KR101704363B1

KR101704363B1 - 이온 가교성 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체

Info

Publication number: KR101704363B1
Application number: KR1020160179688A
Authority: KR
Inventors: 이근용; 박홍현
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2013-09-04
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2017-02-07
Also published as: KR20150028198A; KR20170002354A

Abstract

본 발명은 알긴산 및 히알루론산을 포함하고, 상기 알긴산과 히알루론산이 공유결합을 형성하고 있는 이온 가교성 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체에 관한 것이다. 본 발명을 이용하면, 화학적 가교제를 사용하지 않고 2가 양이온을 첨가하여 히알루론산을 손쉽게 가교시킬 수 있다.

Description

이온 가교성 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체{Ionically Cross-Linkable Alginate-Grafted Hyaluronate}

본 발명은 알긴산으로 그래프트화된 히알루론산 개질체에 관한 것이다.

천연 고분자 기반의 하이드로겔은, 합성 폴리머 기반의 하이드로겔과 비교되는 그들의 대단히 뛰어난 고유의 생체적합성으로 인하여 다양한 생의학 접근에서 이용되어 왔다. 천연 폴리머는 생체재료 디자인에 관하여 중요한 독성을 보일 가능성이 상대적으로 낮다. 천연 폴리머 가운데, 히알루론산은 훌륭한 생체적합성 및 생물 기능성으로 인해 약물 전달[1, 2] 및 조직 공학[3, 4] 적용을 포함하는 많은 생체의학 적용에서 이용되어 왔다. 상기 폴리사카라이드는 β-1,4-D-글루쿠론산-β-1,3-N-아세틸-D-글루코사민 잔기[5]의 반복 유닛으로 구성되고, 관절 낭액(synovial fluid) 및 세포외 매트릭스(extracellular matrix)에서 풍부하다. 히알루론산으로부터 제조한 하이드로겔은 그들의 훌륭한 생물학적 기능, 훌륭한 점탄성질, 높은 수분 함량 및 생분해 성질로 인해 특히 매력적이다. 히알루론산 겔의 한 전형적인 제조 방법은 화학적 가교이다[6-9]. 그러나 화학적 가교 시약은 면역 및 염증 반응과 같은 급성 또는 만성 부작용을 유발할 수 있다[10]. 이것은 잠재적 위험의 원인이 될 수 있고, 히알루론산의 폭넓은 생의학 적용을 제한할 수 있다. 물리적 가교는 화학적 가교에 의해 초래되는 독성 이슈를 극복하는데 적용될 수 있는 대체적인 접근이다. 자극-민감 폴리머 주변의 외부 환경을 변화시킴으로서(예를 들어, 온도[11, 12] 및 pH[13, 14]) 또는 폴리머에 대한 물리적 결합(예를 들어, 이온성[15, 16] 또는 소수성 상호작용[17, 18])에 의해, 하이드로겔을 물리적으로 제조할 수 있다. 알긴산은 이가 양이온(에를 들어 Ca² ⁺)의 존재하에서 물리적으로 가교된 구조를 형성할 수 있지만, 화학적 가교제 없이는 불가능하다. 알긴산은 β-D-만뉴론산(M) 및 α-L-글루론산(G) 잔기의 블록으로 구성된 선형 코폴리머이고[19, 20], 그것은 또한 천연 유도된 생체재료이다. 그것은 우수한 생체적합성 및 낮은 독성으로 인한 생체의학 적용에 사용된다[21, 22]. 구체적으로 세포-접착 모티프(예를 들어 RGD 펩타이드)로 개질된 알긴산은 조직 공학 응용을 위한 주입가능한 하이드로겔로서 종종 이용되어 왔다[23, 24].

관절 연골은 전반적인 개인의 웰-빙(well-being)을 위해 중요하다. 관절 연골 기능 및 구조는 종종 물리적 상처 또는 골관절염과 같은 퇴행성 질환으로 인해 방해받거나 손상된다. 연골 조직은 신경과 혈관이 없기 때문에, 연골세포 증식은 느리고, 조직 결함은 거의 자발적으로 회복되지 않는다[25, 26]. 하이드로겔을 이용한 조직 공학적 접근은 최소-침습 연골세포 전달을 통한 관절 연골 손상을 치료하기 위한 훌륭한 잠재력을 지닌 것으로 알려지고 있다. 상기와 같은 최소 침습 연골세포 전달은 비용, 회복 시간, 및 환자의 고통을 감소시킬 수 있을 것이다[27]. 하이드로겔의 다른 이점은 그들의 뛰어난 점탄성질이다. 하이드로겔의 점탄성 성질은 연골의 자연적인 세포 외 기질(ECM) 물질과 유사하다[28-30]. 히알루론산은 자연적인 연골의 ECM의 주요 성분이므로, 연골 재생에 대한 유망한 후보물질이다. 게다가 히알루론산은 연골세포 대사 상의 중요한 물질인 연골세포 표면 상의 CD44와 상호작용한다[31-33]. 히알루론산은 연골 재생 응용에서 광범위하게 이용되어왔다[34-36].

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 천연고분자인 히알루론산을 화학적 가교제를 사용하지 않고 손쉽게 가교 시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 히알루론산에 공유 결합을 이용하여 알긴산을 그래프트화 시킴으로써, 화학적 가교제를 사용하지 않고도 2가 양이온의 첨가 만으로 손쉽게 가교될 수 있는 알긴산-그래프트화 히알루론산을 제조할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 이온 가교성 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포 이식(cell transplantation)용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 연골재생용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 연골-손상 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 이온 가교성 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 알긴산 및 히알루론산을 포함하고, 상기 알긴산과 히알루론산이 공유결합을 형성하고 있는 이온 가교성 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체를 제공한다.

본 발명자들은 천연고분자인 히알루론산을 화학적 가교제를 사용하지 않고 손쉽게 가교 시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 히알루론산에 공유 결합을 이용하여 알긴산을 그래프트화 시킴으로써, 화학적 가교제를 사용하지 않고도 2가 양이온의 첨가 만으로 손쉽게 가교될 수 있는 알긴산-그래프트화 히알루론산을 제조할 수 있음을 규명하였다(참조: 도 1).

본 명세서에서 사용되는 용어 "알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체"는 알긴산과 공유결합 통해 결합되어 있는 상태의 히알루론산을 의미한다. 본 명세서에서 "알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체"는 "알긴산-그래프트화 히알루론산", "히알루론산 개질체" 또는 "개질체" 등으로 기재할 수 있으며, 모두 같은 의미를 갖는다. 본 발명의 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체는 이온 가교를 통하여 하이드로겔을 간편하고 손쉽게 제조할 수 있다. 종래 히알루론산의 하이드로겔을 형성하기 위하여는 화학적 가교제를 사용하여 하이드로겔을 형성하는 방법을 사용해왔다. 그러나 본 발명의 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체는 히알루론산에 도입된 알긴산의 가교 특성에 의하여, 예를 들어 Ca² ⁺, Ba² ⁺, Cu² ⁺, Fe² ⁺, 및 Mg² ⁺와 같은 2가 양이온의 첨가로 쉽게 이온 가교 반응을 일으킬 수 있다. 이는 화학적 가교제가 체내에서 면역 또는 염증 반응 등의 부작용을 유발할 수 있는 가능성을 배제한다는 점에서 중요하다. 따라서, 체내에 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체를 주입하기 전에, 2가 양이온, 바람직하게 Ca² ⁺를 개질체에 대하여 첨가하고, 겔화가 이루어지기 전에 체내에 주입할 수 있으며, 주입 후 신속한 겔화거동을 통하여 빠르게 하이드로겔을 형성하도록 할 수 있다. 또한, 전체적으로 알긴산과 히알루론산이 균일하게 분산되어 있는 하이드로겔의 형성이 가능하다.

본 발명의 개질체로부터 제조되는 하이드로겔 조성물은 알긴산 도입 정도에 따라 기계적 물성 및 겔화 거동을 조절할 수 있다. 본 발명자들은 알긴산의 중량비가 1:4에서 1:1로 증가함에 따라, 이온 가교 하이드로겔의 탄성 계수는 또한 증가하는 것을 확인하였다(참조: 도 2d). 구조상의 이온 가교 가능한 지점의 수가 증가된 때문인 것으로 보인다. 이온 가교된 알긴산-그래프트화 히알루론산 하이드로겔의 기계적 특성은 이온 가교된 알긴산 겔에 비하여 낮은 수준을 보이더라도, 체내에 이식 후 겔 구조를 유지하기에는 충분하다. 또한, 개질체로부터 제조되는 하이드로겔 조성물은 첨가하는 2가 양이온의 양에 따라 기계적 물성 및 겔화 거동을 조절할 수 있다.

또한, 본 발명의 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체의 경우 알긴산/히알루론산 혼합물에 비하여 많은 이점을 갖는다. 히알루론산 개질체의 경우, 알긴산과 히알루론산이 균일하게 분포된 하이드로겔의 형성이 가능하고, 겔화 시간이 상당히 단축되어 히알루론산 개질체를 겔화 시키기 위하여 2가 양이온을 첨가한 후, 곧바로 체내 이식 등을 수행할 수 있고, 체내 이식 후에도 빠른 시간 내에 겔화가 일어나, 세포 이식 등의 적용 분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 관절 부위 연골세포 등의 이식에 있어서, 이식받은 대상(subject)은 세포 이식 후에도 긴 대기 시간을 요하지 않고, 단시간 내에 거동이 가능해질 수 있다. 또한, 화학적 가교제를 사용하지 않고, 도입된 알긴산의 특성을 이용하여 2가 양이온을 이용하여 겔화가 가능하므로, 생체 적합성이 뛰어나며, 화학적 가교제의 사용으로 인한 각종 부작용을 예방할 수 있다. 또한, 알긴산과 히알루론산의 함량 비율, 2가 양이온의 함량 등을 조절하여, 손쉽게 기계적 물성의 조절이 가능한 이점이 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체를 제조하기 위하여 사용할 수 있는 알긴산의 바람직한 분자량은 10000-1000000 g/몰이고, 히알루론산의 바람직한 분자량은 10000-1000000 g/몰이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체에 포함되는 알긴산과 히알루론산은 중량비가 10:1 내지 1:10이다. 구체적으로 알긴산과 히알루론산의 중량비는 5:1 내지 1:8이고, 더 구체적으로 2:1 내지 1:6이며, 더욱 구체적으로 1:1 내지 1:4이고, 더 구체적으로는 1:1.2 내지 1:3이고, 좀 더 구체적으로 알긴산과 히알루론산의 중량비는 1:1.5 내지 1:2.5이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 알긴산과 히알루론산 사이의 공유결합은 알긴산의 카복실기 및 히알루론산의 카복실기와 공유결합-형성 가능한 링커를 통해 이루어진다. 히알루론산과 알긴산 사이의 공유결합을 형성하는 링커는 카복실산 기능기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 두 개 이상의 기능기를 갖는 당업계에 공지된 링커를 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 알긴산과 히알루론산을 공유결합을 통해 연결하는 링커는 다이아민, 다이비닐설폰, 1,4-뷰테인다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 및 글루타르알데히드, 카보다이이미드, 하이드록시석신이미드, 이미도에스터, 말레이미드, 할로아세틸, 다이설파이드, 하이드로아자이드, 알콕시아민으로 구성된 군에서 선택된다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 링커는 다이아민이고, 가장 바람직하게는 에틸렌다이아민이다.

링커를 사용하여 알긴산과 히알루론산을 공유결합에 의해 부착하기 위하여 알긴산과 히알루론산 중 한쪽을 택하여 우선적으로 링커를 처리하게 되는데, 자가-결합을 방지하기 위하여, 과량의 링커를 사용하는 것이 중요하다. 본 발명의 명세서에서 사용된 용어 "자가-결합"이란 하나의 링커를 통하여 이종 분자인 알긴산 및 히알루론산이 결합을 형성하는 것이 아니라, 알긴산 또는 히알루론산 동종 분자끼리 링커에 의해 결합을 형성하는 것을 의미하고, 하나의 분자 내에서 수개의 카복실산 기능기가 하나의 링커와 결합을 형성하는 것도 포함된다.

본 명세서 상에서 먼저 링커와 반응시키는 알긴산 또는 히알루론산을 "제1반응 물질"이라 하고, 제1반응 물질에 결합된 링커와 결합시키기 위하여 후에 첨가되는 화합물을 "제2반응 물질"이라 한다. 즉, 제1반응 물질이 알긴산인 경우, 제2반응 물질은 히알루론산이 되며, 제1반응 물질이 히알루론산인 경우, 제2반응 물질은 알긴산이 된다. 링커와 결합시킨 제1반응 물질을 제2반응 물질과 반응시키기 전에, 결합을 형성하지 않은 링커에 대하여 여과, 예를 들어 투석 과정을 거쳐 제거하는 과정을 거치게 된다. 이 후 제2반응 물질인 히알루론산 또는 알긴산을 추가적으로 반응시켜 최종적으로 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체를 수득한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 알긴산 및 히알루론산 중 적어도 하나는 세포부착 펩타이드가 결합된다. 상기 세포부착 펩타이드는 당업계에 공지된 어떠한 것이라도 사용이 가능하다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 세포부착 펩타이드는 RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val),EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val) 및 LDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다. 더욱 구체적으로 RGD(Arg-Gly-Asp)를 사용할 수 있다. 세포부착 펩타이드는 히알루론산 개질체에 의해 형성되는 하이드로겔과 세포와의 상호작용을 향상시키는 역할을 한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체를 포함하는 세포 이식(cell transplantation)용 조성물을 제공한다. 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체는 체내에서 하이드로겔을 형성하여 이식될 세포에 대한 생체적합성의 지지체로서 제공될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 이식(cell transplantation)용 조성물"은 체내 이식이 필요한 세포에 대한 지지체 역할을 하여, 세포 이식시 세포와 함께 체내 주입될 수 있는 조성물을 의미한다. 상기 세포 이식의 대상이 되는 세포의 종류에는 특별한 한정이 없다. 상기 세포 이식용 조성물은 이식할 세포와 혼합하여, 예를 들면 주사를 이용하여 원하는 위치에 주입할 수 있다. 세포와 혼합한 본 발명의 조성물을 체내에 주입 전 2가 양이온을 첨가하고 체내에 주입하면, 주입된 조성물이 이식될 부위에서 신속하게 하이드로겔을 형성함으로서 체내 세포를 이식할 수 있다. 이식될 세포는 세포 이식(cell transplantation)용 조성물에 대하여 고분자 용액 0.1 wt% - 10 wt% 내에 1×10⁵ - 5×10⁸세포/ml 정도 포함될 수 있다.

본 발명의 이식용 조성물은 각종 줄기세포 이식에도 사용할 수 있고, 본 발명이 적용되는 줄기세포는 제한이 없으며, 줄기세포의 특성, 즉 미분화, 무한정 증식 및 특정세포로의 분화능을 갖는 세포는 본 발명이 적용될 수 있는 세포이다. 본 발명이 적용되는 줄기세포는 크게 두 종류로 구별된다: 배아줄기세포 (ES) 및 배아생식세포 (EG)를 포함하는 전능성 줄기세포 (pluripotent stem cell)와 다능성 줄기세포 (multipotent stem cell). 배아줄기세포는 배반포의 내부세포괴 (ICM)로부터 유래되고, 배아생식세포는 5-10 주령의 생식융기 (gonadal ridge)의 원시생식세포로부터 유래된다. 한편, 다능성 줄기세포는 배아조직, 태아조직 및 성체 조직에서 발견되며, 이는 성체줄기세포를 포함한다. 전능성 줄기세포는 인 비트로에서 무한정 증식되며, 3 종류의 모든 배아층 (외배엽, 중배엽과 내배엽)으로부터 유래되는 다양한 세포로 분화될 수있는 능력을 갖는다. 한편, 다능성 줄기세포는 그가 유래된 특정 조직으로 분화될 수 있는 능력을 가지며, 자가 재생산 능력은 전형적으로 유기체의 라이프타임으로 제한된다. 다능성 줄기세포의 소스는 모든 조직 종류이고, 특히 골수, 혈액, 간, 피부, 장, 췌장, 뇌, 골격근 및 치수로부터 주로 분리된다. 본 발명의 조성물이 줄기세포 이식에 사용되는 경우에는 본 발명의 치료제 조성물에서, 바람직하게는, 줄기세포 분화 유도제를 추가적으로 포함한다. 줄기세포 분화 유도제의 바람직한 예는 레티노산 (retinoic acid), 아스코브산 (ascorbic acid), 멜라토닌 (melatonine) 또는 여러 가지 성장인자 [예컨대, GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), EGF (epidermal growth factor), NGF (nerve growth factor)]을 포함한다. 본 발명의 세포 이식용 조성물은 하이드로겔을 형성하기 위한 화학적 가교제의 사용이 없어 생체 적합성이 보다 뛰어나다. 또한 세포부착펩타이드를 포함하는 하이드로겔을 이용하는 경우에는 세포와의 상호작용이 향상되어 보다 높은 조직 재생 효율을 도모할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 이식을 위한 세포는 구체적으로 연골세포(chondrocytes), 근아세포(myoblasts), 간세포(hepatocytes), 골아세포(osteoblasts), 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 성체줄기세포(adult stem cells), 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 혈관내피줄기세포, 조혈모세포, 간줄기세포, 심장줄기세포, 췌장줄기세포, 내피전구세포(endothelial progenitors), 성장내피세포(outgrowth endothelial cells), 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells), 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells), 인간신경줄기세포(neural stem cells), 위성세포(satellite cells), 장 상피세포, 평활근세포 및 섬유아세포로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체를 포함하는 연골재생용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 히알루론산 개질체는 체내에서 하이드로겔을 형성하여 주(primary) 연골세포 또는 줄기세포 등의 지지체로 작용하여 연골재생이 필요한 체내 부위에 이식될 수 있다. 본 발명의 연골 재생용 약제학적 조성물은 주사로 이식용 세포와 함께 체내 이식 가능하며, 이식 후 쉽고 신속하게 겔화가 가능하다. 본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 이식을 위한 세포를 조성물의 고분자 용액 0.1 wt% - 10 wt% 내에 1×10⁵ - 5×10⁸세포/ml 포함할 수 있다.

본 발명의 치료제 조성물은 추가적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있고, 본 발명의 치료제 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 치료제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 치료제 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 국소 주입(local injection)이 가장 바람직한 투여방법이다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 조성물의 투여량은 바람직하게는 1회 1 × 10⁵- 5 × 10⁸ 세포/ml이고 그 양은 필요에 의해 조정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 치료제 조성물은 이식되는 세포의 기능을 충분히 발휘할 수 있도록 세포간 네트워킹을 탁월하게 형성케 하여 실제적으로 질환 동물에서 개선된 치료 효능을 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 연골재생용 약제학적 조성물은 주 연골세포 또는 연골 재생을 위한 줄기세포를 추가적으로 더 포함한다. 본 발명의 연골재생용 약제학적 조성물은 주 연골세포 또는 연골 재생을 위한 줄기세포에 대한 지지체 역할을 하며, 세포 이식의 성공률을 획기적으로 상승시켜준다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체를 포함하는 연골-손상 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 연골-손상 질환은 퇴행성 관절염(Osteoarthritis), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis), 반월상 연골 손상(Meniscus Injury), 늑연골염(Costochondritis), 다연골염(Relapsing polychondritis), 및 연골육종(Chondrosarcoma)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 연골-손상 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 상기 세포 이식(cell transplantation)용 조성물 및 연골재생용 약제학적 조성물과 관련이 있는 것으로서, 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 중복되는 내용의 기재는 생략하도록 한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 이온 가교성 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체의 제조방법을 제공한다:

(a) 제 1 반응 물질인 알긴산 또는 히알루론산과 링커를 반응시켜 알긴산 또는 히알루론산의 카르복실기에 링커를 공유 결합시키는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)의 반응 결과물에 제 2 반응 물질인 히알루론산 또는 알긴산을 반응시켜, 링커를 통하여 연결된 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체를 수득하는 단계.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (a)의 링커는 제 1 반응 물질인 알긴산 또는 히알루론산의 카복실기 전부에 결합 가능한 양으로 사용된다.

본 발명의 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체의 제조방법은 본 발명의 다른 양태인 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복되는 내용에 대한 기재는 생략하도록 한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 이온 가교성 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체를 제공한다.

(b) 본 발명은 세포 이식(cell transplantation)용 조성물을 제공한다.

(c) 본 발명은 연골재생용 약제학적 조성물을 제공한다.

(d) 본 발명은 연골-손상 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(e) 본 발명은 이온 가교성 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체의 제조방법을 제공한다.

(e) 본 발명을 이용하면, 화학적 가교제를 사용하지 않고 2가 양이온을 첨가하여 히알루론산을 손쉽게 가교시킬 수 있다.

(f) 본 발명을 이용하면, 알긴산 도입 정도에 따라 생성되는 하이드로겔의 기계적 물성 및 겔화 거동을 손쉽게 조절할 수 있다.

(g) 본 발명을 이용하면, 도입되는 2가 양이온의 양에 따라 히알루론산 개질체의 겔화 거동을 조절할 수 있다.

(h) 본 발명을 이용하면, 하이드로겔의 기계적 물성 및 겔화 거동의 조절을 통하여 약물 및 성장인자 방출 거동의 손쉬운 조절이 가능하다.

(i) 본 발명을 이용하면, 화학적 가교제를 사용하지 않아, 인간을 포함하는 동물(subject)에 주입시에도 동물의 신체에 손상을 주지 않고 주입가능한 세포 전달용 조성물, 약학적 조성물의 제공이 가능하다.

도 1은 알긴산-그래프트화 히알루론산(HGA) 및 칼슘 이온의 존재 하에서의 이의 하이드로겔 형성에 대한 이론적인 설명을 나타낸다. 히알루론산(HA)은 먼저 에틸렌디아민(NH₂-HA)으로 개질시켰다. 그 후, NH₂-HA를 카보다이이미드 캐미스트리를 통해 알긴산(AL)과 반응시켰다.
도 2a는 칼슘 이온의 존재(+) 또는 부재(-) 조건에서, 혼합 후의 히알루론산(HA) 또는 알긴산-그래프트화-히알루론산(HGA) 용액의 이미지를 나타낸다.
도 2b는 주사기 바늘을 통한 주입 후의 HGA의 이미지를 나타낸다.
도 2c는 칼슘 이온의 존재하에서의 HGA1(원) 및 HA(사각형) 용액의 저장 탄성계수(G', 채워진 표시) 및 손실 탄성계수(G", 비어있는 표시)의 변화를 나타낸다.
도 2d는 히알루론산 함량에 의존하는 저장 탄성계수의 변화를 나타낸다.
도 2e는 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔([HGA1]=2 중량%) 내의 칼슘 농도에 의존하는 저장 탄성계수 변화를 나타낸다.
도 2f는 HGA 겔의 겔화 시간을 나타낸다.
도 2g는 알긴산 분자 중량에 의존하는 HGA 겔의 저장 탄성계수([HGA1]=2 중량%, [CaSO₄]=29.7 Mm)를 나타낸다.
도 3a는 37 ℃에서 2주 동안 히알루로니다아제로 처리한 후의 히알루론산/알긴산 혼합 겔 또는 알긴산-그래프트화-히알루론산 겔 모두의 건조 중량의 변화를 나타낸다.
도 3b는 알긴산/히알루론산 혼합 겔의 횡단면 SEM 이미지를 나타낸다.
도 3c는 37 ℃에서 2주간 히알루로니다아제로 배양([폴리머]=2 중량%, 히알루론산/알긴산(mg/mg)=1, [Ca² ⁺]=29.7 mM, [히알루로니다아제]=100 μg/ml)한 후의 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔의 횡단면 SEM 이미지를 나타낸다.
도 4의 a 내지 h는 알시안 블루(a-d) 및 시리우스 레드(e-h)로 염색한 조직 섹션의 조직학적 이미지를 나타낸다. 도 4의 i 내지 p는 매트릴린-1 단백질(i-l) 및 S100 단백질(m-p)의 면역조직화학 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 조직 섹션을 프라이머리 연골세포([세포]=1.0×10⁷ 세포/ml) 및 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔의 이식 6주 후 마우스로부터 회수하였다.
도 5a는 설페이트화 GAG 형성의 정량적 분석 결과를 나타낸다(*P<0.05 및 **P<0.01).
도 5b는 SOX-9 유전자 발현 수준의 정량적 분석 결과를 나타낸다(*P<0.05 및 **P<0.01).
도 5c는 아그레칸의 유전자 발현 수준의 정량적 분석 결과를 나타낸다(*P<0.05 및 **P<0.01).
도 5d는 재생된 연골 조직내의 타입Ⅱ 콜라겐의 유전자 발현 수준의 정량적 분석 결과를 나타낸다(*P<0.05 및 **P<0.01).
도 6a는 히알루론산, 알긴산 및 알긴산-그래프트화 히알루론산의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6b는 알긴산-그래프트화 히알루론산의 정량적 그래프트 효능에 대한 DMMB 분석 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

실시예 1: 알긴산- 그래프트화 히알루론산 개질체 ( hyaluronate -g-alginate; HGA)의 제조

모든 알긴산 샘플을 세포 상호작용을 강화시키기 위해 RGD 펩타이드로 원천적으로 개질시켰다. 즉, 1 g의 소듐 알지네이트(분자량은 200000-300000; FMC Biopolymer)를 100 ml의 0.1 M 2-(N-모폴리노)에테인설폰산(MES; Sigma-Aldrich) 완충액(pH 6.5, 0.3 M의 NaCl)에 용해시켰다. 다음으로 (글라이신)₄-아르기닌-글라이신-아스파트산-세린-프롤린(G₄RGDSP; Anigen)서열을 갖는 16.7 mg의 RGD 펩타이드(Anigen)를 1-에틸-3-(다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC, Sigma Aldrich) 및 N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS, Thermo)의 존재하에서, 활발하게 용액을 교반하면서, 알긴산 용액에 첨가하였다. 그 후 실온에서 20시간 동안 반응시켰다. 변성 용액은 4일 동안 투석하였고(분자량 컷오프는 3500), 이어서 활성탄(charcoal)으로 처리했다. 멸균을 위해, 0.22 μm의 필터로 여과 한 후 용액을 동결하고 동결 건조했다.

아민 기의 도입을 위해, 히알루론산(분자량 600000-850000; Lifecore)을 에틸렌다이아민(Sigma-Aldrich)과 반응시켰다. NH₂-히알루론산의 합성은 EDC/NHS 반응을 이용하여 이미 설명한바와 같이 합성하였다. 반응 동안 히알루론산 사슬 사이의 가교 결합의 억제를 위하여, 10배 몰 비율인 과량의 에틸렌다이아민을 첨가하였다. 그리고 실온에서 20 시간 동안 반응시켰다. 상기 용액을 투석하고 활성탄으로 처리하였으며, 멸균을 위해 0.22 μm의 필터로 여과하였고, 동결 건조했다. 알긴산을 상기 기재된 절차에 따라 카보다이이미드 케미스트리를 통해 NH₂-히알루론산과 결합시켰다(참조: 도 1).

실시예 2: 핵 자기 공명 분광법

히알루론산, 알긴산 및 알긴산 그래프트화 히알루론산 개질체를 70℃에서 1H NMR 분광기(Bruker avance 500 MHz)에 의해 분석하였다. 샘플을 3 mg/ml에서 D₂O에서 용해시켰다.

실시예 3: 디메틸 메틸렌 블루 ( DMMB ) 분석

알긴산 그래프트화 히알루론산 개질체 내의 알긴산/히알루론산 함량을 정량하기 위해 DMMB 분석을 수행하였다. 즉, 16 mg의 DMMB를 25 ml의 에탄올에 용해시켰고, 필터 페이퍼로 여과하였으며, 0.17 M의 소듐 포르메이트 및 1 ml의 포름산을 포함하는 100 ml의 1 M 구아니딘 하이드로클로라이드를 여과한 DMMB와 혼합하였다. 용액을 탈이온수와 500 ml의 총 부피가 되도록 혼합하였다. 각각의 샘플을 탈이온수로 희석하고, 0.1 중량%의 용액을 얻었다. 1 ml의 DMMB 용액을 100 μl의 각 샘플에 추가하고, 30분 동안 격렬하게 혼합하였다. 복합체를 침전시키기 위해 배양한 샘플을 12000 g로 10분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하였고, 실온에서 30분간 건조시켰다. 펠릿을 1 ml의 탈복합 용액으로 용해시켰다. 10% 1-프로판올 및 4 M 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유하는 50 mM의 소듐 아세테이즈 버퍼(pH 6.8)를 가지고 탈복합 용액을 제조하였다. 혼합 30분 후, 100 μl의 각 샘플을 96-웰 플레이트로 옮겼다. 분광광도계(SpectraMax M2; Molecular Devices)를 이용하여 656 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 4: 효소 안정성 시험

알긴산 그래프트화 히알루론산 개질체(HGA1)을 PBS 내에서 용해시켰고, 1 mm 두께의 스페이서를 갖는 두 글래스 플레이트를 이용하여 칼슘 설페이트와 혼합하여 겔([폴리머]=2 중량%, [CaSO₄]=29.7 mM)을 형성시켰다. 펀치(10 mm 직경)를 이용하여 겔 디스크를 얻었고, 0에서 100 μg/ml의 농도 범위의 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 함유하는 PBS 용액 내로 투입하였고, 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 건조 중량을 측정하기 전에 겔 디스크를 냉동시키고 동결건조 시켰다. 또한 히알루론산 및 알긴산의 물리적 혼합물을 대조구([polymer]= 2 중량%, [CaSO₄]=29.7 mM)로 사용하였다. 히알루로니타아제를 처리한 후, 스캐닝 전자 현미경(S-4800 UHR FE-SEM; Hitachi)를 이용하여 겔의 횡단면 이미지를 관찰하였다.

실시예 5: 유동 측정(Rheological measurement)

콘-앤-플레이트(20 mm 직경 플레이트, 4° 콘 각도) 픽스쳐(cone-and-plate fixture)(Bohlin Gemini 150)를 갖는 회전 레오미터를 이용하여 이온 가교 알긴산 그래프트화 히알루론산 겔의 점탄성 특성을 측정하였다. 150 μm 갭 오프닝을 콘 및 플레이트의 정점에 설정하였고, 작동 온도를 37±0.1 ℃로 일정하게 설정했다.

알긴산 그래프트화 히알루론산 개질체를 PBS에 용해하였다. 2중량%의 폴리머 용액은 폴리머 용액의 알긴산 함량에 의존하는 양(알긴산 1g 당 0.42g의 CaSO₄가 혼합될 수 있는 양)의 CaSO₄ 슬러리와 혼합했다. 이온 가교 된 하이드로겔의 기계적 특성은 회전 레오미터(Bohlin Gemini 150)를 이용하여 측정 하였다. 0.5 Hz로 측정하였고, 온도를 37±0.1 ℃로 일정하게 유지했다.

실시예 6: 세포 분리 및 배양

프라이머리 연골 세포를 뉴질랜드 흰 토끼(4 주령, Samtako)의 관절 연골에서 분리하였다. 토끼를 희생시키고 뒷다리의 무릎 관절에서 연골 조직 조각을 얻었다. 차가운 PBS에서 상기 조각을 세척 한 후, 그들을 잘게 갈고, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F-12 배지에서 4.5 mg/ml의 콜라게나제 타입Ⅱ(Worthington)로 6시간 동안 소화시켰다. 소화되지 않은 조직 파편을 제거하기 위해, 콜라게나제 타입Ⅱ 처리한 세포 현탁액을 셀 스트레이너(40 μm; SPL Life Science)를 통과시켰다. 원심 분리기를 사용하여 세포를 회수 한 후, PBS로 2회 세척하고, 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F-12 배지에 현탁하였다. 분리 된 세포는 표준 배양법에 의해 배양하였고, 계대수(passage number) 2 이하의 세포를 in vivo 이식을 위해 사용하였다.

실시예 7: in vivo 연골 조직 재생

모든 동물 시험은 실험 동물의 관리와 이용을 위한 한양 대학교 가이드라인에 따라 수행하였고, 한양대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Commitee)(HY-IACUC-12-060A)에 의해 승인되었다. BALB/c 누드 마우스(6 주령, Nara Biotech)를 졸레틸(Zoletil, Virbac)/롬펀(Rompun, Bayer) 9:1 용액으로 복강 내 주사하여 마취하였다. 칼슘 설페이트 슬러리를 혼합하기 전에([폴리머]=2 중량%), 프라이머리 연골 세포(1.0×10⁷세포/ml)를 RGD-알지네이트 용액(AL) 또는 RGD-알지네이트-그래프트화 히알루론산 용액(HGA1, HGA2 또는 HGA4)모두와 혼합하였다. 100 μl의 각각의 세포-폴리머 혼합물을 마우스(그룹당 6마리)의 등 부위로 피하 주입하였다. 이식 6주 후, 마우스를 희생시켰고, 재생된 조직을 회수하였다.

실시예 8: 조직학적 및 면역조직화학적 분석

회수한 조직 샘플을 차가운 PBS로 세척하였고, 부피를 측정하였다. 샘플을 4% 포름알데히드 용액으로 옮겨 하루 동안(overnight) 고정한 후, 일련의 증가하는 에탄올 용액에 침지하여 탈수시켰다. 크실렌 및 파라핀에 침지 후, 샘플을 파라핀에 고정했다. 표본(specimen)은 마이크로톰(RM2145, Leica)을 이용하여 5 μm 두께로 횡절단 했다. 조직 섹션을 알시안 블루(Alcian blue) 및 시리우스 레드로 염색하였다. 매트릴린-1 단백질 발현의 가시화를 위해 샘플들을 HRP-컨쥬게이션된 항-매트릴린-1 프라이머리 항체(1/100 희석; Bioss)로 처리하였고, 디아미노벤자이딘 퍼옥시다아제 기질 키트(Vector)로 가시화하였다. 광학 현미경(Axioskop 40; Carl Zeiss)을 이용하여 이미지를 얻었다. 조직 섹션을 4 ℃의 습식 상자(humid box)에서 S100 단백질 발현을 가시화하기 위해 항-S100 프라이머리 항체(1/25 희석; Abcam) 및 FITC-컨쥬게이션된 2차 항체(1/100 희석; Jackson)로 처리하였다. 염색된 슬라이드 글라스를 DAPI(Vector Laboratories)를 갖는 VECTASHIELD^® 마운팅 배지로 마운팅하였다. 형광 현미경(ECLIPSE TE2000-E; NIKON)에 의해 형광 이미지를 얻었다.

실시예 9: 설페이트화 글리코사미노글리칸(GAG)의 정량

재생된 조직에서 GAG 함량을 측정하기 위해, Blyscan^TM sGAG 분석 키트(Biocolor)을 사용하였다. 즉, 회수한 조직을 동결 건조하여 무게를 측정하였다. 조직 조각은 70 Mm EDTA 용액에 투입하였고, 하이드로겔 내의 알긴산으로부터의 GAG 검출의 가능성을 배재하고자 조직으로부터 알긴산을 제거하기 위해 37 ℃ 환경에서 30분간 배양했다. 원심 분리 후, 각 샘플의 상등액을 제거하였다. GAG를 추출하기 위해, 1 M NaCl, 5 mM 시스테인 HCl, 및 1 mM EDTA를 함유하는 50 mM 인산 버퍼(pH 6.5)에 용해시킨 500 μl의 파파인 추출 용액(10 μl/ml)을 각 샘플에 첨가하고, 60 ℃에서 밤새 배양하였다. 다음으로 1, 9-디메틸메틸렌 블루 시약(1 ml)을 첨가하였고, 샘플을 30분 동안 부드럽게 교반해주면서 반응시켰다. 10분간 10000 rpm으로 원심분리한 후, 부착되지 않은 염료(dye)의 제거를 위해 상청액을 탈수시키고, 펠릿을 건조시켰다. 해리 시약을 샘플의 펠렛에 첨가하였고, 그들을 격렬하게 혼합하였다. 샘플 및 콘드로이틴 4-설페이트 기준시료를 646 nm에서 분광광도계(SpectraMax M2, Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다.

실시예 10: 유전자 발현

RNA 분리 킷인 RNA iso plus(Takara)를 이용하여, 총 RNA를 회수된 조직으로부터 분리하였다. 분리한 RNA는 reverse transcription master mix(ELPIS Biotech)를 이용하여, cDNA로 역전사 하였다. 연골형성(chondrogenic) 마커 유전자(SOX-9, 아그레칸 및 type Ⅱ 콜라겐) 및 하우스키핑 유전자(GAPDH)는 SYBR^®Premix Ex Taq^TM을 이용하는 ABI Prism 7500 real-time PCR 시스템(Applied Biosystems)에 의해 검출하였다. 프라이머(IDT) 서열은 다음과 같다: SOX-9, , 5'-CTTCATGAAGATGACCGACGAG-3', 5'-CTCTTCGCTCTCCTTCTTGAGG-3'; 아그레칸, 5'-GTGAAAGGTGTTGTGTTCCACT-3', 5'-TGGGGTACCTGACAGTCTGAT-3'; type II 콜라겐, 5'-AAGAGCGGTGACTACTGGATAG-3', 5'-TGCTGTCTCCATAGCTGAAGT-3'; GAPDH, 5'-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3', 5'-CTTCACAAAGTGGTCATTGAGG-3'.

실시예 11: 통계 분석

모든 데이터는 평균±표준편차(n = 6)로 제시된다. 통계 분석은 Student's t-검정을 이용하여 수행하였다. ^*P-값<0.05 및 ^**P<0.01는 통계학적으로 의미 있는 것으로 간주하였다.

실험결과

1. 알긴산- 그래프트화 히알루론산의 특성화

알긴산-그래프트화 히알루론산(HGA)을 디자인하였고, 이온 가교성 히알루론산의 제조로 합성하였다. 즉 처음으로 히알루론산(HA)을 에틸렌디아민(NH₂-HA)으로 개질시켰고, 카보다이이미드에 의해 알긴산으로 컨쥬게이션시켰다(HA-g-AL)(참조: 도 1). 다양한 알긴산-그래프트화 히알루론산 샘플을 합성하였다. 알긴산에 대한 히알루론산의 중량비를 1, 2 및 4(이하 각각 HGA1, HGA2, 및 HGA4라 지칭함). 얻어진 HGA 겔의 세포 상호작용을 강화시키기 위해 RGD 펩타이드를 알긴산과 결합시켰다.

알긴산-그래프트화 히알루론산(HGA)을 ¹H-NMR 분광기(참조: 도 6a)에 의해 확인하였다. 4.2-4.4의 δ피크 영역이 에틸렌디아민으로 개질 후 증가하였으며, 이는 히알루론산(NH₂-HA)에 대한 에틸렌디아민의 성공적인 도입을 나타낸다. 알긴산의 NH₂-히알루론산 개질 후, 알긴산 및 히알루론산의 구체적인 피크는 δ=4.2-4.7 및 δ=2.5-2.6(NCOCH₃)에서의 스펙트럼 상에서 각각 볼 수 있다. HA-g-AL의 그래프트 효율을 스펙트럼으로부터의 폴리머 함량을 계산함으로써 측정하였다(HGA1-93.7%, HGA2=82.6%, HGA4=94.7%). 또한, 그래프트 효율을 다이메틸메틸렌블루(DMMB) 분석으로 측정하였다(참조: 도 6b). 히알루론산은 DMMB 염료에 부착되지 않았다; 그러므로 상기 분석으로부터 HA-g-AL의 알긴산의 함량만을 측정하였다(HGA1=90.4±4.9%, HGA2=86.0±7.9%, HGA4=83.6±9.0%). 상기 발견 된 결과가 ¹H-NMR 스펙트럼으로부터 수득 된 것과 상당히 일치하였다.

2. 알긴산- 그래프트화 히알루론산의 하이드로겔 형성

히알루론산 용액을 칼슘 이온과 혼합한 경우([히알루론산]=2 중량%, [CaSO₄]=30 mM) 하이드로겔이 형성되지 않았다. 대조적으로 칼슘 이온의 존재하에서, 알긴산-그래프트화 히알루론산은 겔을 형성할 수 있었다([HGA1]=2 중량%, [CaSO₄]=30 mM)(참조: 도 2a). 히알루론산-기반의 하이드로겔에서의 대부분의 독성-관련 이슈들은 중합체와 연관된 이슈들로부터 발생하기 보다는 화학적 가교제의 이용으로부터 유발된다[37, 38]. 체내 이식 후 화학적 가교 시약에 의해 발생되는 전형적인 히알루론산 겔에서의 독성-관련 이슈들은 이온 가교성 히알루론산-기반 하이드로겔의 사용에 의해 극복될 수 있다. 이온 가교 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔은 23-G 바늘을 갖는 실린더를 통해 주입될 수 있다(참조: 도 2b). 이는 신체에 대한 약물 및/또는 세포의 최소 침습 전달을 가능케 한다는 관점에서 또한 매력적이다.

3. 알긴산- 그래프트화 히알루론산 겔의 특성화

알긴산-그래프트화 히알루론산 겔의 점탄성 및 겔화 거동을 회전식 레오미터를 이용하여 조사하였다(참조: 도 2c 내지 2g). HGA1 용액을 칼슘 이온과 혼합할 때, 다양한 주파수에서 저장 탄성률(G')은 손실 탄성률(G")보다 더욱 높았고(참조: 도 2c), 이는 혼합물이 이온 가교를 통해 하이드로겔 구조를 구축한다는 것을 나타낸다. 대조적으로 히알루론산 용액은 칼슘 첨가에 대하여 하이드로겔을 형성하지 않는다. 다음으로 이온 가교 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔의 기계적 특성에 대한 알긴산 함량의 효과를 조사하였다(참조: 도 2d). 시험한 모든 샘플에 대한 일정한(constant) 폴리머 및 칼슘 농도 상에서 하이드로겔을 제조하였다([폴리머]=2 중량%, [CaSO₄]=30 mM). 히알루론산 및 알긴산 사이의 중량 비율은 다양했다. 알긴산에 대한 히알루론산의 중량비율이 1로부터 4로 증가함에 따라 겔의 기계적 특성은 2.5±0.2 kPa로부터 0.075±0.001 kPa까지 크게 변경되었다. 그리고 나서 이온 가교 하이드로겔의 탄성의 변화가 칼슘 농도에 따라 어떻게 변화하는지 조사하였다(참조: 도 2e). 칼슘 설페이트 농도가 7.4 mM에서 30 mM까지 증가함에따라, 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔의 G' 값은 0.3±0.1 kPa에서 2.7±0.6 kPa까지 증가하였다. 그러나 칼슘 설페이트 농도가 60 mM까지 증가할 때, 더 이상의 증가는 관찰할 수 없었다. 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔의 겔화 시간은 겔에서의 알긴산 함량에 의해 중요한 영향을 받지 않았다(참조: 도 2f). 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔의 전단 탄성계수는 알긴산 분자량에 의존한다(참조: 도 2g). 알긴산 분자량이 50000 g/mol에서 250000 g/mol까지 증가함에따라, 이온 가교 겔의 G' 또한 0.04±0.003에서 2.4±0.2 kPa까지 증가하였다. 50000 g/mol 또는 100000 g/mol의 알긴산으로 제조한 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔은 불량한 기계적 특성을 보였고, 심지어 칼슘 이온의 존재하에서도 그러했다. 세포 거동(예를 들어, 접착, 증식 및 이동)과 관련한 폴리머 스캐폴드의 기계적 특성들을 조절하는 것은 매우 중요하다[39-41]. 게다가 기계적 특성들은 또한 조직 재생에 즉각적인 영향을 갖는 줄기세포 분화의 조절에 중요하다[41-44]. 조직 공학에서의 사용에 매우 매력적일 수 있는 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔의 기계적 특성은 중합체 조성 및 칼슘 이온 농도의 조절을 통해 쉽게 조절가능하다.

4. 알긴산- 그래프트화 히알루론산 겔의 효소 안정성

알긴산-그래프트화 히알루론산 겔을 in vitro 효소 반응에 대한 안정성을 시험하기 위해 히알루로니다아제로 처리하였다. 2주 배양 시간 상에 겔 중량의 약간의 감소가 관찰되었다. 겔 중량은 효소 농도에 의존하였다(참조: 도 3a). 하이드로겔은 효소가 없는 대조군 조건과 비교하여 2주 동안 100 μg/ml 히알루로니다아제로 처리한 후의 대략 80%의 그들의 초기 중량을 유지하였다. 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔은 효소 처리한 후 양호하게 팩킹된 다공성 구조를 유지하였다(참조: 도 3c). 대조적으로 히알루론산 및 알긴산의 단순 혼합물로부터 제조된 겔은 배양 동안 심지어 1 μg/ml의 히알루로니다아제의 존재하에서 겔 중량의 상당한 감소를 나타내었다. 히알루로니다아제 함량과 관련없이, 대략 40%의 중량 감소를 관찰하였다. 상기 중량 감소는 겔 상의 히알루론산 함량에 기반한 예상과 유사하다. 히알루로니다아제로 처리한 후의 히알루론산/알긴산 혼합 겔 횡단면 이미지는 효소 분해의 의해 상당한 겔 손실을 보였다(참조: 도 3b). 히알루론산은 히알루로니아다제의 작용에 의해 작은 올리고사카라이드 절편으로 절단되었다[45, 46]. 그러나 히알루론산은 in vitro의 내재성 히알루로니다아제(endogeneous hyaluronidase)에 의한 가교 또는 화학적 변형의 부재 하에서 빠르게 분해되었다[47]. 전달된 세포로부터의 새로운 ECM 발달 동안, 겔이 3-D 구조적 환경을 제공하고 스캐폴드로서의 그들의 완전성을 유지해야하기 때문에, 빠른 겔 분해는 많은 타입의 조직의 재생에 불리할 수 있다. 칼슘 이온을 첨가했을 때, 오직 혼합물 내의 알긴산 만이 겔 형성에 참여하기 때문에, 히알루론산/알긴산 혼합된 하이드로겔은 완전한 상호 관통 폴리머 네트워크 구조들을 형성하지 않는다. 혼합된 겔 내의 히알루론산은 히알루로니다아제의 작용에 의해 대부분 전체적으로 분해되었다(참조: 도 3). 반면에 알긴산-그래프트화 히알루론산 내의 히알루론산의 분해는, 히알루로니다아제에 의한 느린 겔 분해를 이끄는 알긴산 체인의 공유결합성 컨쥬게이션에 의해 제한되었다. 이는 상기의 겔들이 in vivo 적용에 혼합 겔보다 더욱 적절하도록 만들 수 있다.

5. 알긴산- 그래프트화 히알루론산을 이용한 In vivo 연골 재생

in vivo 연골 재생에서의 겔의 효능을 입증하기 위해, 프라이머리 연골세포를 갖는 이온 가교성 히알루론산 하이드로겔을 마우스의 등 부위로 주입하였다. 먼저 RGD 펩타이드를 in vivo 시험한 모든 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔에 도입하였다. 또한 RGD-알긴산(AL)을 대조구로 사용하였다. 이식 6주 후, 각 그룹에 대한 조직 부피는 최초 주입 부피와 비교하여 유의하게 변화하지 않았다. 이는 겔이 조직 형성 동안 그들의 3-D 체적 구조를 유지할 수 있다는 것을 나타낸다. 연골 재생에서의 새로운 ECM 형성을 입증하는 프로테오글리칸 및 콜라겐을 가시화하기 위해, 조직 섹션을 각각 알시안 블루(참조: 도 4a 내지 4d) 및 시리우스 레드(참조: 도 4e 내지 4h)로 염색하였다. ECM 형성은 생존 및 기능적 활성의 유지와 관련하여 이식된 세포를 위해 필수적이다. HGA2 및 HGA4 겔의 사용에 대하여 골소강(lacunae) 구조의 균일 분포를 조직 섹션에서 관찰하였다. 반면에 골소강 구조의 희박한 분포가 AL- 및 HGA1-처리 그룹에서 관찰되었다. 흥미롭게도 ECM 형성 및 연골 골소강 발달은 다른 그룹들에 비하여 HGA2 그룹에서 더욱 풍부하였다(참조: 도 4c 및 4g). HGA2 겔과 비교하여 더 빈약한 HGA4 겔의 기계적 성질로 인하여, HGA4 겔은 HGA2 그룹보다 덜 효과적이었다(참조: 도 2d). AL 및 HGA1 겔은 in vivo 연골 재생에 대해 적절하지 않았다.

매트릴린-1(Matrillin-1)(참조: 도 4i 내지 4l) 및 S100 단백질(참조: 도 4m 내지 4p)을 재생된 조직 섹션의 면역조직화학 분석을 위한 항체로 가시화하였다. 매트릴린-1은 연골 조직에서의 ECM 구축과 연관된 연결타입Ⅵ 콜라겐 마이크로피브릴 및 타입Ⅱ 콜라겐 피브릴에서 중요한 역할을 수행한다[48]. 콜라겐 매트릭스의 구축의 증거가되는 현저한 매트릴린-1 신호가 다른 그룹들과 비교하여 HGA2 겔에서 관찰되었다(참조: 도 4k). AL 및 HGA1 겔은 단백질 생성을 충분히 유도하지 않았는데(참조: 도 4i 및 4j), 조직학적 분석으로부터 얻은 결과와 일치한하였다. S100 단백질은 연골세포, 지방세포, 슈반세포 및 신경세포에서 발현되는 세포 내부 칼슘 결합 단백질이다[49]. S100 단백질은 연골생성 과정 동안 초기단계에서 발현되고, 발현은 하이퍼트로피에 의한 것과 같은 연골 세포에서의 표현형 변화에 의한 접합에서 점점 약화된다[50-52]. 양성 S100 형광 신호를 HGA2 및 HGA4 그룹에서 관찰하였고(참조: 도4o 및 4p), 이는 이식된 세포가 알긴산-그래프트화 히알루론산 겔 주입시 그들의 in vivo 연골원성 표현형을 유지하는 것을 나타낸다.

6. GAG 형성 및 유전자 발현의 정량적 분석

설페이트화 글리코사미노글리칸(GAG) 함량을 측정하고 건조 조직 중량에 의해 정규화하였다(참조: 도 5a). GAG는 드물게 1HA(3.2±1.1 μg/ml) 및 AL(4.6μ1.3 μg/ml) 그룹을 형성하였다. HGA2 겔이 사용되는 경우(52.5±7.7 μg/ml)에 다른 그룹들과 비교하여 현저히 더 많은 GAG를 분비하였다. 다음으로 전형적인 연골원 마커의 유전자 발현을 조사하였다(참조: 도 5b 내지 5d). 유전자 발현은 단백질 생산, 형태 형성, 세포 분화 및 표현형질을 조절하는 세포 기능을 알게한다. 연골원 및 ECM 형성 절차는 SOX-9, 아그레칸, 및 타입Ⅱ 콜라겐과 같은 연골원 마커 유전자의 발현과 관련되어 기술될 수 있다. SOX-9은 연골형성의 초기 발달에서 발현되고, 연골 세포 분화 및 기능에 필수적이다[53, 54]. 아그레칸 및 타입Ⅱ 콜라겐은 연골조직의 중요한 ECM 성분이다[55]. 최근의 연구에서 AL에 대한 연골원 마커 유전자의 발현이 거의 관찰되지 않았고, 히알루론산에 의한 강화된 유전자 발현이 관찰되었다. SOX-9, 아그레칸 및 타입Ⅱ 콜라겐의 두드러진 발현이 HGA2 내의 프라이머리 연골세포의 이식 상에 발견되었다. SOX-9, 아그레칸 및 타입Ⅱ 콜라겐의 상대적인 발현 수준은 AL 그룹에 비하여 7.1±1.1, 8.0±1.6 및 31.8±2.5배 더 높았다. HGA4 겔이 HGA2보다 더 많은 히알루론산을 함유하는 반면에, 겔은 in vivo에서 연골원 유전자 발현을 강화시키지 않았다. 특히, 타입Ⅱ 콜라겐 발현 수준은 HGA4 그룹에서 HGA2 그룹에서 보다 더 낮았다. 이러한 결과는 조직학적 및 면역조직화학적 분석으로부터 얻어진 결과와 일치하였다. 본 발명에 있어서, 알긴산-그래프트화 히알루론산은 칼슘 이온의 존재하에서 가교 구조를 형성하고, in vivo 연골 재생에 관한 훌륭한 가능성을 보여주었다. 이전 연구들에서 본 발명자들은 RGD-개질된 알긴산 하이드로겔이 in vivo에서 성공적으로 연골 조직을 재생할 수 있다는 것을 보고하였다[56, 57]. 그러나 성공적인 연골 조직 재생을 위해 대략 5×10⁷ 세포/ml가 필요하다. 본 발명은 알긴산-그래프트화 히알루론산이 세포 농도를 감소시킬 수 있다는 것을 말해준다([세포]=1×10⁷ 세포/ml). 또한 알긴산-그래프트화 히알루론산 내의 히알루론산의 비율이 연골 재생에 있어서의 중요한 파라미터라는 결과를 도출하였다. 겔 강성은 히알루론산의 첨가로 약화되기 때문에(HGA2는 860±70 pa, HGA4는 74.6±0.1 pa)(참조: 도 3d), 히알루론산 및 알긴산 사이의 이상적인 중량 비율은 2(HGA2)라는 결과를 도출하였다. 그러므로 성공적인 in vivo 연골 공학의 달성의 희망을 갖고, 폴리머 함량과 기계적 강성 사이의 조화는 신중하게 고려해야 한다. 알긴산-그래프트화 히알루론산은 이러한 접근의 유망한 후보물질이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

알긴산 및 히알루론산을 포함하고,
상기 히알루론산 사슬에 알긴산이 공유결합된 구조체이며, 상기 공유결합은 알긴산의 카복실기 및 히알루론산의 카복실기가 공유결합 형성이 가능한 링커를 통하여 형성되고,
상기 알긴산 및 히알루론산 중 적어도 하나는 세포부착 펩타이드가 결합되며, 상기 히알루론산 사슬 간에는 서로 결합되지 않고, 상기 알긴산 사슬 간에는 서로 결합되지 않은,
하이드로겔 형성 이전의 이온 가교성 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체.
제1항에 있어서,
상기 알긴산은 분자량이 10000-1000000 g/몰이고, 상기 히알루론산은 분자량이 10000-1000000 g/몰인 것을 특징으로 하는 개질체.
제1항에 있어서,
상기 알긴산과 히알루론산은 중량비가 10:1 내지 1:10인 것을 특징으로 하는 개질체.
제1항에 있어서,
상기 링커는 다이아민, 다이비닐설폰, 1,4-뷰테인다이올, 다이글리시딜 에테르(BDDE) 및 글루타르알데히드, 카보다이이미드, 하이드록시석신이미드, 이미도에스터, 말레이미드, 할로아세틸, 다이설파이드, 하이드로아자이드, 알콕시아민으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 개질체.
제1항에 있어서,
상기 세포부착 펩타이드는 RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), LDV(Leu-Asp-Val), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val),EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr) 및 LDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 개질체.
제1항에 따른 개질체를 포함하는 세포 이식(cell transplantation)용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 세포는 연골세포(chondrocytes), 근아세포(myoblasts), 간세포(hepatocytes), 골아세포(osteoblasts), 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 성체줄기세포(adult stem cells), 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 혈관내피줄기세포, 조혈모세포, 간줄기세포, 심장줄기세포, 췌장줄기세포, 내피전구세포(endothelial progenitors), 성장내피세포(outgrowth endothelial cells), 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells), 조혈줄기세포(hematopoietic stem cells), 인간신경줄기세포(neural stem cells), 위성세포(satellite cells), 장 상피세포, 평활근세포 및 섬유아세포로 구성된 군으로부터 선택된 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항의 개질체를 포함하는 연골재생용 약제학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 주 연골세포 또는 연골 재생을 위한 줄기세포를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항의 개질체를 포함하는 연골-손상 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 연골-손상 질환은 퇴행성 관절염(Osteoarthritis), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis), 반월상 연골 손상(Meniscus Injury), 늑연골염(Costochondritis), 다연골염(Relapsing polychondritis) 및 연골육종(Chondrosarcoma)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 세포 부착 펩타이드를 이용하여 알긴산을 개질하는 단계;
(b) 히알루론산의 카복실기에 링커를 결합하여 아민기가 결합된 히알루론산을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 아민기가 결합된 히알루론산과 상기 세포 부착 펩타이드로 개질된 알긴산을 반응시켜 상기 히알루론산 사슬에 상기 알긴산을 공유결합시키는 단계;를 포함하고,
상기 (b) 단계는 상기 링커를 상기 히알루론산의 카복실기 전부에 결합 가능한 양으로 사용하여 히알루론산 사슬 간의 결합을 방지하는,
제1항의 하이드로겔 형성 가교 이전의 이온 가교성 알긴산-그래프트화 히알루론산 개질체의 제조방법.