JPH11276156A - 生細胞計測方法 - Google Patents
生細胞計測方法Info
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- JPH11276156A JPH11276156A JP8727398A JP8727398A JPH11276156A JP H11276156 A JPH11276156 A JP H11276156A JP 8727398 A JP8727398 A JP 8727398A JP 8727398 A JP8727398 A JP 8727398A JP H11276156 A JPH11276156 A JP H11276156A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生きている細胞からなる構成物だけを移動さ
せる手段により、生きている、あるいは死んでいる状態
が混在した中から、生きているもののみの動きを、リア
ルタイムに抽出、あるいは定量化する。 【解決手段】 生細胞を含む試料を容器に入れ、容器内
に前記生細胞を移動させる環境の勾配を形成し、容器内
の生細胞の分布の経時変化を測定することにより、環境
勾配に反応して移動する生細胞数を定量的に測定する。
せる手段により、生きている、あるいは死んでいる状態
が混在した中から、生きているもののみの動きを、リア
ルタイムに抽出、あるいは定量化する。 【解決手段】 生細胞を含む試料を容器に入れ、容器内
に前記生細胞を移動させる環境の勾配を形成し、容器内
の生細胞の分布の経時変化を測定することにより、環境
勾配に反応して移動する生細胞数を定量的に測定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、衛生保持、医薬
および食品関連分野、生化学実験、上下水処理などにお
いて問題となる、生きている細胞の数量をリアルタイム
に自動的に測定できる生細胞計測方法に関するものであ
る。
および食品関連分野、生化学実験、上下水処理などにお
いて問題となる、生きている細胞の数量をリアルタイム
に自動的に測定できる生細胞計測方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】従来の白血球数は、血球計算板による視
算、あるいは、蛍光や散乱を計測する自動血球係数器に
より測定された。
算、あるいは、蛍光や散乱を計測する自動血球係数器に
より測定された。
【０００３】従来の光を計測手段として用いた例とし
て、Kennedy.M. J らの方法（Estimating Cell Concent
ration in the Presence of Suspended Solids:A Light
Scatter Technique, Biotechnol Bioeng vol.40,No.8,
875-888,1992）がある。菌体のみの懸濁液に光を照射す
ると、光散乱が菌体の濃度に比例した。
て、Kennedy.M. J らの方法（Estimating Cell Concent
ration in the Presence of Suspended Solids:A Light
Scatter Technique, Biotechnol Bioeng vol.40,No.8,
875-888,1992）がある。菌体のみの懸濁液に光を照射す
ると、光散乱が菌体の濃度に比例した。
【０００４】従来の電気的手法を計測手段として用いた
例に、石川らの手法（誘電率計測による生菌数モニタ,
計装 vol.39,No.3,46-50,1996）がある。電場中では、
細胞壁を有する生菌は、分極してコンデンサを形成す
る。また、細胞密度と誘電率の間には直線関係が存在す
る。死細胞やデブリ（断片）は分極しないため、計測値
に影響を与えないことから、生菌のみを計測できる手法
である。
例に、石川らの手法（誘電率計測による生菌数モニタ,
計装 vol.39,No.3,46-50,1996）がある。電場中では、
細胞壁を有する生菌は、分極してコンデンサを形成す
る。また、細胞密度と誘電率の間には直線関係が存在す
る。死細胞やデブリ（断片）は分極しないため、計測値
に影響を与えないことから、生菌のみを計測できる手法
である。
【０００５】正確な菌体数を知るためには、手動による
計数法が最も確実であるとされている。現在、主に用い
られている方法は、日本生物工学会編の「生物工学実験
書」（培風館，１７，１９９２）によると、菌体を含む
一定量を、寒天培地に均一に塗り、生じるコロニー数を
数えることにより、原液中の菌体数を求める手法であ
る。
計数法が最も確実であるとされている。現在、主に用い
られている方法は、日本生物工学会編の「生物工学実験
書」（培風館，１７，１９９２）によると、菌体を含む
一定量を、寒天培地に均一に塗り、生じるコロニー数を
数えることにより、原液中の菌体数を求める手法であ
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従来の自動血球係数器
によると、一括して個数を測定する機能は備えている
が、その白血球の状態、つまり環境に対する走性等の機
能を定量的に測定することができないという問題点があ
った。
によると、一括して個数を測定する機能は備えている
が、その白血球の状態、つまり環境に対する走性等の機
能を定量的に測定することができないという問題点があ
った。
【０００７】従来のリアルタイムに菌体を計測する手法
の一つである、光の散乱を用いた手法によると、死菌、
生菌の区別なく全てを一律に測定しており、生菌を死菌
から分離した測定が不可能であるという問題点があっ
た。
の一つである、光の散乱を用いた手法によると、死菌、
生菌の区別なく全てを一律に測定しており、生菌を死菌
から分離した測定が不可能であるという問題点があっ
た。
【０００８】従来のリアルタイムに菌体を計測する手法
の一つである、電気的な手法は感度が低く、低濃度域の
計測が困難であるという問題点があった。
の一つである、電気的な手法は感度が低く、低濃度域の
計測が困難であるという問題点があった。
【０００９】また、従来の光や電気等の手法を用いた校
正手段を持たない計測器においては、菌体個数の相対値
を得ることはできたが、絶対数の計測はできなかった。
正手段を持たない計測器においては、菌体個数の相対値
を得ることはできたが、絶対数の計測はできなかった。
【００１０】現在、主に用いられている正確な菌体数を
得るための手動の計数法は、コロニーが成長するまで時
間を要するという問題点があった。
得るための手動の計数法は、コロニーが成長するまで時
間を要するという問題点があった。
【００１１】また、従来の手法によると、菌体の種別に
関係なく、それらを一括して測定しているという問題点
があった。
関係なく、それらを一括して測定しているという問題点
があった。
【００１２】この発明は、上記のような問題点を解決す
るためになされたもので、生きている細胞の数量を移動
させる手段により、生きている細胞と死んでいる細胞が
混在した中から、生きているもののみをリアルタイムに
抽出、あるいは定量化できる生細胞計測方法を得ること
を目的とする。
るためになされたもので、生きている細胞の数量を移動
させる手段により、生きている細胞と死んでいる細胞が
混在した中から、生きているもののみをリアルタイムに
抽出、あるいは定量化できる生細胞計測方法を得ること
を目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】この発明の第１の構成に
よる生細胞計測方法は、生細胞を含む試料を容器に入
れ、容器内に前記生細胞を移動させる環境の勾配を形成
し、容器内の生細胞の分布の経時変化を測定することに
より、環境勾配の反応して移動する生細胞数を定量的に
測定するものである。
よる生細胞計測方法は、生細胞を含む試料を容器に入
れ、容器内に前記生細胞を移動させる環境の勾配を形成
し、容器内の生細胞の分布の経時変化を測定することに
より、環境勾配の反応して移動する生細胞数を定量的に
測定するものである。
【００１４】また、この発明の第２の構成による生細胞
計測方法は、第１の構成において、環境の勾配は、生細
胞が好む化学物質等または好まない化学物質等の濃度分
布によって形成されるものである。
計測方法は、第１の構成において、環境の勾配は、生細
胞が好む化学物質等または好まない化学物質等の濃度分
布によって形成されるものである。
【００１５】また、この発明の第３の構成による生細胞
計測方法は、第１の構成において、環境の勾配は、生細
胞の物理的性質に作用して、前記生細胞を強制的に移動
させるものである。
計測方法は、第１の構成において、環境の勾配は、生細
胞の物理的性質に作用して、前記生細胞を強制的に移動
させるものである。
【００１６】また、この発明の第４の構成による生細胞
計測方法は、第１の構成において、定量的に測定する工
程は、容器内の生細胞数の分布の経時変化を測定する相
対測定の工程と、別途に行う絶対測定法による校正の工
程とを含むものである。
計測方法は、第１の構成において、定量的に測定する工
程は、容器内の生細胞数の分布の経時変化を測定する相
対測定の工程と、別途に行う絶対測定法による校正の工
程とを含むものである。
【００１７】また、この発明の第５の構成による生細胞
計測方法は、第１の構成において、経時変化の測定は、
経時変化の初期の変化を、あらかじめ測定された経時変
化の収束に到る全工程の変化と比較することにより、経
時変化の収束する以前に経時変化を推定するものであ
る。
計測方法は、第１の構成において、経時変化の測定は、
経時変化の初期の変化を、あらかじめ測定された経時変
化の収束に到る全工程の変化と比較することにより、経
時変化の収束する以前に経時変化を推定するものであ
る。
【００１８】また、この発明の第６の構成による生細胞
計測方法は、第１の構成において、生細胞数の測定は、
光の散乱、誘電率、抵抗値等を利用したものである。
計測方法は、第１の構成において、生細胞数の測定は、
光の散乱、誘電率、抵抗値等を利用したものである。
【００１９】また、この発明の第７の構成による生細胞
計測方法は、第１の構成において、生細胞数の測定は、
測定対象の生細胞を蛍光染色し、蛍光強度を測定する工
程を含むものである。
計測方法は、第１の構成において、生細胞数の測定は、
測定対象の生細胞を蛍光染色し、蛍光強度を測定する工
程を含むものである。
【００２０】また、この発明の第８の構成による生細胞
計測方法は、第３の構成において、生細胞の強制的移動
は、生菌のみに存在する電荷に作用する電位勾配によっ
て行われるものである。
計測方法は、第３の構成において、生細胞の強制的移動
は、生菌のみに存在する電荷に作用する電位勾配によっ
て行われるものである。
【００２１】また、この発明の第９の構成による生細胞
計測方法は、第１の構成において、生細胞数の測定の前
に、フィルタを用いて測定対象となる生細胞の純度を高
める工程を含むものである。
計測方法は、第１の構成において、生細胞数の測定の前
に、フィルタを用いて測定対象となる生細胞の純度を高
める工程を含むものである。
【００２２】また、この発明の第１０の構成による生細
胞計測方法は、第１の構成において、生細胞数の測定に
おいて、グラム染色により、測定対象の生細胞を選別す
る工程を含むものである。
胞計測方法は、第１の構成において、生細胞数の測定に
おいて、グラム染色により、測定対象の生細胞を選別す
る工程を含むものである。
【００２３】
【発明の実施の形態】実施の形態１．本実施の形態にお
いて、細胞からなる構成物とは、単細胞や多細胞生物ま
たは血球などの生体細胞のことである。また、ここで生
きているとは、生命活動を伴っている細胞に特有の行動
をなす状態である。例えば、運動性を持つ菌体に対して
は、動くことが出来る状態である。白血球は、細菌の分
泌するｃＡＭＰ、あるいはＣａイオン増加に対して、化
学走性を持つ。この性質を利用して白血球の機能的状態
を定量的に計測する方法を以下に説明する。図１のチュ
ーブ１２内に、平均的な健康な人間の白血球を含む血液
試料を設置する。その端の誘引部１１に、化学走性を導
く物質を置く。白血球の移動を、光散乱計測位置１３に
示される位置において、光の散乱の経時的変化を計測す
る。
いて、細胞からなる構成物とは、単細胞や多細胞生物ま
たは血球などの生体細胞のことである。また、ここで生
きているとは、生命活動を伴っている細胞に特有の行動
をなす状態である。例えば、運動性を持つ菌体に対して
は、動くことが出来る状態である。白血球は、細菌の分
泌するｃＡＭＰ、あるいはＣａイオン増加に対して、化
学走性を持つ。この性質を利用して白血球の機能的状態
を定量的に計測する方法を以下に説明する。図１のチュ
ーブ１２内に、平均的な健康な人間の白血球を含む血液
試料を設置する。その端の誘引部１１に、化学走性を導
く物質を置く。白血球の移動を、光散乱計測位置１３に
示される位置において、光の散乱の経時的変化を計測す
る。
【００２４】次に、測定対象の血液試料をチューブ１２
に設置し、同様の測定を行う。これにより得られた測定
値と、比較対象の測定値を比較することにより、評価対
象の白血球の機能的状態を示す指標となる相対値を得
る。
に設置し、同様の測定を行う。これにより得られた測定
値と、比較対象の測定値を比較することにより、評価対
象の白血球の機能的状態を示す指標となる相対値を得
る。
【００２５】あるいは、光散乱多点計測位置１４におい
て多点計測し、得られた測定値を最小２乗推定法等によ
り、直線や指数関数に近似して、白血球の機能的状態の
評価に用いる。
て多点計測し、得られた測定値を最小２乗推定法等によ
り、直線や指数関数に近似して、白血球の機能的状態の
評価に用いる。
【００２６】この手法によると、少量の血液サンプルと
簡単な操作によって、白血球のみの、機能的状態につい
ての情報を得ることができる。
簡単な操作によって、白血球のみの、機能的状態につい
ての情報を得ることができる。
【００２７】または、白血球の走性を導く環境である誘
引部を、端ではなく中央に設定し、正規分布に近似し
て、評価に用いる。
引部を、端ではなく中央に設定し、正規分布に近似し
て、評価に用いる。
【００２８】このように、特定の生細胞の移動を誘因す
る環境設定を行い、生細胞の移動を計測する手段を設け
ることにより、特定の生細胞の機能的状態を定量的に測
定することができる。
る環境設定を行い、生細胞の移動を計測する手段を設け
ることにより、特定の生細胞の機能的状態を定量的に測
定することができる。
【００２９】実施の形態２．本実施の形態において、生
菌とは、生命活動を伴っている菌体に特有の行動をなす
菌体であり、例えば運動性を持つ菌体に対しては、動く
ことが出来る状態にある菌体、と定義する。運動性を持
つ菌は、好む環境に近づき、好まない環境からは遠ざか
るという走性を持つ。例えば、大腸菌は、アミノ酸を好
み、酢酸を嫌う性質を持つように、媒質中における化学
物質の濃度の差が刺激になって引き起こされる化学走性
を有する。
菌とは、生命活動を伴っている菌体に特有の行動をなす
菌体であり、例えば運動性を持つ菌体に対しては、動く
ことが出来る状態にある菌体、と定義する。運動性を持
つ菌は、好む環境に近づき、好まない環境からは遠ざか
るという走性を持つ。例えば、大腸菌は、アミノ酸を好
み、酢酸を嫌う性質を持つように、媒質中における化学
物質の濃度の差が刺激になって引き起こされる化学走性
を有する。
【００３０】この性質を利用し、図２において、菌体の
容器の一方に好む環境２１、他方には好まない環境２２
を備えた走性利用生菌体数計測装置２３を用意する。こ
の時、この環境勾配は、図２の容器２４のｘ軸に対して
垂直方向に均一となるように加える。
容器の一方に好む環境２１、他方には好まない環境２２
を備えた走性利用生菌体数計測装置２３を用意する。こ
の時、この環境勾配は、図２の容器２４のｘ軸に対して
垂直方向に均一となるように加える。
【００３１】まず、測定対象の生細胞を含む試料溶液か
ら、菌体の大きさよりも孔が大きいろ紙により、計測の
邪魔となるゴミ等を取り除く。
ら、菌体の大きさよりも孔が大きいろ紙により、計測の
邪魔となるゴミ等を取り除く。
【００３２】次に、均一に混ざった測定対象の大腸菌を
含む溶液を容器２４に入れる。
含む溶液を容器２４に入れる。
【００３３】好む環境と好まない環境を結ぶ線に対して
垂直になるよう、光散乱計測部２５において光の散乱を
計測する。
垂直になるよう、光散乱計測部２５において光の散乱を
計測する。
【００３４】図３において、時間が経過するとともに、
大腸菌の生菌は好む環境の方向へ移動し、好まない環境
から遠ざかる。この結果、生菌体数は、好む環境に近い
地点で増加し、好まない環境の地点で減少する。この
時、死菌は移動しない。
大腸菌の生菌は好む環境の方向へ移動し、好まない環境
から遠ざかる。この結果、生菌体数は、好む環境に近い
地点で増加し、好まない環境の地点で減少する。この
時、死菌は移動しない。
【００３５】従って、好まない環境２２に最も近い光散
乱計測部２５において、経時的な菌体測定値は減少して
いく。
乱計測部２５において、経時的な菌体測定値は減少して
いく。
【００３６】光の散乱と菌体数は、前述のＫｅｎｎｅｄ
ｙ．Ｍ．Ｊらの文献より比例関係にあることから、時刻
ｔの時の光の散乱の測定値と菌体個数の関係は、以下の
式で表わされる。 Ｉ（ｔ）＝ｋ＊Ｎ（ｔ）＋Ｃ ……（１） ただし、Ｉ＝時刻ｔの時の測定値、Ｋ＝定数、Ｎ＝時刻
ｔの時の菌体数、Ｃ＝死菌を含むベースライン値（溶液
別）である。
ｙ．Ｍ．Ｊらの文献より比例関係にあることから、時刻
ｔの時の光の散乱の測定値と菌体個数の関係は、以下の
式で表わされる。 Ｉ（ｔ）＝ｋ＊Ｎ（ｔ）＋Ｃ ……（１） ただし、Ｉ＝時刻ｔの時の測定値、Ｋ＝定数、Ｎ＝時刻
ｔの時の菌体数、Ｃ＝死菌を含むベースライン値（溶液
別）である。
【００３７】予め、測定値と菌体数の関係式、上記式
（１）におけるｋを校正手段により求めておく。
（１）におけるｋを校正手段により求めておく。
【００３８】その方法は、まずバッファを水に交換し
た、含まれる菌が既知である原液を用意し、それを希釈
してサンプル調整したものを適当に数点用意する。調整
すると直ちに、各々について走性利用生菌体数計測装置
２３を用いて光の散乱を計測する。一方、計測と同時
に、一定量（１００μＬ）をプレートに塗付しておき、
コロニーが生成した後、その数を数えて、正確な菌体数
を得る。
た、含まれる菌が既知である原液を用意し、それを希釈
してサンプル調整したものを適当に数点用意する。調整
すると直ちに、各々について走性利用生菌体数計測装置
２３を用いて光の散乱を計測する。一方、計測と同時
に、一定量（１００μＬ）をプレートに塗付しておき、
コロニーが生成した後、その数を数えて、正確な菌体数
を得る。
【００３９】光の散乱の測定値と、手動のコロニー計数
法により得られた菌体数の関係から、光の散乱の手段に
おける式（１）におけるｋが、校正部２６において算出
される。
法により得られた菌体数の関係から、光の散乱の手段に
おける式（１）におけるｋが、校正部２６において算出
される。
【００４０】次に、算出されたkが、校正部２６から計
算部２７へ送られ、設定される。
算部２７へ送られ、設定される。
【００４１】実際の測定においては、好まない環境に最
も近い計測位置において、開始時（ｔ＝０）の測定値
と、それ以上減少が見られない定常状態に落ち着いた時
点での測定値３１の値をベースライン値として得、それ
らの差を算出する。この測定値の差が、生菌の濃度に比
例する。走性利用生菌体数計測装置２３における計測に
伴い、生きている大腸菌の菌体の個体数が、オンライン
で自動的にリアルタイムに算出される。
も近い計測位置において、開始時（ｔ＝０）の測定値
と、それ以上減少が見られない定常状態に落ち着いた時
点での測定値３１の値をベースライン値として得、それ
らの差を算出する。この測定値の差が、生菌の濃度に比
例する。走性利用生菌体数計測装置２３における計測に
伴い、生きている大腸菌の菌体の個体数が、オンライン
で自動的にリアルタイムに算出される。
【００４２】同様な手法で、計測手段を、誘電率、抵
抗、超音波などに代えた場合にも、生きている大腸菌の
菌体数が求められる。
抗、超音波などに代えた場合にも、生きている大腸菌の
菌体数が求められる。
【００４３】あるいは、計測手段を、容器２４において
蛍光染色し、その蛍光スペクトルのパルス数、パルス波
高値、パルス幅を計測する手段に代替した場合にも、生
きている大腸菌の菌体数が求められる。
蛍光染色し、その蛍光スペクトルのパルス数、パルス波
高値、パルス幅を計測する手段に代替した場合にも、生
きている大腸菌の菌体数が求められる。
【００４４】あるいは、このような化学走性を利用した
手法を、好む環境や好まない環境を変えて、繰り返すこ
とにより、生きている大腸菌だけの分離精製に利用する
こともできる。
手法を、好む環境や好まない環境を変えて、繰り返すこ
とにより、生きている大腸菌だけの分離精製に利用する
こともできる。
【００４５】実施の形態３．本実施の形態は、菌体が好
まない環境（あるいは好む環境）に注目して、菌体減少
（増加）を経時的に測定し、計測時間を短縮して結果を
得る手法であり、短時間で計測できるため、実施の形態
２に比べ、大腸菌の分裂増殖による菌体数増加の影響が
少ない。
まない環境（あるいは好む環境）に注目して、菌体減少
（増加）を経時的に測定し、計測時間を短縮して結果を
得る手法であり、短時間で計測できるため、実施の形態
２に比べ、大腸菌の分裂増殖による菌体数増加の影響が
少ない。
【００４６】菌体が好まない環境（あるいは好む環境）
における、減衰（増加）の様子は、時刻ｔにおける測定
値として以下のように示される。（好きな環境を設定す
る場合は、逆数を考える） Ｉ（ｔ）＝ｋ＊Ｎｏ１／２∧（ｔ／Ｔ）＋Ｃ ……（２） ただし、Ｉ＝測定値、ｋ＝定数、Ｎｏ＝初期生菌体数、
Ｔ＝半減期、Ｃ＝死菌を含むベースライン値（溶液別）
である。この減衰（増加）の様子から、定常状態に落ち
着いた場合の値が推定される。
における、減衰（増加）の様子は、時刻ｔにおける測定
値として以下のように示される。（好きな環境を設定す
る場合は、逆数を考える） Ｉ（ｔ）＝ｋ＊Ｎｏ１／２∧（ｔ／Ｔ）＋Ｃ ……（２） ただし、Ｉ＝測定値、ｋ＝定数、Ｎｏ＝初期生菌体数、
Ｔ＝半減期、Ｃ＝死菌を含むベースライン値（溶液別）
である。この減衰（増加）の様子から、定常状態に落ち
着いた場合の値が推定される。
【００４７】実施の形態２と同様に予め校正を行い、そ
の計測手段における測定値と菌体数との関係を示す関係
式を計算部２７に設定しておく。
の計測手段における測定値と菌体数との関係を示す関係
式を計算部２７に設定しておく。
【００４８】実際の測定においては、開始時（ｔ＝０）
の値と、減衰（増加）の初期の数ヵ所について計測す
る。次にその減衰（増加）の状態を、最小２乗推定法等
により直線や指数関数に近似し、定常状態に収束する以
前に定常状態に収束した時点での測定値を推定する。
の値と、減衰（増加）の初期の数ヵ所について計測す
る。次にその減衰（増加）の状態を、最小２乗推定法等
により直線や指数関数に近似し、定常状態に収束する以
前に定常状態に収束した時点での測定値を推定する。
【００４９】次に、上記の校正に基づき、開始時（ｔ＝
０）の値と定常状態に落ち着いた時点での測定値３１と
の差を求め、校正により求めた関係式により、菌体数を
求める。
０）の値と定常状態に落ち着いた時点での測定値３１と
の差を求め、校正により求めた関係式により、菌体数を
求める。
【００５０】この手法によると、菌体濃度が定常状態に
なるまで待機する実施の形態２の場合に比べ、短時間で
計測できる。
なるまで待機する実施の形態２の場合に比べ、短時間で
計測できる。
【００５１】実施の形態４．本実施の形態は、図２の多
点光散乱計測部２８で多点計測を行う。好む環境２１か
らの距離と、十分に時間が経過して定常状態に達した時
（あるいは初期の数回の測定により推定される値でも
可）の多点計測による各測定値についての関係式を、最
小２乗推定法により菌体数に比例する直線に近似する。
この直線の傾きをＩとする。
点光散乱計測部２８で多点計測を行う。好む環境２１か
らの距離と、十分に時間が経過して定常状態に達した時
（あるいは初期の数回の測定により推定される値でも
可）の多点計測による各測定値についての関係式を、最
小２乗推定法により菌体数に比例する直線に近似する。
この直線の傾きをＩとする。
【００５２】この直線の傾きＩは、幅が決まった箱の中
では、菌体数に比例すると予想される。Ｉと菌体数との
関係を示す直線を考えた時、菌体数が０の場合の傾きは
０である。
では、菌体数に比例すると予想される。Ｉと菌体数との
関係を示す直線を考えた時、菌体数が０の場合の傾きは
０である。
【００５３】予め校正として、好む環境２１からの距離
と多点計測による各測定値から前記の傾きＩを求め、同
時にプレートを用いた手動計算法により菌体数を得る。
これにより、菌体数に比例する直線の傾きが求められ、
この直線を用いて、測定値から菌体数を算出する。
と多点計測による各測定値から前記の傾きＩを求め、同
時にプレートを用いた手動計算法により菌体数を得る。
これにより、菌体数に比例する直線の傾きが求められ、
この直線を用いて、測定値から菌体数を算出する。
【００５４】実施の形態５．電荷を持つ細胞において、
生きている状態とは、生命活動を行っているために電荷
を持っている状態である、と定義する。負の電荷を持つ
大腸菌については、図２の好む環境２１と好まない環境
２２の代わりに、プラス極とマイナス極を準備する。負
に帯電した大腸菌は、正極へ動き、負極付近で減少す
る。後は、上記と同様な手法で生菌について定量化す
る、あるいは校正手段を併用して菌体数を求める。この
方法は生菌の能動的運動性を利用するものではなく、生
菌であるとの指標となる物理的性質（電荷など）を利用
して、外的環境により強制的に走行させるものである。
生きている状態とは、生命活動を行っているために電荷
を持っている状態である、と定義する。負の電荷を持つ
大腸菌については、図２の好む環境２１と好まない環境
２２の代わりに、プラス極とマイナス極を準備する。負
に帯電した大腸菌は、正極へ動き、負極付近で減少す
る。後は、上記と同様な手法で生菌について定量化す
る、あるいは校正手段を併用して菌体数を求める。この
方法は生菌の能動的運動性を利用するものではなく、生
菌であるとの指標となる物理的性質（電荷など）を利用
して、外的環境により強制的に走行させるものである。
【００５５】実施の形態６．菌体の大きさに注目し、測
定前に、予め測定対象の大きさのものを選別する。図２
のうち、容器２４と設定環境２１、２２を図４に示す。
ここでは、測定対象より若干大きめの孔を持つフィルタ
と、若干小さめの孔を持つフィルタ２種を用意する。
定前に、予め測定対象の大きさのものを選別する。図２
のうち、容器２４と設定環境２１、２２を図４に示す。
ここでは、測定対象より若干大きめの孔を持つフィルタ
と、若干小さめの孔を持つフィルタ２種を用意する。
【００５６】まず、測定対象の大きさよりも大きなフィ
ルタ４１を、容器２４の断面に隙間ないよう、かつ移動
できるように設置する。
ルタ４１を、容器２４の断面に隙間ないよう、かつ移動
できるように設置する。
【００５７】次に、フィルタ４１を、容器２４を横切っ
て移動し、その残渣物を装置内に装備されたチューブ４
２により排出する。
て移動し、その残渣物を装置内に装備されたチューブ４
２により排出する。
【００５８】次に、そのろ液について、フィルタ４１と
同様に設置され用意された、測定対象よりやや小さい孔
を持つフィルタを同様に横切ってろ過させ、そのろ液は
チューブ４２により排出すると同時に直ちに無菌の水で
残渣物を溶かす。
同様に設置され用意された、測定対象よりやや小さい孔
を持つフィルタを同様に横切ってろ過させ、そのろ液は
チューブ４２により排出すると同時に直ちに無菌の水で
残渣物を溶かす。
【００５９】この結果、目的対象とほぼ同等の大きさを
持つものが選択される。よって、例えば実施の形態２の
ような化学走性を用いた測定を行う前に、予備的な選別
手段として、この操作を行うことにより、測定対象とな
るものの純度を高めるため、測定精度が向上する。
持つものが選択される。よって、例えば実施の形態２の
ような化学走性を用いた測定を行う前に、予備的な選別
手段として、この操作を行うことにより、測定対象とな
るものの純度を高めるため、測定精度が向上する。
【００６０】あるいは、この手段を応用して、例えば実
施の形態２においては、予め菌体のバッファを入れ替え
ることが可能となり、測定の際に、バッファの影響によ
る誤差がなくなる。
施の形態２においては、予め菌体のバッファを入れ替え
ることが可能となり、測定の際に、バッファの影響によ
る誤差がなくなる。
【００６１】実施の形態７．図２の装置を用い、図５に
おいて染色により決定されるグラム陰性菌とグラム陽性
菌を区別するために、グラム染色液を容器２４に注入
し、画像取り込み部５１より、画像を取り込み、画像解
析装置５２で、染色された色により、菌体数を求める。
おいて染色により決定されるグラム陰性菌とグラム陽性
菌を区別するために、グラム染色液を容器２４に注入
し、画像取り込み部５１より、画像を取り込み、画像解
析装置５２で、染色された色により、菌体数を求める。
【００６２】大腸菌を対象とする場合には、フィルタに
より大きさを分別した後、グラム陰性菌でかつ電荷を持
ち、アミノ酸に引き寄せられるという性質を利用した環
境を設定して生菌の走行性を測定し、かつ校正手段より
算出された関数を用いて、生菌数および生菌の状態が把
握できる。
より大きさを分別した後、グラム陰性菌でかつ電荷を持
ち、アミノ酸に引き寄せられるという性質を利用した環
境を設定して生菌の走行性を測定し、かつ校正手段より
算出された関数を用いて、生菌数および生菌の状態が把
握できる。
【００６３】
【発明の効果】この発明の第１〜３，６，７，８の構成
による生細胞計測方法によれば、生菌と死菌が混在する
試料中の生菌のみを定量的に測定することができる。
による生細胞計測方法によれば、生菌と死菌が混在する
試料中の生菌のみを定量的に測定することができる。
【００６４】また、この発明の第４の構成による生細胞
計測方法によれば、生菌と死菌が混在する試料中の生菌
のみを定量的に絶対測定できる。
計測方法によれば、生菌と死菌が混在する試料中の生菌
のみを定量的に絶対測定できる。
【００６５】また、この発明の第５の構成による生細胞
計測方法によれば、生細胞数の計測を短時間で行うこと
ができる。
計測方法によれば、生細胞数の計測を短時間で行うこと
ができる。
【００６６】また、この発明の第９の構成による生細胞
計測方法によれば、生細胞数の計測の精度を高めること
ができる。
計測方法によれば、生細胞数の計測の精度を高めること
ができる。
【００６７】また、この発明の第１０の構成による生細
胞計測方法によれば、生細胞数の計測において、複数の
菌種の混在する試料中の測定対象菌を限定することがで
きる。また、生菌と死菌の合計数と生菌のみの数の両方
を測定することができる。
胞計測方法によれば、生細胞数の計測において、複数の
菌種の混在する試料中の測定対象菌を限定することがで
きる。また、生菌と死菌の合計数と生菌のみの数の両方
を測定することができる。
【図１】 白血球を測定するための装置を示す図であ
る。
る。
【図２】 走性利用生菌数計測装置を示す図である。
【図３】 走性利用生菌数計測装置において、化学走性
を誘引した際の、菌体の濃度勾配を示す図である。
を誘引した際の、菌体の濃度勾配を示す図である。
【図４】 走性利用生菌数計測装置において、大きさを
フィルタにより、選別しているところの説明図である。
フィルタにより、選別しているところの説明図である。
【図５】 画像解析装置を備えた、走性利用生菌数計測
装置において、グラム染色により選別するときの図であ
る。
装置において、グラム染色により選別するときの図であ
る。
１１ 誘引部、１２ チューブ、１３ 光散乱計測位
置、１４ 光散乱多点計測位置、２１ 好む環境、２２
好まない環境、２３ 走性利用生菌体数計測装置、２
４ 容器、２５ 光散乱計測部、２６ 校正部、２７
計算部、２８ 多点光散乱計測部、３１ 好まない環境
における定常状態に落ち着いた時点での測定値、４１
フィルタ、４２ 排出部、５１ 画像取り込み部、５２
画像解析装置。
置、１４ 光散乱多点計測位置、２１ 好む環境、２２
好まない環境、２３ 走性利用生菌体数計測装置、２
４ 容器、２５ 光散乱計測部、２６ 校正部、２７
計算部、２８ 多点光散乱計測部、３１ 好まない環境
における定常状態に落ち着いた時点での測定値、４１
フィルタ、４２ 排出部、５１ 画像取り込み部、５２
画像解析装置。
Claims (10)
- 【請求項１】 生細胞を含む試料を容器に入れ、容器内
に前記生細胞を移動させる環境の勾配を形成し、容器内
の生細胞の分布の経時変化を測定することにより、環境
勾配に反応して移動する生細胞数を定量的に測定する生
細胞計測方法。 - 【請求項２】 前記環境の勾配は、前記生細胞が好む化
学物質等または好まない化学物質等の濃度分布によって
形成される請求項１記載の生細胞計測方法。 - 【請求項３】 前記環境の勾配は、前記生細胞の物理的
性質に作用して、前記生細胞を強制的に移動させるもの
である請求項１記載の生細胞計測方法。 - 【請求項４】 前記定量的に測定する工程は、前記容器
内の生細胞数の分布の経時変化を測定する相対測定の工
程と、別途に行う絶対測定法による校正の工程とを含む
ものである請求項１記載の生細胞計測方法。 - 【請求項５】 前記経時変化の測定は、経時変化の初期
の変化を、あらかじめ測定された経時変化の収束に到る
全工程の変化と比較することにより、経時変化の収束す
る以前に経時変化を推定するものである請求項１記載の
生細胞計測方法。 - 【請求項６】 前記生細胞数の測定は、光の散乱、誘電
率、抵抗値等を利用したものである請求項１記載の生細
胞計測方法。 - 【請求項７】 前記生細胞数の測定は、測定対象の生細
胞を蛍光染色し、蛍光強度を測定する工程を含むもので
ある請求項１記載の生細胞計測方法。 - 【請求項８】 前記生細胞の強制的移動は、生菌のみに
存在する電荷に作用する電位勾配によって行われる請求
項３記載の生細胞計測方法。 - 【請求項９】 前記生細胞数の測定の前に、フィルタを
用いて測定対象となる生細胞の純度を高める工程を含む
ものである請求項１記載の生細胞計測方法。 - 【請求項１０】 前記生細胞数の測定において、グラム
染色により、測定対象の生細胞を選別する工程を含むも
のである請求項１記載の生細胞計測方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8727398A JPH11276156A (ja) | 1998-03-31 | 1998-03-31 | 生細胞計測方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8727398A JPH11276156A (ja) | 1998-03-31 | 1998-03-31 | 生細胞計測方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11276156A true JPH11276156A (ja) | 1999-10-12 |
Family
ID=13910171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8727398A Pending JPH11276156A (ja) | 1998-03-31 | 1998-03-31 | 生細胞計測方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11276156A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004074463A1 (ja) * | 2003-02-19 | 2004-09-02 | Waseda University | 細胞分離用ハイドロゲルおよび細胞の分離方法 |
| JP2010161979A (ja) * | 2009-01-16 | 2010-07-29 | Kimigafuchigakuen Sojo Univ | 微生物培養装置 |
| JP2014135935A (ja) * | 2013-01-17 | 2014-07-28 | Azbil Corp | 微生物検出システム及び微生物検出方法 |
-
1998
- 1998-03-31 JP JP8727398A patent/JPH11276156A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004074463A1 (ja) * | 2003-02-19 | 2004-09-02 | Waseda University | 細胞分離用ハイドロゲルおよび細胞の分離方法 |
| JPWO2004074463A1 (ja) * | 2003-02-19 | 2006-06-01 | 学校法人早稲田大学 | 細胞分離用ハイドロゲルおよび細胞の分離方法 |
| JP2010161979A (ja) * | 2009-01-16 | 2010-07-29 | Kimigafuchigakuen Sojo Univ | 微生物培養装置 |
| JP2014135935A (ja) * | 2013-01-17 | 2014-07-28 | Azbil Corp | 微生物検出システム及び微生物検出方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD01 | Notification of change of attorney |
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