WO2004074463A1 - 細胞分離用ハイドロゲルおよび細胞の分離方法 - Google Patents

細胞分離用ハイドロゲルおよび細胞の分離方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2004074463A1
WO2004074463A1 PCT/JP2004/001856 JP2004001856W WO2004074463A1 WO 2004074463 A1 WO2004074463 A1 WO 2004074463A1 JP 2004001856 W JP2004001856 W JP 2004001856W WO 2004074463 A1 WO2004074463 A1 WO 2004074463A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gel
sol
cells
composition
organisms
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/001856
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yuichi Mori
Hiroshi Yoshioka
Yuko Sato
Satoru Yoshida
Shinya Ohtsubo
Original Assignee
Waseda University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Waseda University filed Critical Waseda University
Priority to US10/545,935 priority Critical patent/US20060121116A1/en
Priority to JP2005502753A priority patent/JPWO2004074463A1/ja
Priority to CA002516592A priority patent/CA2516592A1/en
Priority to EP04712684A priority patent/EP1595944A4/en
Publication of WO2004074463A1 publication Critical patent/WO2004074463A1/ja
Priority to US11/907,110 priority patent/US20080213869A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to the property of moving cells and cells or organisms (hereinafter referred to as "cells / organisms") according to the strength of chemotaxis or the properties of a field (e.g., The present invention relates to a hydrogel for separating cells, microorganisms, and the like by utilizing viscotaxis, and a method for separating cells and organisms using such a hydrogel.
  • the present invention utilizes the property of migrating according to the concentration of a bioactive substance inherent in many organisms (chemotaxis), or the property of migrating according to the strength of a field, For selectively moving cells, microorganisms, and the like, thereby separating the cells and organisms (ie, performing an operation involving selective movement, such as separation (fractionation, fractionation, or fractionation)).
  • the present invention relates to a hide-mouth gel and a method for separating cells and organisms using such a hide-mouth gel.
  • cells are separated (differentiated, sorted, or separated) based on differences in chemotactic performance against factors related to immune diseases such as atopic dermatitis, allergy, and rheumatism. Sorting etc.).
  • hydrogel of the present invention for example, cells can be separated (differentiated, fractionated, or fractionated) by differences in chemotactic performance with respect to factors related to cancer treatment and metastasis of cancer cells. Etc.).
  • the hydrogel of the present invention can be used, for example, in the field of regenerative medicine, in the induction, formation, regeneration, etc. of tissues and organs such as blood vessels and nerves. Cells can be separated (fractionated, sorted, or sorted, etc.) by the difference in chemotactic performance for the relevant factors.
  • hydrogel of the present invention it is possible to use the hydrogel of the present invention to separate (fraction, sort, or sort) cells based on differences in motility and the like, for example, in connection with techniques for selecting excellent sperm. Become.
  • cells can be separated (fractionation, fractionation, or fractionation, etc.) using the hydrogel of the present invention, for example, by utilizing differences in chemotaxis (eg, electrophoretic mobility) with respect to an electric field. It becomes possible.
  • chemotaxis eg, electrophoretic mobility
  • a motif (or a part thereof) has the ability to move, in response to an external stimulus, exercising, and if its motility has a certain direction, the property of this creature is called chemotaxis. This is a well-known property. If the stimulus is a substance, its properties are called chemotaxis. On the other hand, when the stimulus is a physical stimulus, it is called electrotaxis, magnetotaxis, phototaxis, thermotaxis, viscometer, etc., depending on the physical stimulus.
  • Organisms having the above motility include lower animals, plants, microorganisms, cells and organisms, and most organisms on the earth are considered to have running performance.
  • chemotaxis of living organisms particularly the chemotaxis of cells, plays an important role in living organisms.
  • the induction and regeneration of blood vessels require the proliferation of vascular endothelial cells, and the induction and regeneration of blood vessels in response to a gradient in the concentration of vascular epidermal growth factor, ie, the chemotactic activity of vascular endothelial cells. It has been found that guidance and regeneration are performed depending on the performance.
  • cancer cells with high auxotrophy secrete vascular endothelial cell growth factor and It is well known to induce blood vessels from blood vessels into cancer tissue.
  • the vascular system is induced and regenerated by the gradient of oxygen concentration.
  • vascular endothelial cells exhibit negative chemotactic performance for oxygen.
  • the induction and regeneration of a neural network is also performed in vivo by imparting a concentration gradient of a nerve cell growth factor to a field. It is also well known that chemotactic properties of immune-related cells such as leukocytes are exerted in response to an allergen causing an allergic reaction, and leukocytes and the like are accumulated at the reaction site. Furthermore, the possibility of cancer metastasis being caused by cancer cells having high chemotactic performance is increasing.
  • chemotaxis due to physical stimulation is also well known.
  • the growth of plants in the light direction is well known as phototaxis.
  • cells that exhibit various electrophoretic performances in cell electrophoresis are known.
  • cells having high motility, such as sperm have a high correlation between their motility and function.
  • the running performance of living organisms, especially cells, especially chemotactic performance is a very important property for controlling the function of living organisms.
  • lymphocytes include B lymphocytes and T lymphocytes, and B lymphocytes differentiate into many plasma cells upon external stimuli.
  • T lymphocytes are classified according to their functions into killer T cells, helper T cells, sublesser T cells, and various T cell subpopulations of organisms. Also, it is becoming clear that macrophages have various subpopulations.
  • cancer cells in cancer tissues are also diverse, and it has been found that there is a large distribution in drug or radiation resistance, proliferation ability, metastatic property, and the like. Further, it is well known that stem cells existing in bone marrow are differentiated into various cells depending on the environment.
  • each of these diverse cell groups has its own migration performance, and cells can be fractionated for each migration performance.
  • cells can be fractionated for each migration performance.
  • sort and sort cells having different running performances, it will be a great step forward to elucidate cell functions.
  • Today it is considered possible to develop new treatments for immune-related diseases and cancers for which there is no effective treatment, and to develop more efficient tissue and organ regenerative medicine techniques.
  • An object of the present invention is to provide a hydrogel for separating cells and organisms and a method for separating cells and organisms, which can solve the above-mentioned disadvantages of the prior art.
  • Another object of the present invention is to provide, as described above, a port capable of separating (fractionating, fractionating or sorting, etc.) cells and organisms having various running performances that could not be achieved by the conventional technology. It is to provide a gel.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for separating cells and organisms using hydrogel according to their running performance.
  • the present inventors have performed the separation of cells and organisms using a hydrogel having a specific structure or a gel with a high-opening mouth capable of realizing a difference in the concentration of a specific substance inside or outside a gel. Found that it was extremely effective in achieving the above objectives.
  • the gel for a cell / organism separation according to the present invention is based on the above findings, and more specifically, a cell / organism capable of selectively moving cells according to the concentration difference of a physiologically active substance. It is a hydrogel for separation.
  • a thermoreversible sol-gel transition phenomenon in which a sol state is formed at a low temperature and a gel is formed at a high temperature, and The above-mentioned hydrogel for cell / biological separation is provided, wherein the gel is substantially water-insoluble at a high temperature.
  • a gel-forming composition comprising at least water and a hydrogel-forming polymer; a reversible sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature; Use a gel-forming composition that becomes a substantially water-insoluble gel at temperatures above the transition temperature;
  • aqueous solution containing a physiologically active substance is brought into contact with one side of the gel-state composition at a temperature higher than the sol-gel transition temperature of the gel-forming composition; and the other of the gel-state composition Contacting a suspension of cells and organisms with the surface side of the
  • the cells and organisms While forming a concentration gradient of the physiologically active substance in the composition in the gel state, the cells and organisms are transferred from the suspension into the composition in the gel state by the chemotaxis induced by the concentration gradient.
  • the separated portion of the composition in the gel state is cooled to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to form a sol, and at least a step of recovering the cells and the organism from the composition in the sol state is performed.
  • a separation method is provided.
  • a gel-forming composition comprising at least water and a hydrogel-forming polymer; a reversible sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature; Use a gel-forming composition that becomes a substantially water-insoluble gel at temperatures above the transition temperature;
  • composition in a gel state with an aqueous solution containing a physiologically active substance at a temperature higher than the sol-gel transition temperature;
  • the physiologically active substance is transferred into the composition in the gel state to form a concentration gradient of the physiologically active substance in the composition, and the cells and organisms in the composition are transformed according to the concentration gradient.
  • a cell / organism including at least a step of cooling the separated portion of the composition in the gel state to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to form a sol, and recovering the cell / organism from the composition in the sol state.
  • a gel-forming composition comprising at least water and a hydrogel-forming polymer; a reversible sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature; Use a gel-forming composition that becomes a substantially water-insoluble gel at temperatures above the transition temperature;
  • the gel-state composition is Contacting a suspension of organisms to transfer cells and organisms from the suspension into the gel composition;
  • the separated gel-state composition is converted into a sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and at least a step of recovering cells transferred into the composition from the sol-state composition
  • a method for separating cells and organisms is provided.
  • a gel-forming composition comprising at least water and a hydrogel-forming polymer; a reversible sol state at a temperature lower than the sol-gel transition temperature; Use a gel-forming composition that becomes a substantially water-insoluble gel at temperatures above the transition temperature;
  • the gel-state composition is brought into contact with a cell-organism suspension, and the cells are transferred from the cell-organism suspension into the gel-state composition by the chemotaxis induced by the gradient of each property. Transferring the organism, the cells, separating at least a part of the gel-state composition into which the organism has been transferred from the other part of the composition, and
  • a cell / organism including at least a step of cooling the separated portion of the composition in the gel state to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to form a sol, and recovering the cell / organism from the composition in the sol state.
  • a gel-forming composition comprising at least water and a hydrogel-forming polymer;
  • a gel-forming composition that reversibly enters a sol state at a lower temperature and becomes a substantially water-insoluble gel state at a temperature higher than the sol-gel transition temperature;
  • composition in the gel state in a field where the physical properties change continuously to form a gradient of each physical property in the composition; Relocating cells / organisms that have been substantially uniformly distributed in the composition with the composition in a gel state due to the difference in migration performance for each physical property,
  • a cell / organism including at least a step of cooling the separated portion of the composition in the gel state to a temperature lower than the sol-gel transition temperature to form a sol, and recovering the cell / organism from the composition in the sol state.
  • the hydrogel for example, exhibits a sol-gel transition phenomenon in which the sol state is formed at a low temperature and gels at a high temperature, and the sol-gel transition is thermoreversible and higher than the sol-gel transition temperature
  • the concentration of a physiologically active substance that induces chemotaxis in cells and organisms
  • a physiologically active substance that induces chemotaxis in cells and organisms
  • the cell / organism is made to have chemotaxis to each property by creating gradients of various properties such as electric field, magnetic field, luminous intensity, temperature, and viscosity in the gel of the mouth. Can be separated (fractionation, fractionation or fractionation, etc.) depending on the difference in
  • a suspension of an aqueous solution containing a physiologically active substance and a cell / organism for separation is used at a temperature higher than the sol-gel transition temperature using the above-mentioned mouth gel.
  • a concentration gradient of the physiologically active substance is created in the hydrogel, and the cells and organisms are transferred from the cell and organism suspension into the hide mouth gel by the chemotaxis induced by the concentration gradient. Can be migrated.
  • the transferability or migration distance of various cells / organisms into the hydrogel differs depending on the difference in the chemotactic performance of the sorting cells / organisms.
  • the sol state containing cells and organisms is obtained by cutting out the hydrogel of a portion containing cells and organisms having different conversion performances, that is, different migration distances, and cooling it to a temperature lower than the sol-gel transition temperature of the hydrogel. Can be produced. Next, a large amount of cells and biological culture or preservation solution is added to the sol, and the polymer solution is diluted so that it does not gel even at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and then subjected to normal separation such as centrifugation or membrane separation. It is possible to separate cells and organisms (fractionation, fractionation or sorting, etc.) by this method.
  • the hydrogel is brought into a sol state by lowering the temperature to a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and cells / organisms for separation are added to prepare a cell / organism suspension. Can .
  • the cell / organism suspension is heated to a temperature higher than the above-mentioned sol-gel transition temperature to cause gelation, thereby producing a hydrogel in which the cells / organisms for separation are substantially uniformly dispersed inside.
  • the hydrogel is brought into contact with an aqueous solution containing a physiologically active substance (chemotaxis factor) to transfer the physiologically active substance into the hydrogel, whereby the concentration gradient of the physiologically active substance in the hydrogel is reduced. Make it.
  • a physiologically active substance chemotaxis factor
  • the above-mentioned hydrogel is converted into a sol-state aqueous solution by lowering the temperature to a temperature lower than the sol-gel transition temperature, and a physiologically active substance is substantially uniformly mixed with the sol-state aqueous solution.
  • the cells are separated and separated as a sol-state aqueous solution by lowering the sol-gel transition temperature. Separation (fractionation, fractionation, or fractionation, etc.) may be.
  • the hydrogel is placed in a field where physical properties selected from electric field strength, magnetic field strength, luminous intensity, temperature, viscosity and the like are continuously changed, and the gradient of the property is set in the field.
  • the gel is made in a gel with a hydrogel and then the hydrogel is contacted with a suspension of cells and organisms for sorting. Then, the cells and organisms can be transferred from the cell and organism suspension into the hide mouth gel by the chemotaxis caused by the gradient of each property.
  • the migration or migration distance of various cells / organisms into the gel at the hide mouth differs depending on the difference in the migration performance of the cells / organisms for sorting against the physical properties of the organisms.
  • the hydrogel to which the cells / organisms have migrated or the hydrogel having a different running performance is cut out and cooled to a temperature lower than the sol-gel transition temperature of the hydrogel.
  • ⁇ Create a sol containing living organisms.
  • a large amount of cells or a biological culture solution or a preservation solution is added to the sol, and the polymer solution is diluted so as not to gel even at a temperature higher than the sol-gel transition temperature, and then subjected to a normal separation method such as centrifugation or membrane separation. Cells and organisms can be separated (fractionation, fractionation, or fractionation, etc.).
  • the hydrogel is brought into a sol state by lowering the temperature to below the Zolgel transition temperature, and cells / organisms for separation are added to prepare a cell / organism suspension. it can.
  • the cell / organism suspension is heated to a temperature higher than the above-mentioned sol-gel transition temperature to gel, thereby producing a hydrogel in which cells / organisms for separation are substantially uniformly dispersed.
  • the gel is placed in a place where properties selected from electric field strength, magnetic field strength, luminous intensity, temperature, and viscosity change continuously, and a gradient of each property is produced in the hydrogel.
  • the hydrogel for cell / biological separation (fractionation, fractionation, or fractionation, etc.) of the present invention utilizes hydrophobic bonds at least partially for crosslinking. Presumed. Hydrophobic bonds are the only physical bonds among various physical bonds that become stronger as the temperature rises.
  • the sol-gel transition temperature of the hydrogel can be changed by changing the hydrophobic bonding force of the cross-linking point.
  • the sol-gel transition temperature of the gel of the present invention is preferably higher than 0 ° C and not higher than 45 ° C.
  • the physical properties of the above-described hydrogel are such that the process of embedding cells, organisms, microorganisms, tissues, organs, and the like in the hydrogel and recovering the same from the hydrogel involves thermal damage or enzymatic damage. Enables implementation without substantial provision.
  • agar gel which exhibits a positive temperature-solubility change
  • the temperature at which the gel transfers to the sol due to its strong binding force is about 95 ° C, which is significantly higher than the physiological temperature range (usually 0 ° C to 40 ° C), so cells, organisms, microorganisms, tissues, Embedding and recovery of organs in agar gel were not possible.
  • the crosslinks are formed by ionic bonds and the bonding strength is strong, and it is difficult to transfer the gel to sol under physiological conditions.
  • the gel of the present invention is that cells, organisms, microorganisms, tissues, organs, and the like can move (to a certain extent) in the hydrogel.
  • the binding energy of the cross-linking point of a three-dimensional network of hydrogel is AF
  • the crosslink point of the hydrogel is in a bonded state for an operation having a frequency higher than 1 / (sec- 1 ). That is, it corresponds as a cross-linked structure, and for an operation having a frequency lower than ⁇ ⁇ ⁇ (sec- 1 ), the cross-linking point of the hydrogel is in a non-bonded state, that is, as a liquid having no cross-linked structure.
  • the gels behave as solids for very fast movements and as liquids for very slow movements. This cell.
  • Organism, microorganism, carrying the Hyde port gels embedded tissues, etc., or generated during the cutting operation typically, the frequency of the motion is high, greater than about 1 0- 2 sec 1 order
  • the hydrogel behaves as a solid, whereas cells, organisms, microorganisms, tissues, and the like move or proliferate in the hydrogel at a low frequency of about 10 Behaves as a liquid for slow motions smaller than 4 sec 1 order. Therefore, cells, organisms, microorganisms, tissues, and the like can move in the hide mouth gel by their running performance.
  • the bonding of the cross-linking points to form a three-dimensional network having the above properties The energy is preferably equivalent to the thermal energy (RT) in the physiological temperature range (0 ° C to 40 ° C), and several tens to several hundreds of kca 1 / mo 1 and binding energy
  • RT thermal energy
  • a three-dimensional network formed by a high covalent bond, a crystallized structure, and a cross-linked structure formed by ionic bonds is unsuitable for the hydrogel of the present invention, and is a bond by dispersive force having a bond energy of several kca 1 / mo 1.
  • a three-dimensional network structure formed by hydrogen bonds or hydrophobic bonds can be suitably used as the hydrogel of the present invention.
  • a three-dimensional network structure formed by hydrophobic bonds ie, a hydrogel
  • a hydrogel has a property that the hydrophobic bonds become stronger with an increase in temperature, so that the sol is gelled at a low temperature and gelled at a high temperature. Therefore, the temperature dependence of the sol-gel transition is opposite to that of a high-opening gel using other bonds, for example, bonds by hydrogen bonding, dispersing force, and the like.
  • the physical properties of hydrogels using hydrophobic bonds are higher than those of conventional gels in that they can embed cells and organisms in a low-temperature sol, avoiding thermal damage during embedding.
  • the gel of the present invention can be suitably used as the gel for cell / biological fractionation.
  • the transition of the hide-opening gel utilizing the hydrophobic bond is thermally reversible, the gel can be dissolved at a low temperature even when the gel is removed from cells and organisms embedded in the gel. Cells and organisms can be recovered from the gel without causing thermal damage.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view of a preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic perspective view of another preferred embodiment of the present invention.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to the drawings as necessary.
  • “parts” and “%” representing quantitative ratios are based on mass unless otherwise specified.
  • the hydrogel for cell / biological separation (fractionation, fractionation, or separation) of the present invention contains a hydrogel-forming polymer having an sol-gel transition temperature, and the sol state at a lower temperature. It exhibits a thermoreversible sol-gel transition that gels at higher temperatures.
  • “cells and organisms” mean “cells and Z or organisms”, and organisms (plants and animals) containing one or more cells as long as they show some chemotaxis to any physiologically active substance. ) Includes or refers to any cell or cell aggregate derived from.
  • the forms of the cells and cell aggregates are not particularly limited, and include, for example, single cells, multicellular organisms or organs thereof, microorganisms, sperm, eggs, and the like.
  • separation means that the above-mentioned cells and organisms are differentiated in their spatial positions based on any difference in their chemotaxis. In the present invention, this form of “making a difference in spatial position” is not particularly limited.
  • “separation” refers to the inside and / or outside of the gel based on the chemotaxis or the chemotaxis corresponding to the physical properties of the cells and / or organisms described above. Any separation operation that can achieve some selectivity in the arrangement of the cells and / or organisms using selective movement between them. “Separation” in the present invention includes, for example, fractionation, fractionation, or fractionation.
  • sol state In the present invention, "sol state”, “gel state” and “sol-gel”
  • the definition and measurement of the transition temperature is based on the definitions and methods described in the literature (H. Yoshioka et al., Journal of Macromolecular Science, A31 (1), 113 (1994)). That is, the dynamic elastic modulus of a sample at an observation frequency of 1 Hz is measured by gradually changing the temperature from a low temperature side to a high temperature side (1 ° C / 1 minute), and the storage elastic modulus (G,. The temperature at which the elastic term) exceeds the loss modulus (G ", viscous term) is defined as the sol-gel transition temperature.
  • the state of G"> G is a sol
  • the state of G " ⁇ G ' is a gel.
  • the following measurement conditions can be suitably used.
  • Measuring equipment (trade name): Stress control type rheometer CSL700, manufactured by Carri_Med
  • Applicable stress Within the linear region.
  • the above-mentioned Zolgel transition temperature is higher than 0 ° C, preferably 45 ° C or lower, and more preferably 0 ° C or lower. It is preferably 42 ° C or less (especially 4 ° C or more and 40 ° C or less).
  • the hydrogel having such a suitable sol-gel transition temperature can be easily selected from the specific compounds as described below according to the above-mentioned screening method (sol-gel transition temperature measurement method).
  • Cell / biological separation (fractionation, fractionation) using the hydrogel of the present invention Separation, or fractionation, etc.) the above-mentioned Zolgel transition temperature ( a ° C) is used for cell / biological fractionation, the temperature for fractionation (b ° C), and cooling for fractionation.
  • the temperature be set between the temperature at the time (c ° C). That is, it is preferable that the above three temperatures a ° C, b ° C, and c ° C have a relationship of b>a> c. More specifically, (b ⁇ a) is preferably from 1 to 40 ° C., more preferably from 2 to 30 ° C., and (a ⁇ c) is from 1 to 40 ° C., and Is preferably 2 to 30 ° C.
  • the hydrogel preferably used in the present invention has a cell selectivity RZR measured by the following assay from the viewpoint of exhibiting a suitable cell selectivity.
  • the hydrogel is preferably 2 or more, more preferably 5 or more, and still more preferably 10 or more.
  • Cell selectivity RZR Is measured as follows.
  • the hydrogel of the present invention exhibits a solid behavior at higher frequencies because cells, organisms, microorganisms, and the like can move freely therein, while it exhibits a solid behavior at lower frequencies. It is preferable to exhibit liquid behavior. More specifically, the mobility of cells, organisms, and the like in the gel for a hide can be suitably measured by the following method. (Method for measuring mobility of cells, organisms, etc. in a gel at the mouth) The hydrogel of the present invention (1 mL as a hydrogel) was tested in a sol state (temperature lower than the sol-gel transition temperature) with an inner diameter of 1 cm.
  • T is 1 minute to 24 hours, preferably 5 minutes to 10 hours.
  • the gel-like properties of the hydrogel of the present invention can also be suitably measured by measuring the steady-state flow viscosity.
  • Steady flow viscosity can be measured, for example, by creep experiments. In the creep experiment, a constant shear stress is applied to the sample, and the time change of the shear strain is observed. Generally, in the creep behavior of a viscoelastic material, the shear rate changes with time at the initial stage, but thereafter, the shear rate becomes constant. The ratio between shear stress and shear rate at this time is defined as steady flow viscosity ⁇ . This steady flow viscosity is sometimes called Newton viscosity. However, the steady flow viscosity here must be determined within a linear region that hardly depends on shear stress.
  • a stress control type viscoelasticity measuring device CSL type rheometer (CSL500, manufactured by Carrymed USA) was used as a measuring device, and an acrylic disk was used as a measuring device. (4 cm diameter) Observe the cleaving behavior (delay curve) for a measurement time of at least 5 minutes or more for a thickness of 600 ⁇ m. The sampling time is once every second for the first 100 seconds and once every 100 seconds thereafter.
  • the sol - at about 1 0 ° C higher temperature Ri by gel transition temperature is preferably 77 is 5 X 1 0 3 ⁇ 5 X 1 0 6 P a ⁇ sec, more 8 xl 0 3 ⁇ 2 X l 0 6 P a ⁇ sec, in particular l X l 0 4 P a ⁇ sec or more and less l X l 0 6 P a ⁇ sec.
  • the gel-like properties of the hydrogel of the present invention can be suitably measured also by the dynamic elastic modulus.
  • ⁇ (t) ⁇ Q cos t (where t is time) with an amplitude ⁇ 0 and a frequency ⁇ ⁇ ⁇ , a constant stress ⁇ .
  • ⁇ (t) o Q cos ( ⁇ t + ⁇ ), where ⁇ is the phase difference, is obtained.
  • ff Q Z o ;.
  • the ratio (G "/ G,) is an indicator of gel-like properties.
  • the hide mouth gel of the present invention preferably exhibits the following properties (for details of such elastic modulus measurement, refer to, for example, References: Ryohei Oda, Modern Industrial Chemistry) 19, p. 359, Asakura Shoten, 1989).
  • the ratio ⁇ (tan ⁇ ) s / (tan ⁇ ) L ⁇ of (tan 5) s to (tan S) L is preferably less than 1 (more preferably 0.8 or less, particularly preferably 0 5 or less) .
  • Hydrogel-forming polymer concentration about 8% by mass
  • Temperature A temperature approximately 10 ° C higher than the sol-gel transition temperature of the gel at the mouth opening.
  • Measuring equipment Stress-controlled rheometer (Model: CSL500, manufactured by Carry Med, USA)
  • the hydrogel-forming polymer that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it exhibits a thermoreversible sol-gel transition as described above (that is, it has a sol-gel transition temperature). From the point that it is easy to show a suitable sol-gel change at physiological temperature (about 0 to 42 ° C),
  • the cloud points of a plurality of blocks having a cloud point and a hydrophilic block, the composition of both blocks, the hydrophobicity of both blocks, and the hydrophilicity It is preferable to adjust the properties, Z, molecular weight, and the like, respectively.
  • polystyrene resin whose aqueous solution has a sol-gel transition temperature and exhibits a sol state reversibly at a temperature lower than the transition temperature
  • polypropylene oxide and polyethylene oxide include, for example, polypropylene oxide and polyethylene oxide.
  • Polyalkylene oxide block copolymers typified by block copolymers of the following; ethylenolide senorelose such as methylcellulose and hydroxypropinolesenorelose; chitosan derivatives (K. R. Holme , et al. Macromolecules, 24, 3828 (1991)) and the like.
  • Pluronic F-127 (trade name, manufactured by BASF Wyandotte Chemica Is Co,) in which polyethylene oxide is bonded to both ends of polypropylene oxide as a polyalkylene oxide block copolymer ) Gels are being developed. It is known that this high-concentration aqueous solution of the pull-mouth nick F-127 becomes a gel at a temperature of about 20 ° C or higher and an aqueous solution at a lower temperature. However, in the case of this material, it is about 20 mass 0 /. The gel state can be obtained only at such a high concentration, and even if the gel is maintained at a temperature higher than the gelation temperature at a high concentration of about 20% by mass or more, the gel will be dissolved by adding more water.
  • Pluronic F_127 has a relatively small molecular weight, exhibits not only a very high osmotic pressure in a high gel state of about 20% by mass or more, but also easily penetrates cell membranes, so May have adverse effects on biological tissues.
  • the sol-gel transition temperature is usually high and is about 45 ° C or higher ( ⁇ Sarkar J. Appl. Polym. Science, 24, 1073, 1979).
  • the fractionation and fractionation of cells and organisms are carried out at a temperature of around 37 ° C. or lower, the etherified cellulose is in a sol state, and the etherified cell orifice is in a sol state. It is practically difficult to fractionate and separate cells, organisms, etc. by using the method.
  • the problems of the conventional polymer which has a sol-gel transition point in its aqueous solution and shows a sol state reversibly at a temperature lower than the transition temperature are as follows: 1) At a temperature higher than the sol-gel transition temperature. Once gelled, the gel will dissolve when water is further added. 2) The sol-gel transition temperature is higher than the cell / organic fractionation and fractionation temperature (around or below 37 ° C). It is high and it is in a sol state at the fractionation and fractionation temperatures. 3) It is necessary to make the aqueous polymer concentration very high in order to gel.
  • a hydrogel-forming polymer having an sol-gel transition temperature of preferably higher than 0 ° C. and not higher than 42 ° C.
  • a constant block having a cloud point and a hydrophilic block are combined, and the aqueous solution has a sol-gel transition temperature and reversibly forms a sol at a temperature lower than the sol-gel transition temperature.
  • the hydrogel-forming polymer utilizing a hydrophobic bond which can be suitably used as a base for separation (fractionation, fractionation, or fractionation, etc.) of cells and organisms of the present invention, comprises a plurality of polymers having a cloud point. It is preferable that this block is combined with a hydrophilic block.
  • the hydrophilic block exists because the hydrogel becomes water-soluble at temperatures below the sol-gel transition temperature.
  • the plurality of blocks having a cloud point are present because the hydrogel changes to a gel state at a temperature higher than the sol-gel transition temperature.
  • a block having a cloud point dissolves in water below the cloud point and becomes insoluble in water above the cloud point, so that at a temperature above the cloud point,
  • the blocks serve as cross-linking points consisting of hydrophobic bonds to form a gel. That is, the cloud point derived from the hydrophobic bond corresponds to the sol-gel transition temperature of the hydrogel.
  • the cloud point and the sol-gel transition temperature do not necessarily have to match. This is because the cloud point of the “block having a cloud point” described above is generally affected by the binding between the block and the hydrophilic block.
  • the hydrogel used in the present invention utilizes the property that the hydrophobic bond not only becomes stronger with an increase in temperature, but that the change is reversible with respect to temperature. Multiple crosslinking points are formed in one molecule
  • the hydrogel-forming polymer has a plurality of “blocks having a cloud point” in the molecule.
  • the hydrophilic block in the hydrogel-forming polymer becomes water-soluble at a temperature lower than the sol-gel transition temperature, as described above. It has a function of changing the water-containing gel while preventing the above-mentioned gel at the high temperature from being excessively increased at a temperature higher than the above-mentioned transition temperature, thereby preventing the above-mentioned gel of the mouth from being aggregated and precipitated. .
  • the block having a cloud point is preferably a block of a polymer having a negative temperature coefficient of solubility in water, and more specifically, polypropylene block, propylene block, and the like.
  • Copolymers with other alkylenoxides poly N-substituted acrylamide derivatives , A poly-N-substituted metaacrylamide derivative, a copolymer of an N-substituted acrylamide derivative and an N-substituted metaacrylamide derivative, polyvinyl methyl ether, or a partially acetylated polybutyl alcohol.
  • Molecules can be used preferably.
  • the above polymer (block having a cloud point) has a cloud point of higher than 4 ° C and not higher than 45 ° C depends on the polymer (a plurality of blocks having a cloud point and hydrophilicity) used in the present invention.
  • the sol-gel transition temperature of the compound having a hydrophilic block bonded thereto is set to be higher than 4 ° C and 40 ° C or lower.
  • the cloud point is measured, for example, by cooling an aqueous solution of about 1% by weight of the above-mentioned polymer (block having a cloud point) into a transparent homogeneous solution, and then gradually increasing the temperature (heating). This can be done by setting the point at which the solution becomes cloudy for the first time as the cloud point at a rate of about 1 ° C / in).
  • poly N-substituted acrylamide derivatives and poly N monosubstituted meta acrylamide derivatives that can be used in the present invention are listed below.
  • the polymer may be a homopolymer (a homopolymer) or a copolymer of a monomer constituting the polymer and another monomer.
  • a copolymer any of a hydrophilic monomer and a hydrophobic monomer can be used.
  • copolymerization with a hydrophilic monomer raises the cloud point of the product, and copolymerization with a hydrophobic monomer lowers the cloud point of the product. Therefore, by selecting these monomers to be copolymerized, A polymer having a cloud point of (for example, a cloud point higher than 4 ° C and 45 ° C or less) can be obtained.
  • hydrophilic monomers examples include N-bulpyrrolidone, bulpyridine, acrylamide, metaacrylamide, N-methylacrylamide, hydroxysethylmetarate, and hydroxylethyl acrylate.
  • Acid hydroxymethyl methacrylate, hydroxymethyl acrylate, acrylic acid having an acidic group, metaacrylic acid and salts thereof, vinyl sulfonic acid, styrene sulfonic acid, etc., and a basic group.
  • the hydrophobic monomers include acrylate derivatives, methacrylate derivatives such as ethyl acrylate, methyl methacrylate, and glycidyl methacrylate, and N-n Examples include, but are not limited to, N-substituted alkyl methacrylamide derivatives such as butyl methacrylamide, butyl chloride, acrylonitrile, styrene, butyl acetate and the like.
  • hydrophilic blocks to be combined with the above-mentioned block having a cloud point include, specifically, methylcellulose, dextran, poly (ethylene oxide), polyvinyl alcohol, poly-N— Bierpi mouth lidone, polyvinyl pyridine, polyacrylamide, polymethacrylinoleamide, poly N-methylacrylamide, polyhydroxymethyl acrylate, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyvinyl acid Sulfonic acid, polystyrene sulfonic acid and their salts; poly N, N-dimethylaminoethyl methacrylate, poly N, N-ethylaminoethyl methacrylate, poly N, N-dimethylamino propylacrylamide and their salts And the like.
  • the method for bonding the block having a cloud point and the hydrophilic block is not particularly limited.
  • a polymerizable functional group for example, acryloyl
  • copolymerizing a monomer that gives the other block for example, acryloyl
  • a combination of a block having a cloud point and the above-described hydrophilic block is a monomer that provides a block having a cloud point and a monomer that provides a hydrophilic block. It can also be obtained by block copolymerization with
  • a functional group for example, a hydroxyl group, an amino group, a carboxy group, an isocyanate group, etc.
  • a functional group for example, a hydroxyl group, an amino group, a carboxy group, an isocyanate group, etc.
  • it can also be carried out by combining the two by a chemical reaction. At this time, usually, a plurality of reactive groups are introduced into the hydrophilic block.
  • a bond between a polypropylene having a cloud point and a hydrophilic block can be formed by, for example, anion polymerization or cationic polymerization, a monomer (which constitutes another hydrophilic block) with propylene oxide.
  • ethylene oxide eg, ethylene oxide
  • a block copolymer in which polypropylene oxide and “hydrophilic block” (eg, polyethylene oxide) are bonded can be obtained.
  • Such a block copolymer can be obtained by introducing a polymerizable group (for example, an atalyloyl group) into the end of polypropylene propylene and then copolymerizing the monomers constituting the hydrophilic block.
  • polypropylene oxide in a hydrophilic block can also be obtained by introducing a functional group capable of binding and reacting with a terminal functional group (for example, a hydroxyl group) and reacting both.
  • the polymer of the present invention in the embodiment containing the block having the cloud point has a structure in which, at a temperature lower than the cloud point, the “block having the cloud point” existing in the molecule is a hydrophilic block. Since both are water-soluble, they dissolve completely in water and show a sol state. However, when the temperature of the aqueous solution of the polymer is heated to a temperature higher than the above cloud point, the “block having a cloud point” existing in the molecule becomes hydrophobic, and the hydrophobic interaction causes the interaction between the separate molecules. Meet. On the other hand, since the hydrophilic block is still water-soluble at this time (when heated to a temperature higher than the cloud point), the polymer of the present invention is used in water between blocks having a cloud point.
  • the sol-gel transition of the polymer of the present invention in a preferred embodiment is based on the reversible change in hydrophilicity and hydrophobicity at the cloud point of a block having a cloud point present in the molecule. Therefore, it is completely reversible in response to temperature changes.
  • the hydrogel of the present invention which contains at least water, is substantially insoluble in water at a temperature higher than the sol-gel transition temperature (cJ ° C) and reversibly water-soluble at a temperature lower than the sol-gel transition temperature (e ° C). Shows solubility.
  • the above-mentioned high temperature (d ° C) is preferably 1 ° C or more, more preferably 2 ° C or more (particularly 5 ° C or more) higher than the sol-gel transition temperature.
  • substantially water-insoluble means that the amount of the polymer dissolved in 100 mL of water at the temperature (d ° C.) is 5 • 0 g or less (further, 0.5 g Hereinafter, it is particularly preferable to be 0.1 lg or less.
  • the above low temperature (e ° C) is preferably 1 ° C or more (in absolute value) lower than the sol-gel transition temperature, and more preferably 2 ° C or more (particularly 5 ° C or more). More preferably, it is.
  • water-soluble means that the amount of the polymer soluble in 100 mL of water at the temperature (e ° C.) is 0.5 g or more (furthermore, 1.0 g or more). It is preferable that Further, "reversibly water-soluble” means that the aqueous solution of a polymer having a gel structure at the mouth opening is once gelled (at a temperature higher than the sol-gel transition temperature), and the sol-gel transition temperature is high. At lower temperatures, the above water solubility is observed.
  • the above polymer preferably has a viscosity of 10 to 30000 centivoise (more preferably 50 to 10000 centivoise) at a 10% aqueous solution at 5 ° C. Such a viscosity is preferably measured, for example, under the following measurement conditions.
  • Viscometer Stress-controlled rheometer (model name: CSL500, manufactured by Carry Med, USA)
  • Rotor diameter 60 mm
  • Rotor shape Parallel plate Measurement frequency: 1 Hz (Hertz)
  • the aqueous solution of the hydrogel-forming polymer of the present invention is the sol-gel After gelling at a temperature higher than the transition temperature, even if the gel is immersed in a large amount of water, the gel does not substantially dissolve.
  • the above characteristics of the substrate for separation (fractionation, fractionation, or fractionation, etc.) of the above-mentioned cells and organisms can be confirmed, for example, as follows. That is, 0.15 g of the hydrogel-forming polymer of the present invention is dissolved in 1.35 g of distilled water at a temperature lower than the above sol-gel transition temperature (for example, under ice cooling) to obtain 10 W.
  • Aqueous solution was prepared, and the aqueous solution was poured into a plastic Petri dish having a diameter of 35 mm, and heated to 37 ° C, whereby a gel having a thickness of about 1.5 mm was placed in the Petri dish. After formation, the weight (f gram) of the whole petri dish containing the gel is measured. Next, the whole petri dish containing the gel was allowed to stand at 37 ° C. for 10 hours in water in 250 mL, and then the weight (g gram) of the whole petri dish containing the gel was measured. The presence or absence of dissolution of the gel from is evaluated.
  • the weight loss rate of the gel is preferably 5.0% or less, more preferably 1.0%. It is preferably at most 0.1%.
  • the aqueous solution of the hydrogel-forming polymer of the present invention is gelled at a temperature higher than the above-mentioned sol-gel transition temperature, and then becomes a large amount (about 0.1 to 100 times the volume of gel). Even if immersed in water, the gel does not dissolve for a long time.
  • Such properties of the polymer used in the present invention are achieved, for example, by the presence of two or more (multiple) blocks having a cloud point in the polymer.
  • the above-mentioned pull-out nick F in which polyethylene oxide is bonded to both ends of polypropylene oxide, is used.
  • the present inventors have found that when a similar gel is prepared using —127, the gel dissolves completely in water after standing for several hours.
  • the concentration in water that is, ⁇ (polymer) / (polymer + water) ⁇ XI It is preferable to use a hydrogel-forming polymer capable of gelling at a concentration of 0% (%) and 20% or less (more preferably 15% or less, particularly 10% or less).
  • the physiologically active substance in the present invention refers to a substance that binds, reacts, or attracts cells or organisms.
  • Examples include chemotactic factors (chemotaxis factors), antibodies, cytokines and their receptors, cell adhesion factors, and the like.
  • Chemotaxis is a property in which a cell or microorganism accumulates or escapes according to the concentration ⁇ when a concentration difference of a certain chemical substance (chemotaxis factor) stimulates.
  • Chemotaxis is a property possessed by many cells such as microorganisms, leukocytes, cancer cells, and sperm. Microorganisms and cell organisms each have the ability to recognize specific chemotactic factors.
  • typical chemotactic factors include neutrophils, immunoglobulin-derived factors that act on macrophages, and other complement-derived factors that act on neutrophils, such as C3a, C5a, and N—Horminore et al.
  • lymphokine which is a lymphocyte-derived factor that acts on macrophages, peptidic factors that act on eosinophils, ekalectin, and the like. These are chemotactic factors for immunocompetent cells involved in allergic reactions.
  • vascular endothelial cell growth factor related to blood vessel induction and regeneration various cell growth factors such as vascular endothelial cell growth factor related to blood vessel induction and regeneration, and neural network induction and regeneration related nerve cell growth factor are also considered to be chemotactic factors.
  • the vascular system is also induced and regenerated by the gradient of oxygen concentration, and oxygen is known to be a negative chemotactic factor.
  • Chemotactic factors have also been implicated in the metastasis of cancer cells.
  • immune-related and cancer-related drugs that act directly on cells can be considered to have chemotaxis in many cases. (Physiotaxis factor)
  • Physical chemotaxis is a property in which cells or microorganisms gather or escape according to the difference in intensity when a difference in the intensity of a certain physical factor serves as a stimulus.
  • Physotaxis is a property of many microbial cells, each of which has the ability to recognize specific motility factors.
  • typical physical chemotaxis factors are electric field, magnetic field, gravitational field, luminous intensity, temperature, viscosity, etc.
  • the chemoattractant is a cell attracting ability NZN measured on the target cell by the following measurement method. Is preferably at least 1.2, more preferably at least 2, and even more preferably at least 10 chemotactic factors.
  • the cell attraction ability can be measured, for example, as follows.
  • the hydrogel-forming polymer (TGP-5) lg of the present invention obtained in Production Example 8 described below was dissolved at 4 ° C in 9 g of physiological saline containing a chemotactic factor to form the hydrogel of the present invention.
  • the concentration of the chemoattractant in the aqueous solution of the hydrogel-forming polymer must be set within a range that attracts the target cells, and is usually from 10 to 6 M to 10 to 5 M. Range. 1 g of this aqueous solution is heated to 37 ° C. to form a hydrogel having a surface area of 10 to 15 cm 2 (S / V ratio: 10 to 15).
  • the aqueous solution was filled into a 23 mL 1-mL syringe equipped with an injection needle and cooled to 4 ° C. Extrude in 10 seconds. At this time, the diameter of the narrow hydrogel obtained is about 3 mm and the length is about 14 cm, so that a hydrogel having a surface area of about 13 cm 2 can be obtained.
  • the high Dorogeru 1 g of S ⁇ V ratio 1 0-1 5 comprising said chemotactic factor 1 0- 6 M to 1 0- 5 M, a suspension of cells of interest (cell count: 1 0 6 / ml) to 1 Contact in a 4 mL disposable centrifuge tube and gently spin at 37 ° C for 4 hours.
  • the cell suspension is removed by decantation while leaving the hydrogel, and 10 mL of a 37 ° C saline solution is newly added to wash and remove the cells adhering to the surface of the gel at the opening. After repeating the washing operation three times, the mixture is cooled to 4 ° C. to dissolve the hydrogel, and the number N of cells migrated into the hydrogel is measured. On the other hand, the same measurement as described above was performed for the hydrogel of the present invention containing no chemotactic factor, and the number of cells N migrated into the hydrogel was determined. Measure NZN. Ask for.
  • a concentration gradient of the physiologically active substance is formed, and cells and organisms that have been substantially uniformly distributed in the hydrogel according to the concentration gradient are subjected to various portions in the gel at the mouth due to differences in chemotactic performance.
  • a physiologically active substance is uniformly mixed with an aqueous solution of a gel-forming polymer in a sol state, and the mixture in the sol state is heated to a temperature higher than the sol-gel transition temperature to a predetermined temperature. Hydrogel with shape Then, the cell / organism is brought into contact with a suspension of cells / organisms at a temperature higher than the sol-gel transition temperature to transfer the cells / organisms into a hydrogel of a predetermined shape.
  • FIG. 1 schematically shows an embodiment of the present invention according to the above methods 1) and 2)
  • FIG. 2 schematically shows an embodiment according to the above method 3).
  • Which of the above methods is adopted may be appropriately selected depending on the type of the target cell and the organism.
  • the shape of the hydrogel may be appropriately selected according to the purpose, and may be any shape such as a column, a disk, a rectangular parallelepiped, a sphere, a thin string, a fiber, a flake, a plate, a film, and an irregular shape. be able to.
  • the hydrogel containing the physiologically active substance is used to increase the frequency of contact with the cells in the cell suspension placed around the hydrogel. It is advantageous to increase the surface area per unit volume for the given shape given to the surface, and it is desirable to use any of spherical, thin, fiber, flake, plate, film, and irregular shapes . It is preferable that the predetermined shape given to the gel with a mouth opening is a shape having a surface area (S) / volume (V) ratio of at least 10 (cm ⁇ ), particularly at least 30 (cm- 1 ). More preferably, it is 60 (cm- 1 ) or more.
  • the method 3 it is preferable to agitate or circulate the cell suspension in order to increase the frequency of contact between the hydrogel and the cells in the cell suspension disposed around the hydrogel.
  • a number of sets of the hydrogel and the cell suspension arranged around it can be processed in parallel. At this time, by changing the concentration of the chemotactic factor in the gel of the hydrogel in each set, or by changing the contact time between the hydrogel of each set and the cell suspension, the target cells and organisms can be obtained. It can be fractionated and collected.
  • IMLP N-forinyl-methionyl-leucyl-phenylalanine: molecular weight 437.6, chemotactic peptides, LPS (Lipopolysaccharide), etc. are known as chemotactic factors for leukocytes (neutrophils).
  • LPS Lipopolysaccharide
  • chemotactic factors for leukocytes neurotrophils
  • a concentration gradient of these chemotactic factors is formed in the hydrogel of the present invention and brought into contact with a cell group containing leukocytes (for example, peripheral blood), the chemotaxis induced by these chemoattractants is generated.
  • High and low cells are separated in the hydrogel according to the concentration of the chemoattractant in the gel.Then, the portion of the gel where the target cells are present is cut out and cooled, and the cells are cooled. Drogel is converted into a sol, diluted with physiological saline or the like, and only the target cells can be collected by a method such as centrifugation.
  • a low-temperature sol-state aqueous hydrogel solution of the present invention When it is desired to collect a large amount of cells having affinity for iMLP or LPS from blood, these chemotactic factors are dissolved in a low-temperature sol-state aqueous hydrogel solution of the present invention.
  • the solution is dropped into physiological saline at a temperature higher than the gel transition temperature to gel in the form of microdroplets, and the small hydrogel of the present invention containing this chemotactic factor is heated to a temperature higher than the sol-gel transition temperature. Keep at temperature and recover from saline and disperse it in blood.
  • the mixture is stirred at a temperature higher than the sol-gel transition temperature as it is, only cells having an affinity for fMLP or LPS are taken into the hydrogel of the present invention in the form of microdroplets.
  • the hydrogel of the present invention in which cells have been taken in while maintaining the temperature higher than the sol-gel transition temperature, is collected by centrifugation, and washed. Thereafter, the gel of the present invention in which the cells were taken in at a temperature lower than the transition temperature was formed into a sol, diluted with physiological saline or the like, and further washed repeatedly to remove the hydrogel of the present invention. Collect cells.
  • the feature of this method is that only the cells in the cell suspension
  • the hydrogel of the present invention containing a chemotactic factor can move freely, and the size and shape of the gel of the present invention can produce a very high surface area per unit amount. Thus, high frequency contact between the cells and the hydrogel of the present invention can be expected.
  • by encapsulating various chemotactic factors in the hydrogel of the present invention, or by changing the conditions such as time and temperature functional recovery in a small and multiplex type can be expected.
  • pluripotent hematopoietic stem cells are contained in CD34 positive cells among hematopoietic cells, and CD34 positive in hematopoietic cells of transplant donors.
  • the rate has been used as one of the evaluations of hematopoietic stem cell transplantation.
  • CD34-positive cells cells that have the ability to migrate to chemokines, such as the chemokine receptor CXCR-4 ligand Stromal cell lder ived fact or-1 (SDF-l), have been transplanted.
  • SDF-l Stromal cell lder ived fact or-1
  • the hide-mouth gel of the present invention containing SDF-1 is used to evaluate reactivity to SDF_1 in CD34-positive cells and to separate cells that react with SDF-1.
  • CD34-positive cells were separated by magnetic bead method from hematopoietic cells collected from the bone marrow fluid, peripheral blood, or cord blood of the donor, and SDF-1 was added to the CD34-positive cell suspension.
  • the contained gel of the present invention is co-suspended and cultured with stirring for a certain period of time, and CD34-positive cells that have entered the gel of the present invention in response to SDF-1 are separated and recovered.
  • the recovery indicates the percentage of SDF-1 reactive cells, and it is expected that the homing activity of the donor cells can be evaluated.
  • the vesicles can be directly transplanted as hematopoietic stem cells having high-homing activity.
  • Sperm is a cell specialized for fertilization. It is the only cell in the life of an organism that has flagella and exhibits a sophisticated motor function, chemotaxis. This chemotaxis enables fertilization.
  • the hydrogel of the present invention is used to utilize only sperm having high migration ability based on chemotaxis for fertilization with an egg cell. After washing the collected semen, the spermatozoa are caused to float in a small amount of the hydrogel of the present invention in a sol state, and gelled as it is at a temperature higher than the sol-gel transition temperature.
  • the periphery of the microgel-like hide mouth gel of the present invention containing the spermatozoa is covered with a hydrogel of the present invention in an appropriate amount prepared separately and at an appropriate concentration.
  • the amount and concentration of the outer hydrogel of the present invention is such that only sperm having a high migratory ability can move inside the mebiol gel, and can be transferred from the hydrogel of the present invention within a certain period of time. Adjust so that it comes out of the suspension.
  • the hydrogel of the present invention containing sperm is suspended at a temperature higher than its sol-gel transition temperature in a plastic petri dish in which egg cells are placed in a culture solution.
  • Polypropylene Oxido-Polyethylene Oxide Copolymer (Propylene Oxide Z Ethylene Oxide Average Degree of Polymerization Approximately 60 Z180, manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd .: Pull Mouth F-127) 1 0 g was dissolved in 30 mL of dry clog form, 0.13 g of hexamethylene diisocyanate was added in the presence of phosphorus pentoxide, and the mixture was reacted at the boiling point of reflux for 6 hours.
  • the residue was dissolved in distilled water, and subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration membrane (Amicon PM-30) having a molecular weight cut off of 30,000 to obtain a high molecular weight polymer and a low molecular weight polymer.
  • the coalescence was fractionated.
  • the obtained aqueous solution was frozen to obtain an F-127 high polymer and an F-127 low polymer.
  • the F_127 high polymer (the hydrogel-forming polymer of the present invention, TGP-1) obtained as described above was dissolved in distilled water at a concentration of 8% by mass under water cooling.
  • TGP-1 the hydrogel-forming polymer of the present invention
  • poly (ethylene oxide) triol having an average molecular weight of about 700,000.
  • N-isopropyl acrylamide (manufactured by Eastman Kodak Co., Ltd.) 96 g, N-attaliroxysuccinimide (manufactured by Kokusan Chemical Co., Ltd.) 17 g, and n-butyl methacrylate (Kanto Chemical Co., Ltd.) 7 g) was dissolved in 400 ml of black form, and after purging with nitrogen, 1.5 g of N, N, azobisisobutyl-to-trile was added and polymerized at 60 ° C for 6 hours. Let me do. After the reaction solution was concentrated, it was reprecipitated (reprecipitated) in getyl ether.
  • the solids are collected by filtration, dried in vacuo, and dried with 78 g of poly (N-isopropylacrylamide) _N_atalyloxysuccinimide-co- n -butylmethylacrylate Rate).
  • the solid matter After collecting the solid matter by filtration, the solid matter is vacuum-dried, and the poly (N-isopropylacrylyl amidodo-n-butyl methacrylate) of the present invention in which a plurality of poly (N-isobutylacrylamide) and polyethylene oxide are combined.
  • An oral gel-forming polymer (TGP_3) was obtained.
  • the TGP-3 thus obtained was dissolved in distilled water at a concentration of 5% by mass under ice-cooling, and its sol-gel transition temperature was measured to be about 21 ° C.
  • TGP_3 2.0 g of the above-described gel-forming polymer of the present invention (TGP_3) was placed in an EOG (ethylene oxide gas) sterilization bag (manufactured by Hogi Medical Co., Ltd., trade name: Hybrid sterilization bag).
  • EOG ethylene oxide gas
  • the bag was filled with EOG using an EOG sterilizer (Easy Pack, manufactured by Inuchi Seieido) (EOG concentration: about 900 mg / L), and left at room temperature for 24 hours. After leaving at 40 ° C. for half a day, the EOG was removed from the bag and air-sealed.
  • the bags were placed in a vacuum dryer (40 ° C) and sterilized by leaving them for half a day with occasional air-rate.
  • the precipitate was dissolved again in 6 L of distilled water to obtain a hollow fiber filter having a molecular weight cut off of 100,000.
  • the solution was concentrated to 2 L at 10 ° C using a type ultrafiltration membrane (H1P100-43, manufactured by Amicon).
  • the concentrated solution was diluted by adding 4 L of distilled water, and the dilution operation was repeated.
  • the above dilution and ultrafiltration / concentration operations were further repeated five times to remove those having a molecular weight of 100,000 or less.
  • the substance not filtered by the ultrafiltration (remaining in the ultrafiltration membrane) is collected, freeze-dried, and formed into a hydrogel-forming polymer (TGP-) of the present invention having a molecular weight of 100,000 or more. 4) 60 g was obtained.
  • Ig of the hydrogel-forming polymer (TGP-4) of the present invention obtained as described above was dissolved in 9 g of distilled water under ice cooling.
  • the sol-gel transition temperature of this aqueous solution was measured, the sol-gel transition temperature was found to be 25.
  • the hide-mouth gel-forming polymer (TGP-3) of the present invention of Production Example 3 was dissolved in distilled water at a concentration of 1 °% by mass, and ⁇ at 37 ° C. was measured. 0 5 Pa ⁇ sec.
  • agar was dissolved in distilled water at a concentration of 2% by mass at 90 ° C, gelled at 10 ° C for 1 hour, and J at 37 ° C was measured. Is a device measurement It was over the limit (l X l 0 7 P a ⁇ sec).
  • the concentrated solution was diluted by adding 4 L of cold distilled water, and the ultrafiltration and concentration operation was performed again. The above dilution and ultrafiltration / concentration operations were further repeated 5 times to remove those having a molecular weight of 100,000 or less.
  • the substance not filtered by the ultrafiltration (the substance remaining in the ultrafiltration membrane) is collected, frozen and dried, and the hydrogel-forming polymer of the present invention having a molecular weight of 100,000 or more (TGP-5) 72 g were obtained.
  • the concentrated solution was diluted by adding 4 L of cold distilled water, and the ultrafiltration and concentration operation was performed again. The above dilution and ultrafiltration / concentration operations were further repeated 5 times to remove those having a molecular weight of 100,000 or less.
  • the polymer not filtered by the ultrafiltration (remaining in the ultrafiltration membrane) is collected, freeze-dried, and subjected to the hydrogel-forming polymer of the present invention having a molecular weight of 100,000 or more (TGP-6). ) 40 g were obtained.
  • the concentrated solution was diluted by adding 4 L of cold distilled water, and the ultrafiltration and concentration operation was performed again. The above dilution and ultrafiltration / concentration operations were further repeated 5 times to remove those having a molecular weight of 100,000 or less.
  • the material not filtered by the ultrafiltration (remaining in the ultrafiltration membrane) is collected, freeze-dried, and subjected to the hydrogel-forming polymer of the present invention having a molecular weight of 100,000 or more (TGP-7 ) 22 g were obtained.
  • Ig of the hydrogel-forming polymer (TGP-7) of the present invention obtained as described above was dissolved in 9 g of distilled water under ice-cooling.
  • the sol-gel transition temperature of this aqueous solution was measured, the sol-gel transition temperature was found to be 37.
  • the hydrogel-forming polymer (TGP-5) of the present invention obtained in Production Example 8 was sterilized by E0G in the same manner as in Production Example 4, and its lg was 9 g 'D'MEM medium at 4 ° C, 0.5 ml each (about 0.5 mm thick) was injected onto the above soft agar gel and gelled at room temperature .
  • the sol-gel transition temperature of this hydrogel was 18 ° C. And border the 8.
  • the sedimented cells were resuspended in 20 ⁇ L of physiological saline, the number of cells was counted, and the number of neutrophils transferred into the hydrogel of the present invention was measured. Further, after removing the hydrogel of the present invention, the number of cells transferred to soft agar was observed under a microscope, and the results are summarized in Table 1.
  • the hydrogel-forming polymer (TGP-I5) of the present invention obtained in Production Example 8 was sterilized by EOG in the same manner as in Production Example 4, and its lg was changed to 9 g of D. And MEM medium (Dulbecco's Modification Eagle's Medium, GIBCO, containing 10% Fetal Calf Serum) under ice-cooling.
  • MEM medium Dulbecco's Modification Eagle's Medium, GIBCO, containing 10% Fetal Calf Serum
  • fMLP was dissolved at 4 ° C in D, MEM medium of the above-mentioned gel-forming polymer (TGP-5) (concentration: 1 CT 6 M).
  • This fMLP-containing high-mouth gel-forming polymer (TGP-5) D'MEM medium was placed in a 23 mL 1-mL syringe with an injection needle, and cooled to 4 ° C. 1 mL of this 4 ° C aqueous solution was extruded into 10 mL of phosphate buffered saline (PBS) at 37 ° C in a disposable centrifuge tube (Falcon, 14 mL). Then, a string-like hydrogel was formed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the gel was cooled to 4 ° C to form a string-shaped gel with a sol, diluted with PBS and washed by centrifugation to prepare a light-Giemsa stained sample of the cells taken up in the gel and observed under a microscope.
  • fMLP erythrocytes and platelets
  • Example 2 The same experiment as in Example 2 was performed, except that f MLP was not contained in the hydrogel.
  • f MLP was not contained in the hydrogel.
  • hydrogel capable of separating (fractionating, fractionating or sorting, etc.) cells and organisms having various running performances.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

生理活性物質の濃度差に応じて、細胞の選択的な移動を可能とするハイドロゲルを用いて、細胞・生物の分離を行う。従来の技術では達成し得なかった多様な走性能を有する細胞・生物の分離（分画、分別ないし分取等）を可能にするハイドロゲルを提供する。

Description

明 細 書
細胞分離用ハイ ドロゲルおよび細胞の分離方法
技術分野
本発明は、 細胞およびノ又は生物 （以下、 「細胞 · 生物」 という ) を、 化学走性または場の性質の強弱に従って移動する性質 （電気 走性、 磁気走性、 光走性、 温度走性、 粘度走性など） を利用して、 細胞、 微生物等を分離するためのハイ ドロゲル、 およびこのよ うな ハイ ドロゲルを利用する細胞 ·生物の分離方法に関する。
よ り詳しく は、 本発明は、 多く の生物に本質的に備わっている生 理活性物質の濃度に従って移動する性質 （化学走性） 、 または場の 性質の強弱に従って移動する性質を利用して、 細胞、 微生物等を選 択的に移動させ、 これにより該細胞 · 生物を分離する （すなわち、 分離 （分画、 分別、 ないし分取） 等の、 選択的な移動を伴う操作を 行う） ためのハイ ド口ゲルおよびこのよ うなハイ ド口ゲルを利用す る細胞 · 生物の分離方法に関する。
本発明のハイ ド口ゲルを利用して、 例えば、 ア ト ピー性皮膚炎、 アレルギー、 リ ゥマチ等の免疫疾患に関連する因子に対する化学走 性能の差異によって細胞を分離 （分画、 分別、 ないし分取等） する ことが可能となる。
更には、 本発明のハイ ドロゲルを利用して、 例えば、 癌の治療法 に関連し癌細胞の転移現象等に関連する因子に対する化学走性能の 差異によって細胞を分離 （分画、 分別、 ないし分取等） することが 可能となる。
更には、 本発明のハイ ドロゲルを利用して、 例えば、 再生医療の 分野に関連し血管、 神経等の組織、 臓器の誘導、 形成、 再生等に関 連する因子に対する化学走性能の差異によって細胞を分離 （分画、 分別、 ないし分取等） することが可能となる。
更には、 本発明のハイ ドロゲルを利用して、 例えば、 優良精子の 選別技術等に関連し運動能等の差異によって細胞を分離 （分画、 分 別、 ないし分取等） することが可能となる。
更には、 本発明のハイ ドロゲルを利用して、 例えば、 電場に対す る走性 （電気泳動度等） の差異を利用して細胞を分離 （分画、 分別 、 ないし分取等） することが可能となる。 背景技術
運動能を有する生物 （ないしは、 その部分) 力 s、 外部からの刺激 に反応して運動を起こし、 その運動性に一定の方向性が認められる 場合、 この生物の有する性質を走性と呼び、 一般によく知られた性 質である。 この刺激が物質である場合には、 その性質は化学走性と 呼ばれる。 他方、 その刺激が物理的刺激の場合には、 その物理的刺 激に応じて、 電気走性、 磁気走性、 光走性、 温度走性、 粘度走性等 と呼ばれている。
以上等の運動能を有する生物としては下等動物、 植物、 微生物、 細胞 · 生物が挙げられ、 地球上のほとんどの生物が走性能を有して いると考えられる。 近年、 種々の走性に関する研究の発展に伴い、 生物の走性、 特に細胞の走性が生体の重要な機能を荷っていること が判明してきた。
例えば、 血管の誘導、 再生には血管内皮細胞の増殖が必要であり 、 血管內皮細胞増殖因子濃度に勾配があるよ うな場に応じて血管が 誘導、 再生されること即ち血管内皮細胞の化学走性能によって誘導 、 再生が行われているこ とが判明している。 また、 栄養要求性の高 い癌細胞は、 血管内皮細胞増殖因子を分泌するこ とによ り、 ホス ト の血管から癌組織へ血管を誘導することが良く知られている。 更に 、 血管系は酸素濃度の勾配によっても誘導、 再生されることが判明 している。 血管系の重要な機能が組織、 臓器に酸素を供給するこ と であることから、 低酸素領域に血管系を誘導、 再生し酸素濃度をコ ン ト ロールするための機能と考えられる。 即ち、 血管内皮細胞は酸 素に対して負の化学走性能を示すことになる。
同様に神経網の誘導、 再生も、 生体内では場に神経細胞増殖因子 の濃度勾配を付与することによ り巧妙に行われている。 また、 ァ レ ルギー反応を惹起するァレルゲンに反応して白血球等の免疫関連細 胞の化学走性が発揮され、 白血球等が反応部位に集積されることは 良く知られている。 更には、 癌の転移現象についても化学走性能の 高い癌細胞によって起こる可能性が高まっている。
他方、 新しい抗癌剤の開発に於いて、 免疫関連細胞に対して化学 走性を惹起する性質を有し、 且つ癌組織に選択的に集積する薬剤が 注目を集めている。 即ち、 化学走性を利用した薬剤の開発が期待さ れている。
上記したような化学走性以外に、 物理的刺激による走性も良く知 られている。 例えば、 植物の光の方向への成長は走光性と して良く 知られている。 また、 細胞電気泳動に於いて種々の電気走性能を示 す細胞が知られている。 更には、 精子等の運動能の高い細胞は、 そ の運動能と機能との高い相関性を有することが判明してきている。 以上のように生物、 特に細胞の有する走性能、 特に化学走性能は 生体の機能制御にとって非常に重要な性質であり、 生命現象を理解 しょう という観点から、 更には、 前述したよ うに各種の免疫疾患、 癌等に対する新しい治療法の開発、 更には病変または欠損している 組織、 器官を誘導、 再生する為の再生医療の開発という観点から、 近年、 大いに注目を集めている。 このように重要な生物の機能である走性能を測定する装置に関し ては従来から研究開発が行われており、 細胞懸濁液と化学走性因子 溶液との間に微孔性の膜を設置し、 該膜の微孔を通過して因子側に 移行する細胞数を測定するボイデンチヤンパー方式と、 微孔性膜の かわりに細胞がギリギリ通過できる微少流路をシリ コン単結晶基板 上に多数形成したアレイを用いて、 細胞懸濁液と化学走性因子溶液 とを接触させ該微少流路を通過する細胞数を顕微鏡観察によつて測 定する方法等である。 しかしながら、 従来、 開発されてきたこれら の装置、 または方法を用いた場合には、 特定の化学走性因子に対し てある閾値以上の化学走性能を有する細胞の数のみの測定しかでき なレ、。
我々の生体を構成している組織、 臓器は非常に多くの種類の細胞 から形成されている。 更に細胞はその環境によって絶えず変化して いると考えられている。 例えば、 免疫担当細胞群も多種の細胞から 成っていて、 リ ンパ球とマクロファージに大別される。 リ ンパ球に は B リ ンパ球と Tリ ンパ球があり、 B リ ンパ球は外部刺激によ り多 くの形質細胞へと分化する。 一方、 T リ ンパ球はその機能によって キラー T細胞、 ヘルパー T細胞、 サブレッサー T細胞 . 生物の多様 な T細胞サブポピュ レーショ ン （subpopulat i on) に分類される。 また、 マク ロファージについても、 多様なサブポピュレーショ ンが 存在することが明らかになりつつある。
また、 癌組織中の癌細胞も多様で、 薬剤または放射線耐性、 増殖 能、 転移性等に大きな分布が存在することが判明している。 更には 、 骨髄中に存在する幹細胞は環境によって多様な細胞に分化するこ とも良く知られている。
当然のことながら、 これらの多種多様な細胞群はそれぞれ独自の 走性能を有しており、 それぞれの走性能毎に細胞の分画ができ、 更 に、 それぞれの走性能を有する細胞を分別、 分取することが可能と なれば、 細胞機能の解明に向かって大きな前進となる。 そして今日 、 有効な治療法のない免疫関連疾患、 癌等の新しい治療法の開発、 およびより効率の良い組織 · 器官の再生医療技術の開発が可能にな るものと考えられる。
しかしながら、 前述したように、 現在の細胞走性能の測定技術で は、 多様な走性能を有する細胞 · 生物の分離 （分画、 分別ないし分 取等） は実際には不可能である。 発明の開示
本発明の目的は、 上記した従来技術の欠点を解消できる細胞 · 生 物分離用ハイ ドロゲルおよび細胞 · 生物の分離方法を提供すること にある。
本発明の他の目的は、 上述したよ うに従来の技術では達成し得な かった多様な走性能を有する細胞 · 生物の分離 （分画、 分別ないし 分取等） を可能にするハイ ド口ゲルを提供することにある。
本発明の更に他の目的は、 ハイ ドロゲルを用いて、 それぞれの走 性能に応じて細胞 · 生物を分離する方法を提供することにある。 本発明者は鋭意研究の結果、 特定の構成を有するハイ ドロゲル、 ないしは特定の物質のゲル内またはゲル内外の濃度差を実現できる ハイ ド口ゲルを利用して、 細胞 · 生物の分離を行う ことが、 上記目 的の達成のために極めて効果的なことを見出した。
本発明の細胞 · 生物分離用ハイ ド口ゲルは上記知見に基づく もの であり、 よ り詳しく は、 生理活性物質の濃度差に応じて、 細胞の選 択的な移動を可能とする細胞 ·生物分離用ハイ ドロゲルである。 本発明によれば、 例えば、 低温でゾル状態、 高温でゲル化する熱 可逆的なゾルーゲル転移現象を示し、 且つゾルーゲル転移温度よ り 高い温度で該ゲルは実質的に水不溶性である上記細胞 · 生物分離用 ハイ ドロゲルが提供される。
本発明によれば、 更に、 水と、 ハイ ドロゲル形成性高分子とを少 なく とも含むゲル形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度では可逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組 成物を用い ；
前記ゲル形成性の組成物のゾルーゲル転移温度よ り高い温度で、 ゲル状態の該組成物の一方の面側に生理活性物質を含有する水溶液 を接触させ、 且つ、 該ゲル状態の組成物の他方の面側に細胞 · 生物 の懸濁液を接触させる工程、
ゲル状態の組成物内に生理活性物質の濃度勾配を形成しつつ、 該 濃度勾配によつて惹起される化学走性によって、 前記懸濁液から細 胞 · 生物をゲル状態の組成物内に移行させる工程、
該細胞 · 生物が移行したゲル状態の組成物の少なく とも一部分を 、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度より低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法 が提供される。
本発明によれば、 更に、 水と、 ハイ ドロゲル形成性高分子とを少 なく とも含むゲル形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度では可逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組 成物を用い ；
ゾル—ゲル転移温度よ り低い温度で、 ゾル状態の前記ゲル形成性 の組成物に細胞 · 生物を添加して、 該組成物内に細胞 · 生物を懸濁 させる工程、
細胞 · 生物が懸濁した前記ゾル状態の組成物を、 そのゾルーゲル 転移温度よ り高い温度でゲル化させ、 細胞 · 生物が実質的に均一に 内部に分散したゲル状態の組成物を形成する工程、
ゾルーゲル転移温度より高い温度で、 前記ゲル状態の組成物を、 生理活性物質を含有する水溶液に接触させる工程、
前記ゲル状態の組成物内に生理活性物質を移行させて、 組成物中 に生理活性物質の濃度勾配を形成させつつ、 該濃度勾配にしたがつ て該組成物中の細胞 · 生物を、 その化学走性能の違いによってゲル 状態の組成物内で再配置させる工程、
該細胞 · 生物が再配置したゲル状態の組成物の少なく とも一部分 を、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法 が提供される。
本発明によれば、 更に、 水と、 ハイ ドロゲル形成性高分子とを少 なく とも含むゲル形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度では可逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組 成物を用い ；
前記ゲル形成性の組成物を、 そのゾルーゲル転移温度より低い温 度でゾル状態と し、 該ゾル状態の組成物中に生理活性物質を実質的 に均一に混合する工程、
該ゾル状態の組成物をゾルーゲル転移温度よ り高い温度で、 所定 の形状を付与したゲル状態とする工程、
ゾルーゲル転移温度よ り高い温度で、 該ゲル状態の組成物を細胞 • 生物の懸濁液と接触させて、 該懸濁液から細胞 · 生物をゲル状態 の組成物内に移行させる工程、
細胞 · 生物が移行したゲル状態の組成物を、 細胞 · 生物の懸濁液 から分離する工程、 および、
分離したゲル状態の組成物をゾルーゲル転移'温度よ り低い温度で ゾル状態と し、 該ゾル状態の組成物から、 該耝成物内に移行した細 胞 ♦ 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法が 提供される。
本発明によれば、 更に、 水と、 ハイ ドロゲル形成性高分子とを少 なく とも含むゲル形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度では可逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組 成物を用い ；
ゲル状態の前記ゲル形成性の組成物を、 物理的性質が連続的に変 化する場に配置し、 該物理的性質の勾配を該ハイ ドロゲル内に形成 する工程、
該ゲル状態の組成物を細胞 · 生物の懸濁液に接触させ、. それぞれ の性質の勾配によって惹起される走性によって、 該細胞 · 生物の懸 濁液から該ゲル状態の組成物内に細胞 · 生物を移行させる工程、 該細胞 · 生物が移行したゲル状態の組成物の少なく とも一部分を 、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法 が提供される。
本発明によれば、 更に、 水と、 ハイ ドロゲル形成性高分子とを少 なく とも含むゲル形成性の耝成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度では可逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では実質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組 成物を用い ；
前記ゲル形成性の組成物をゾルーゲル転移温度よ り低い温度でゾ ル状態と し、 該ゾルに細胞 · 生物を添加して、 細胞 · 生物が懸濁し た組成物を形成する工程、
該細胞 · 生物が懸濁した組成物をゾルーゲル転移温度よ り高い温 度でゲル化させ、 該細胞 · 生物が実質的に均一に内部に分散したゲ ル状態の組成物を形成する工程、
該ゲル状態の組成物を物理的性質が連続的に変化する場に配置し て、 該組成物中にそれぞれの物理的性質の勾配を形成する工程、 該物理的性質の勾配に従って、 ゲル状態の組成物中に実質的に均 一に分布していた細胞 · 生物を、 それぞれの物理的性質に対する走 性能の違いによってゲル状態の組成物で再配置させる工程、
該細胞 · 生物が再配置したゲル状態の組成物の少なく とも一部分 を、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法 が提供される。
上記構成を有する本発明においては、 ハイ ドロゲル （例えば、 低 温でゾル状態、 高温でゲル化するゾルーゲル転移現象を示し、 該ゾ ルーゲル転移が熱可逆的であり、 且つ該ゾルーゲル転移温度よ り高 い温度で該ゲルは実質的に水不溶性であるハイ ドロゲル） を用いて 、 走性能に応じて細胞 · 生物を分離 （分画、 分別ないし分取等） す ることが可能となる。 すなわち、 本発明においては、 例えば、 細胞 • 生物に化学走性を惹起する生理活性物質 （化学走性因子） の濃度 勾配を該ハイ ドロゲル中に作り出す、 あるいはハイ ドロゲルの内部 と外部で生理活性物質の濃度差を持たせることによって、 細胞 · 生 物を化学走性の差異によって分離 （分画、 分別ないし分取等） する ことができる。
更に、 本発明においては、 細胞 ' 生物に電場、 磁場、 光度、 温度 、 粘度等の諸性質の勾配を該ハイ ド口ゲル中に作り出すことによつ て細胞 · 生物をそれぞれの性質に対する走性の差異によって分離 （ 分画、 分別ないし分取等） することができる。
本発明の 1つの好ましい態様においては、 例えば、 上記のハイ ド 口ゲルを用いて、 そのゾルーゲル転移温度よ り高い温度で、 生理活 性物質を含有する水溶液と分別用細胞 · 生物の懸濁液を隔離し、 該 ハイ ドロゲル内に該生理活性物質の濃度勾配を作製し、 該濃度勾配 によって惹起される化学走性によって該細胞 · 生物懸濁液から該ハ イ ド口ゲル内に細胞 · 生物を移行させることができる。 その結果、 分別用細胞 · 生物の化学走性能の違いによつて各種細胞 · 生物のハ ィ ドロゲル内への移行性または移行距離が異なるため、 該細胞 · 生 物が移行したハイ ドロゲル、 または走化性能の異なる即ち移行距離 の異なる細胞 · 生物を含有する部分のハイ ドロゲルを切り出して、 該ハイ ドロゲルのゾルーゲル転移温度よ り低い温度に冷却すること によ り、 細胞 · 生物を含有するゾル状態を作製することができる。 次いで大量の細胞 · 生物培養液または保存液を該ゾルに加え、 ゾル ―ゲル転移温度よ り高い温度でもゲル化しないよ うに高分子溶液を 希釈した後、 遠心分離または膜分離等の通常の分別方法で細胞 · 生 物を分離 （分画、 分別ないし分取等） することが可能である。
本発明の他の好ましい態様においては、 上記ハイ ドロゲルをゾル ―ゲル転移温度よ り低い温度にすることによってゾル状態にし、 分 別用細胞 · 生物を添加し細胞 · 生物懸濁液を作製することができる 。 次いで該細胞 · 生物懸濁液を上記のゾルーゲル転移温度よ り高い 温度にするこ とによってゲル化させ、 分別用細胞 · 生物が実質的に 均一に内部に分散したハイ ドロゲルを作製する。 次いで該ハイ ドロ ゲルを生理活性物質 （化学走性因子） を含有する水溶液に接触させ 該ハイ ドロゲル中に該生理活性物質を移行させることによって、 該 ハイ ドロゲル中に該生理活性物質の濃度勾配を作製する。 該濃度勾 配にしたがって該ハイ ド口ゲル中に実質的に均一に分布していた細 胞 ·生物が化学走性能の違いによつてハイ ド口ゲル内の各部位に再 配列される。 次いで上記のハイ ド口ゲルの各部位を切り出し、 上述 した方法と同様の方法によって、 細胞 · 生物を化学走性能の違いに よって分離 （分画、 分別ないし分取等） することが可能である。 本発明の更に他の好ましい態様においては、 上記のハイ ドロゲル をゾルーゲル転移温度よ り低い温度にすることによってゾル状態の 水溶液と し、 該ゾル状態の水溶液に生理活性物質を実質的に均一に 混合する工程、 該ゾル状態の混合液を該ゾルーゲル転移温度よ り高 い温度に昇温して所定の形状を付与したハイ ド口ゲルとする工程、 該所定形状のハイ ドロゲルを該ゾルーゲル転移温度より高い温度で 細胞 · 生物の懸濁液と接触させる工程、 細胞 · 生物が移行した所定 形状のハイ ド口ゲルを細胞 · 生物の懸濁液から回収する工程、 回収 した所定形状のハイ ドロゲルを該ゾルーゲル転移温度よ り低い温度 にすることによってゾル状態の水溶液と して、 分画、 分別された細 胞 · 生物を回収する工程によって目的の細胞 · 生物を分離 （分画、 分別、 ないし分取等） することも可能である。
本発明の更に他の好ましい態様においては、 該ハイ ドロゲルを電 界強度、 磁界強度、 光度、 温度、 粘度等から選ばれる物理的性質が 連続的に変化する場に設置し該性質の勾配を該ハイ ド口ゲル内に作 製し、 次いで該ハイ ドロゲルを分別用細胞 · 生物の懸濁液に接触さ せ、 それぞれの性質の勾配によつて惹起される走性によつて該細胞 • 生物懸濁液から該ハイ ド口ゲル内に細胞 · 生物を移行させること ができる。 該分別用細胞 · 生物のそれぞれの物理的性質に対する走 性能の違いによつて各種細胞 · 生物のハイ ド口ゲル内への移行性ま たは移行距離が異なる。 次いで細胞 · 生物が移行したハイ ドロゲル または走性能の異なる、 即ち移行距離の異なる細胞 · 生物を含有す る部分のハイ ドロゲルを切り出し該ハイ ドロゲルのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却することにより細胞 · 生物を含有するゾル 状態を作製する。 次いで大量の細胞 · 生物培養液または保存液を該 ゾルに加え、 ゾルーゲル転移温度より高い温度でもゲル化しないよ うに高分子溶液を希釈した後、 遠心分離または膜分離等の通常の分 別方法で細胞 · 生物を分離 （分画、 分別、 ないし分取等） すること が可能である。
本発明の更に他の好ましい態様においては、 該ハイ ドロゲルをゾ ルーゲル転移温度よ り低い温度にすることによってゾル状態にし、 分別用細胞 · 生物を添加し細胞 · 生物懸濁液を作製することができ る。 次いで該細胞 · 生物懸濁液を上記のゾルーゲル転移温度よ り高 い温度にすることによつてゲル化させ、 分別用細胞 · 生物が実質的 に均一に内部に分散したハイ ドロゲルを作製する。 次いで該ハイ ド 口ゲルを電界強度、 磁界強度、 光度、 温度、 粘度から選ばれる性質 が連続的に変化する場に設置し該ハイ ドロゲル中にそれぞれの性質 の勾配を作製する。 該勾配に従って該ハイ ドロゲル中に実質的に均 一に分布していた細胞 · 生物がそれぞれの性質に対する走性能の違 いによってハイ ドロゲル内の各部位に再配列される。 次いで上記の ハイ ドロゲルの各部位を切り出し上記の方法と同様の方法によって それぞれの走性能の違いによって細胞 · 生物を分離 （分画、 分別、 ないし分取等） することが可能である。 本発明者らの知見によれば、 本発明の細胞 · 生物分離 （分画、 分 別、 ないし分取等） 用のハイ ドロゲルは、 疎水結合を架橋の少なく とも一部に利用していると推定される。 疎水結合は種々の物理的結 合の中で唯一、 温度昇すると結合が強くなる結合である。 この疎水 結合を架橋結合に用いると、 低温で溶液状態 （ゾル） で高温でゲル 化する本発明に好適に用いられるハイ ドロゲルを合成することが可 能である。 また、 架橋点の疎水結合力を変えることによって、 該ハ ィ ドロゲルのゾルーゲル転移温度を変えることが可能である。 本発 明のハイ ド口ゲルのゾルーゲル転移温度は、 0 °Cより高く 4 5 °C以 下であることが好適である。 例えば、 上記したハイ ドロゲルの物性 が、 細胞 · 生物、 微生物、 組織 ·器官等を該ハイ ドロゲルの中に埋 入し、 且つ、 該ハイ ドロゲルから回収する工程を、 熱的損傷または 酵素による損傷を実質的に与えることなく実施することを可能にす る。
これに対して、 従来よ り細胞 ·生物 ·組織培養に使用されてきた 寒天ゲル （正の温度一溶解度変化を示す） は、 架橋が主と して結晶 化構造によつて形成されているため、 結合力が強くゲルがゾルに転 移する温度は約 9 5 °Cで生理的温度範囲 （通常は 0 °C〜 4 0 °C ) よ り も著しく高いため細胞 · 生物、 微生物、 組織 · 器官等の寒天ゲル 中への埋入、 回収は不可能であった。 従来のアルギン酸ゲル （正の 温度一溶解変化を示す） の場合は、 架橋がイオン結合によって形成 されているために結合力が強く、 生理的条件下でゲルをゾルに転移 させることは困難であり、 細胞 ， 生物等を該ゲル中に埋入、 回収す ることはできなかった。 更に、 従来のコラーゲン、 ゼラチンゲル （ いずれも、 正の温度一溶解度変化を示す） の場合は架橋が結晶化構 造、 またはイオン結合によって形成されているためにゲルをゾル化 するためにコラゲナーゼ、 ゼラチナーゼ等の酵素を必要とする。 従 つて、 生理的条件下 （コラゲナーゼ、 ゼラチナーゼ等の使用は生物 体組織に酵素反応による損傷を与える） で細胞 · 生物、 組織 · 器官 等を回収することが困難であった。
一方、 本発明のハイ ド口ゲルのも う 1つの重要な性質は、 該ハイ ドロゲル中で細胞 · 生物、 微生物、 組織 · 器官等が、 （ある程度ま で） 動く ことができることである。 上記の物性を獲得するためには 上記のハイ ドロゲルの三次元網目構造の架橋点結合が強すぎないこ とが不可欠である。 一般的にハイ ドロゲルの三次元網目の架橋点の 結合エネルギーを A Fとすると、 架橋点の寿命 は次式で表さ れる。 τ = τ 。 e x p ( Δ F / K T )
ここで架橋点寿命がて の三次元網目構造を有するハイ ドロゲルの 場合は、 1 / ( s e c—1 ) よ り も高い周波数を有する動作に対し ては該ハイ ドロゲルの架橋点は結合した状態、 即ち架橋構造体とし て対応し、 ΐ Ζ τ ( s e c—1 ) より も低い周波数を有する動作に対 しては該ハイ ドロゲルの架橋点は非結合の状態、 即ち架橋構造を有 さない液体として対応する。 これは、 該ハイ ド口ゲルは非常に速い 動作に対しては固体と して、 非常にゆっく り した動作に対しては液 体と してそれぞれ振舞う ことを意味している。 これは細胞 . 生物、 微生物、 組織等を埋入した該ハイ ド口ゲルを運搬する、 または切断 する際に生ずる動作 （通常、 動きの周波数は高く、 約 1 0— 2 s e c 1オーダーを越える） に対しては該ハイ ドロゲルは固体と して振 舞うのに対して、 該ハイ ドロゲル中で細胞 · 生物、 微生物、 組織等 が、 移動する、 または増殖するような周波数の低い、 約 1 0 _ 4 s e c 1オーダーよ り小さいゆつく り した動作に対しては液体として振 舞う。 従って、 該ハイ ド口ゲル中で細胞 · 生物、 微生物、 組織等が それぞれの走性能によって移動することが可能である。
上記等の性質を有する三次元網目構造を形成する架橋点の結合ェ ネルギ一と しては生理的温度範囲 （ 0 °C〜 4 0 °C ) における熱エネ ルギー （R T ) と同等度であることが好ましく、 数十〜数百 k c a 1 / m o 1 と結合エネルギーの高い共有結合、 結晶化構造、 イオン 結合による架橋構造によって形成される三次元網目構造体は本発明 のハイ ドロゲルとしては不適であり、 数 k c a 1 / m o 1 の結合ェ ネルギーを有する分散力による結合、 水素結合または疎水結合によ る三次元網目構造体が本発明のハイ ドロゲルと して好適に使用可能 である。
前述したよ うに、 疎水結合によって形成きれる三次元網目構造体 、 即ちハイ ドロゲルは、 疎水結合は温度の上昇と共に強くなるとい う性質を有するために、 低温でゾル、 高温でゲル化する。 従って、 他の結合、 例えば水素結合、 分散力等による結合を利用したハイ ド 口ゲルとはゾルーゲル転移の温度依存性が逆になる。 疎水性結合を 利用したハイ ドロゲルの物性は、 細胞 · 生物を低温ゾル状態で包埋 することができるため、 包埋時の熱的損傷を回避できるという点で 従来のハイ ド口ゲルよ り も本発明の細胞 · 生物分画用ハイ ド口ゲル と しては好適に使用可能である。 更に、 疎水性結合を利用したハイ ド口ゲルの転移は熱的に可逆的であるため、 該ゲルに包埋した細胞 • 生物から該ゲルを除去する際にも低温でゲルを溶解でき、 容易に 且つ熱的損傷を与えることなく該ゲルから細胞 · 生物を回収するこ とが可能である。 図面の簡単な説明
図 1 は、 本発明の好適な態様の模式斜視図である。
図 2は、 本発明の他の好適な態様の模式斜視図である。 発明を実施するための最良の形態 以下、 必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明 する。 以下の記載において量比を表す 「部」 および 「％」 は、 特に 断らない限り質量基準とする。
(細胞 · 生物分離用ハイ ド口ゲル）
本発明の細胞 · 生物分離 （分画、 分別、 ないし分取等） 用ハイ ド 口ゲルは、 その水溶液がゾルーゲル転移温度を有するハイ ドロゲル 形成性の高分子を含み、 よ り低い温度でゾル状態、 よ り高い温度で ゲル化する熱可逆的なゾルーゲル転移を示す。 本発明において、 「 細胞 ' 生物」 とは、 「細胞および Z又は生物」 の意味であり、 任意 の生理活性物質に対して何らかの走性を示す限り、 1以上の細胞を 含む生物 （植物および動物） に関連するかないしは由来する任意の 細胞および細胞集合体を含む。 本発明において、 この細胞および細 胞集合体の形態は特に制限されず、 例えば、 単細胞、 多細胞の生物 又はその器官、 微生物、 精子、 卵子等を包含する。
(分離）
本発明において 「分離」 とは、 上記した細胞 · 生物を、 それらの 有する任意の走性の差異に基づいて、 それらの空間的な位置に差異 をつけることを言う。 本発明において、 この 「空間的な位置に差異 をつける」 形態は特に制限されない。
他の観点からは、 本発明において、 「分離」 とは、 上記した細胞 および/又は生物の化学走性または物理的性質に対応する走性に基 づく、 ゲル内および/又はゲル一外部環境の間の選択的な移動を利 用して、 該細胞および/又は生物の配置に何らかの選択性を実現で きる任意の分離操作を言う。 本発明における 「分離」 としては、 例 えば、 分画、 分別、 ないし分取等が挙げられる。
(ゾルーゲル転移温度）
本発明において 「ゾル状態」 、 「ゲル状態」 および 「ゾルーゲル 転移温度の定義および測定は、 文献 （H. Yoshioka ら、 Journal of Macromolecular Science, A 3 1 ( 1 ) ， 1 1 3 ( 1 9 9 4 ) ) に記載された定義および方法に基づく。 即ち、 観測周波数 1 H z に おける試料の動的弾性率を低温側から高温側へ徐々に温度を変化 （ 1 °C/ 1分） させて測定し、 該試料の貯蔵弾性率 （G ,、 弾性項） が損失弾性率 （G" 、 粘性項） を上回る点の温度をゾルーゲル転移 温度とする。 一般に、 G" 〉 G の状態がゾルであり、 G" < G ' の状態がゲルであると定義される。 このゾルーゲル転移温度の測定 に際しては、 下記の測定条件が好適に使用可能である。
<動的 ·損失弾性率の測定条件〉
測定機器 （商品名） ： ス ト レス制御式レオメーター C S L 7 0 0 、 C a r r i _M e d社製
試料溶液 （ないし分散液） の濃度 （ただし 「ゾルーゲル転移温度 を有する高分子化合物」 の濃度として） ： 1 0 (重量） ％
試料溶液の量 ： 約 0. 8 g
測定用セルの形状 · 寸法 ： アタ リル製平行円盤 （直径 4. 0 c m ) 、 ギャップ 6 0 0 /z m
測定周波数 ： 1 H z
適用ス ト レス ： 線形領域内。
本発明においては、 細胞 · 生物の熱的損傷を防ぐ点から、 上記ゾ ルーゲル転移温度は 0 °Cよ り高く、 4 5 °C以下であることが好まし く、 更には、 0 °Cよ り高く 4 2 °C以下 （特に 4 °C以上 4 0 °C以下で ある） ことが好ましい。
このような好適なゾルーゲル転移温度を有するハイ ドロゲルは、 後述するような具体的な化合物の中から、 上記したスク リーニング 方法 （ゾルーゲル転移温度測定法） に従って容易に選択することが できる。 本発明のハイ ドロゲルを用いて細胞 · 生物分離 （分画、 分 別、 ないし分取等） するという一連の操作においては、 上記したゾ ルーゲル転移温度 （ a °C) を細胞 · 生物分画、 分別時の温度 （ b °C ) と、 分取するための冷却時の温度 （ c °C) との間に設定すること が好ましい。 すなわち、 上記した 3種の温度 a °C、 b °C、 および c °Cの間には、 b 〉 a 〉 cの関係があることが好ましい。 より具体的 には、 （ b— a ) は 1〜 4 0 °C、 更には 2〜 3 0 °Cであることが好 ましく、 また （ a — c ) は 1〜 4 0 °C、 更には 2〜 3 0 °Cであるこ とが好ましい。
(細胞選択能）
本発明で好ましく用いられるハイ ドロゲルは、 好適な細胞選択能 を示す点からは、 下記の測定法によ り測定される細胞選択能 RZR 。が 2以上、 よ り好ましく は 5以上、 さらに好ましく は 1 0以上の ハイ ドロゲルであることが好ましい。 細胞選択能 RZR。の測定は 以下のよ うにして行う。
f ML Pを 1 0—6M含有し、 ≤ノ¥比 1 0〜 1 5のハイ ドロゲル 1 gを 1 4 m Lのデイ スポーザブル遠沈管内でクェン酸加ヒ ト全血 1 0 mL と 3 7 °Cで 4時間接触させ、 ハイ ド口ゲル中に取り込まれ た赤血球数 （E) と白血球数 （L ) の比 R = L _ Eを測定する。 予 め測定されたクェン酸加ヒ ト全血中の赤血球数 （E0) と白血球数
(L。） の比 RQ= L。ZEQと、 上記 Rの比 RZR。を求め、 細胞選 択能とする。
(ハイ ド口ゲル内での細胞 · 生物等の移動性）
本発明のハイ ドロゲルは、 その中で細胞 · 生物、 微生物等が自由 に移動できる点から、 よ り高い周波数に対しては固体的な挙動を示 し、 他方、 よ り低い周波数に対しては液体的な挙動を示すことが好 ましい。 より具体的には、 該ハイ ド口ゲル内の細胞 · 生物等の移動 性は以下の方法で好適に測定することが可能である。 (ハイ ド口ゲル内での細胞 · 生物等の移動性測定方法） 本発明のハイ ドロゲル （ハイ ドロゲルと して l mL) をゾル状態 (ゾルーゲル転移温度よ り低い温度） で内径 1 c mの試験管に入れ 、 該ハイ ド口ゲルのゾルーゲル転移温度よ り も充分高い温度 （たと えば該ゾル—ゲル転移温度よ り も約 1 0 °C高い温度） とした水溶中 で上記試験管を 1 2時間保持し、 該ハイ ドロゲルをゲル化させる。 次いで、 該試験管の上下を逆にした場合に溶液 Z空気の界面 （メニ スカス） が溶液の自重で変形するまでの時間 （T) を測定する。 こ こで 1 ZT ( s e c—1) よ り低い周波数の動作に対しては該ハイ ド 口ゲルは液体と して振舞い、 1 ZT ( s e c—1) よ り高い周波数の 動作に対しては該ハイ ドロゲルは固体として振舞う ことになる。 本 発明のハイ ドロゲルの場合には Tは 1分〜 2 4時間、 好ましく は 5 分〜 1 0時間である。
(定常流動粘度）
本発明のハイ ドロゲルのゲル的性質は、 定常流動粘度の測定によ つても好適に測定可能である。 定常流動粘度 (ィータ） は、 例え ばク リープ実験によつて測定することができる。 ク リープ実験では 一定のずり応力を試料に与え、 ずり歪の時間変化を観測する。 一般 に粘弾性体のク リープ挙動では、 初期にずり速度が時間とともに変 化するが、 その後ずり速度が一定となる。 この時のずり応力とずり 速度の比を定常流動粘度 η と定義する。 この定常流動粘度は、 ニュ 一トン粘度と呼ばれることもある。 ただし、 ここで定常流動粘度は 、 ずり応力にほとんど依存しない線形領域内で決定されなければな らない。
具体的な測定方法は、 測定装置と してス ト レス制御式粘弾性測定 装置 C S L型レオメーター （C S L 5 0 0、 米国キャ リ ーメ ド社製 ) を、 測定デパイスにァク リル製円盤 （直径 4 c m) を使用し、 試 料厚み 6 0 0 μ mと して少なく とも 5分間以上の測定時間ク リーブ 挙動 （遅延曲線） を観測する。 サンプリ ング時間は、 最初の 1 0 0 秒間は 1秒に 1回、 その後は 1 0秒に 1回とする。
適用するずり応力 （ス ト レス） の決定にあたっては、 1 0秒間ず り応力を負荷して偏移角度が 2 X I 0 '3 r a d以上検出される最低 値に設定する。 解析には 5分以降の少なく とも 2 0以上の測定値を 採用する。 本発明のハイ ドロゲルは、 そのゾル—ゲル転移温度よ り 約 1 0 °C高い温度において、 77が 5 X 1 03〜 5 X 1 06 P a · s e cであることが好ましく、 更には 8 x l 03〜 2 X l 06 P a · s e c、 特に l X l 04 P a · s e c以上、 l X l 06 P a · s e c以下 であることが好ましい。
上記 77が 5 X 1 03 P a · s e c未満では短時間の観測でも流動 性が比較的高く なり、 ゲルによる細胞 · 生物の自由拡散運動の抑制 効果が不十分となったり、 ゲルによる生理活性物質の濃度勾配形成 が不十分となる等の不都合が生じる。 他方、 77が 5 X l 06 P a · s e c を超えると、 長時間の観測でもゲルが流動性をほとんど示さ なく なる傾向が強ま り、 ゲル内で細胞 · 生物が走性によって移動す るこ とが困難となる。 また、 が 5 X l 06 P a · s e c を超える とゲルが脆さを呈する可能性が強まり、 わずかの純弾性変形の後、 一挙にもろく破壤する脆性破壊が生起しゃすい傾向が強まる。
(動的弾性率）
本発明のハイ ドロゲルのゲル的性質は、 動的弾性率によっても好 適に測定可能である。 該ゲルに振幅 γ 0、 振動数を ω Ζ Ζ π とする 歪み γ ( t ) = γ Q c o s の t ( t は時間） を与えた際に、 一定応 力を σ。、 位相差を δ とする σ ( t ) = o Q c o s ( ω t + δ ) が得 られたとする。 | G | = ff QZ o;。とすると、 動的弾性率 G， ( ω ) = I G I c o s δ と、 損失弾性率 G " ( 0) ) = l G | s i n 5 との 比 （G" / G， ) が、 ゲル的性質を表す指標となる。
本発明のハイ ドロゲルは、 ω / 2 π = 1 Η ζの歪み （速い動作に 対応する） に対しては固体と して挙動し、 且つ、 ω Ζ 2 π = 1 0一4 H zの歪み （遅い動作に対応する） に対しては固体と して挙動する 。 よ り具体的には、 本発明のハイ ド口ゲルは、 以下の性質を示すこ とが好ましい （このよ う な弾性率測定の詳細については、 例えば、 文献 ： 小田良平ら編集、 近代工業化学 1 9、 第 3 5 9頁、 朝倉書店 、 1 9 8 5を参照することができる） 。
ω / 2 π = 1 H z (ゲルが固体として挙動する振動数） の際に、 ( G " / G ' ) = ( t a η δ ) sが 1未満であることが好ましレ、 (よ り好ましく は 0. 8以下、 特に好ましく は 0. 5以下） 。
ω / 2 π = 1 0 " H z (ゲルが液体と して挙動する振動数） の際 に、 （ G " Z G， ） L = ( t a η δ ) Lが 1以上であることが好ま しい （よ り好ましくは 1 . 5以上、 特に好ましく は 2以上） 。
上記 （ t a n 5 ) sと、 （ t a n S ) Lとの比 { ( t a n δ ) s / ( t a n δ ) L } が 1未満であることが好ましい （より好ま しくは 0. 8以下、 特に好ましく は 0. 5以下） 。
<測定条件 >
ハイ ドロゲル形成性高分子の濃度 ： 約 8質量％
温度 ： ハイ ド口ゲルのゾルーゲル転移温度より約 1 0 °C高い温度 測定機器： ス ト レス制御式レオメータ （機種名 ： C S L 5 0 0 、 米国キヤリーメ ド社製）
(ハイ ドロゲル形成性の高分子）
上述したよ うな熱可逆的なゾルーゲル転移を示す （すなわち、 ゾ ルーゲル転移温度を有する） 限り、 本発明に使用可能なハイ ドロゲ ル形成性の高分子は特に制限されない。 生理的温度 （ 0〜4 2 °C程 度） において好適なゾルーゲル変化を示すことが容易な点からは、 例えば、 該ハイ ドロゲル形成性の高分子中の曇点を有する複数のブ 口 ックと親水性のブロ ックの曇点、 両ブロ ックの組成および両ブロ ックの疎水性度、 親水性度、 および Zまたは分子量等をそれぞれ調 整することによって達成することが好ましい。 その水溶液がゾルー ゲル転移温度を有し、 該転移温度よ り低い温度で可逆的にゾル状態 を示す高分子の具体例と しては、 例えば、 ポ リ プロ ピレンォキサイ ドとポリ エチレンォキサイ ドとのブロ ック共重合体等に代表される ポリアルキレンォキサイ ドプロ ック共重合体 ； メ チルセルロース、 ヒ ドロ キシプロ ピノレセノレロース等のエーテノレィ匕セノレロース ； キ トサ ン誘導体 ( K . R. Holme, et al. Macromolecules, 2 4， 3 8 2 8 ( 1 9 9 1 ) ) 等が知られている。
ポリアルキレンォキサイ ドブロ ック共重合体と して、 ポリプロ ピ レンォキサイ ドの両端にポリエチレンォキサイ ドが結合したプル口 ニック （Pluronic) F - 1 2 7 (商品名、 BASF Wyandotte Chemica Is Co,製） ゲルが開発されている。 このプル口ニック F— 1 2 7の 高濃度水溶液は、 約 2 0 °C以上でハイ ド口ゲルとなり、 これよ り低 い温度で水溶液となることが知られている。 しかしながら、 この材 料の場合は約 2 0質量0/。以上の高濃度でしかゲル状態にはならず、 また約 2 0質量％以上の高濃度でゲル化温度よ り高い温度に保持し ても、 さ らに水を加えるとゲルが溶解してしま う。 また、 プルロニ ック F _ 1 2 7は分子量が比較的小さく、 約 2 0質量％以上の高度 のゲル状態で非常に高い浸透圧を示すのみならず細胞膜を容易に透 過するため、 細胞または、 生物体組織に悪影響を及ぼす可能性があ る。
一方、 メチノレセノレロース、 ヒ ドロキシプロピノレセノレロース等に代 表されるエーテル化セルロースの場合は、 通常は、 ゾルーゲル転移 温度が高く約 4 5 °C以上である （Ν· SarkarJ. Appl. Polym. Science, 2 4 , 1 0 7 3 , 1 9 7 9 ) 。 これに対して、 細胞 ' 生物等の分画、 分別は殆ど 3 7 °C近辺またはそれ以下の温度で実施されるため、 上 記エーテル化セルロースはゾル状態であり、 該エーテル化セル口一 スを用いる方法では細胞 · 生物等の分画、 分別は事実上は困難であ る。
上記したよ うに、 その水溶液中がゾルーゲル転移点を有し、 且つ 該転移温度よ り低い温度で可逆的にゾル状態を示す従来の高分子の 問題点は、 1 ) ゾルーゲル転移温度より高い温度で一旦ゲル化して も、 さらに水を添加するとゲルが溶解してしま う こ と、 2 ) ゾルー ゲル転移温度が細胞 · 生物の分画、 分別温度 （ 3 7 °C近辺またはそ れ以下） より も高く、 分画、 分別温度ではゾル状態であること、 3 ) ゲル化させるためには、 水溶液の高分子濃度を非常に高くする必 要があること、 等である。
これに対して、 本発明者の検討によれば、 例えば、 その水溶液が 好ましく は 0 °Cよ り高く 4 2 °C以下であるゾル—ゲル転移温度を有 するハイ ドロゲル形成性の高分子 （例えば、 曇点を有する律数のプ ロックと親水性のブロ ックが結合してなり、 その水溶液がゾルーゲ ル転移温度を有し、 且つ、 ゾルーゲル転移温度よ り低い温度で可逆 的にゾル状態を示す高分子） を用いて細胞 · 生物等の分離 （分画、 分別、 ないし分取等） 用基材を構成した場合に、 上記問題は好適に 解決可能であることが判明している。
(好適なハイ ドロゲル形成性の高分子）
本発明の細胞 · 生物等の分離 （分画、 分別、 ないし分取等） 用基 材と して好適に使用可能な疎水結合を利用したハイ ドロゲル形成性 の高分子は、 曇点を有する複数のブロック と親水性のブロックが結 合してなることが好ましい。 該親水性のブロ ックは、 ゾル一ゲル転 移温度より低い温度で該ハイ ドロゲルが水溶性になるために存在す ることが好ましく、 また曇点を有する複数のブロックは、 ハイ ドロ ゲルがゾルーゲル転移温度よ り高い温度でゲル状態に変化するため に存在するこ とが好ましい。 換言すれば、 曇点を有するブロ ックは 該曇点よ り低い温度では水に溶解し、 該曇点よ り高い温度では水に 不溶性に変化するために、 曇点よ り高い温度で、 該プロックはゲル を形成するための疎水結合からなる架橋点としての役割を果たす。 すなわち、 疎水性結合に由来する曇点が、 上記ハイ ドロゲルのゾル 一ゲル転移温度に対応する。 ただし、 該曇点と ゾルーゲル転移温度 とは必ずしも一致しなくてもよい。 これは、 上記した 「曇点を有す るプロ ック」 の曇点は、 一般に、 該ブロ ックと親水性ブロ ック との 結合によって影響を受けるためである。
本発明に用いるハイ ドロゲルは、 疎水性結合が温度の上昇と共に 強くなるのみならず、 その変化が温度に対して可逆的であるという 性質を利用したものである。 1分子内に複数個の架橋点が形成され
、 安定性に優れたゲルが形成される点からは、 ハイ ドロゲル形成性 の高分子が 「曇点を有するブロ ック」 を分子内に複数個有すること が好ましい。 一方、 上記ハイ ドロゲル形成性の高分子中の親水性ブ ロ ックは、 前述したように、 該ハイ ド口ゲル形成性の高分子がゾル 一ゲル転移温度よ り も低い温度で水溶性に変化させる機能を有し、 上記転移温度より高い温度で疎水性結合力が増大しすぎて上記ハイ ド口ゲルが凝集沈澱してしまう ことを防止しつつ、 含水ゲルの状態 を形成させる機能を有する。
(曇点を有する複数のプロ ック）
曇点を有するブロ ック と しては、 水に対する溶解度一温度係数が 負を示す高分子のブロ ックであることが好ましく、 よ り具体的には 、 ポリ プロ ピレンォキサイ ド、 プロ ピレンォキサイ ドと他のアルキ レンォキサイ ドとの共重合体、 ポリ N—置換アク リルアミ ド誘導体 、 ポリ N—置換メ タアク リルアミ ド誘導体、 N—置換アク リルアミ ド誘導体と N—置換メタアク リルアミ ド誘導体との共重合体、 ポリ ビエルメチルエーテル、 ポリ ビュルアルコール部分酢化物からなる 群より選ばれる高分子が好ましく使用可能である。 上記の高分子 （ 曇点を有するプロ ック） の曇点が 4 °Cより高く 4 5 °C以下であるこ とが、 本発明に用いる高分子 （曇点を有する複数のブロ ック と親水 性のブロ ックが結合した化合物） のゾルーゲル転移温度を 4 °Cよ り 高く 4 0 °C以下と,する点から好ましい。 ここで曇点の測定は、 例え ば、 上記の高分子 （曇点を有するブロ ック） の約 1重量％の水溶液 を冷却して透明な均一溶液と した後、 除々に昇温 （昇温速度約 1 °C / i n ) して、 該溶液がはじめて白濁する点を曇点とすることに よって行う ことが可能である。
本発明に使用可能なポリ N—置換アク リルアミ ド誘導体、 ポリ N 一置換メタアク リルアミ ド誘導体の具体的な例を以下に列挙する。 ポリ 一 N—ァクロイルビペリ ジン ； ポリ _ N— n—プロ ピルメ タァ ク リルアミ ド ； ポリ 一 N—イ ソプロ ピルアク リルアミ ド ； ポリ 一 N ， N—ジェチルァク リノレアミ ド ； ポリ 一 N—イ ソプロ ピルメ タァク リルアミ ド ； ポリ 一 N—シク ロプロ ピルアタ リノレアミ ド ； ポリ 一 N ーァク リ ロイルピロ リ ジン ； ポリ 一 N , N -ェチルメチルァク リル アミ ド ； ポリ 一 N—シク ロプロ ピルメ タアク リルアミ ド ； ポリ 一 N ーェチルァク リルアミ ド。 上記の高分子は単独重合体 （ホモポリマ 一） であっても、 上記重合体を構成する単量体と他の単量体との共 重合体であってもよい。 このよ うな共重合体を構成する他の単量体 と しては、 親水性単量体、 疎水性単量体のいずれも用いることがで きる。 一般的には、 親水性単量体と共重合すると生成物の曇点は上 昇し、 疎水性単量体と共重合すると生成物の曇点は下降する。 従つ て、 これらの共重合すべき単量体を選択することによつても、 所望 の曇点 （例えば 4 °Cよ り高く 4 5 °C以下の曇点） を有する高分子を 得るこ とができる。
(親水性単量体）
上記親水性単量体と しては、 N—ビュルピロ リ ドン、 ビュルピリ ジン、 アク リ ルアミ ド、 メタアク リ ルアミ ド、 N —メチルアク リ ル アミ ド、 ヒ ドロキシェチルメ タアタ リ レー ト、 ヒ ドロキシェチルァ ク リ レー ト、 ヒ ドロキシメチルメ タアタ リ レー ト、 ヒ ドロキシメチ ルァク リ レー ト、 酸性基を有するアク リル酸、 メ タアク リ ル酸およ びそれらの塩、 ビニルスルホ ン酸、 スチレンスルホン酸等、 並びに 塩基性基を有する N， N —ジメチルァミ ノェチルメ タク リ レー ト、 N， N —ジェチルアミ ノエチルメ タク リ ー ト、 N， N —ジメチルァ ミ ノプロ ピルァク リルアミ ドおよびそれらの塩等が挙げられるが、 これらに限定されるものではない。
(疎水性単量体）
一方、 上記疎水性単量体と しては、 ェチルァク リ レー ト、 メ チル メ タタ リ レー ト、 グリ シジルメタク リ レー ト等のアタ リ レー ト誘導 体およびメ タク リ レー ト誘導体、 N— n —ブチルメ タアク リルアミ ド等の N—置換アルキルメタアク リ ルアミ ド誘導体、 塩化ビュル、 アク リ ロニ ト リル、 スチレン、 酢酸ビュル等が挙げられるが、 これ らに限定されるものではない。
(親水性のブロ ック）
一方、 上記した曇点を有するプロ ック と結合すべき親水性のプロ ック と しては、 具体的には、 メチルセルロース、 デキス トラン、 ポ リ エチレンオキサイ ド、 ポリ ビニルアルコール、 ポリ N —ビエルピ 口 リ ドン、 ポリ ビニルピリ ジン、 ポリ アク リルアミ ド、 ポリ メ タァ ク リノレアミ ド、 ポリ N —メチルアク リルアミ ド、 ポリ ヒ ドロキシメ チルァク リ レー ト、 ポリ アク リル酸、 ポリ メ タク リル酸、 ポリ ビニ ルスルホン酸、 ポ リ スチレンスルホン酸およびそれらの塩 ； ポ リ N ， N—ジメチルアミ ノエチルメタク リ レー ト、 ポリ N， N—ジェチ ルアミ ノエチルメ タタ リ レー ト、 ポリ N， N —ジメチルァミ ノプロ ピルァク リルアミ ドおよびそれらの塩等が挙げられる。
曇点を有するプロ ック と上記の親水性のブロ ック とを結合する方 法は特に制限されないが、 例えば、 上記いずれかのプロ ック中に重 合性官能基 （例えばァク リ ロイル基） を導入し、 他方のブロ ックを 与える単量体を共重合させることによって行う こ とができる。 また 、 曇点を有するブロ ック と上記の親水性のブロ ック との結合物は、 曇点を有するブロ ックを与える単量体と、 親水性のプロ ックを与え る単量体とのブロ ック共重合によって得るこ と も可能である。
また、 曇点を有するブロ ック と親水性のブロ ック との結合は、 予 め両者に反応活性な官能基 （例えば水酸基、 アミ ノ基、 カルボキシ ル基、 イ ソシァネー ト基等） を導入し、 両者を化学反応によ り結合 させるこ とによって行う こ ともできる。 この際、 親水性のブロ ック 中には通常、 反応活性な官能基を複数導入する。
また、 曇点を有するポリ プロ ピレンォキサイ ドと親水性のプロ ッ ク との結合は、 例えば、 ァニオン重合またはカチオン重合で、 プロ ピレンォキサイ ドと 「他の親水性ブロ ック」 を構成するモノ マー （ 例えばエチレンオキサイ ド） とを繰り返し逐次重合させるこ とで、 ポリ プロ ピレンオキサイ ドと 「親水性ブロ ック」 （例えばポリ ェチ レンオキサイ ド） が結合したブロ ック共重合体を得るこ とができる このよ うなブロ ック共重合体は、 ポ リ プロ ピレンォキサイ ドの末 端に重合性基 （例えばアタ リ ロイル基） を導入後、 親水性のブロ ッ クを構成するモノマーを共重合させるこ とによっても得るこ とがで きる。 更には、 親水性のブロ ック中に、 ポ リ プロ ピレンォキサイ ド 末端の官能基 （例えば水酸基） と結合反応し得る官能基を導入し、 両者を反応させることによつても、 本発明に用いる高分子を得るこ とができる。
また、 ポリ プロ ピレンダリ コールの両端にポリエチレンダリ コー ルが結合した、 プル口ニック F— 1 2 7 (商品名、 旭電化工業 （ 株） 製） 等の材料を連結させることによつても、 本発明に用いるハ イ ド口ゲル形成性の高分子を得ることができる。
この曇点を有するブロ ックを含む態様における本発明の高分子は 、 曇点より低い温度においては、 分子内に存在する上記 「曇点を有 するブロ ック」 が親水性のブロ ックと ともに水溶性であるため、 完 全に水に溶解し、 ゾル状態を示す。 しかし、 この高分子の水溶液の 温度を上記曇点よ り高い温度に加温すると、 分子内に存在する 「曇 点を有するブロック」 が疎水性となり、 疎水的相互作用によって、 別個の分子間で会合する。 一方、 親水性のブロ ックは、 この時 （曇 点よ り高い温度に加温された際） でも水溶性であるため、 本発明の 高分子は水中において、 曇点を有するプロ ック間の疎水性会合部を 架橋点とした三次元網目構造を持つハイ ドロゲルを生成する。 この ハイ ド口ゲルの温度を再び、 分子内に存在する 「曇点を有するプロ ック」 の曇点よ り低い温度に冷却すると、 該曇点を有するブロ ック が水溶性となり、 疎水性会合による架橋点が解放され、 ハイ ドロゲ ル構造が消失して、 本発明の高分子は、 再び完全な水溶液となる。 このよ うに、 好適な態様における本発明の高分子のゾル—ゲル転移 は、 分子内に存在する曇点を有するプロ ックの該曇点における可逆 的な親水性、 疎水性の変化に基づく ものであるため、 温度変化に対 応して、 完全な可逆性を有する。
(ゲルの溶解性）
上述したようにその水溶液がゾル—ゲル転移温度を有する高分子 を少なく とも含む本発明のハイ ドロゲルは、 該ゾルーゲル転移温度 よ り高い温度 （ cJ °C) で実質的に水不溶性を示し、 ゾルーゲル転移 温度よ り低い温度 （ e °C) で可逆的に水可溶性を示す。 上記した高 い温度 （ d°C) は、 ゾルーゲル転移温度よ り 1 °C以上高い温度であ ることが好ましく、 2 °C以上 （特に 5 °C以上） 高い温度であること が更に好ましい。 また、 上記 「実質的に水不溶性」 とは、 上記温度 ( d °C) において、 水 1 0 0 m Lに溶解する上記高分子の量が、 5 • 0 g以下 （更には 0. 5 g以下、 特に 0. l g以下） であること が好ましい。 一方、 上記した低い温度 （ e °C) は、 ゾル—ゲル転移 温度より （絶対値で） 1 °C以上低い温度であることが好ましく、 2 °C以上 （特に 5 °C以上） 低い温度であることが更に好ましい。 また 、 上記 「水可溶性」 とは、 上記温度 （ e °C) において、 水 1 0 0 m Lに溶解する上記高分子の量が、 0. 5 g以上 （更には 1. O g以 上） であることが好ましい。 更に 「可逆的に水可溶性を示す」 とは 、 上記ハイ ド口ゲル形成性の高分子の水溶液が、 一旦 （ゾルーゲル 転移温度より高い温度において） ゲル化された後においても、 ゾル 一ゲル転移温度よ り低い温度においては、 上記した水可溶性を示す ことをレヽう。
上記高分子は、 その 1 0 %水溶液が 5 °Cで、 1 0〜 3， 0 0 0セ ンチボイズ （更には 5 0〜 1， 0 0 0センチボイズ） の粘度を示す ことが好ましい。 このよ うな粘度は、 例えば以下等の測定条件下で 測定することが好ましい。
粘度計 ： ス ト レス制御式レオメータ （機種名 ： C S L 5 0 0 、 米国 キャリーメ ド社製）
ローター直径 ： 6 0 mm ローター形状 ： 平行平板 測定 周波数 ： 1 H z (ヘルツ）
本発明のハイ ドロゲル形成性高分子の水溶液は、 上記ゾルーゲル 転移温度より高い温度でゲル化させた後、 多量の水中に浸漬しても 、 該ゲルは実質的に溶解しない。 上記細胞 ' 生物等の分離 （分画、 分別、 ないし分取等） 用基材の上記特性は、 例えば、 以下のように して確認することが可能である。 すなわち、 本発明のハイ ドロゲル 形成性の高分子 0 . 1 5 gを、 上記ゾルーゲル転移温度よ り低い温 度 （例えば氷冷下） で、 蒸留水 1 . 3 5 gに溶解して 1 0 W %の水 溶液を作製し、 該水溶液を径が 3 5 m mのプラスチックシャーレ中 に注入し、 3 7 °Cに加温することによって、 厚さ約 1 . 5 m mのゲ ルを該シャーレ中に形成させた後、 該ゲルを含むシャーレ全体の重 量 （ f グラム） を測定する。 次いで、 該ゲルを含むシャーレ全体を 2 5 0 m L中の水中に 3 7 °Cで 1 0時間静置した後、 該ゲルを含む シャーレ全体の重量 （ gグラム） を測定して、 ゲル表面からの該ゲ ルの溶解の有無を評価する。 この際、 本発明のハイ ド口ゲル形成性 の高分子においては、 上記ゲルの重量減少率、 すなわち （ f _ g ) f 力 5 . 0 %以下であることが好ましく、 更には 1 . 0 %以下 (特に 0 . 1 %以下） であることが好ましい。 本発明のハイ ドロゲ ル形成性の高分子の水溶液は、 上記ゾルーゲル転移温度よ り高い温 度でゲル化させた後、 多量 （体積比で、 ゲルの 0 . 1〜 1 0 0倍程 度） の水中に浸漬しても、 長期間に 1つて該ゲルは溶解することが ない。 このよ うな本発明に用いる高分子の性質は、 例えば、 該高分 子内に曇点を有するプロ ックが 2個以上 （複数個） 存在することに よって達成される。 これに対して、 ポリ プロピレンオキサイ ドの両 端にポリエチレンォキサイ ドが結合してなる前述のプル口ニック F
— 1 2 7を用いて同様のゲルを作成した場合には、 数時間の静置で 該ゲルは完全に水に溶解することを、 本発明者らは見出している。
非ゲル化時の細胞毒性をできる限り低いレベルに抑える点からは 、 水に対する濃度、 すなわち { (高分子） / (高分子 +水） } X I 0 0 ( % ) で、 2 0 %以下 （更には 1 5 %以下、 特に 1 0 %以下） の濃度でゲル化が可能なハイ ドロゲル形成性の高分子を用いること が好ましい。
(生理活性物質）
本発明中の生理活性物質とは、 細胞や生物に対して結合性、 反応 性、 あるいは誘引性のある物質をいう。 例えば、 走化性因子 （化学 走性因子） 、 抗体、 サイ トカインおよびその受容体、 細胞接着因子 等を挙げることができる。
化学走性とはある化学物質 （化学走性因子） の濃度差が刺激とな つて細胞、 または微生物が該濃度荸に従って集合したり逃避したり する性質である。 化学走性は多くの微生物、 白血球、 癌細胞、 精子 等の細胞が有している性質であり微生物、 細胞 '生物がそれぞれ特 異的な化学走性因子を認識する能力を有している。 例えば典型的な 化学走性因子としては好中球、 マクロファージに働く免疫グロプリ ン由来因子等、 好中球に働く補体由来因子である C 3 a、 C 5 a、 N —ホルミ ノレ一 M e t — L e w— P h e等、 マクロフ ァージに働く リ ンパ球由来因子である リ ンホカイン等、 好酸球に働くペプチ ド性 因子、 ェカレクチン等が挙げられる。 これらはアレルギー反応に関 連する免疫担当細胞に対する化学走性因子である。
先に述べたように最近では血管の誘導、 再生に関連する血管内皮 細胞増殖因子、 神経網の誘導、 再生に関連する神経細胞増殖因子等 の各種細胞増殖因子も化学走性因子と考えられている。 また血管系 は酸素濃度の勾配によっても誘導、 再生されることが分かっていて 、 酸素は負の走化性因子と言える。 また、 癌細胞の転移に関しても 化学走性因子がかかわつていることが分かってきた。 以上のよ うに 細胞に直接、 作用する免疫関連、 癌関連薬剤は多く の場合、 化学走 性を有するものと考えることができる。 (物理走性因子）
物理走性とはある物理的因子の強度差が刺激となって細胞、 ある いは微生物が該強度差に従って集合したり、 逃避したりする性質で ある。 物理走性は多くの微生物細胞が有している性質であり、 それ ぞれ特異的な物理走性因子を認識する能力を有している。 例えば、 典型的な物理走性因子としては、 電場、 磁場、 重力場、 光度、 温度 、 粘度等である。
(走化因子）
本発明において、 走化因子は、 対象とする細胞について下記の測 定法により測定される細胞誘引能 NZN。が 1. 2以上、 より好ま しく は 2以上、 さらに好ましくは 1 0以上の走化因子であることが 好ましい。 細胞誘引能の測定は、 例えば以下のようにして行う こと ができる。
後述の製造例 8で得られる本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P— 5 ) l gを走化因子を含有する 9 gの生理食塩水に 4 °Cで 溶解し、 本発明のハイ ドロゲル形成性高分子濃度 1 0 w t %の水溶 液を調製する。 ここでハイ ドロゲル形成性高分子水溶液中の走化因 子の濃度は、 対象となる細胞を誘引しう る範囲に設定する必要があ り、 通常は 1 0 -6M〜 1 0— 5Mの範囲とする。 この水溶液 1 gを 3 7 °Cに昇温して表面積 1 0〜 1 5 c m2 ( S /V比 ： 1 0〜 1 5 ) のハイ ドロゲルとする。 具体的には例えば、 該水溶液を 2 3 Gの注 射針付き 1 m Lシリ ンジに充填して 4 °Cに冷却し、 これを 3 7での 生理食塩水 l O O m L中に 5〜 1 0秒間で押し出す。 この時得られ る細紐状のハイ ドロゲルの直径は約 3 mm、 長さ約 1 4 c mとなる ので、 表面積約 1 3 c m2のハイ ド口ゲルが得られる。 上記の走化 因子 1 0— 6M〜 1 0-5Mを含む S · V比 1 0〜 1 5のハイ ドロゲル 1 g と、 対象となる細胞の懸濁液 （細胞数 ： 1 06個/ m L) を 1 4 m Lのデイスポーザブル遠沈管内で接触させ、 3 7 °Cで 4時間ゆ るやかに回転攪拌する。 ハイ ドロゲルを残してデカンテーショ ンに より細胞懸濁液を除去、 3 7 °Cの生理食塩水 1 0 m Lを新たに加え て、 ハイ ド口ゲル表面に付着した細胞を洗浄除去する。 この洗浄操 作 3回繰り返した後、 4 °Cに冷却してハイ ドロゲルを溶解し、 ハイ ドロゲル中に遊走した細胞数 Nを測定する。 一方、 走化因子を含有 しない本発明のハイ ドロゲルについて上記と同様の測定を行い、 ハ ィ ドロゲル中に遊走した細胞数 N。を測定し、 遊走因子の細胞誘引 能 N Z N。を求める。
(化学走性能によ り細胞 · 生物を分離する装置および方法） 本発明のハイ ドロゲルを用いて化学走性能によ り細胞を分離 （分 画、 分別、 ないし分取等） する装置および方法はハイ ドロゲル内で 細胞 · 生物を遊走させるまでの手段によ り、 例えば次の 3種類に大 別される。 1 ) 生理活性物質を含有する水溶液と分別用細胞 · 生物 の懸濁液をハイ ドロゲルで隔離し、 該ハイ ドロゲル内に該生理活性 物質の濃度勾配を作製し、 該濃度勾配によって惹起される化学走性 によって該細胞 · 生物懸濁液から該ハイ ド口ゲル内に細胞 · 生物を 移行させる方法、 2 ) 細胞 · 生物が実質的に均一に内部に分散した ハイ ドロゲルを作製し、 次いで該ハイ ドロゲルを該ゾル—ゲル転移 温度よ り高い温度で生理活性物質を含有する水溶液に接触させ該ハ イ ド口ゲル中に該生理活性物質を移行させることによつて該ハイ ド 口ゲル中に該生理活性物質の濃度勾配を形成させ、 該濃度勾配にし たがって該ハイ ドロゲル中に実質的に均一に分布していた細胞 · 生 物が化学走性能の違いによつてハイ ド口ゲル内の各部に再配列され る方法、 3 ) ゾル状態のハイ ド口ゲル形成性高分子の水溶液に生理 活性物質を均一に混合し、 該ゾル状態の混合液を該ゾルーゲル転移 温度よ り高い温度に昇温して所定の形状を付与したハイ ドロゲルと して、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度で細胞 · 生物の懸濁液と 接触させ、 細胞 · 生物を所定形状のハイ ドロゲル中へ移行させる方 法である。
上記 1 ) および 2 ) の方法による本発明の態様を模式的に示した ものが図 1であり、 上記 3 ) の方法による態様を模式的に示したも のが図 2である。 上記のいずれの方法を採用するかは、 目的の細胞 • 生物の種類等によって適宜選択すれば良い。 ハイ ドロゲルの形状 も目的に応じて適宜選択すれば良く、 円柱状、 円盤状、 直方体状、 球状、 細紐状、 ファイバー状、 フレーク状、 板状、 膜状、 不定形状 等任意の形状とすることができる。
特に上記 3 ) の方法を採用する場合は、 生理活性物質 （走化因子 ) を含有するハイ ドロゲルとその周囲に配置された細胞懸濁液中の 細胞との接触頻度を高めるために、 ハイ ドロゲルに付与する所定の 形状は単位体積当たりの表面積を大きくするこ とが有利であり、 球 状、 細紐状、 ファイバー状、 フレーク状、 板状、 膜状、 不定形状の いずれかとすることが望ましい。 また、 このハイ ド口ゲルに付与す る所定形状が、 表面積 （ S ) /体積 （V ) 比が 1 0 ( c m υ 以上 の形状であることが好ましく、 特に 3 0 ( c m—1 ) 以上、 さらには 6 0 ( c m - 1 ) 以上であることが好ましい。
また 3 ) の方法を採用する場合は、 ハイ ドロゲルとその周囲に配 置された細胞懸濁液中の細胞との接触頻度を高めるために、 細胞懸 濁液を攪拌あるいは循環させることが好ましい。 また、 ハイ ドロゲ ルとその周囲に配置された細胞懸濁液の組を多数並列に処理するこ ともできる。 この時、 各組においてハイ ド口ゲル中の走化因子濃度 を変えたり、 各組のハイ ドロゲルと細胞懸濁液との接触時間を変え たりすることによ り、 目的とする細胞 · 生物を分画 · 回収するこ と ができる。 以下に本発明の具体的な態様を挙げて説明する。
(白血球の分画 · 回収）
I ML P (N-forinyl - methionyl - leucyl - phenylalanine： 分子量 4 3 7. 6 , chemotactic peptidesリ 、 L P S (Lipopolysacchar ide) 等は白血球 （好中球） の走化因子と して知られている。 これ らの走化因子の濃度勾配を本発明のハイ ドロゲル中に形成させ、 白 血球を含む細胞群 （例えば末梢血） と接触させると、 これら走化因 子によつて惹起される走化性の高い細胞と低い細胞がハイ ド口ゲル 中の走化因子の濃度に応じてハイ ドロゲル内で分離される。 その後 、 目的の細胞が存在するハイ ド口ゲルの部分を切り出し、 冷却して ハイ ドロゲルをゾル化させ、 生理食塩水等で希釈して遠心分離等の 方法で目的とする細胞のみを回収することができる。
また、 i ML Pや L P Sに親和性を有する細胞を血液中から大量 に回収したい場合は、 これらの走化因子を低温ゾル状態の本発明の ハイ ドロゲル水溶液に溶解し、 例えばこの水溶液をそのゾル一ゲル 転移温度よ り高い温度の生理食塩水中に滴下して微小液滴の形状の ままゲル化させ、 この走化因子を含有する微小な本発明のハイ ドロ ゲルをゾル—ゲル転移温度より高い温度に保持して生理食塩水から 回収し、 これを血液中に分散させる。 そのまま、 該ゾルーゲル転移 温度よ り高い温度に保持して攪拌すると、 f ML Pや L P Sに親和 性を有する細胞のみが微小液滴形状の本発明のハイ ドロゲル中に取 り込まれる。 該ゾルーゲル転移温度より高い温度に保持して細胞を 取り込んだ本発明のハイ ドロゲルを遠心操作によ り回収し、 それを 洗浄する。 その後、 転移温度よ り低い温度にして細胞を取り込んだ 本発明のハイ ド口ゲルをゾル化させ、 生理食塩水等で希釈し、 さら に洗浄を繰り返すことによって本発明のハイ ドロゲルを取り除き、 目的細胞を回収する。 この方法の特徴は、 細胞浮遊液中で細胞だけ でなく、 走化因子を含んだ本発明のハイ ドロゲルも自由に動く こと ができ、 さ らに本発明のハイ ド口ゲルの大きさ · 形状から非常に高 い単位量当たりの表面積が生み出されることから、 細胞と本発明の ハイ ドロゲルとの高頻度の接触性が期待できる。 また種々の走化因 子を本発明のハイ ドロゲルに封入したり、 時間、 温度等の条件に変 化を与えることによ り、 小型でマルチプレックスタイプでの機能的 回収が期待できる。
(幹細胞移植用高定着性細胞の分画 · 回収）
ヒ ト造血幹細胞移植においては、 造血細胞の中の C D 3 4陽性細 胞中に多分化能を有する造血幹細胞が含まれていることが知られて おり、 移植ドナーの造血細胞中 C D 3 4陽性率が造血幹細胞移植の 評価のひとつとして利用されている。 最近では、 この C D 3 4陽性 細胞の中でもケモカイン受容体 C X C R - 4のリガンドである Stro mal cel l der ived fact or - 1 ( S D F— l ) 等のケモカインに対 して遊走能を示す細胞が移植レシピエン トの骨髄への homing活性が 高いことが注目されている。 S D F— 1 に対して高い遊走能を示す 細胞の数が多いほど、 移植ドナー細胞のレシピエン ト骨髄への定着 率が高いという報告もある。 C D 3 4陽性細胞中の S D F _ 1 に対 する反応性を評価し、 また S D F— 1に反応する細胞を分離するた めに S D F— 1を含有した本発明のハイ ド口ゲルを利用する。 移植 ドナーの骨髄液、 末梢血、 あるいは臍帯血よ り採取した造血細胞よ り C D 3 4陽性細胞を磁気ビーズ法によ り分離し、 その C D 3 4陽 性細胞浮遊液中に S D F— 1 を含有した本発明のハイ ド口ゲルを共 浮遊させ、 一定時間撹拌培養し、 S D F— 1 に反応して本発明のハ イ ド口ゲル内に入り込んだ C D 3 4陽性細胞を分離回収する。 その 回収率は S D F— 1反応性細胞率をあらわし、 ドナー細胞の h 0 m i n g活性を評価しうることが期待できる。 さ らにこの分離した細 胞はそのまま h i g h - h o m i n g活性を持つた造血幹細胞と し て移植が可能である。
(精子の走化性を利用した機能的分離および体外受精法）
精子は受精のために特殊化した細胞で、 鞭毛を有し、 洗練された 運動機能である走化性を示す、 生物の一生のなかで唯一個体を離れ て重要な役割を果たす細胞である。 この走化性が受精を可能にして いる。 この走化性に基づく遊走能の高い精子のみを卵細胞との受精 に利用するために本発明のハイ ドロゲルを利用する。 採取した精液 を洗浄後、 その精子を少量のゾル状態の本発明のハイ ドロゲルに浮 遊させ、 そのままそのゾルーゲル転移温度よ り高い温度でゲル化さ せる。 さらにその精子を含む微小ゲル状の本発明のハイ ド口ゲルの 周りを、 別途用意した適当な量で適当な濃度の本発明のハイ ドロゲ ルで覆う。 この外側の本発明のハイ ドロゲルの量 ， 濃度は遊走能の 高い精子のみがメ ビオール · ジェル内を移動するこ とが可能で、 し かも一定時間内にこの本発明のハイ ド口ゲルから外部の浮遊液中に 出られるように調整する。 培養液中に卵細胞を置いたプラスチック シャーレ内に精子を含んだ本発明のハイ ドロゲルをそのゾルーゲル 転移温度より高い温度で浮遊させる。 運動機能の高い精子のみが本 発明のハイ ドロゲル内で高い走化性を示し、 本発明のハイ ドロゲル 内で機能的に選択された高い走化性を示す精子のみが培養液中へ湧 出してく る。 したがって、 卵細胞は走化性の高い精子とのみ受精す ることができるようになる。
以下に実施例を示し、 本発明を更に具体的に説明するが、 本発明 の範囲は特許請求の範囲によ り限定されるものであり、 以下の実施 例によって限定されるものではない。 実施例 製造例 1
ポリ プロピレンォキサイ ドーポリエチレンォキサイ ド共重合体 （ プロ ピレンォキサイ ド Zエチレンォキサイ ド平均重合度約 6 0 Z 1 8 0、 旭電化工業 （株） 製 ： プル口ニック F— 1 2 7 ) 1 0 gを乾 燥クロ 口ホルム 3 0 m Lに溶解し、 五酸化リ ン共存下、 へキサメチ レンジイ ソシァネート 0 . 1 3 gを加え、 沸点還流下に 6時間反応 させた。 溶媒を減圧留去後、 残さを蒸留水に溶解し、 分画分子量 3 万の限外濾過膜 （アミ コン P M— 3 0 ) を用いて限外濾過を行い、 高分子量重合体と低分子量重合体を分画した。 得られた水溶液を凍 結して、 F— 1 2 7高重合体および F - 1 2 7低重合体を得た。
上記によ り得た F _ 1 2 7高重合体 （本発明のハイ ドロゲル形成 性高分子、 T G P— 1 ) を、 水冷下、 8質量％の濃度で蒸留水に溶 解した。 この水溶液をゆるやかに加温していく と、 2 1 °Cから徐々 に粘度が上昇し、 約 2 7 °Cで固化して、 ハイ ド口ゲルとなった。 こ のハイ ド口ゲルを冷却すると、 2 1 °Cで水溶液に戻った。 この変化 は、 可逆的に繰り返し観測された。 一方、 上記 F _ 1 2 7低重合体 を、 永点下 8質量％の濃度で蒸留水に溶解したものは、 6 0 °C以上 に加熱しても全くゲル化しなかった。
製造例 2
ト リ メチロールプロパン 1 モルに対し、 エチレンォキサイ ド 1 6
0モルをカチオン重合によ り付加して、 平均分子量約 7 0 0 0のポ リエチレンォキサイ ドト リオールを得た。
上記によ り得たポリエチレンォキサイ ドト リオール 1 0 0 gを蒸 留水 1 0 0 0 m Lに溶解した後、 室温で過マンガン酸カ リ ウム 1 2 gを徐々に加えて、 そのまま約 1時間、 酸化反応させた。 固形物を 濾過によ り除いた後、 生成物をクロ 口ホルムで抽出し、 溶媒 （クロ 口ホルム） を減圧留去してポリエチレンォキサイ ドト リ カルボキシ ル体 9 0 gを得た。
上記により得たポリエチレンォキサイ ドト リカルボキシル体 1 0 g と、 ポ リ プロ ピレンオキサイ ドジァミ ノ体 （プロ ピレンォキサイ ド平均重合度約 6 5、 米国ジェファーソ ンケミカル社製、 商品名 ： ジェファーミ ン D— 4 0 0 0、 曇点 ： 約 9 °C) 1 0 g とを四塩化炭 素 1 0 0 0 m Lに溶解し、 ジシクロへキシルカルポジイ ミ ド 1 . 2 gを加えた後、 沸点還流下に 6時間反応させた。 反応液を冷却し、 固形物を濾過により除いた後、 溶媒 （四塩化炭素） を減圧留去し、 残さを真空乾燥して、 複数のポ リ プロ ピレンォキサイ ドとポリェチ レンォキサイ ドとが結合した本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P— 2 ) を得た。 これを氷冷下、 5質量％の濃度で蒸留水に溶 解し、 そのゾル一ゲル転移温度を測定したところ、 約 1 6 °Cであつ た。
製造例 3
N—イ ソプロ ピルアク リ ルアミ ド (ィース トマンコダック社製） 9 6 g、 N—アタ リ ロキシスクシンイ ミ ド （国産化学 （株） 製） 1 7 g、 および n—ブチルメタク リ レート （関東化学 （株） 製） 7 g をクロ 口ホルム 4 0 0 0 m Lに溶解し、 窒素置換後、 N， N， ーァ ゾビスイ ソプチ口 - ト リ ル 1 . 5 gを加え、 6 0 °Cで 6時間重合さ せた。 反応液を濃縮した後、 ジェチルエーテルに再沈 （再沈殿） し た。 濾過によ り固形物を回収した後、 真空乾燥して、 7 8 gのポリ (N—イ ソプロ ピルアク リ ルア ミ ド一コ _N_アタ リ ロ キシスク シ ンイ ミ ド— コ ー n —プチルメタク リ レー ト） を得た。
上記により得たポリ （N—イ ソプロピルアク リルアミ ドーコ ー N ーァク リ ロキシスクシンィ ミ ドーコ ー n—プチルメタク リ レート） に、 過剰のイ ソプロ ピルアミ ンを加えてポリ （N—イ ソプロ ピルァ ク リルアミ ドーコ ー n—ブチルメタタ リ レー ト） を得た。 このポリ (N—イ ソプロ ピルアク リルアミ ド一コ一 n—プチルメ タタ リ レー ト） の水溶液の曇点は 1 9 °Cであった。
前記のポリ （N—イ ソプロ ピルアク リルアミ ド一コ一 N—アタ リ ロキシスクシンイ ミ ド一コ一 n—ブチルメ タク リ レー ト） 1 0 g、 および両末端アミ ノ化ポリ エチレンオキサイ ド （分子量 6， 0 0 0 、 川研ファインケミカル （株） 製） 5 gをクロ 口ホルム 1 0 0 0 m Lに溶解し、 5 0 °Cで 3時間反応させた。 室温まで冷却した後、 'ィ ソプロ ピルアミン 1 gを加え、 1時間放置した後、 反応液を濃縮し 、 残渣をジェチルエーテル中に沈澱させた。 濾過によ り固形物を回 収した後、 真空乾燥して、 複数のポリ （N—イ ソプロピルアク リル アミ ドーコ一 n—プチルメタタ リ レー ト） とポリエチレンォキサイ ドとが結合した本発明のハイ ド口ゲル形成性高分子 （T G P _ 3 ) を得た。
このようにして得た T G P— 3を氷冷下、 5質量％の濃度で蒸留 水に溶解し、 そのゾルーゲル転移温度を測定したところ、 約 2 1 °C であった。
製造例 4 (滅菌方法）
上記した本発明のハイ ド口ゲル形成性高分子 （T G P _ 3 ) の 2 . 0 gを、 E O G (エチレンオキサイ ドガス） 滅菌バッグ （ホギメ ディカル社製、 商品名 ： ハイブリ ッ ド滅菌バッグ） に入れ、 E O G 滅菌装置 （イージーパック、 井内盛栄堂製） で E O Gをバッグに充 填し （E O G濃度 ： 9 0 0 m g /L程度） 、 室温にて一昼夜放置し た。 さらに 4 0 °Cで半日放置した後、 E O Gをバッグから抜き、 ェ アレーシヨ ンを行った。 バッグを真空乾燥器 （ 4 0 °C) に入れ、 時 々エアレーシヨ ンしながら半日放置することによ り滅菌した。
この滅菌操作によ り高分子のゾルーゲル転移温度が変化しないこ とを、 別途確認した。 製造例 5
N—イ ソプロ ピルァク リルアミ ド 3 7 g と、 n—ブチルメタク リ レー ト 3 g と、 ポリ エチレンオキサイ ドモノアタ リ レー ト （分子量 4， 0 0 0、 日本油脂 （株） 製 ： PME— 4 0 0 0 ) 2 8 g とを、 ベンゼン 3 4 0 m Lに溶解した後、 2， 2 一一ァゾビスイ ソブチロ 二 ト リル 0. 8 gを加え、 6 0 °Cで 6時間反応させた。 得られた反 応生成物にクロ口ホルム 6 0 0 mLを加えて溶解し、 該溶液をエー テル 2 0 L (リ ッ トノレ） に滴下して沈澱させた。 得られた沈殿を濾 過によ り回収し、 該沈澱を約 4 0 °Cで 2 4時間真空乾燥した後、 蒸 留水 6 Lに再び溶解し、 分画分子量 1 0万のホローフアイパー型限 外濾過膜 （アミ コン社製 H 1 P 1 0 0 - 4 3 ) を用いて 1 0 °Cで 2 Lまで濃縮した。 該濃縮液に蒸留水 4 Lを加えて希釈し、 上記希釈 操作を再度行った。 上記の希釈、 限外濾過濃縮操作をさ らに 5回繰 り返し、 分子量 1 0万以下のものを除去した。 この限外濾過によ り 濾過されなかったもの （限外濾過膜内に残留したもの） を回収して 凍結乾燥し、 分子量 1 0万以上の本発明のハイ ドロゲル形成性高分 子 （T G P— 4 ) 6 0 gを得た。
上記によ り得た本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （T G P— 4 ) l gを、 9 gの蒸留水に氷冷下で溶解した。 この水溶液のゾルー ゲル転移温度を測定したところ、 該ゾルーゲル転移温度は 2 5でで めった。
製造例 6
製造例 3の本発明のハイ ド口ゲル形成性高分子 （T G P— 3 ) を 1 ◦質量％の濃度で蒸留水に溶解し、 3 7 °Cにおける η を測定した ところ、 5. 8 X 1 05 P a · s e cであった。 一方、 寒天を 2質 量％の濃度で蒸留水に 9 0 °Cで溶解して、 1 0 °Cで 1時間ゲル化さ せた後、 3 7 °Cにおける J を測定したところ、 その 77は機器の測定 限界 （ l X l 07 P a · s e c ) を越えていた。
製造例 7
N—イソプロ ピルァク リルアミ ド 7 1 . 0 gおよび n—プチルメ タク リ レー ト 4. 4 gをエタノール 1 1 1 7 gに溶解した。 これに ポリ エチレングリ コールジメタタ リ レー ト （P D E 6 0 0 0、 日本 油脂 （株） 製） 2 2. 6 gを水 7 7 3 gに溶解した水溶液を加え、 窒素気流下 7 0 °Cに加温した。 窒素気流下 7 0 °Cを保ちながら、 N ， N , Ν， ， N， 一テ トラメチルエチレンジァミ ン （T EME D) 0. 8 m L と 1 0 %過硫酸アンモニゥム （ A P S ) 水溶液 8 m Lを 加え 3 0分間攪拌反応させた。 さらに T EME D O . 8 mLと 1 0 % A P S水溶液 8 m Lを 3 0分間隔で 4回加えて重合反応を完結さ せた。 反応液を 1 0 °C以下に冷却後、 1 0 °Cの冷却蒸留水 5 Lを加 えて希釈し、 分画分子量 1 0万の限外ろ過膜を用いて 1 0 °Cで 2 L まで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水 4 Lを加えて希釈し、 上記限外ろ過濃縮操 作を再度行った。 上記の希釈、 限外ろ過濃縮操作を更に 5回繰り返 し、 分子量 1 0万以下のものを除去した。 この限外ろ過により ろ過 されなかったもの （限外ろ過膜内に残留したもの） を回収して凍結, 乾燥し、 分子量 1 0万以上の本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P— 5 ) 7 2 gを得た。
上記によ り得た本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （T G P— 5 ) 1 gを、 9 gの蒸留水に氷冷下で溶解した。 この水溶液のゾル— ゲル転移温度を測定したところ、 該ゾルーゲル転移温度は 2 0でで めつに。
製造例 8
N—イソプロ ピルアク リルアミ ド 4 2. 0 gおよび n—プチルメ タク リ レー ト 4. 0 gをエタノール 5 9 2 gに溶解した。 これにポ リエチレングリ コールジメタタ リ レー ト （P D E 6 0 0 0、 日本油 脂 （株） 製） 1 1 . 5 gを水 6 5. 1 gに溶解した水溶液を加え、 窒素気流下 7 0 °Cに加温した。 窒素気流下 7 0 °Cを保ちながら、 N ， N， N， ， N， ーテ トラメチルエチレンジァミ ン （T EME D) 0. 4 m L と 1 0 %過硫酸アンモニゥム （ A P S ) 水溶液 4 m Lを 加え 3 0分間攪拌反応させた。 さ らに T EME D O . 4 m L と 1 0 % A P S水溶液 4 m Lを 3 0分間隔で 4回加えて重合反応を完結さ せた。 反応液を 5 °C以下に冷却後、 5 °Cの冷却蒸留水 5 Lを加えて 希釈し、 分画分子量 1 0万の限外ろ過膜を用いて 5 °Cで 2 Lまで濃 縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水 4 Lを加えて希釈し、 上記限外ろ過濃縮操 作を再度行った。 上記の希釈、 限外ろ過濃縮操作を更に 5回繰り返 し、 分子量 1 0万以下のものを除去した。 この限外ろ過によ りろ過 されなかったもの （限外ろ過膜内に残留したもの） を回収して凍結 乾燥し、 分子量 1 0万以上の本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P— 6 ) 4 0 gを得た。
上記によ り得た本発明のハイ ド口ゲル形成性高分子 （T G P— 6 ) l gを、 9 gの蒸留水に氷冷下で溶解した。 この水溶液のゾル一 ゲル転移温度を測定したところ、 該ゾルーゲル転移温度は 7 °Cであ つた。
製造例 9
N—イソプロ ピルァク リルアミ ド 4 5. 5 gおよび n—プチルメ タク リ レー ト 0. 5 6 gをエタノール 5 9 2 gに溶解した。 これに ポリエチレングリ コールジメタク リ レー ト （P D E 6 0 0 0、 日本 油脂 （株） 製） 1 1 . 5 gを水 6 5. 1 gに溶解した水溶液を加え 、 窒素気流下 7 0 °Cに加温した。 窒素気流下 7 0 °Cを保ちながら、 N, N, N ' , N ' ーテ トラメチルエチレンジァミ ン （T EME D ) 0. 4 m L と 1 0 %過硫酸アンモニゥム （A P S ) 水溶液 4 m L を加え 3 0分間攪拌反応させた。 さ らに T EME D O . 4 mL と 1 0 % A P S水溶液 4 mLを 3 0分間隔で 4回加えて重合反応を完結 させた。 反応液を 1 0 °C以下に冷却後、 1 0 °Cの冷却蒸留水 5 Lを 加えて希釈し、 分画分子量 1 0万の限外ろ過膜を用いて 1 0 °Cで 2 Lまで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水 4 Lを加えて希釈し、 上記限外ろ過濃縮操 作を再度行った。 上記の希釈、 限外ろ過濃縮操作を更に 5回繰り返 し、 分子量 1 0万以下のものを除去した。 この限外ろ過によ り ろ過 されなかったもの （限外ろ過膜内に残留したもの） を回収して凍結 乾燥し、 分子量 1 0万以上の本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P— 7 ) 2 2 gを得た。
上記によ り得た本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （T G P— 7 ) l gを、 9 gの蒸留水に氷冷下で溶解した。 この水溶液のゾルー ゲル転移温度を測定したところ、 該ゾルーゲル転移温度は 3 7でで めった。
実施例 1 (好中球遊走能）
f M L P (N_formy丄一 metnionyl—丄 eucyl— phenylalanine： 分十量 4 3 7. 6 ,chemotactic peptides, S I GMA社製） を 0 M、 1 CT6M、 1 0 -7M、 1 0 -8Mそれぞれ含む軟寒天培地 （n a c a 1 a i t e s q u e社製軟寒天末濃度 ： 0. 6 %となるように D ， MEM培地 (Dulbecco ' s Modification Eagle's Medium, GIBCO 社製、 1 0 %の 03 (Fetal Calf Serum) を含む） に溶解したも の） を 4 2 °Cで調製し、 直径 3 5 mmのポリ スチレンディ ッシュ （ SUMIL0N社製） に各 l mL (厚さ約 l mm) を入れて室温でゲル化 させた。 製造例 8で得られた本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （ T G P— 5 ) を製造例 4 と同様にして E 0 G滅菌し、 その l gを 9 gの D' MEM培地に 4 °Cで溶解し、 上記の軟寒天ゲルの上にそれ ぞれ 0. 5 m L (厚さ約 0. 5 mm) ずつ注入し、 室温でゲル化さ せた。 このハイ ドロゲルのゾルーゲル転移温度は 1 8 °Cであった。 上記の本発明のハイ ドロゲル層の上に 8. 0 μ πιのポアサイズのフ ィルター付 tissue culture insert (NUN C社製） を付置し、 そ の中にヒ ト末梢血白血球 1 07個を含む細胞浮遊液 0. 5 m Lを入 れ、 3 7 °Cインキュベーター内に静置した。 3 7 °Cで 3時間静置し た後、 ディ ッシュをインキュベーターから取り出した。 該デイ ツシ ュを氷上で冷却し、 tissue culture insertを除去、 本発明のハイ ドロゲルをゾル化させた。 氷冷下液状の本発明のハイ ドロゲルを回 収し、 生理食塩水で希釈して遠心 （ 3 0 0 0 r p m、 5分間） した 。 沈降した細胞を 2 0 μ Lの生理食塩水に再浮遊させて細胞数を カウント し、 本発明のハイ ドロゲル中へ移行した好中球の数を測定 した。 また、 本発明のハイ ドロゲルを除去した後、 軟寒天中まで移 行した細胞数を顕微鏡下で観察し、 結果を表 1 にまとめた。
(走化因子濃度とハイ ドロゲル中遊走細胞数）
表 1 走化因子濃度とハイ ドロゲル中遊走細胞数
Figure imgf000047_0001
上記表 1 に示す結果は、 走化因子である f ML Pのゲル中におけ る濃度が高いほど、 f ML P反応性細胞の遊走能が高くなることを 示している。 また該細胞は f ML P濃度の高い方向へ遊走すること も示している。
実施例 2 (好中球の選択的分画回収）
製造例 8で得られた本発明のハイ ドロゲル形成性高分子 （T G P 一 5 ) を製造例 4 と同様にして E O G滅菌し、 その l gを 9 gの D ， MEM培地 (Dulbecco's Modification Eagle's Medium, GIBCO社 製、 1 0 % F e t a l C a l f S e r u mを含む） に氷冷下で 溶解した。 この水溶液のゾルーゲル転移温度を測定したところ、 該 ゾルーゲル転移温度は 1 8 °Cであった。
f ML Pを上記ハイ ド口ゲル形成性高分子 （T G P— 5 ) の D， MEM培地に 4 °Cで溶解した （濃度 ： 1 CT6M) 。 この f ML P含 有ハイ ド口ゲル形成性高分子 （ T G P— 5 ) D ' MEM培地を 2 3 Gの注射針付 1 m Lシリ ンジに入れ 4 °Cに冷却した。 この 4 °Cの水 溶液 1 m Lをデイスポーザブル遠沈管 （ファルコン社製、 1 4 m L ) に入れた 3 7 °Cのリ ン酸緩衝食塩水 （ P B S ) 1 0 m Lに押し出 し、 細紐状のハイ ドロゲルを形成させた。 3 7 °Cに保持しながら、 細紐状のハイ ドロゲルを残して P B Sをデカンテーショ ンによ り除 去し、 代わりにへパリ ン加ヒ ト全血 1 0 m Lを遠沈管内の細紐状の ハイ ドロゲルに加えて 3 7 °Cで 4時間ゆるやかに回転攪拌した。 3 7 °Cに保持しながら、 へパリ ン加ヒ ト全血を除去、 3 7 °Cに加温し た P B Sで細紐状のハイ ド口ゲルを洗浄した。 洗浄後、 4 °Cに冷却 して細紐状のハイ ド口ゲルをゾル化させ、 P B Sで希釈、 遠心洗浄 し、 ゲル中に取り込まれた細胞のライ ト · ギムザ染色標本を作製し 顕微鏡観察した結果、 f ML Pに反応しゲル内に遊走した細胞のみ が観察された。 その細胞の分画は好中球および単球が優位で、 赤血 球や血小板等 f ML Pに非反応性の細胞はほとんど観察されなかつ た。
比較例
f M L Pをハイ ドロゲル中に含有させなかった以外は、 実施例 2 と全く 同様の実験を行った。 この比較例で得られたハイ ドロゲル内 に取り込まれた細胞を観察したところ、 赤血球、 血小板、 白血球い ずれもほとんど観察されなかった。 産業上の利用可能性
上述したよ うに本発明によれば、 多様な走性能を有する細胞 · 生 物の分離 （分画、 分別ないし分取等） を可能にするハイ ドロゲルが 提供される。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 生理活性物質の濃度差に応じて、 細胞の選択的な移動を可能 とする細胞 · 生物分離用ハイ ドロゲル。
2 . 前記選択的な移動が、 前記ゲルと外部環境との間の移動であ る請求項 1 に記載の細胞 · 生物分離用ハイ ドロゲル。
3 . 前記選択的な移動が、 前記ゲル内における移動である請求項 1に記載の細胞 ·生物分離用ハイ ドロゲル。
4 . 前記ハイ ドロゲルが、 低温でゾル状態、 高温でゲル化する熱 可逆的なゾルーゲル転移現象を示し、 且つゾルーゲル転移温度よ り 高い温度で該ゲルは実質的に水不溶性である請求項 1 〜 3のいずれ かに記載の細胞 ·生物分離用ハイ ドロゲル。
5 . 前記ハイ ドロゲルが 0 °Cよ り高く 4 5 °C以下のゾル—ゲル転 移温度を有する請求項 4に記載の細胞 · 生物分離用ハイ ドロゲル。
6 . 前記ハイ ド口ゲルが生理活性物質を含有し、 且つ該生理活性 物質がハイ ドロゲルの内部と外部で濃度差を有する請求項 1 〜 5の いずれかに記載の細胞 · 生物分離用ハイ ド口ゲル。
7 . 前記ハイ ド口ゲルが生理活性物質を実質的に含有せず、 且つ 該生理活性物質がハイ ド口ゲルの内部と外部で濃度差を有する請求 項 1〜 5のいずれかに記載の細胞 · 生物分離用ハイ ドロゲル。
8 . 前記ハイ ドロゲルの内部で生理活性物質の濃度勾配が形成さ れている請求項 1〜 7のいずれかに記載の細胞 · 生物分離用ハイ ド 口ゲノレ。
9 . 場 （fi e ld) の物理的性質が勾配を有し、 且つ該物理的性質 の勾配に基づく走性の差異によ り細胞 · 生物が分離される請求項 1 〜 7のいずれかに記載の細胞 · 生物分離用ハイ ド口ゲル。
1 0 . 前記ハイ ド口ゲルが、 水と、 曇点を有する複数のブロ ック と親水性のブロ ック とが結合してなるハイ ドロゲル形成性高分子と を含む請求項 1〜 9のいずれかに記載の細胞 · 生物分離用ハイ ド口 ゲル。
1 1 . 水と、 ハイ ド口ゲル形成性高分子とを少なく とも含むゲル 形成性の組成物であって ； ゾル—ゲル転移温度よ り低い温度では可 逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では実 質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物を用い ； 前記ゲル形成性の組成物のゾルーゲル転移温度よ り高い温度で、 ゲル状態の該組成物の一方の面側に生理活性物質を含有する水溶液 を接触させ、 且つ、 該ゲル状態の組成物の他方の面側に細胞 · 生物 の懸濁液を接触させる工程、
ゲル状態の組成物内に生理活性物質の濃度勾配を形成しつつ、 該 濃度勾配によって惹起される化学走性によって、 前記懸濁液から細 胞 · 生物をゲル状態の組成物内に移行させる工程、
該細胞 · 生物が移行したゲル状態の組成物の少なく とも一部分を 、 該耝成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法
1 2 . 水と、 ハイ ド口ゲル形成性高分子とを少なく とも含むゲル 形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度では可 逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では実 質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物を用い ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度で、 ゾル状態の前記ゲル形成性 の組成物に細胞 · 生物を添加して、 該組成物内に細胞 · 生物を懸濁 させる工程、 細胞 '生物が懸濁した前記ゾル状態の組成物を、 そのゾルーゲル 転移温度よ り高い温度でゲル化させ、 細胞 · 生物が実質的に均一に 内部に分散したゲル状態の組成物を形成する工程、
ゾルーゲル転移温度よ り高い温度で、 前記ゲル状態の組成物を、 生理活性物質を含有する水溶液に接触させる工程、
前記ゲル状態の組成物内に生理活性物質を移行させて、 組成物中 に生理活性物質の濃度勾配を形成させつつ、 該濃度勾配にしたがつ て該組成物中の細胞 · 生物を、 その化学走性能の違いによってゲル 状態の組成物内で再配置させる工程、
該細胞 · 生物が再配置したゲル状態の組成物の少なく とも一部分 を、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ'、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法
1 3 . 水と、 ハイ ドロゲル形成性高分子とを少なく とも含むゲル 形成性の組成物であって ； ゾル—ゲル転移温度よ り低い温度では可 逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では実 質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物を用い ； 前記ゲル形成性の組成物を、 そのゾル—ゲル転移温度よ り低い温 度でゾル状態とし、 該ゾル状態の組成物中に生理活性物質を実質的 に均一に混合する工程、
該ゾル状態の組成物をゾルーゲル転移温度よ り高い温度で、 所定 の形状を付与したゲル状態とする工程、
ゾルーゲル転移温度よ り高い温度で、 該ゲル状態の組成物を細胞 - 生物の懸濁液と接触させて、 該懸濁液から細胞 · 生物をゲル状態 の組成物内に移行させる工程、 細胞 · 生物が移行したゲル状態の組成物を、 細胞 · 生物の懸濁液 から分離する工程、 および、
分離したゲル状態の組成物をゾルーゲル転移温度より低い温度で ゾル状態と し、 該ゾル状態の組成物から、 該組成物内に移行した細 胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法。
1 4 . 前記ハイ ド口ゲル形成性の組成物が、 0 °Cよ り高く 4 5 °C 以下であるゾルーゲル転移温度を有する請求項 1 1〜 1 3のいずれ かに記載の細胞 · 生物の分離方法。
1 5 . 細胞 · 生物が移行または再配置されたゲル状の組成物から 、 走化性能または移行距離の異なる細胞 · 生物を含有する複数の部 分をそれぞれ分離して、 該複数の部分のゲル状の組成物から細胞 · 生物を回収する請求項 1 1 〜 1 4のいずれかに記載の細胞 ' 生物の 分離方法。
1 6 . 前記ハイ ドロゲルに付与する所定の形状が、 表面積 （ S ) /体積 （V ) 比が 1 0 ( c π 1 ) 以上の形状である請求項 1 3に記 載の細胞 · 生物の分離方法。
1 7 . 前記ハイ ド口ゲルに付与する所定形状が、 球状、 細紐状、 フ ァイバー状、 フ レーク状、 板状、 膜状、 不定形状のいずれかであ る請求項 1 6に記載の細胞 · 生物の分離方法。
1 8 . 水と、 ハイ ド口ゲル形成性高分子とを少なく とも含むゲル 形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度では可 逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では実 質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物を用い ； ゲル状態の前記ゲル形成性の組成物を、 物理的性質が連続的に変 化する場に配置し、 該物理的性質の勾配を該ハイ ドロゲル内に形成 する工程、
該ゲル状態の組成物を細胞 · 生物の懸濁液に接触させ、 それぞれ の性質の勾配によって惹起される走性によって、 該細胞 · 生物の懸 濁液から該ゲル状態の組成物内に細胞 · 生物を移行させる工程、 該細胞 · 生物が移行したゲル状態の組成物の少なく とも一部分を 、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の耝成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法
1 9 . 水と、 ハイ ドロゲル形成性高分子とを少なく とも含むゲル 形成性の組成物であって ； ゾルーゲル転移温度よ り低い温度では可 逆的にゾル状態となり、 該ゾルーゲル転移温度よ り高い温度では実 質的に水不溶性のゲル状態となるゲル形成性の組成物を用い ； 前記ゲル形成性の組成物をゾルーゲル転移温度よ り低い温度でゾ ル状態と し、 該ゾルに細胞 ·生物を添加して、 細胞 · 生物が懸濁し た組成物を形成する工程、
該細胞 · 生物が懸濁した組成物をゾルーゲル転移温度よ り高い温 度でゲル化させ、 該細胞 · 生物が実質的に均一に内部に分散したゲ ル状態の組成物を形成する工程、
該ゲル状態の組成物を物理的性質が連続的に変化する場に配置し て、 該組成物中にそれぞれの物理的性質の勾配を形成する工程、 該物理的性質の勾配に従って、 ゲル状態の組成物中に実質的に均 一に分布していた細胞 · 生物を、 それぞれの物理的性質に対する走 性能の違いによってゲル状態の組成物で再配置させる工程、
該細胞 · 生物が再配置したゲル状態の組成物の少なく とも一部分 を、 該組成物の他の部分から分離する工程、 および、
前記ゲル状態の組成物の分離された部分を、 そのゾルーゲル転移 温度よ り低い温度に冷却してゾル化させ、 該ゾル状態の組成物から 細胞 · 生物を回収する工程を少なく とも含む細胞 · 生物の分離方法
2 0 . 前記物理的性質が、 電界強度、 磁界強度、 光度、 温度、 お よび粘度から選ばれる 1以上の物理的性質である請求項 1 8または 1 9に記載の細胞 · 生物の分離方法。
2 1 . 細胞 · 生物が移行または再配置されたゲル状の組成物から 、 走化性能または移行距離の異なる細胞 · 生物を含有する複数の部 分をそれぞれ分離して、 該複数の部分のゲル状の組成物から細胞 · 生物を回収する請求項 1 8〜 2 0のいずれかに記載の細胞 · 生物の 分離方法。
2 2 . 前記ハイ ド口ゲル形成性の組成物が、 0 °Cより高く 4 5 °C 以下であるゾルーゲル転移温度を有する請求項 1 8〜 2 1のいずれ かに記載の細胞 · 生物の分離方法。
PCT/JP2004/001856 2003-02-19 2004-02-19 細胞分離用ハイドロゲルおよび細胞の分離方法 WO2004074463A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/545,935 US20060121116A1 (en) 2003-02-19 2004-02-19 Hydrogel for cell separation and method of separating cells
JP2005502753A JPWO2004074463A1 (ja) 2003-02-19 2004-02-19 細胞分離用ハイドロゲルおよび細胞の分離方法
CA002516592A CA2516592A1 (en) 2003-02-19 2004-02-19 Hydrogel for separating cell and method of separating cell
EP04712684A EP1595944A4 (en) 2003-02-19 2004-02-19 HYDROGEL FOR CELL SEPARATION AND CELL SEPARATION METHOD
US11/907,110 US20080213869A1 (en) 2003-02-19 2007-10-09 Hydrogel for separating cell and method of separating cell

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003041391 2003-02-19
JP2003-041391 2003-02-19

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/907,110 Division US20080213869A1 (en) 2003-02-19 2007-10-09 Hydrogel for separating cell and method of separating cell

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004074463A1 true WO2004074463A1 (ja) 2004-09-02

Family

ID=32905286

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/001856 WO2004074463A1 (ja) 2003-02-19 2004-02-19 細胞分離用ハイドロゲルおよび細胞の分離方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20060121116A1 (ja)
EP (1) EP1595944A4 (ja)
JP (1) JPWO2004074463A1 (ja)
CA (1) CA2516592A1 (ja)
WO (1) WO2004074463A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008107210A (ja) * 2006-10-25 2008-05-08 Mebiol Kk 好中球機能検査システムおよび好中球機能検査方法
CN113980325A (zh) * 2021-09-15 2022-01-28 苏州市立医院(北区) 一种可提高中性粒细胞趋化效率的凝胶制备方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100624450B1 (ko) * 2004-12-10 2006-09-18 삼성전자주식회사 히드로겔을 이용한 생물분자의 분리 및 정제 방법
CA2932542C (en) * 2012-12-14 2023-06-06 The Regents Of The University Of California Viral vector nanocapsule for targeting gene therapy and its preparation
US20230310609A1 (en) * 2020-08-21 2023-10-05 Virginia Polytechnic Institute And State University Injectable hydrogels and methods of capturing cells using the same

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0214340A2 (en) * 1985-09-09 1987-03-18 BioControl Systems, Inc. Process for detection of selected motile organisms
JPH0823956A (ja) * 1994-07-12 1996-01-30 Matsushita Electric Ind Co Ltd 濃度勾配生成装置及びその製造方法
GB2314035A (en) * 1995-02-21 1997-12-17 Mini Agriculture & Fisheries Dielectrophoresis
US5733736A (en) * 1996-12-16 1998-03-31 Springfield College Motility channel pathogen detector and method of use
JPH11276156A (ja) * 1998-03-31 1999-10-12 Mitsubishi Electric Corp 生細胞計測方法
WO2000007007A1 (en) * 1998-07-28 2000-02-10 Biometric Imaging, Inc. Device and method for cell motility assay
JP2000262865A (ja) * 1999-03-15 2000-09-26 Matsushita Electric Ind Co Ltd 細菌濃縮装置
JP2001017156A (ja) * 1999-07-07 2001-01-23 Matsushita Electric Ind Co Ltd 微生物濃度濃縮装置および微生物濃度濃縮方法
US6391654B1 (en) * 1998-08-14 2002-05-21 Genosis Limited Separation and detection of spermatozoa
JP2002159287A (ja) * 2000-09-12 2002-06-04 Effector Cell Institute Inc 細胞走化性検出及び走化細胞分離装置

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5589352A (en) * 1993-09-03 1996-12-31 Board Of Trustees Operating Michigan State University Diffusion gradient chamber system
IL125532A0 (en) * 1998-07-27 1999-03-12 Yeda Res & Dev Hematopoietic cell composition for use in transplantation
CA2453539A1 (en) * 2001-07-13 2002-07-12 Mebiol Inc. Cell or tissue-culturing carrier, and culturing method

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0214340A2 (en) * 1985-09-09 1987-03-18 BioControl Systems, Inc. Process for detection of selected motile organisms
JPH0823956A (ja) * 1994-07-12 1996-01-30 Matsushita Electric Ind Co Ltd 濃度勾配生成装置及びその製造方法
GB2314035A (en) * 1995-02-21 1997-12-17 Mini Agriculture & Fisheries Dielectrophoresis
US5733736A (en) * 1996-12-16 1998-03-31 Springfield College Motility channel pathogen detector and method of use
JPH11276156A (ja) * 1998-03-31 1999-10-12 Mitsubishi Electric Corp 生細胞計測方法
WO2000007007A1 (en) * 1998-07-28 2000-02-10 Biometric Imaging, Inc. Device and method for cell motility assay
US6391654B1 (en) * 1998-08-14 2002-05-21 Genosis Limited Separation and detection of spermatozoa
JP2000262865A (ja) * 1999-03-15 2000-09-26 Matsushita Electric Ind Co Ltd 細菌濃縮装置
JP2001017156A (ja) * 1999-07-07 2001-01-23 Matsushita Electric Ind Co Ltd 微生物濃度濃縮装置および微生物濃度濃縮方法
JP2002159287A (ja) * 2000-09-12 2002-06-04 Effector Cell Institute Inc 細胞走化性検出及び走化細胞分離装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1595944A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008107210A (ja) * 2006-10-25 2008-05-08 Mebiol Kk 好中球機能検査システムおよび好中球機能検査方法
CN113980325A (zh) * 2021-09-15 2022-01-28 苏州市立医院(北区) 一种可提高中性粒细胞趋化效率的凝胶制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2516592A1 (en) 2004-09-02
EP1595944A4 (en) 2006-02-22
US20060121116A1 (en) 2006-06-08
US20080213869A1 (en) 2008-09-04
EP1595944A1 (en) 2005-11-16
JPWO2004074463A1 (ja) 2006-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9587213B2 (en) Methods and devices for encapsulating cells
WO2016208777A1 (ja) 細胞培養器
US9206391B2 (en) Method for preparing biological tissue
JPS6157288B2 (ja)
WO2001070022A1 (fr) Materiaux de revetement pour tissus biologiques, tissus biologiques revetus et procede d&#39;enduction de tissus biologiques
US20160376550A1 (en) Cell culture support and associated method for cell growth and release
JPWO2003006635A1 (ja) 細胞・組織培養用担体および培養方法
US20100190246A1 (en) Method for preparing biological tissue
US20080213869A1 (en) Hydrogel for separating cell and method of separating cell
JP3414444B2 (ja) 固定化用器具、これを用いた生物組織の固定化法および培養法
WO2006103685A2 (en) A method for cultivating cells derived from corneal limbal tissue and cells deived from corneal limbal tissue
JP6757578B2 (ja) Ｔｇｐ含有保存液と微小重力負荷による免疫細胞及び血液細胞の機能増強方法
WO2021090767A1 (ja) 細胞培養装置
WO2004078961A1 (ja) 浮遊担体および浮遊・回収方法
WO2005079994A1 (ja) 分離・回収装置および分離・回収方法
JP6373241B2 (ja) 細胞の保存方法
TW202146647A (zh) 自然殺手細胞的放大方法
JP6558432B2 (ja) 組織の作製方法
US8932854B2 (en) Adsorbent for lymphocyte proliferation inhibitor and treating method
WO2006090933A1 (ja) Ｃ型肝炎ウイルス粒子およびその増殖法
JP3190147B2 (ja) 初代癌細胞培養用担体およびこれを用いる初代癌細胞の培養方法
US20200299628A1 (en) Thermally responsive microgel particles for cell culture applications
JP6264765B2 (ja) 組織の作製方法
CN114849601B (zh) 蛋白修饰微球及其应用
Jones et al. Use of polyacrylamide for cloning of primary tumors

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005502753

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006121116

Country of ref document: US

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004712684

Country of ref document: EP

Ref document number: 10545935

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2516592

Country of ref document: CA

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004712684

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0407709

Country of ref document: BR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10545935

Country of ref document: US