.5mol/L的乙酸溶液中，在常温下搅拌10分钟，得到溶液B；
（3）将溶液A缓慢加入到溶液B中，并不断搅拌，待液体中出现白色片状时，加入1mL浓度为1mol/L盐酸，充分搅拌，至白色片状消失之后，加入1mL甘油溶液，继续搅拌至液体均匀稳定,得到溶胶溶液，其中甘油溶液为甘油与水按照体积比例为1:80混合；
（4）将步骤（3）得到的产物200目过滤，置于400毫米汞柱的负压下脱泡，流延成膜；
（5）将步骤（4）得到的产物在-40℃下冷冻25h后，在-10℃冷冻干燥15小时；
（6）将步骤（5）得到的产物使用4%的NaOH 溶液进行交联，交联10小时；
（7）将步骤（6）得到的交联产物放入水浴锅中，温度为55℃，每1.5小时进行一次换水处理，重复3次，取出后用去离子水清洗，再进行-10℃冷冻干燥20小时，即得软组织工程多孔支架。
本实施例所制备的多孔支架的厚度分布在0.9mm～2.3mm之间，符合皮肤膜的基本特性；通过拉伸实验测的多孔支架的拉伸强度为1.4MPa，力学性能良好；如图1所示为本实施例所制备的多孔支架的扫描电镜图片，从图中可知支架表面有孔；通过BET测得孔隙率为35.0%，吸水率为224.78%。
本实施例所制备的多孔支架进行细胞毒性实验，结果如下表1所示，结合国家标准GB/T14233.3-2005相关规定：（1）浓度在0.05-0.3g/mL时，细胞增殖度（RGR）均在90-110之间，细胞毒性为0或1级；（2）浓度在0.05-0.2g/mL时，细胞增殖度（RGR）均在100-112之间，细胞毒性为0级；浓度在0.2-0.4g/mL时，细胞增殖度均在75-100之间，细胞毒性为1级；（3）支架浓度在0.05-0.2g/mL时，细胞增殖度（RGR）均在75-95之间，细胞毒性为1级；浓度在0.2～0.4g/mL时，细胞增殖度（RGR）均在95-120之间，细胞毒性为0级或1级。结合上表1可以得出实施例1所得的多孔支架无细胞毒性。
表1 多孔软组织工程支架材料的细胞实验
。
实施例2
本实施例所述软组织工程多孔支架，由羧甲基纤维素钠、壳聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮复合制得，羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1:0.1，羧甲基纤维素钠与壳聚糖的质量比为1:1.25。
本实施例所述软组织工程多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将羧甲基纤维素钠和聚乙烯基吡咯烷酮按照1:0.1的质量比例，称取1g羧甲基纤维素钠粉体和0.1g聚乙烯基吡咯烷酮粉体混匀后，加入33mL水搅拌25分钟混合均匀，得到溶液A；
（2）按照羧甲基纤维素钠与壳聚糖的质量比为1:1.25，称取1.25g壳聚糖粉体加入到20mL浓度为3mol/L的乳酸溶液中，在常温下搅拌30分钟，得到溶液B；
（3）将溶液A缓慢加入到溶液B中，并不断搅拌，待液体中出现白色片状时，加入2mL浓度为4mol/L的盐酸，充分搅拌，至白色片状消失之后，加入5mL甘油溶液，继续搅拌至液体均匀稳定,甘油溶液为甘油与水按照体积比例为1:10混合；
（4）将步骤（3）得到的产物200目过滤，置于450毫米汞柱的负压下脱泡，流延成膜；
（5）将步骤（4）得到的产物在-30℃下冷冻20h后，在-20℃冷冻干燥10小时；
（6）将步骤（5）得到的产物使用1%的NaOH溶液进行交联，交联2小时；
（7）将步骤（6）得到的交联产物放入水浴锅中，温度为55℃，每1.5小时进行一次换水处理，重复6次，取出后用去离子水清洗，再进行-30℃冷冻干燥15小时，即得软组织工程多孔支架。
本实施例所制备的多孔支架的厚度分布在0.8mm～1.6mm之间，符合皮肤膜的一个基本特性；通过拉伸实验测的多孔支架的拉伸强度为15MPa，力学性能良好；通过BET检测测得孔隙率为50%，吸水率为394.29%。
实施例3
本实施例所述软组织工程多孔支架，由羧甲基纤维素钠、壳聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮复合制得，羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1:50，羧甲基纤维素钠与壳聚糖质量比为1:0.1。
本实施例所述软组织工程多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮按照1:50的质量比例，称取1g羧甲基纤维素钠粉体和50g聚乙烯基吡咯烷酮粉体混匀后，加入255mL水搅拌30分钟混合均匀，得到溶液A；
（2）按照羧甲基纤维素钠和壳聚糖1:0.1的质量比例，称取0.1g壳聚糖粉体加入到15mL浓度为2mol/L的柠檬酸溶液中，在常温下搅拌30分钟，得到溶液B；
（3）将溶液A缓慢加入到溶液B中，并不断搅拌，待液体中出现白色片状时，加入1.5mL浓度为6mol/L的盐酸，充分搅拌，至白色片状消失之后，加入10mL甘油溶液，继续搅拌至液体均匀稳定,得到溶胶溶液，其中甘油溶液为甘油与水按照体积比例为1:50混合；
（4）将步骤（3）得到的产物200目过滤，置于420毫米汞柱的负压下脱泡，流延成膜；
（5）将步骤（4）得到的产物在-50℃下冷冻15h后，在-40℃冷冻干燥20小时；
（6）将步骤（5）得到的产物使用15%的NaOH 溶液进行交联，交联20小时；
（7）将步骤（6）得到的交联产物放入水浴锅中，温度为55℃，每1.5小时进行一次换水处理，重复6次，取出后用去离子水清洗，再进行-20℃冷冻干燥10小时，即得软组织工程多孔支架。
本实施例所制备的多孔支架的厚度主要分布在0.8mm～2.4mm之间，符合皮肤膜的一个基本特性；通过拉伸实验测的多孔支架的拉伸强度为28MPa，力学性能良好；通过多孔支架的扫描电镜图片可知支架表面有孔；通过BET检测测得孔隙率为65%，吸水率为吸水率为358.92%。
实施例4
本实施例所述软组织工程多孔支架，由羧甲基纤维素钠、壳聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮复合制得，羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1:0.5，羧甲基纤维素钠与壳聚糖质量比为1:50。
本实施例所述软组织工程多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮按照1:0.5的质量比例，称取1g羧甲基纤维素钠粉体和0.5g聚乙烯基吡咯烷酮粉体混匀后，加入30mL水搅拌20分钟混合均匀，得到溶液A；
（2）按照羧甲基纤维素钠和壳聚糖1:50的质量比例，称取50g壳聚糖粉体加入到30mL浓度为5mol/L的苹果酸溶液中，在常温下搅拌30分钟，得到溶液B；
（3）将溶液A缓慢加入到溶液B中，并不断搅拌，待液体中出现白色片状时，加入1.8mL浓度为5mol/L的盐酸，充分搅拌，至白色片状消失之后，加入6mL甘油溶液，继续搅拌至液体均匀稳定,得到溶胶溶液，其中甘油溶液为甘油与水按照体积比例为1:100混合；
（4）将步骤（3）得到的产物200目过滤，置于500毫米汞柱的负压下脱泡，流延成膜；
（5）将步骤（4）得到的产物在-45℃下冷冻16h后，在-30℃冷冻干燥18小时；
（6）将步骤（5）得到的产物使用15%的磷酸三苯酯溶液进行交联，交联10小时；
（7）将步骤（6）得到的交联产物放入水浴锅中，温度为55℃，每1.5小时进行一次换水处理，重复4次，取出后用去离子水清洗，再进行-40℃冷冻干燥12小时，即得软组织工程多孔支架。
本实施例所制备的多孔支架的厚度主要分布在1.0mm～2.6mm之间，符合皮肤膜的一个基本特性；通过拉伸实验测的多孔支架的拉伸强度为68.9MPa，力学性能良好；通过多孔支架的扫描电镜图片可知支架表面有孔；通过实验测得孔隙率为87%，吸水率为657.34%。
实施例5
本实施例所述软组织工程多孔支架，由羧甲基纤维素钠、壳聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮复合制得，羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1:20，羧甲基纤维素钠与壳聚糖质量比为1:10。
本实施例所述软组织工程多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮按照1:20的质量比例，称取1g羧甲基纤维素钠粉体和20g聚乙烯基吡咯烷酮粉体混匀后，加入210mL水搅拌20分钟混合均匀，得到溶液A；
（2）按照羧甲基纤维素钠和壳聚糖1:10的质量比例，称取10g壳聚糖粉体加入到20mL浓度为1mol/L的苹果酸和1mol/L的柠檬酸以质量比1:1混合的混合溶液中，在常温下搅拌30分钟，得到溶液B；
（3）将溶液A缓慢加入到溶液B中，并不断搅拌，待液体中出现白色片状时，加入1.5mL浓度为2mol/L的盐酸，充分搅拌，至白色片状消失之后，加入3mL甘油溶液，继续搅拌至液体均匀稳定,得到溶胶溶液，其中甘油溶液为甘油与水按照体积比例为1:20混合；
（4）将步骤（3）得到的产物200目过滤，置于480毫米汞柱的负压下脱泡，流延成膜；
（5）将步骤（4）得到的产物在-35℃下冷冻18h后，在-50℃冷冻干燥12小时；
（6）将步骤（5）得到的产物使用10%的磷酸三苯酯溶液进行交联，交联2小时；
（7）将步骤（6）得到的交联产物放入水浴锅中，温度为55℃，每1.5小时进行一次换水处理，重复4次，取出后用去离子水清洗，再进行-35℃冷冻干燥14小时，即得软组织工程多孔支架。
本实施例所制备的多孔支架的厚度分布在0.8mm～1.6mm之间，符合皮肤膜的一个基本特性；通过拉伸实验测的多孔支架的拉伸强度为49MPa，力学性能良好；通过多孔支架的扫描电镜图片可知支架表面有孔；通过BET实验测得孔隙率为70%，吸水率为650.70%。
实施例6
本实施例所述软组织工程多孔支架，由羧甲基纤维素钠、壳聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮复合制得，羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮的质量比为1:10，羧甲基纤维素钠与壳聚糖质量比为1:30。
本实施例所述软组织工程多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮按照1:10的质量比例，称取1g羧甲基纤维素钠粉体和10g聚乙烯基吡咯烷酮粉体混匀后，加入220mL水搅拌20-30分钟混合均匀，得到溶液A；
（2）按照羧甲基纤维素钠和壳聚糖1:30的质量比例，称取30g壳聚糖粉体加入到25mL浓度为4mol/L的乙酸和4mol/L的乳酸以质量比1:2混合后的混合溶液中，在常温下搅拌5-30分钟，得到溶液B；
（3）将溶液A缓慢加入到溶液B中，并不断搅拌，待液体中出现白色片状时，加入1.2mL浓度为3mol/L的盐酸，充分搅拌，至白色片状消失之后，加入7mL甘油溶液，继续搅拌至液体均匀稳定,得到溶胶溶液，其中甘油溶液为甘油与水按照体积比例为1:40混合；
（4）将步骤（3）得到的产物200目过滤，置于430毫米汞柱的负压下脱泡，流延成膜；
（5）将步骤（4）得到的产物在-35℃下冷冻22h后，在-35℃冷冻干燥16小时；
（6）将步骤（5）得到的产物使用1%的磷酸三苯酯溶液进行交联，交联18小时；
（7）将步骤（6）得到的交联产物放入水浴锅中，温度为55℃，每1.5小时进行一次换水处理，重复5次，取出后用去离子水清洗，再进行-15℃冷冻干燥18小时，即得软组织工程多孔支架。
本实施例所制备的多孔支架的厚度分布在0.9mm～1.8mm之间，符合皮肤膜的一个基本特性；通过拉伸实验测的多孔支架的拉伸强度为37MPa，力学性能良好；如图2所示为本实施例制备的多孔支架的扫描电镜图片，由图中可知支架表面有孔；通过BET实验测得孔隙率为58%，吸水率为394.29%。
以上所述仅为本发明的实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种软组织工程多孔支架的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）将羧甲基纤维素钠与聚乙烯基吡咯烷酮按照质量比为1:50～1:0.1的比例混匀后，加水，充分搅拌，得溶液A，其中水的加入量与羧甲基纤维素钠和聚乙烯基吡咯烷酮的总质量的比例为5～30mL/g；
（2）按照羧甲基纤维素钠与壳聚糖的质量比为1:50～1:0.1的比例，将壳聚糖加入到10～30mL浓度为0.5～5mol/L酸溶液中，搅拌均匀，得到溶液B；
（3）将溶液A缓慢加入到溶液B中，并不断搅拌，待出现白色片状时，加入1～2mL浓度为1～6mol/L的盐酸溶液，充分搅拌，至白色片状消失之后，加入1～10mL甘油溶液，继续搅拌至液体均匀稳定；
（4）将步骤（3）得到的溶液进行过滤，滤饼脱泡、流延成膜；
（5）将步骤（4）得到的产物在-30～-50℃的条件下冷冻15～25小时，再在-10～-50℃干燥10～20小时；
（6）将步骤（5）得到的产物进行交联；
（7）将步骤（6）得到的交联产物进行清洗、冷冻干燥，即得到软组织工程多孔支架。
2.根据权利要求1所述软组织工程多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤（2）中的酸溶液为乙酸溶液、乳酸溶液、苹果酸溶液、柠檬酸溶液中的一种或任意比例的几种混合。
3.根据权利要求1所述软组织工程多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤（3）甘油溶液为甘油与水按照体积比1:100～1:10混合。
4.根据权利要求1所述软组织工程多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤（4）脱泡在400～500毫米汞柱的负压下进行。
5.根据权利要求1所述软组织工程多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤（6）的交联剂为质量分数为1%～15%的磷酸三苯酯溶液或质量分数为1%～15%的氢氧化钠溶液，交联时间为2～20小时。
6.根据权利要求1所述软组织工程多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤（7）冷冻干燥温度为-40～-10℃，时间为10～20小时。
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