KR102025546B1 - 히알루론산-칼슘 복합체 및 알지네이트를 포함하는 약물 전달체 - Google Patents

히알루론산-칼슘 복합체 및 알지네이트를 포함하는 약물 전달체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루론산-칼슘 복합체 화합물 및 알지네이트 염 화합물을 포함하는 약물 전달체를 제공하며, 상기 약물 전달체는 외부의 Ca 이온 소스를 필요로 하지 않아 주사 가능하고, 면역 억제제를 국소적으로 및 일정하게 전달할 수 있다.

Description

히알루론산-칼슘 복합체 및 알지네이트를 포함하는 약물 전달체{Drug carrier comprising hyaluronate-calcium complex and alginate}
본 발명은 히알루론산-칼슘 복합체 화합물 및 알지네이트 염 화합물을 포함하는 약물 전달체에 관한 것이다.
사이클로스포린 A(CsA)는 장기 이식에서의 거부 반응을 방지하고 류마티스 관절염, 건선 및 크론병과 같은 T 세포의 과잉 반응와 관련된 질환을 치료하는 것에 널리 사용되는 잠재력 있는 면역 억제제이다. CsA는 T 세포의 중요한 활성자인 인터루킨 2(IL-2)의 생성을 감소시켜 이러한 세포의 활성을 막는 것으로 알려져 있다. 반복되는 CsA의 정맥 또는 구강 투여는 종종 감염 위험의 증가 또는 림프종, 경련, 소화성 궤양, 췌장염, 발열, 구토, 설사, 혼란, 고 콜레스테롤 혈증, 호흡 곤란, 가려움증, 고혈압, 신장 및 간의 기능 장애와 같은 많은 부작용을 야기한다. 게다가, 이의 큰 분자량 및 소수성으로 인한 CsA의 낮은 수용성은 생물학적 이용 가능성을 최대로 할 수 있는 약물 전달 방법의 개발을 촉진시켰다. CsA의 국소적 및 지속적인 방출은 이러한 문제를 해결하기 위한 효과적인 방안이 될 수 있다.
주사 가능하며, 그 자리에서(in situ) 형성되는 하이드로겔은 최근 재생 약물 영역에서 연구되고 있다. 주사 가능한 하이드로겔은 불규칙한 형상의 파인 영역을 완벽하게 채울 수 있으며, 3차원의 고-수화된 스캐폴드를 형성할 수 있다는 점 이외에도 쉽게 조절이 가능하며 최소한의 침투적 외과적 과정을 필요로 한다는 점에서 장점을 가진다. 게다가, 이러한 생체 재료는 약물, 생분자 및 심지어 세포와 같은 치료제를 수술 이식과 관련한 위험 없이 비-침투적 및 국소적으로 전달할 수 있다. 특히, 알지네이트, 히알루론산, 콜라겐, 키토산 및 피브린과 같은 자연적 고분자로부터 유래된 주사 가능한 하이드로겔이 최근 빈번하게 사용되고 있으며, 국소적인 치료제의 전달을 포함한 생체의학적 작용을 위한 잠재력을 보이고 있다.
히알루론산(HA-H)은 결합 조직, 상피 조직 및 신경 조직에 널리 분포된 글리코스아미노글리칸으로, 이의 뛰어난 물리적 및 생화학적 특성으로 인해 조직 재생 등의 다양한 생체 재료 분야에서 널리 사용되고 있다. 히알루론산은 미용 분야에서 널리 사용되는 재료이며, 성형 수술에서 피부 필러로 사용되며, 피부 밑에 주사될 수 있다. 주사 가능한 변형된 히알루론산 기반의 하이드로겔은 조직 공학 및 재생 의학 분야에서 생체 재료로 사용될 수 있으나, 대개의 경우 화학적으로 변형되어 갖게 된 좋지 않은 생체분해성으로 인해 그 적용이 제한적이다.
KR 10-1240133 B1 KR 10-2017-0142127 A
주사 가능한 하이드로겔 형태의 약물 전달체는 신체 내에 불규칙한 형태의 손상 영역을 완전히 채울 수 있고, 3차원의 고도로 수화된 스캐폴드를 형성할 수 있을 뿐만 아니라, 취급이 용이하며 최소한의 침습적 외과 수술 절차를 거친다는 점 등의 여러 이점을 갖는다.
이에 본 발명의 목적은 생분해성을 가지며 주사가 가능한 하이드로겔 형태의 약물 전달체 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자 연구한 결과, 본 발명의 발명자는 생분해성을 가지며, 주사가 가능한 하이드로겔 형태의 약물 전달체를 개발하여 본 발명을 완성하였으며, 본 발명의 과제 해결 수단은 다음과 같다.
1. 히알루론산-칼슘 복합체 화합물 및 알지네이트 염 화합물을 포함하는 약물 전달체.
2. 히알루론산-칼슘 복합체 화합물 수용액 및 알지네이트 염 화합물 수용액을 혼합하는 단계; 를 포함하는 1의 제조 방법.
본 발명의 약물 전달체는 주사 가능하며, 생분해성을 가진다. 또한, 약물을 국소 및 지속적으로 전달할 수 있으며, 외부에서 Ca 소스를 추가로 사용하지 않아도 되어 소량의 Ca 만으로 겔화가 진행될 수 있고, 이에 따라 겔화에 걸리는 시간을 조절할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 약물 전달체가 피부로 주사되어 면역 억제 약물(사이클로스포린 A)를 전달하는 과정을 간략화한 도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 본 발명의 약물 전달체를 제조하는 과정을 간략화한 도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 두 용액을 섞은 이후 겔화가 진행되는 것을 나타내는 사진이다.
도 4A는 HA-H 및 HA-Ca의 FT-IR 스펙트럼, 도 4B는 HA-H 및 HA-Ca의 열 중량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 HA-H 및 HA-Ca의 1H NMR을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 HA-Ca-Alg의 SEM 이미지를 나타낸 도이다(A-HA-Ca-Alg70, B-HA-Ca-Alg60, C-HA-Ca-Alg50, D-HA-Ca-Alg40).
도 7은 HA-Ca-Alg 샘플들의 시간에 따른 점도 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 HA-Ca-Alg50의 시간에 따른 가수 분해 정도를 나타낸 도이다.
도 9는 CsA를 봉입한 HA-Ca-Alg50 하이드로겔로부터 방출되는 CsA의 양(A), 상대적 비율(B) 및 봉입한 CsA의 양에 따른 하루 방출량(C-400μg, D-200μg, E-100μg)을 나타낸 도이다.
도 10은 PBS에 CsA를 녹인 용액(A) 및 CsA를 봉입한 하이드로겔(B)이 T 세포 증식에 미치는 영향을 시간에 따라 나타낸 도이다.
도 11은 PBS에 CsA를 녹인 용액(A) 및 CsA를 봉입한 하이드로겔(B)이 IL-2 생성량에 미치는 영향을 시간에 따라 나타낸 도이다.
본 발명은 히알루론산-칼슘 복합체 화합물 및 알지네이트 염 화합물을 포함하는 약물 전달체를 제공한다.
상기 약물 전달체는 히알루론산-칼슘 복합체 화합물 및 알지네이트 염 화합물의 자가조립(self-assembly)에 의해 형성되며, 이에 따라 외부로부터의 추가적인 칼슘 이온 제공이 불필요하며, 추가적인 칼슘 이온 제공 없이 겔화를 조절할 수 있다.
상기 히알루론산-칼슘 복합체의 칼슘 함량은 단량체 1몰 당 0.7 내지 0.85몰이 바람직하다. 이보다 칼슘 함량이 적을 경우 외부 칼슘 이온 소스가 필요하다는 단점이 있다.
상기 약물 전달체가 전달할 수 있는 약물은 다양할 수 있으며, 주사제로 전달할 수 있는 약물은 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 약물 전달체는 면역 억제제, 항암제 및 항생제를 전달하기에 적합하다.
상기 면역 억제제는 장기이식의 거부반응 예방이나 자기면역질환에 사용되는 물질로, 면역 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있는 모든 물질을 포함한다. 상기 면역 억제제의 예로는 프레드니손, 아자티오푸린, 마이코페놀레이트 모페틸 (RS61443), 사이클로스포린, 타크롤리무스 (FK506), 라파마이신 등이 있다.
상기 항암제는 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 항암활성을 나타내는 약제를 통칭하며, 항암 효과를 나타낼 수 있는 모든 물질을 포함한다. 상기 항암제의 예로는 독소루비신, 파클리탁셀 등이 있다.
상기 항생제는 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질을 통칭하며, 항생 효과를 나타낼 수 있는 모든 물질을 포함한다. 상기 항생제의 예로는 페니실린 계열 항생제, 아미노글리코사이드 계열 항생제, 테트라사이클린 계열 항생제, 퀴놀론 계열 항생제 등이 있으며, 상기 페니실린 계열 항생제의 예로는 암피실린, 아목시실린, 페니실린, 옥사실린, 테모실린 등이 있고, 상기 아미노글리코사이드 계열 항생제의 예로는 카나마이신, 겐타마이신, 네오마이신, 토브라마이신, 아미카신, 아베카신 등이 있으며, 상기 테트라사이클린 계열 항생제의 예로는 데메클로사이클린, 테트라사이클린, 독시사이클린, 옥시테트라사이클린 등이 있고, 상기 퀴놀론 계열 항생제의 예로는 에노사신, 가티플로사신, 레보플로사신, 로메플로사신, 오플로사신 등이 있다.
상기 약물 전달체가 면역 억제제 중 사이클로스포린 A를 전달할 경우, 도 1과 같이 피부에 주사하여 면역 반응을 억제할 수 있다.
상기 약물 전달체는 하이드로겔 형태일 수 있다. 본 발명에서 하이드로겔은 물을 용매로 하는 겔을 지칭하며 그물 조직 사이에 물이 위치하는 형태로 존재한다. 겔은 콜로이드 용액이 일정 농도 이상으로 진해져서 그물조직이 형성된 것을 지칭한다.
상기 약물 전달체는 히알루론산-칼슘 복합체를 포함함으로써, 내부에 이미 칼슘 이온이 포함되어 있으므로 알지네이트 용액과 혼합시 추가적인 칼슘 이온의 제공 없이 겔화가 이루어지는데 걸리는 시간을 조절할 수 있고, 이로 인해 주사용으로 사용되기에 적합하다.
본 발명의 약물 전달체에 있어서, 히알루론산-칼슘 복합체와 알지네이트의 질량비는 7:3 내지 4:6일 수 있다.
본 발명은 히알루론산-칼슘 복합체 수용액과 알지네이트-나트륨 수용액을 혼합하는 단계; 를 포함하는 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 약물 전달체는 히알루론산-칼슘 복합체 수용액과 알지네이트-나트륨 수용액을 혼합하여 제조할 수 있으며, 상기 히알루론산-칼슘 복합체 화합물은 히알루론산과 염기성 칼슘염을 반응시켜 제조할 수 있다. 예컨대, 히알루론산과 Ca(OAc)2를 반응시켜 제조할 수 있다. 상기 히알루론산과 Ca(OAc)2의 반응은 산-염기 반응과 이온교환 반응을 포함하며, 그 결과 히알루론산-칼슘 복합체와 부산물로 AcOH가 형성된다.
상기 염기성 칼슘염으로는 Ca(OAc)2 이외에도 Ca(OH)2, CaCO3 또는 Ca(HCO3)2 등이 사용될 수 있다.
상기 약물 전달체의 제조방법에 있어서, 상기 히알루론산-칼슘 복합체 수용액과 알지네이트-나트륨 수용액의 혼합 비율은 7:3 내지 4:6일 수 있다.
실시예
이하에서 본 발명의 이해를 돕기 위한 바람직한 실시예를 제시한다. 단 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
재료
히알루론산(HA-H, Mw:80,000-100,000, 산 형태)는 HNI Co.(Muscatine, USA)로부터 구입하였다. 알지네이트-나트륨(Mw:1.2-1.9x105, 굴루론산(Guluronic acid, G)에 대한 만누론산(Mannuronic acid, M)의 비는 1.56이다) 및 Ca(OAc)2는 각각 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA) 및 Alfa Aesar(Boston, USA)로부터 구입하였다. CsA(>97%의 순도)는 TCI(Tokyo, Japan)로부터 구입하였다. 하이드로겔 형성을 위한 인산-완충 식염수(PBS) 용액은 Biosesang(Seongnam, Korea)로부터 구입하였다. 유기 용매를 포함하는 모든 보조 화학물질은 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구입하였으며, 모든 구입한 화학물질은 추가 정제 없이 사용되었다.
실시예 1-1. HA-Ca 복합체의 합성
HA-Ca 복합체를 합성하기 위하여, 1g의 HA-H 분말을 100ml의 탈이온수(DW)에 상온에서 교반하여 현탁시켰다. 그 후 Ca(OAc)2(35.24g)을 천천히 HA-H 수용액에 첨가하였다. 혼합액을 밤새 40℃에서 교반하였으며, 반응 종결 후에 탈이온수에서 5일단 투석(membrane tubing, 분자량 3,500Da 기준, Spectrum Laboratoires, USA)하여 모든 무기 불순물을 제거하였다. 정제된 수용액은 동결 건조되어 HA-Ca 복합체 분말(0.96g)을 수득하였다.
실시예 1-2. 주사 가능한 HA-Ca-Alg 하이드로겔의 합성
HA-Ca 수용액(3 중량/부피%, 용액 A)와 Alg-Na 수용액(3 중량/부피%, 용액 B)을 각자 준비한 후, 표 1의 비율로 혼합하였으며, 그 과정을 도 2로 간단히 나타내었다.
하이드로겔 샘플 용액 A (mL) 용액 B (mL)
HA-Ca-Alg70 0.7 0.3
HA-Ca-Alg60 0.6 0.4
HA-Ca-Alg50 0.5 0.5
HA-Ca-Alg40 0.4 0.6
각 혼합액은 폴리디메틸실록세인(PDMS) 몰드(Sylgard®, Sewang Hitech, Gimpo, Korea)에서 HA-Ca-Alg 하이드로겔을 형성할 때 까지 접착되었다. 도 3에서와 같이 혼합액은 30분 경과 후 겔화가 모두 진행되었다.
실험예 1. HA-Ca 및 HA-Ca-Alg 시료의 물리화학적 특성 분석
4000 내지 500cm- 1사이에서 4cm-1 해상도에서 16 스캔으로 FT-IR 스펙트럼(Perkin-Elmer, Spectrum BXII, Waltham, USA)을 기록하였다. 이를 도 4A로 도시하였으며, HA-H에서 HA-Ca로 전환되면서 화학적 및 구조적 변화가 나타나는 것을 확인할 수 있다. HA-Ca로의 변화 이후, 전형적인 넓은 OH 피크가 약 3415cm-1에서 관측되었다. 또한 HA-Ca의 특징인 카복실레이트 결합의 비대칭 및 대칭 스트레칭 피크가 1620 및 1410cm-1에서 각기 관측되었다.
열중량 분석은 Scinco TGA N-1500 기구(Scinco, Seoul, Korea; 샘플 중량 5mg, 가열 속도 10℃/분, 초기 온도는 상온으로 설정)을 이용하여 수행되었으며, 이를 도 4B로 도시하였다. HA-H 및 HA-Ca 샘플 모두 100℃이하에서 수분 증발 단계(약 10-15중량%)를 나타내었으며, HA-Ca 염이 HA-H 산 형태보다 더 많은 물을 함유하였다. -OH, -C(O)OH 및 NHC(O)Me를 포함한 고리 치환기의 1차적 질량 손실은 HA-H 및 HA-Ca 각각 170-400 및 200-400℃ 사이에서 발생하였다. HA-Ca의 질량 손실이 30℃ 가량 늦는 이유는 칼슘 이온이 C(O)O-와 상호작용하여 연소를 지연시키기 때문이다. 탄수화물 잔기 고리의 열 분해에 대응하는 2차적 질량 손실은 HA-H 및 HA-Ca 각각 420-520 및 420-480℃ 사이에서 발생하였다. HA-Ca의 질량 손실이 40℃ 가량 일찍 완료되는 이유는 HA-Ca에서 연소될 탄수화물 잔기 고리가 더 적기 때문이다. 또한 520℃ 이상의 고온에서 HA-H는 거의 대부분의 잔기가 연소된 상태지만, HA-Ca의 경우 약 10 및 6 중량%의 Ca(OH)2 및 CaO 잔기가 각기 480-700℃ 및 700℃에서 발견되었다. 이는 마지막 CaO 잔기의 4.14중량%의 칼슘 함량을 나타내는 것으로, ICP-OES 분석에서 얻어진 4.06중량%와 유사하다.
1H NMR 스펙트럼은 HA-Ca 샘플의 Ca2 +의 가능한 결합 위치를 파악하기 위해 수행되었으며, Bruker Ultrashield 500 Plus 스펙트로미터 (Bruker, Billerica, USA)을 사용하였다. 그 결과를 도 5로 도시하였다. HA-H 스펙트럼의 주된 피크 값은 문헌 값에 기반하여 이미 부여것이되었으며, HA-Ca의 스펙트럼은 C-1, C-2 및 C-5 위치에서의 갈라짐 패턴에서 유의미한 변화가 나타날 라는 기대에 부합하였다. 반면, C-3, C-4, C-7, C-9, C-10 및 C-11 위치에서는 오직 작은 변화만 나타났다. 이는 칼슘-교환 고리형 단당류 단량체에서의 전하 밀도 및 화학적 배치의 변화로 인한 것이다. 결론적으로 1H NMR 데이터는 칼슘 이온의 교환이 산-염기 반응을 통해 주로 카복시산 위치에서 이루어졌다는 것을 나타낸다.
치환 정도(DS)을 결정하기 위해 사용된 원소 분석은 고-해상도 ICP-OES으로 Perkin-Elmer Optima 5300DV 스펙트로미터(Perkin-Elmer, Waltham, USA)을 이용하여 수행되었다. 샘플들은 질산을 이용하여 분해되었으며, 순 방향 속도 1.5ml/분(온도 24±1℃, 상대 습도 29±1%)으로 분석하였다. 평균적으로 HA-Ca 샘플들은 샘플 1g당 약 40.6±0.276mg의 Ca를 함유하였으며, 이는 칼슘-교환된 단량체 1몰당 Ca2 +이 0.84몰 존재한다는 것을 나타낸다. 이는 이론적으로 완벽히 Ca2 +-교환된 HA-Ca 생성물의 최종 DS 값과 일치한다.
각 분석은 3회 반복 수행되었다. HA-Ca-Alg 하이드로겔의 마이크로 다공성 구조는 15kv 전압에서 SEM(Hitachi S-4300, Hitachi, Tokyo, Japan)을 사용하여 관측되었다. 그 결과는 도 6으로 도시하였다(A-HA-Ca-Alg70, B-HA-Ca-Alg60, C-HA-Ca-Alg50, D-HA-Ca-Alg40). SEM 이미지는 상이한 용액 비에 대해서 서로 다른 단면적을 보여주었다. HA-Ca의 상대적인 양이 증가함에 따라, 1) 평균 기공의 크기가 약 70에서 170μm로 증가하였고, 2) 기공의 형태(또는 크기)가 덜 균일해졌으며, 3) 기공 표면의 거침이 줄어들었다.
실험예 2. HA-Ca-Alg 하이드로겔의 점도 측정
용액 A 및 B를 혼합한 후, 냉각수 통로가 장착된 소 시료 어댑터(SSA-S27, Brookfield Engineering)이 장착된 RVDV-I+ 스핀들 형 점도계(Brookfield Engineering Laboratories, Middleburg, MA, USA)을 이용하여 주사 가능한 HA-Ca-Alg 하이드로겔의 점도 변화를 25℃에서 40분간 측정하였다. 점도계의 스프링 토크 및 스핀들 속도는 각기 0.72mPa·s와 90rpm이었다. 시료의 온도는 항온 수조로 조절되었다. 전단 속도는 용액에 잠긴 스핀들의 속도를 변화시켜 조절하였다. 4개의 하이드로겔 샘플의 점도는 특정 전단 속도에서의 토크에 대한 저항을 측정하여 결정되었다. 본 분석은 3회 반복 수행되었으며, 그 결과를 도 7로 도시하였다. 그 결과로부터 HA-Ca의 농도가 달라짐에 따라 가교 결합의 시작 시간 및 최대 가교 결합이 변화함을 확인할 수 있다. HA-Ca-Alg40 < HA-Ca-Alg70 < HA-Ca-Alg60 ≤ HA-Ca-Alg50의 순서로 최대 점도가 증가하였으며, 이는 높은 점도의 하이드로겔을 제조하기 위해서는 Ca2 +의 농도뿐만 아니라, 알지네이트 분자의 농도 또한 고려하여햐 한다는 점을 나타낸다.
실험예 3. 겔화 시간 및 분해 시간의 측정
겔화 시간은 용액 A 및 B의 혼합액이 더 이상 바이알 전화(inversion)에 흐르지 않는 시간을 측정함으로써, 잘 알려진 바이알 전화 테스트(흐름 테스트로도 알려짐)로 측정되었다. 측정은 체온(37oC)에서 3회 반복 수행되었으며, 평균 겔화 시간을 계산하였다. 그 결과를 하기 표 2로 표시하였다.
하이드로겔 샘플 겔화 시간 (분)
HA-Ca-Alg70 2
HA-Ca-Alg60 8
HA-Ca-Alg50 15
HA-Ca-Alg40 45
분해 시간은 HA-Ca-Alg50 샘플에 대해 수행하였으며, PBS 및 37℃조건에서 분해가 진행되었다. 그 결과를 도 8로 도시하였다. 도 8로부터 하이드로겔 샘플이 적당한 가수 분해 패턴을 나타내며, 16일 이내에 모두 분해된다는 것을 확인할 수 있다. 첫 6일간 하이드로겔은 느린 분해 속도를 나타냈으나(5중량%/일), 그 후 7일 동안 분해 속도가 상승하였으며(8.57중량%일 까지), 마지막 3일간은 다시 3.33중량%/일까지 분해 속도가 느려졌다. 처음과 마지막의 느린 분해 속도는 상대적으로 작은 표면적으로 인한 것이다. 두 번째 분해 단계에서 하이드로겔은 여러 조각으로 나누어졌으며, 그 결과 표면적이 상승하였다. 일반적으로 하이드로겔 샘플들은 16일 넘어서 완벽하게 분해되었으며, 평균적으로 6.25중량%/일의 속도로 분해되었다. 적당한 분해 속도는 HA-Ca-Alg50 하이드로겔이 CsA와 같은 고분자량 및 낮은 수용성의 면역억제제 약물을 국소적으로 전달하는 것을 조절하기 위해 효율적일 수 있다는 것을 시사한다.
실험예 4. 시간에 따른 CsA 방출량 측정
100, 200 또는 400μg의 CsA을 디메틸설폭사이드(DMSO, 10μL)에 녹인 후, 0.5ml의 용액 A 및 0.5ml의 용액 B와 혼합하였다. 특히, CsA 용액은 스톡 CsA/DMSO 용액(2mg/0.5ml)으로부터 제조되었다. 1ml의 PBS 용액을 제조된 하이드로겔 샘플에 첨가한 후, 모든 CsA-탑재 HA-Ca-Alg50 하이드로겔 샘플들은 특정 시간동안 37℃에서 배양하였다. 각 샘플의 상층액을 총 2주간 매일 수득하였으며, 시간에 따라 방출되는 CsA의 양을 측정하는 것에 사용하였다. 수득된 누출액은 동결 건조되었으며, 1ml의 아세토나이트릴(ACN)에 재용해시켰다. 결과물 용액을 주사기가 장착된 폴리테트라플로로에틸렌(PTFE) 멤브레인 필터(13mm 직경, 0.2μm 구멍 크기, Advantec, Sapporo, Japan)로 거른 이후에, 수득된 여과액을 HPLC 바이알에 주사하고, 각 하이드로겔 샘플로부터 방출된 CsA의 양을 측정하였다. HLPC 실험(LC20A Series, Shimadzu, Kyoto, Japan)에 하기 실험 조건이 적용되었다: 직경 4μm 및 크기 4.6(내측 직경)x150mm(길이)의 스테인리스 강철 ET-RP1 4D(Shodex, Tokyo, Japan) 분석 칼럼; MeOH/ACN=6:4; 유속=0.35ml/분; 온도=73℃; 로딩양=50μl; 흡광도=210nm; 총 보유시간=15분.
각 샘플로부터 방출된 CsA의 양은 ACN에서의 CsA의 검량선(5-100μg/ml 범위)을 사용하여 계산하였다. 누적 약물 방출량은 다음 식을 사용하여 계산하였다: 누적 약물 방출량(중량%)=(Mtime/Mtotal)x100
여기서 Mtime 및 Mtotal은 각기 특정 시간에 방출된 CsA의 양 및 봉입된 CsA의 총량이다. 2주간 매일 방출된 CsA 누적량의 도시는 체온에서의 각 샘플의 CsA 방출에 대한 포화점을 결정하기 위해 사용되었다. 측정은 3회 반복 수행되었으며, 그 결과를 도 9로 도시하였다. 모든 샘플들은 처음 봉입된 양과 거의 동일한 최대치의 방출량을 보였으며, 소수성의 CsA 분자들이 친수성의 하이드로겔로부터 방출되어 친수성인 PBS로 진입하는 것이 오직 하이드로겔의 가수 분해를 통해서만 이루어지기 때문에 CsA의 방출 패턴은 하이드로겔의 가수 분해와 연결되었다. 그러므로 HA-Ca-Alg50 하이드로겔이 일정한 CsA 방출이 가능한 국소적 주사 가능 약물 전달 시스템으로 가장 적합하였다.
실험예 5. CsA-포함 HA-Ca-Alg 하이드로겔로부터 방출되는 CsA로 처리된 T 세포의 증식 및 IL-2 생성 분석
실험예 4와 마찬가지로 14개의 100, 200 또는 400μg의 CsA를 포함하는 HA-Ca-Alg50 하이드로겔 샘플을 제조하였다. CsA 겔 누출액이 T 세포의 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여, Orient Bio Inc. (Seongnam, Korea)에서 구매한 6주령의 C57BL/6 암컷 쥐의 전신 림프절로부터 쥐의 T 세포를 준비하였다. 정제된 T 세포들은 세포 밀도를 1 x 106/ml에 맞추기 위해 10% 열-비활성화된 소태아혈청, 2mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 100μM 비필수 아미노산, 25mM pH 7.0 HEPES 용액, 1mM 피루브산 나트륨 및 50μM 2-β-메르캅토에탄올로 보충된 RPMI 1640 배지에 재현탁되었다. 상기 T 세포들은 4μg/ml의 T 세포의 잠재적인 미토겐인 콘카나발린 A로 자극되었다. 자극된 T 세포들은 96-웰 둥근 바닥 미세판에 1x105 세포/웰로 첨가되었으며, 100μl의 CsA 겔 누출액이 각 웰에 혼합되었다. 그 후 T 세포들은 37℃의 습한 5% CO2 배양기에서 배양되었다. T 세포 배양에 사용된 모든 물질은 Gibco(Waltham, USA)로부터 구매하였다.
배양 6일 후, 상청액을 수득하였으며, IL-2 사이토킨의 농도를 Mouse IL-2 ELISA Ready-Set-Go 키트(eBioscience, Waltham, USA)로 ELISA 분석하였으며, 대조군 세포는 CsA 없는 겔 누출액으로 처리되었다.
동시에 T 세포의 증식은 3-(4,5-디메틸싸이아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라아졸륨 브로마이드(MTT assay, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)로 측정하였다. RPMI 1640 배지에 용해되어 있는 50μg의 MTT가 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가되었다. T 세포는 4시간 동안 37℃의 습한 5% CO2 배양기에서 배양되었다. 배양 이후, 배양 배지는 웰에서 제거되었으며, 보라색의 포르마잔 결정(MTT 대사 산물)을 200μl/웰의 DMSO에 용해시켰다. Synergy Mx (BioTek Instruments, Winooski, USA) 플레이트 리더가 570nm에서의 흡광도를 측정하기 위해 사용되었으며, 670nm에서의 배경 흡광도는 감산되었다. 마지막으로 상대적인 T 세포 증식 및 IL-2 생성 속도가 다음과 같이 계산되었다: T 세포 증식 %=100x(실험군에서의 A570-A670)/(대조군에서의 A570-A670)
IL-2 생성 %=100x(실험군에서의 IL-2 농도)/(대조군에서의 IL-2 농도)
여기서 A570 및 A670은 각기 570 및 670nm에서의 흡광도이다.
데이터는 0μg/ml의 CsA 그룹과 100μg/ml 또는 200μg/ml의 CsA 그룹 사이의 유의미한 차이를 분석하기 위해 Student’s t-test로 분석되었다. 0.05 미만의 p-value는 통계학적으로 유의미한 것으로 여겨졌으며, *로 표시되었다. T 세포의 증식에 대한 결과는 도 10으로, IL-2 생성량에 대한 결과는 도 11로 도시하였다.
도 10 및 11에서 확인한 것과 같이 연장된 면역 억제 효과는 HA-Ca-Alg50 하이드로겔의 가수 분해 패턴 및 일정한 방출과 연관이 있다. 200μg/ml의 경우, 면역 억제 효과가 14일에 이를 때 까지 연장되었다.

Claims (12)

  1. 히알루론산-칼슘 복합체 화합물 및 알지네이트 염 화합물을 포함하는 주사용 약물의 전달에 사용하기 위한 하이드로겔 형태를 갖는 약물 전달체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약물전달체는 히알루론산-칼슘 복합체 화합물 및 알지네이트 염 화합물의 자가조립(self-assembly)를 통해 형성된 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 주사용 약물은 면역 억제제, 항암제 및 항생제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약물 전달체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 면역 억제제는 프레드니손, 아자티오푸린, 마이코페놀레이트 모페틸, 사이클로스포린, 타크롤리무스 및 라파마이신으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약물 전달체.
  6. 제4항에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀 또는 독소루비신인 약물 전달체.
  7. 제4항에 있어서, 상기 항생제는 페니실린 계열 항생제, 아미노글리코사이드 계열 항생제, 테트라사이클린 계열 항생제 및 퀴놀론 계열 항생제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 약물 전달체.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산-칼슘 복합체 화합물과 알지네이트 염 화합물의 질량비는 7:3 내지 4:6인 것인 약물 전달체.
  10. Ca(OAc)2, Ca(OH)2, CaCO3 및 Ca(HCO3)2로 이루어진 군에서 선택되는 염기성 칼슘염과 히알루론산을 반응시켜 히알루론산-칼슘 복합체 화합물을 제조하는 단계; 및
    히알루론산-칼슘 복합체 화합물과 알지네이트 염 화합물을 혼합하는 단계; 를 포함하는 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 주사용 약물의 전달에 사용하기 위한 하이드로겔 형태를 갖는 약물 전달체의 제조방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
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