KR101724150B1 - 전단 가역적 세포-마이크로스피어 집합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 생체적합성 복수의 마이크로스피어(a plurality of microspheres)(상기 마이크로스피어는 세포 표면에 존재하는 수용체 단백질에 대하여 결합능을 갖는 리간드가 그의 표면에 부착되어 있다); 및 (b) 상기 리간드에 대하여 결합능을 갖는 수용체 단백질이 표면에 존재하는 복수의 세포(a plurality of cells)를 포함하고, 상기 세포 및 마이크로스피어는 상기 수용체 단백질과 리간드의 상호 작용에 의해 전단 가역적으로 결합되어 있는 세포-마이크로스피어 집합체(aggregate)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 사용함으로써 최소 침습적인 방법으로 대상에 세포를 전달할 수 있다.

Description

전단 가역적 세포-마이크로스피어 집합체 및 이의 제조방법{Shear Reversible Cell-microsphere Aggregates and Methods for Manufacturing the Same}

본 발명은 전단 가역적인 결합을 형성하는 세포와 마이크로스피어의 집합체에 관한 것이다.

상처 또는 노화에 의한 조직 및 기관의 상실 또는 장애는 인간의 건강 관리에서의 가장 흔한 이슈 중 하나이다. 환자들은 전형적으로, 외과적인 복원을 통한 장기 이식 또는 기계적 장치를 사용하는 것에 의해 치료받을 수 있다. 그러나 이식은 기증자 부족으로 극도로 제한적이며, 외과적 복원은 장기적인 문제가 될 수 있다[1]. 미국 내에서 대략 100,000명의 환자들이 장기 이식을 기다리고 있다[2]. 또한 기계적 장치는 단일 장기기관의 모든 기능을 수행할 수 없다[3, 4]. 특히, 연골재생은, 천연 연골에 대한 치료적 기회가 제한적임에 따라, 부상을 입었거나, 노화된 연골에 의해 고통받는 환자들에게 필수적이다[5]. 자가 세포 이식이 현재 환자들에게 치료 방법으로 받아들여지고 있다. 그러나, 이 방법은 여전히 제한된 수의 세포분리, 분리 부위의 병적상태, 분리 세포의 제한된 증식, 및 이식절차 동안의 세포의 돌연변이를 포함하는 제한이 따른다[6].

최근에는 조직 공학 접근이, 폴리머 스캐폴드를 사용한 연골-형성 세포의 전달에 의한 연골 재생에서 훌륭한 잠재력을 보여왔다[7]. 조직 공학은 세포와 폴리머 스캐폴드의 조합을 이용한 인공 조직 및 기관을 제공한다. 이러한 접근에서, 폴리머 스캐폴드는 조직-특이적 세포를 원하는 부위로 전달하는 것을 돕고, 새로운 조직 형성 동안 공간을 제공한다[8-10]. 조직 재생을 위한 세포 전달의 흥미로운 접근은 주입가능한 스캐폴드의 사용이다. 주입가능한 전달 시스템은 임상의들(clinicians)이 최소 침습의 방법으로 세포/폴리머 구조를 이식할 수 있게 한다[8]. 특히, 주입 동안 액체처럼 흐를 수 있으나, 체내에서 자리잡은 후에는 고체 구조를 형성하는 시스템은, 조직 공학에서의 세포의 주입가능한 전달에 대하여 이상적일 수 있다[10].

자연적으로 유도된 물질들은 그들의 타고난 생적합성 및 낮은 독성으로 인하여 많은 의료 응용을 위한 주입 가능 의약으로서 많은 주목을 받아왔다[11, 12].

알긴산은 전형적으로 갈조류에서 추출되는 천연에 존재하는 다당류이고, 그들의 생적합성, 낮은 독성, 비교적 낮은 가격, 및 2가 양이온(예를 들어, 칼슘 이온)에 의한 온화한 겔화 등의 이유로, 많은 조직 공학 응용에서 널리 사용되어 왔다[12]. 알긴산은 G 및 M이 교차된 블록(MG) 뿐만아니고, β-D-만뉴론산(M) 및 α-L-글루론산(G) 잔기의 단독폴리머 블록들을 포함하는 선형 구조를 갖는다[13]. M 및 G 블록의 비율은 알긴산의 기원에 의해 정해지고, 알긴산의 겔화 거동에 큰 영향을 준다[14]. 알긴산 마이크로스피어는 제조가 간편해지고, 2가 양이온의 존재하에 폴리머의 겔화 성질이 급속해짐에 따라[20, 21], 세포[15, 17] 또는 단백질 수송[18, 19]을 위해 널리 사용되어왔다.

스캐폴드 구축이 기질(matrix)-연관된 세포 이식에 있어서의 세포의 분배 및 거동에 중요한 영향을 준다는 것이 알려져 있다. 연골세포를 작은 직경의 섬유(fiber) 상에서 배양하는 경우, 상기 섬유가 제한된 공간만을 상기 세포에 제공함에 따라, 연골세포는 성장하지 않는다. 스캐폴드 구축의 중요한 사이즈는 연골세포의 직경보다 작은 범위이다[22]. 최근의 연구들 또한 폴리머 마이크로파티클을 사용한 세포 집합체의 형성이 줄기 세포 분화에 유용하다는 것을 주장한다[23, 30].

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 체내에 최소 침습적인 방법으로 세포를 전달할 수 있는 세포 전달용 고분자 지지체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 세포에 대한 결합능을 갖는 세포부착 펩타이드를 도입하고, 세포와 유사한 직경을 갖는 마이크로스피어를 세포와 혼합하는 경우 전단 가역적인 세포-마이크로스피어 집합체가 형성됨을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포와 마이크로스피어가 전단 가역적으로 결합되어 있는 세포-마이크로스피어 집합체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 전단 가역적 세포 이식(cell transplantation)용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 연골재생용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 연골-손상 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 생체적합성 복수의 마이크로스피어(a plurality of microspheres)(상기 마이크로스피어는 세포 표면에 존재하는 수용체 단백질에 대하여 결합능을 갖는 리간드가 그의 표면에 부착되어 있다); 및 (b) 상기 리간드에 대하여 결합능을 갖는 수용체 단백질이 표면에 존재하는 복수의 세포(a plurality of cells)를 포함하고, 상기 세포 및 마이크로스피어는 상기 수용체 단백질과 리간드의 상호 작용에 의해 전단 가역적으로 결합되어 있는 세포-마이크로스피어 집합체(aggregate)을 제공한다.

본 발명자들은 체내에 최소 침습적인 방법으로 세포를 전달할 수 있는 세포 전달용 고분자 지지체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 세포에 대한 결합능을 갖는 세포부착 펩타이드를 도입하고, 세포와 유사한 직경을 갖는 마이크로스피어를 세포와 혼합하는 경우 전단 가역적인 세포-마이크로스피어 집합체가 형성됨을 규명하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "생체적합성(biocompatibility)"이란, 생체 조직이나 체액 등과 접촉하였을 때 거부반응을 나타내지 않는 특성을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "마이크로스피어"란, 지름이 약 수백 마이크로미터 이하인 구상의 미립자를 의미한다. 본 발명의 세포-마이크로스피어 집합체는 "전단 가역적"인 특성을 갖는데, 이는 집합체에 전단력(shear force)이 인가(apply)되는 경우에는 세포와 마이크로스피어 간의 결합이 깨지고, 인가되었던 전단력이 제거되면 다시 세포와 마이크로스피어 간의 결합이 형성되어 집합체를 형성하게 되는 특성을 의미한다. 예를 들어 세포-마이크로스피어 집합체의 체내 주입 시 주사기에 가해지는 압력에 의한 전단력에 의해 집합체의 세포와 마이크로스피어 간의 결합은 깨지게 되고 최소 침습적인 체내 주입이 가능해지게 되는데, 체내 주입 후에는 가역적으로 다시 세포와 마이크로스피어 간의 결합을 형성하여 집합체 구조를 형성할 수 있도록 한다(참조: 도 4). 따라서, 본 발명의 세포-마이크로스피어 집합체는 최소 침습적인 세포 전달에 대하여 이상적일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로스피어는 집합체 내에 함께 포함되는 세포와 전단 가역적-가교 형성이 가능한 직경을 갖는다. 본 발명자들은 세포의 사이즈와 유사한 알긴산 마이크로스피어가 세포와 함께 전단 가역적인 집합 구조를 형성하는데 효과적일 수 있다고 판단하였다(참조: 도 1). 상기 전단 가역적-가교 형성이 가능한 마이크로스피어의 직경은 함께 집합체를 형성하는 세포의 직경에 따라 변화하며, 세포와 유사한 직경을 갖도록 준비하는 것이 바람직하다(참조: 도 2). 상기 세포의 크기에 비하여 상기 마이크로스피어의 크기가 너무 작은 경우에는 엔도시토시스에 의하여 마이크로스피어가 세포 내로 유입될 수 있고, 반면에 마이크로스피어의 크기가 너무 큰 경우에는 복수의 세포와 복수의 마이크로스피어가 함께 집합체를 형성하지 못하고, 단독의 마이크로스피어에 복수의 세포가 결합하는 양상을 보일 수 있으며, 구체적인 예로 대상(subject)에 주입 시 마이크로스피어를 포함하는 집합체가 주사기 바늘을 통과하지 못하는 문제도 발생할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 마이크로스피어가 세포와 전단 가역적-가교를 형성하는 것이 가능한 직경은 대략 1-500 μm 이고, 더 구체적으로 1-300 μm, 보다 구체적으로 1-100 μm, 보다 더 구체적으로 3-50 μm, 보다 더 구체적으로 5-30 μm 이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로스피어는 알긴산 중합체, 폴리에틸렌글라이콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록 공중합체, 알킬셀룰로오스, 하이드록시알킬셀룰로오스, 헤파린, 하이알루론산, 키토산 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중합체이다. 중합체의 형성은 당업계에 공지된 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 마이크로스피어는 알긴산 중합체이다. 알긴산에 대한 가교 화합물로서 2가 양이온염을 사용할 수 있다. 알긴산 마이크로스피어는 균일한 크기 분포를 갖는 구형 형상을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 리간드는 RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val),EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val) 및 LDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 리간드는 RGD이다. 알긴산은 세포와 최소의 상호작용을 갖지만, RGD(arginine-glycin-aspartic acid) 서열을 갖는 펩타이드는 세포와 강한 상호작용을 하는 모티프로 알려져 있다[31]. RGD 리간드가 부착된 마이크로스피어는 RGD의 세포부착 특성으로 인하여 세포와 강한 상호작용으로 전단 가역적인 결합을 형성하는 것이 가능해진다. RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어 및 세포는 변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어와 비교하여 집합체 내에서 균일하게 분산되었다(참조: 도 5).

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 집합체에 포함되는 세포는 연골세포(chondrocytes), 근아세포(myoblasts), 간세포(hepatocytes), 골아세포(osteoblasts), 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 성체줄기세포(adult stem cells), 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 혈관내피줄기세포, 조혈모세포, 간줄기세포, 심장줄기세포, 췌장줄기세포, 내피전구세포(endothelial progenitors), 성장내피세포(outgrowth endothelial cells), 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells), 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells), 인간신경줄기세포(neural stem cells), 위성세포(satellite cells), 장 상피세포, 평활근세포 및 섬유아세포로 구성된 군으로부터 선택된 세포이다. 상기 세포들은 마이크로스피어와의 상호작용에 의하여 전단 가역적인 세포-마이크로스피어 집합체를 형성한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 복수의 세포와 복수의 마이크로스피어는 함량비가 세포 및 마이크로스피어 입자 수를 기준으로 0.1:1 내지 1:0.1, 더 구체적으로 0.5:1 내지 2:1, 더욱 더 구체적으로 0.8:1 내지 1.2:1이 되도록 복수의 세포와 복수의 마이크로스피어를 포함한다. 본 발명의 집합체의 세포 및 마이크로스피어는 상호 교차하는 전단가역적인 결합을 형성하여, 3차원적 집합체를 형성한다.

세포/마이크로스피어 집합체는 밀집된 물질이 아니기 때문에, 충분한 영양 및 산소를 세포에 공급할 수 있는 상호 연결된 다공성 스캐폴드와 같은 3D 환경을 세포에 제공할 수 있다. 게다가, 조직 형성에 영향을 줄 수 있는 용해성 인자를 집합체 내의 마이크로스피어 내부로 불러들일 수 있다. 폴리머 마이크로스피어를 이용한 세포의 집합 배양은 또한 상기에서 예로 든바와 같이 줄기 세포에 적용할 수 있다. 본 발명자들은 세포-폴리머 상호작용은 집합체 형성 뿐만 아니라 조직 재생에도 중요하다는 것을 밝혔다. 세포-상호작용하는 마이크로스피어는 또한 췌도 세포 및 간세포의 배양을 포함하는 각종 조직 공학 응용에 대하여 유용할 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 세포-마이크로스피어 집합체를 포함하는 전단 가역적 세포 이식(cell transplantation)용 조성물을 제공한다. 종래 세포 이식에 있어서, 세포를 고분자 용액의 상태로 이식 대상에 이식 후 하이드로겔을 형성하기 위하여 화학적 개시제 및/또는 가교제를 이용해온 반면에, 본 발명인 전단 가역적 세포 이식용 조성물의 경우에는 전단가역적인 특성을 가지므로, 이식 후 하이드로겔을 형성하기 위한 별도의 과정 없이도, 집합체를 형성하여 세포의 전달을 가능케 한다. 이식의 대상이 되는 세포는 세포-마이크로스피어 집합체를 구성하는 세포이며, 집합체의 마이크로스피어가 스캐폴드와 같은 역할을 하며 세포 이식을 가능하게 한다. 본 발명인 세포 이식용 조성물은 세포 이식이 필요한 분야에서 제한 없이 유용하게 활용 가능하다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포-마이크로스피어 집합체를 포함하며, 집합체에 포함되는 복수의 세포는 연골 재생을 위한 연골세포 또는 줄기세포인, 연골재생용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 연골 재생용 약제학적 조성물은 주사로 체내 이식 가능하며, 이식 후 전단 가역적 특성으로 집합체가 형성된다.

본 발명의 치료제 조성물은 추가적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있고, 본 발명의 치료제 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 치료제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 치료제 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 국소 주입(local injection)이 가장 바람직한 투여방법이다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 조성물의 투여량은 바람직하게는 1회 1 x 10⁵- 1 x 10⁸ 세포이다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 치료제 조성물은 이식되는 세포의 기능을 충분히 발휘할 수 있도록 세포간 네트워킹을 탁월하게 형성케 하여 실제적으로 질환 동물에서 개선된 치료 효능을 나타낸다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 세포-마이크로스피어 집합체를 포함하며, 집합체에 포함되는 복수의 세포는 연골 재생을 위한 연골세포 또는 줄기세포인, 연골-손상 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 연골-손상 질환은 퇴행성 관절염(Osteoarthritis), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis), 반월상 연골 손상(Meniscus Injury), 늑연골염(Costochondritis), 다연골염(Relapsing polychondritis), 및 연골육종(Chondrosarcoma)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 연골-손상 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 상기 세포 이식(cell transplantation)용 조성물 및 연골재생용 약제학적 조성물과 관련이 있는 것으로서, 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 중복되는 내용의 기재는 생략하도록 한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 세포와 마이크로스피어가 전단 가역적으로 결합되어 있는 세포-마이크로스피어 집합체를 제공한다.

(b) 본 발명은 전단 가역적 세포 이식(cell transplantation)용 조성물을 제공한다.

(c) 본 발명은 연골재생용 약제학적 조성물을 제공한다.

(d) 본 발명은 연골-손상 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(d) 본 발명의 집합체를 이용함으로써, 충분한 영양 및 산소를 세포에 공급할 수 있는 상호 연결된 다공성 스캐폴드와 같은 3D 환경을 세포에 제공할 수 있다.

(e) 본 발명의 집합체를 이용함으로써, 조직 형성에 영향을 줄 수 있는 용해성 인자를 집합체 내의 마이크로스피어 내부로 불러들일 수 있다.

(f) 본 발명의 세포 이식용 조성물을 이용함으로써, 최소 침습적인 방법으로 세포를 대상에 전달할 수 있다.

(g) 본 발명의 약제학적 조성물을 이용함으로써, 연골 재생을 도모하고, 연골질환을 예방 또는 치료 할 수 있다.

(h) 본 발명의 집합체는 또한 췌도 세포 및 간세포의 배양을 포함하는 각종 조직 공학 응용에 대하여 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 세포/마이크로스피어 집합체 형성의 개념도를 나타낸다.
도 2는 (A) RGD로 변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어 및 (B) RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지 및 크기분포를 나타낸다(스케일 막대 20 μm).
도 3은 세포/알긴산 마이크로스피어 집합체(빨강) 및 세포/RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어 집합체(파랑)의 점탄성을 나타낸다. 저장 탄성률(G', 채워진 점으로 표시)과 손실 탄성률(G", 비어있는 점으로 표시)은 RGD-알긴산 마이크로스피어를 (A) ATDC5 세포 또는 (B) 연골세포(세포와 마이크로스피어는 각각 1.5×10⁸/ml)와 혼합한 후 측정하였다.
도 4는 회전형 레오미터(75 Pa, 3s)를 이용하여 전단력을 인가하는 것에 의해 집합체 구조가 깨진 후의 ATDC5 세포 및 RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어 집합체(파랑) 사이의 전단-가역적인 집합체 형성을 나타낸다. 변형되지 않은 마이크로스피어(빨강)는 세포의 존재하에서 전단 가역적인 집합체의 형성을 보이지 않는다. 화살표는 계에 대한 전단력의 인가를 나타낸다(세포 및 마이크로스피어는 각각 1.5×10⁸/ml).
도 5는 세포/마이크로스피어 집합체의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지를 나타낸다(스케일 막대 20 μm). ATDC5 세포는 (A) RGD 변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어 또는 (B) RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어와 혼합하였다.
도 6은 (A) 주입 6주 후 회수 된 재생 조직 및 (B) 알시안 블루 및 (C) 반 기슨스 염색을 이용하여 염색한 조직학적 조직 절편을 나타낸다.
도 7은 재생된 연골 조직으로부터의 설페이트화 GAGs 정량 분석을 나타낸다(**P<0.01).
도 8은 (A) 재생된 연골 조직에서의 연골형성(chondregenic) 마커 유전자(어그레칸, 콜라겐 타입 Ⅱ 및 SOX-9)의 발현, (B) 조직에서의 콜라겐 타입 Ⅱ 발현의 정량 분석(**P<0.01)을 나타낸다.
도 9는 알긴산 마이크로스피어의 RGD 변형을 FT-IR로 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

실험재료

알긴산 나트륨(분자량 200000-300000)을 FMC사로부터 구입하였다. 과요오드산 나트륨, 소르비탄 트리올리에이트(SPAN80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올리에이트(TWEEN80), 염화칼슘, 1-에틸-3-(다이메틸아미노프로필)카보다이이미드, 2-(N-모폴리노)에탄설폰산, 인간 트랜스페린, 셀렌산 나트륨, 파파인, 및 콜라게나제 타입II를 Sigma사로부터 구입하였다. (글라이신)4-아르기닌-글라이신-아스파트산-세린-프롤린(G4RGDSP)서열을 갖는 펩타이드는 Anigen사에서 구입하였다. N-히드록시설포석신이미드는 Thermo사에서 구입하였다. 태아소혈청, 페니실린-스트렙토마이신, PBS(phosphate beffered saline), 둘베코 변형된 이글 배지 및 햄 F-12 배지(DMEM/F-12)는 Gibco사로부터 구입하였다. 옥타데실 로다민 B 클로라이드(O246) 및 에틸렌 글리콜은 Invitrogen 및 Junsei 사로부터 각각 구입하였다. RNAiso plus 키트는 Takara로부터 구입하였고, BlyscanTM sGAG 분석 키트는 Biocolor사로부터 구입하였다.

알긴산 마이크로스피어의 제작

알긴산 마이크로스피어는 유중수형 에멀전 방법에 의해 준비하였고, 염화칼슘을 이용하여 고형화하였다. 알긴산 소듐(3중량%) 수용액은 SPAN85(16.3 mM)을 함유하는 이소옥테인에서 호모지나이저를 사용하여 10000 rpm으로 5분간 분산시켰다. 그 뒤에 에멀젼은 안정한 유중수형 에멀젼 입자를 형성하도록 TWEEN80(95.6 mM)을 포함하는 이소옥테인에서 분산시켰다(10000 rpm, 5분). 에멀젼을 교반하고, 20 중량% 염화칼슘 용액을 첨가하여 1시간 동안 이온 가교를 형성시켰다. 다음으로 혼합물을 600 ml의 증류수에 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 1500 rpm에서 10분간 원심분리한 뒤, 상등액을 제거하고, 증류수를 첨가하였다. 마이크로스피어 현탁액은 1500 rpm에서 10분간 다시 원심분리하였고, 상등액을 제거하였다. 이러한 워싱 절차를 잔여 오일을 제거하기위해 4회 반복하였다. 마지막으로, 마이크로스피어 이미지를 광학 현미경(Olympus) 및 공초점 레이저 주사 현미경(Olympus)을 이용하여 얻었다. 알긴산 마이크로스피어의 평균 직경은 Image J 소프트웨어(NIH)를 이용하여 측정하였고, 직경은 세포 직경과 유사한 14.2±4.4 μm였다.

RGD 펩타이드를 갖는 알긴산 마이크로스피어의 변형

알긴산 마이크로스피어의 표면은 카보다이이미드 화학(carbodiimide chemistry) 방법을 이용하여, (글라이신)4-아르기닌-글라이신-아스파트산-세린-프롤린(G4RGDSP) 서열의 펩타이드로 변형하였다. 요컨대, 알긴산 마이크로스피어를 실온에서 2-(N-모폴리노)에테인설폰산 버퍼 내에 분산시켰고(pH 6.5, 0.3 M NaCl), G₄RGDSP 펩타이드를 1-에틸-3-(다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 및 N-히드록시설포석신이미드의 존재하에서 현탁액에 첨가하였다. RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어의 직경은 대략 15.3±3.6 μm로 측정되었고, 변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어와 비교하여 중요한 변화는 없었다. 알긴산 마이크로스피어에 대한 RGD 펩타이드의 화학적 접합은 푸리에 변환 적외선 분광기(Perkin Elmer)를 이용하여 400-2000 cm^-1의 파장 범위에서 확인하였다.

세포 분리 및 배양

프라이머리 연골세포는 뉴질랜드 흰토끼(4주령, Samtako)의 무릎 관절 연골로부터 분리하였다. 연골 조각은 PBS로 세척하였고, 10% 태아소혈청(FBS)및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 햄 F-12 배지(DMEM/F-12) 및 둘베코 변형된 이글 배지의 1:1 혼합물로 구성된 배지내에서 0.05 중량% 콜라게나제 타입Ⅱ로 8시간 동안 소화시켰다. 분리된 세포는 PBS로 세척하였다. 프라이머리 연골세포는 37℃, 5% CO₂ 환경에서, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F-12에서 배양하였다. ATDC5 세포주는 RIKEN 세포 은행으로부터 구입하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 환경에서, 5% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신, 10 mg/ml의 인간 트랜스페린, 3×10⁸ M 소듐 셀레나이트가 보충된 DMEM/F-12에서 배양하였다.

세포/마이크로스피어 집합체(aggregates)의 제조

알긴산 마이크로스피어는 배지에서 배양하였다(1.5×10⁸/ml, [폴리머]=16 중량%). 현탁액과 혼합하기 전에, ATDC5 세포막을 옥타데실 로다민 B 클로라이드로 2시간 동안 염색하였다. 과량의 로다민 분자는 1500 rpm으로 3분 동안 원심분리하여 제거하였다. 그리고 난 뒤 세포를 알긴산 마이크로스피어 현탁액과 혼합하였다([세포]=1.5×10⁸/ml). 혼합물을 커버글라스로 이동시켰고, 5분 후 세포/마이크로스피어 집합체를 공초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 관찰하였다.

유동학적 측정(Rhenological measurements)

세포/마이크로스피어 집합체의 유동학적 특성을 콘(cone) 및 플레이트 픽스츄어(20 mm 직경 플레이트, 4ㅀ콘 각도)를 구비한 회전형 레오미터 Gemini 150(Malvern)을 이용하여 측정하였다. 세포/마이크로스피어의 점탄성을, 37℃ 온도를 유지한채로 0.01-1 Hz 범위에서 주파수 스윕 모드(frequency sweep mode)를 이용하여 기록하였다. 3초 동안 전단 응력(75 Pa)을 가하는 것에 의도적으로 집합체 구조를 깨뜨린 후, 전단-가역적인 집합체 형성을 시험하였다.

In vivo 연골 재생

BALB/c 누드 마우스(6주령)를 NARA Bio로부터 구입하였다. 모든 동물 시험은 실험 동물의 관리와 이용을 위한 한양 대학교 가이드라인에 따라 수행하였고, 한양대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Commitee)(HY-IACUC-12-060A)에 의해 승인되었다. 마우스를 10 중량% 롬펀(rompun)을 포함하는 졸레틸의 근육 내 주사로 마취하였다. 세포/마이크로스피어 집합체(주사량, 100 μl)를 마우스(그룹 Ⅰ은 프라이머리 연골세포 만; 그룹 Ⅱ는 프라이머리 연골세포/변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어 집합체; 그룹 Ⅲ은 프라이머리 연골세포/RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어 집합체; 개체수는 그룹당 6마리)의 등에 주사하였다. 6주 후 재생된 조직 절편을 회수하였다.

조직학적 분석

회수된 조직은 차가운 PBS(4 ℃)로 세척하였고, 10% 포르말린으로 24시간 동안 고정하였다. 시편은 조직학적 분석을 위하여 알코올로 탈수하였고, 크실렌으로 처리하였으며, 파라핀으로 고정하였다. 5 μm 두께의 조직 절편을 마이크로톰을 이용하여 얻었고, 설페이트화 글리코사미노글리칸(sGAG)에 대하여 알시안블루(Alcian blue), 콜라겐 섬유에 대하여 반 기슨(van Gieson's)을 이용하여 염색하였다.

설페이트화 글리코사미노글리칸 함량에 대한 생화학적 분석

조직 절편을 동결건조하여, 무게를 측정하고, 조직 절편으로부터 알긴산을 제거하기 위해 20분간 50 mM EDTA 용액을 첨가하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고, 24시간 동안 60℃에서 1 M NaCl, 5 mM 시스테인 HCl, 및 1mM EDTA를 포함하는 pH 6.5의 50 mM 인산 버퍼에 용해되어 있는 500 mL의 파파인 용액(10 μl/ml)으로 배양하였다. 설페이트화 글리코사미노글리칸 (sGAG) 함량을 Blyscan^TM sGAG 분석 키트를 사용하여 측정했다. 간단히 말해서, 1,9-디메틸메틸렌 블루 시약(1 ml)을 추출 버퍼(100 ml)에 첨가하였고, 30분간 쉐이커에서 반응시켰다. 10000×g에서 10분간 원심분리에 의해 상등액을 제거하고, 튜브에서 드랍플릿(droplets)을 제거한 후, sGAG-염료 복합체를 용해제(1 ml)로 용해하였다. 각 샘플에서 염료 및 콘드로이틴-4-설페이트 기준시료의 흡광도는 656 nm에서 분광광도계(Molecular Devices)를 사용하여 측정하였다.

mRNA 분리 및 PCR

PCR 분석을 위해, RNA를 회수된 조직으로부터 RNAiso plus kit(Takara)를 사용하여 분리하였다. RNA의 양은 UV-VIS 분광계를 사용하여 260 nm에서 측정하였고, 농도 및 품질은 아가로스 겔 상에서 확인하였다. 분리된 RNA 샘플은 Maxime RT PreMix 키트(iNtRON Biotechnology)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. 연골형성(chondregenic) 마커 유전자(콜라겐 타입 Ⅱ, 어그레칸, 및 SOX-9), 과 하우스키핑 유전자(GAPDH)는 RT-PCR(Takara)을 이용하여 조사하였다. PCR 생성물은 일반적인 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다: 콜라겐 타입 Ⅱ, 5'-AACACTGCCAACGTCCAGAT-3', 5'-CTGCAGCACGGTATAGGTGA-3' (201 bp); 어그레칸, 5'-GAGGTCGTGGTGAAAGGTGT-3', 5'-GTGTGGATGGGGTACCTGAC-3' (206 bp); 및 SOX-9, 5'-ACCTCAAGAAGGAGAGCGAAGA-3', 5'-CGGGTGGTCTTTCTTGTGCT-3' (354 bp); GAPDH, 5'-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3', 5'-CACAATGCCGAAGTCCTCGT-3' (293 bp).

모든 데이터는 평균±표준편차로 제시된다. 통계 분석은 Student's t-검정을 이용하여 수행하였다. **P 값<0.01는 통계학적으로 의미 있는 것으로 간주하였다.

실험 결과

알긴산 마이크로스피어의 특성화

알긴산 마이크로스피어를 유중수형 에멀젼 방법에 의해 제조하였고, 가교 화합물로서 염화 칼슘을 사용하여 고형화 하였다. 알긴산 마이크로스피어는 균일한 크기 분포를 갖는 구형 형상을 갖고, 그들의 평균 직경은 14.2±4.4 μm(참조: 도 2의 A)이다. 알긴산은 세포와 상호작용이 없으므로, 알긴산 마이크로스피어의 표면에 카보다이이미드 화학(carbodiimide chemistry)을 이용하여 접착 리간드인 RGD 펩타이드로 변형시켰다. 알긴산 마이크로스피어의 RGD 변형은 FT-IR로 확인하였다(참조: 도 9). RGD-변형 알긴산 마이크로스피어의 C-N 스트래칭의 특성 피크(1400 cm^-1)의 강도의 증가가 변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어와 비교하여 분명히 관찰되었다. 1640-1620 cm^-1에서 나타나는 N-H 밴딩 피크와 부분적으로 오버랩되는 강한 C=O 스트래칭 밴드가 1610 cm^-1에서 나타났다(32, 33). 이 결과는 RGD 펩타이드가 성공적으로 알긴산 마이크로스피어를 변형시켰음을 보여준다. 알긴산 마이크로스피어의 크기 및 형태에서의 중요한 변화는, 변형 후에 관찰되지 않았다(참조: 도 2의 B). RGD-변형 알긴산 마이크로스피어의 평균 직경은 15.3±3.6 μm로 측정되었다.

세포/마이크로스피어 집합체의 형성

세포/마이크로스피어 집합체의 점탄성을 세포와 마이크로스피어 사이의 집합체 구조의 형성을 확인하기 위하여 조사하였다. 세포/마이크로스피어 집합체의 저장 탄성률(G')과 손실 탄성률(G")은 37℃에서 0.01-1 Hz 범위로 측정하였다(참조: 도 3). 변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어를 ATDC5 세포 또는 프라이머리 연골세포([cell]=[마이크로스피어]=1.5×10⁸/ml)와 혼합하는 경우에, G' 및 G" 값 사이의 중요한 차이가 측정되지 않았다. RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어를 ATDC5 세포 또는 프라이머리 연골 세포와 혼합하는 때에, 흥미롭게도 세포/마이크로스피어 집합체 형성의 지표인 G' 값은 G" 값보다 매우 높았다.

다음으로 이러한 세포/마이크로 집합체가 전단-가역적 집합체 형성이 가능한지에 대하여 시험하였다. 세포/마이크로스피어 집합체의 전단-가역적 회복은, 집합 구조에 전단 응력를 가해 의도적으로 깨뜨린 후 시간의 경과에 따라 관찰되었다. 세포 존재하에서의 RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어의 집합체 형성은 전단-가역적이고, 수회 반복될 수 있었다(참조: 도 4). 그러나, 변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어는 세포와 마이크로스피어 사이의 상호작용의 부족으로 인하여, 전단-가역적인 특성을 보이지 않았다.

세포/마이크로스피어 집합체의 현미경 관찰

세포/마이크로스피어 집합체의 형태는 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 측정하였다. 세포막을 옥사데실 로다민 B 클로라이드로 염색한 후에, 세포는 대략 같은 수의 알긴산 마이크로스피어([세포]=[마이크로스피어]=1.5×10⁸/ml)와 혼합하였다. 세포를 RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어와 혼합할 때, 세포의 형태는 현저하게 변화되고, 이는 아마도 세포 리셉터 및 마이크로스피어 표면의 접착 리간드 사이의 특이적 상호작용이 기여하는 결과일 수 있다(참조: 도 5). 그러나, 변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어와 혼합한 세포는 둥근 형상을 유지하는데, 알긴산 마이크로스피어와의 특이적 상호작용의 부재 때문일 것이다.

회수된 재생 조직 및 조직학적 분석

프라이머리 연골세포 및 알긴산 마이크로스피어를 이용하여 형성된 집합체는 주사기를 사용하여 마우스의 등으로 피하주입하였다. 주입 6주 후, 재생된 조직 절편을 회수하였다. 세포/마이크로스피어 집합체는 단단한 구조를 형성하고 있었다(참조: 도 6A). 대조적으로, 프라이머리 연골세포 만을 주입한 그룹은 가장 작은 사이즈 및 거친 조직 형성을 보였다. 조직 절편은 글리코사미노글리칸(GAGs) 형성에 대하여 알시안 블루로, 콜라겐 섬유 형성에 대하여 반 기슨 염색법으로 염색하였다(참조: 도 6B 및 6C). 큰 염증은 재생된 조직에서 발견되지 않았다. 세포/RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어 집합체의 주입은 세포/변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어 집합체에 비하여 균일하게 분산된 세포를 얻을 수 있다. 세포/RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어 집합체를 사용한 경우, 연골의 전형적인 구조인 골소강(Lacunae)이 대단히 많이 관찰되었다. 그러나, 세포/변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어 집합체는 골소강을 거의 형성하지 않았다. 세포/RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어 집합체의 콜라겐 섬유 형성 및 GAGs 분비는 세포/변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어 집합체와 비교하여 더욱 두드러졌다. 섬유아세포의 조직 절편 내로의 침투가 프라이머리 연골세포만을 주입한 그룹에서 관찰되었다.

생화학적 분석 및 연골형성(chondrogenic) 유전자 발현

다음으로, 재생된 조직에서 설페이트화 GAGs의 함량을 Blyscan^TM sGAG 분석 키트를 사용하여 정량하였다(참조: 도 7). 가장 적은 양의 설페이트화 GAGs(47.5±36.8 μg/mg)를 갖는 그룹을 주입하였다. 세포/RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어 집합체(277.0±19.9 μg/mg)의 설페이트화 GAG 함량은 세포/변형되지 않은 알긴산 마이크로스피어 집합체의 함량(214±9.8 μg/mg)보다 대단히 높았다.

다음으로, 어그레칸, 콜라겐 타입 Ⅱ, 및 SOX-9의 유전자 발현을 조사하였다(참조: 도 8A). 콜라겐 타입 Ⅱ 및 어그레칸은 천연 연골, 특히 관절 연골의 주요 구조적 요소이고; SOX-9은 연골 조직에서 발현되어 콜라겐 발현을 직접 조절하는 것으로 알려져 있다. 세포/RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어 집합체는 재생된 조직 내의 어그레칸, 콜라겐 타입 Ⅱ, 및 SOX-9의 가장 높은 발현량을 보인다. 이러한 유전자들은 세포만을 처리한 그룹에서는 거의 발현되지 않는다. 콜라겐 타입 Ⅱ의 유전자 발현량의 정량 분석은 또한 세포/RGD-변형된 알긴산 마이크로스피어 집합체가 in vivo 연골 조직의 재생에 가장 효과적이라는 것을 지지한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (14)

1. (a) 생체적합성 복수의 마이크로스피어(a plurality of microspheres); 상기 마이크로스피어는 세포 표면에 존재하는 수용체 단백질에 대하여 결합능을 갖는 리간드가 세포와 상호작용을 위해 그의 표면에 부착되어 있고; 및
   (b) 상기 리간드에 대하여 결합능을 갖는 수용체 단백질이 표면에 존재하는 복수의 세포(a plurality of cells)를 포함하고,
   상기 복수의 세포 및 복수의 마이크로스피어는 상기 수용체 단백질과 리간드의 상호 작용에 의해 전단 가역적으로 결합되어 집합체(aggregate)를 형성하고,
   상기 마이크로스피어는 상기 집합체 내에 함께 포함되는 세포와 전단 가역적-가교 형성이 가능한 직경을 가지며, 상기 직경은 5-30 μm인 것을 특징으로 하는 세포-마이크로스피어 집합체(aggregate).
   
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5. 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로스피어는 알긴산 중합체, 폴리에틸렌글라이콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 블록 공중합체, 폴리락틱에시드-폴리글라이콜릭에시드 공중합체, 폴리락틱에시드, 폴리락틱에시드-폴리카프로락톤 공중합체, 알킬셀룰로오스, 하이드록시알킬셀룰로오스, 헤파린, 하이알루론산, 키토산 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중합체인 것을 특징으로 하는 세포-마이크로스피어 집합체.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 마이크로스피어는 알긴산 중합체인 것을 특징으로 하는 세포-마이크로스피어 집합체.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 리간드는 RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val),EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val) 및 LDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인것을 특징으로 하는 세포-마이크로스피어 집합체.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 리간드는 RGD인 것을 특징으로 하는 세포-마이크로스피어 집합체.
   
9. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 연골세포(chondrocytes), 근아세포(myoblasts), 간세포(hepatocytes), 골아세포(osteoblasts), 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 성체줄기세포(adult stem cells), 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 혈관내피줄기세포, 조혈모세포, 간줄기세포, 심장줄기세포, 췌장줄기세포, 내피전구세포(endothelial progenitors), 성장내피세포(outgrowth endothelial cells), 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells), 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells), 인간신경줄기세포(neural stem cells), 위성세포(satellite cells), 장 상피세포, 평활근세포 및 섬유아세포로 구성된 군으로부터 선택된 세포인 것을 특징으로 하는 세포-마이크로스피어 집합체.
   
10. 제 1 항에 있어서, 상기 복수의 세포와 복수의 마이크로스피어는 함량비가 세포 및 마이크로스피어 입자 수를 기준으로 0.5:1 내지 2:1인 것을 특징으로 하는 세포-마이크로스피어 집합체.
    
11. 제 1 항의 세포-마이크로스피어 집합체를 포함하는 전단 가역적 세포 이식(cell transplantation)용 조성물.
    
12. 제 1 항의 세포-마이크로스피어 집합체를 포함하며, 집합체에 포함되는 복수의 세포는 연골 재생을 위한 연골세포 또는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 연골재생용 약제학적 조성물.
    
13. 제 1 항의 세포-마이크로스피어 집합체를 포함하며, 집합체에 포함되는 복수의 세포는 연골 재생을 위한 연골세포 또는 줄기세포인, 연골-손상 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
    
14. 제 13 항에 있어서, 상기 연골-손상 질환은 퇴행성 관절염(Osteoarthritis), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis), 반월상 연골 손상(Meniscus Injury), 늑연골염(Costochondritis), 다연골염(Relapsing polychondritis), 및 연골육종(Chondrosarcoma)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
    

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